Báo cáo Nghiên cứu chuyển hóa limonene trong tinh dầu ở Việt Nam

êm toluene vào để khuấy trộn đƣợc đều). Tiếp tục khuấy trong 12 giờ ở 85-90°C. Sau khi kết thúc phản ứng, thu lấy sản phẩm, hòa vào nƣớc, chiết lấy phần dung dịch (tan trong nƣớc). Tiếp tục axit hóa phần dung dịch chiết đƣợc bằng axit clohidric rồi chiết lấy phần hữu cơ ở phía trên. Lớp dƣới đƣợc chiết tiếp với một lƣợng nhỏ toluene và thu lấy phần hữu cơ ở trên. Đổ chung các phần hữu cơ chiết đƣợc với nhau, kiềm hóa bằng KOH và chiết lấy lớp dƣới (lớp trên là toluene). Tiếp tục axit hóa phần dung dịch chiết đƣợc bằng axit HC1 (1:1) rồi chiết lấy lớp hữu cơ ở trên bằng ete. Cuối cùng làm khan và cất loại ete, thu đƣợc axit 2-(3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-enyloxy)axetic (axít A1 hay axít limonenoxyaxetic). II.4/ Phản ứng của muối và etylbromua trên chất mang Silicagel: II.4.1/ Phương trình phản ứng II.4.2/ Cách tiến hành Axit limonenoxyaxetic đƣợc kiềm hóa bằng KOH đặc đến pH=9. Làm khan silicagel bằng cách sấy trên một đĩa sứ sạch ở 110°c trong 3 giờ. Tẩm lên 40g silicagel đã đƣợc sấy khô đó khoảng 15 - 16g muối kali limonenoxyaxetat ở trên và tiếp tục sấy ở 110°c trong 3 giờ (trong lúc sấy nên đảo trộn silicagel để việc bốc hơi nƣớc đƣợc thuận lợi). Sau khi sấy xong, đem cân lại để tính lƣợng muối cho vào. Cho hỗn hợp vào bình thép, thêm vào đó một lƣợng Etyl Bromua theo tỉ lệ mmuối :mEtBr = 1:1,6. Đảo trộn đều rồi đóng chặt nắp bình, sau đó nung nóng hỗn hợp phản ứng ở 50°C trong 10 giờ. Khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp vào bình thủy tinh rồi chiết nhiều lần bằng dietyl ete. Phần dịch chiết thu đƣợc đem chƣng cất cách thủy thu hồi dung môi ở 38-40°C; sau đó đem chƣng cất ở áp suất thấp thu lấy sản phẩm ở 165 - 168°C dƣới áp suất 21mmHg. Sản phẩm thu đƣợc là một chất lỏng không màu, trong suốt và có mùi thơm nhẹ. II.5/ Tổng hợp dẫn xuất 9-triclometyllimonene II.5.1/ Phương trình phản ứng 22 II.5.2/ Cách tiến hành Cho vào bình cầu 500ml (có lắp ống sinh hàn hồi lƣu) hỗn hợp của 36,63ml limonene và 212 ml CCl4 đun hồi lƣu (cách thủy) trong 24 giờ, cách 6 giờ lại cho thêm 1/4 lƣợng của 2,2g benzoylperoxit trong 44ml CCl4 Trung hòa hỗn hợp sau phản ứng bằng dung dịch Na2CO2 10%, chiết lấy phần hữu cơ, làm khan bằng Na2SO4 rồi cất loại CCl4 ở áp suất thƣờng. Phần cặn (cân đƣợc 38g) đƣợc chƣng cất dƣới áp suất thấp thu đƣợc 11 g phân đoạn 1 ở 90 - 92°C/ 40mmHg (limonene); 2,2g hợp chất trung gian và 16g chất dầu sánh, màu vàng ở 165-170°C /19mmHg. II.6/ Thủy phân dẫn xuất 9-triclometyllimonene II.6.1/Phương trình phản ứng Phản ứng xảy ra đồng thời theo hai hƣớng: Và: II.6.2/ Cách tiến hành Cho vào bình cầu 250ml có lắp sinh hàn hồi lƣu 14g dẫn xuất trihalogen của limonene; 110ml etylen glycol; 14,3g KOH và 33ml H2O rồi đun hồi lƣu trong 15 giờ. Sản phẩm đƣợc xử lý bằng cách gạn bỏ phần nhựa, lấy phần dung dịch đem chƣng cất. Phần nƣớc ngƣng đƣợc chiết bằng ete để thu lấy xeton (4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en). Phần cặn còn lại đƣợc chiết bằng ete để loại bỏ phần hữu cơ tan trong ete. Axit hoa phần dung dịch bằng HC1, chiết lấy phần hữu cơ bằng ete. Kiềm hóa phần ete bằng dung dịch NaOH 10% và chiết lấy dung dịch muối. Lại axit hóa và 23 chiết lấy phần hữu cơ bằng ete, cho bay hơi hết dung môi sau đó kết tình lại sản phẩm bằng CH3COOH/ H20 (tì lệ 1:4) rồi bằng rƣợu/ nƣớc. Sản phẩm axít 3-(4-metylxiclohex-3- enyl)but-2-enoic (axít A2 hay axít limonenecacboxylic) tinh khiết nhận đƣợc có dạng tính thể hình kim không màu, t o C = 108-109°C. Hiệu suất=27%. II.7/ Tổng hợp este etyllimonenecacboxylat II.7.1/Phương trình phản ứng: II.7.2/ Cách tiến hành Hòa tan 2,5g axit (4) trong etanol tuyệt đối trong bình cầu 100ml bão hòa bằng hidroclorua khan rồi đun hồi lƣu trong 2 giờ 30 phút (sinh hàn có lắp ống làm khan chứa CaCl2). Sau khi cất loại bớt etanol, trung hòa sản phẩm nhận đƣợc bằng dung dịch NaHCO3 10%. Dùng ete chiết lấy sản phẩm hữu cơ ở lớp trên, rửa bằng nƣớc, cất loại ete và chƣng cất thu lấy este ở 125°c, áp suất 25mmHg. Sản phẩm là một chất dầu không màu, có mùi thơm dễ chịu. Hiệu suất=53%. II.8/ Tổng hợp các hiđrazit thế II.8.1/ Điều chế các axit aryloxyaxetic a/ Phương trình phản ứng b/ Cách tiến hành Hòa tan 0,1 mol phenol (meta-crezol hoặc a-naphtol) trong 30ml dung dịch chứa 5,6g KOH. Thêm vào đó 20ml dung dịch của 0,lmol axit monoclo axetic đã đƣợc kiềm hóa bằng 0,05mol K2CO3. Đun hồi lƣu trong 90 phút. Làm nguội hỗn hợp sau phản ứng và axit hóa bằng HC1 (1: 1). Lọc thu lấy sản phẩm axit aryloxyaxetic, rửa bằng nƣớc rồi kết tinh lại bằng etanol - nƣớc. II.8.2/ Điều chế este etyl aryloxyaxetat a/ Phương trình phản ứng 24 b/ Cách tiến hành Hòa tan 0,1 mol axit aryloxyaxetic trong 25ml etanol, thêm vào đó 3ml H2SO4 đậm đặc rồi đun hồi lƣu trong 6 giờ. cất bới rƣợu dƣ khỏi hỗn hợp phản ứng rồi để nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 20%. Este tách ra đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc lạnh. Etyl 3- metyl-phenoxyaxetat đƣợc chiết ra ở dạng lỏng, sau đó đƣợc làm khan bằng Na2S04 và chƣng cất thu lấy sản phẩm. Etyl 1-naphtoxyaxetat ở dạng rắn đƣợc lọc sau đó kết tinh lại bằng etanol - nƣớc. II.8.3/ Điều chếhiđrazit của axỉt aryloxyaxetic a/ Phương trình phản ứng ArOCH2COOC2H5 + NH2NH2 ArOCH2CONHNH2 + C2H5OH b/ Cách tiến hành Cho 0,05mol este etyl aryloxyaxetat vào bình cầu 100 ml, thêm vào đó l0 ml etanol khan và 1 ml hidrazin hiđrat 50% sau đó tiếp tục thêm dần etanol vào và khuấy để tạo thành dung dịch đồng nhất. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng trong 4 giờ (trong 2 giờ đầu, cứ mỗi giờ lại cho thêm vào hỗn hợp phản ứng lml hiđrazin hiđrat 50%). Sau khi cất loại bới etanol, để nguội hỗn hợp phản ứng sản phẩm tách ra ở dạng rắn. Lọc lấy kết tủa, kết tinh lại một lần bằng bằng etanol - nƣớc và sau đó bằng benzene. II.8.4/ Phản ứng ngửng tụ giữa hiđrazit vời 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en a/ Phương trình phản ứng b/ Cách tiến hành Cho vào bình cầu 0,02mol 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en trong 30ml toluene, thêm vào đó 0,01mol hidrazit của axit aryloxyaxetic. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ, sau đó lắp ống tách nƣớc và tiếp tục đun trong 4 giờ nữa. Cất loại bới dung môi toluene rồi để nguội hỗn hợp phản ứng, sản phẩm tách ra ở dạng rắn, Lọc lấy kết tủa, kết tinh lại trong etanol. III/ Nghiên cứu cấu trúc Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo bằng phƣơng pháp mao quản trên máy GẠLLENKAMP MPD 350 tại Khoa Hóa Trƣờng ĐHSP Thành phố Hồ Chí Minh. Phổ hồng ngoại của các chất đƣợc đo trên máy BRUKER-IFS48 tại Trung Tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của các chất đƣợc đo trên máy BRƢKER Avance 500MHz tại Phòng cấu trúc, Viện Hóa học thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà nội. 25 Phân tích sắc ký và khối phổ đƣợc thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia, Hà nội. IV/ Thử hoạt tính sinh học Các axít mà chúng tôi tổng hợp đƣợc đều có cấu trúc của một auxin, với những đặc điểm nhƣ: Có cấu trúc vòng đóng vai trò của một nhân auxin; Có ít nhất một liên kết đôi trong vòng; Có mạch nhánh chứa nhóm cácboxyl; Có ít nhất một nguyên tử cacbon ngăn cách giữa nhân và nhóm cacboxyl [25]. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thăm dò hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của chúng. Hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của các axít (A1) và (A2) đƣợc nghiên cứu trên 2 chỉ tiêu là tỷ lệ nảy mầm của hạt và tốc độ sinh trƣởng của mầm cây. Đối tƣợng đƣợc chọn: đối với thực vật một lá mầm là hạt lúa giống Lg (cho axít A1) và lúa Nàng Thơm (cho axít A2); đối với thực vật hai là mầm là hạt đậu xanh thu hoạch vào vụ mùa 2003. Cách thức tiến hành tƣơng tự nhƣ đã đƣợc mô tả trong tài liệu [8]: Các công thức thí nghiệm ngâm hạt: nƣớc cất 2 lần (ĐC); axít (A1 và A2) ở các nồng độ l0mg/ lít, 20mg/ lít, 50mg/ lít và l00mg/ lít. Thời gian ngâm đối với hạt lúa là 48 giờ, đối với hạt đậu là 4 giờ. Kết thúc quá trình ngâm, vớt hạt ra và chọn những hạt tốt, đều nhau xếp vào các hộp Petri có lout giấy lọc đã đƣợc thấm ƣớt đều nhau bằng 5ml nƣớc cất. Mỗi hộp chứa 50 hạt, đƣợc đậy nắp để tránh sự bay hơi của nƣớc, đảm bảo sự giống nhau trong các hộp. Mỗi công thức đƣợc lặp lại 10 lần (10 hộp - đối với hạt lúa) và 6 lần (6 hộp - đối với hạt đậu xanh). Sau khi xếp hạt vào hộp Petri (ủ) 1 ngày thì bắt đầu đếm số hạt nảy mầm. Bắt đầu đo sinh trƣởng của thân và rễ từ ngày thứ 4 (đối với lúa) hay ngày thứ 5 (đối với đậu). 26 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I/ Chuyển hóa hóa học I.1/ Tách limonene từ vỏ bƣởi Limonene thu đƣợc từ tinh dầu vỏ bƣởi bằng cách chƣng cất dƣới áp suất thấp là một chất lỏng trong suốt có mùi cam nhẹ. Phổ hồng ngoại của limonene thu đƣợc từ tinh dầu vỏ bƣởi hoàn toàn trùng với phổ hồng ngoại của D-limonene. Một số vân đặc trƣng trên phổ hồng ngoại của D-limonene là:vCH no= 2920,8cm -1 ; Vc=c = 1644,7cm -1 ; vcHanken = 3041,6 và 3083,9cm -1 . Mặc dù có nhiều phƣơng pháp phân tách tinh dầu từ vỏ cam, bƣởi nhƣng chúng tôi lựa chọn biện pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc vì theo nhiều tài liệu [2,4,5], đây là phƣơng pháp tƣơng đối đơn giản, cho tinh dầu có chất lƣợng cao và hiệu suất cũng tốt. Chúng tôi cũng chủ yếu sử dụng vỏ bƣởi để làm nguyên liệu cung cấp tinh dầu do việc thu gom vỏ bƣởi tƣơng đối thuận tiện, hơn nữa việc sơ chế cũng đơn giản và dễ dàng hơn so với vỏ cam. Trong qua trình phân tách limonene từ vỏ bƣởi, chúng tôi nhận thấy rằng để thu đƣợc tinh dầu với hiệu suất cao và chất lƣợng tốt, vỏ bƣởi cần phải còn tƣơi. Trái lại, nếu sử dụng vỏ bƣởi đã héo hay ủng, không những lƣợng tinh dầu thu đƣợc ít đi mà tinh dầu còn có mùi lạ do vỏ bƣởi dễ bị sậm màu, cháy khét trong qua trình chƣng cất. I.2/ Tổng hợp 3-(4-metylxicIohex-3-enyl)but-3-en-l-ol 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol đƣợc tổng hợp trên cơ sở phản ứng giữa limonene và parafocmandehit nhờ xúc tác axit Liuyt. Cơ chế phản ứng nhƣ sau: Focmandehit đƣợc dùng ở dạng parafocmandehit (HCHO)n nhằm loại trừ sự có mặt của nƣớc trong phản ứng - điều này có thể dẫn đến sự tạo thành sản phẩm không mong muốn do các phân tử nƣớc cũng có thể tham gia phản ứng cộng vào liên kết đôi 27 khi có mặt xúc tác axit. Hơn nữa, nƣớc có thể làm mất hoạt tính của xúc tác SnCl4 do tạo thành các hiđrat kết tinh và tách khỏi môi trƣờng phản ứng. Ancol tạo thành sau phản ứng đƣợc tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng bằng phƣơng pháp chƣng cất dƣới áp suất thấp. Khi đó, chúng tôi thu đƣợc 2 phân đoạn: Phân đoạn 1 có nhiệt độ sôi 92 - 94°c ở áp suất 41mmHg; Phân đoạn 2 có nhiệt độ sôi 145 - 150°c ở áp suất 23mmHg. Các tính chất vật lý của phân đoạn 1 cho thấy chất nhận đƣợc là limonene. Phân đoạn 2 có nhiệt độ sôi cao hơn hẳn, chứng tỏ có chất mới đã đƣợc tạo thành. So sánh phổ hồng ngoại của sản phẩm này với limonene có thể thấy: trên phổ vẫn còn vân hấp thụ ở 1642,7cm -1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết đôi C = C, ngoài ra còn xuất hiện vân tù và rộng ở 3427,7cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết O - H có tham gia liên kết hiđro; vân ở 1131,2cm-1 tƣơng ứng với dao động của liên kết C - O. Nhƣ thế sản phẩm nhận đƣợc là một ancol chƣa no. So sánh nhiệt độ sôi của ancol này và phổ hồng ngoại của nó với các tính chất tƣơng tự của sản phẩm đƣợc công bố trong các tài liệu [4,23] cho phép chúng tôi đánh giá rằng sản phẩm 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol đã đƣợc tạo ra. I.3/ Phản ứng của 3-(4-metylxiclohex-3-enyI)but-3-en-l-ol với axit monocloaxetic Bản chất của phản ứng của 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol với axít monocloaxetic là phản ứng thế nucleophin. Vì thế, để làm tăng khả năng phản ứng của tác nhân acol, cần phải chuyển nó thành dạng ancolat LO-. Việc chuyển hóa này đƣợc thực hiện thông qua phản ứng giữa ancol và natri trong môi trƣờng không có nƣớc. Phản ứng này xảy ra thuận lợi hơn khi dùng huyền phù natri trong toluene nhờ tăng khả năng tiếp xúc tốt giữa natri và ancol. Khi thêm axit (đã đƣợc cất lại trƣớc khi sử dụng - nhằm loại trừ sự có mặt của nƣớc) vào dung dịch ancolat, sẽ xảy ra phản ứng: RCOOH + LONa → RCOONa + LOH (L là gốc limonenyl) vì thế cần phải sử dụng lƣợng dƣ ancolat để đảm bảo sự có mặt của tác nhân ancolat cho phản ứng thế nucleophin: LONa + ClCH2COONa → LOCH2COONa + NaCl Sản phẩm nhận đƣợc ở dạng muối, tan tốt trong nƣớc và kém tan trong toluene. Do đó, sau khi kết thúc phản ứng, chúng tôi thêm nƣớc vào hỗn hợp phản ứng và chiết lấy phần dung dịch tan trong nƣớc nhằm loại bỏ ancol dƣ (tan trong toluene). Axít hóa muối để chuyển về dạng axit thì axit lại kém tan trong nƣớc, nhờ thế có thể chiết và tách bỏ đƣợc tạp chất tan trong nƣớc (muối natri monocloaxetat). Lại kiềm hóa và chiết lấy phần dung dịch muối tan trong nƣớc, sau đó axit hóa trở lại và chiết lấy phần hữu cơ bằng ete nhằm thu đƣợc sản phẩm sạch hơn. Cuối cùng, làm khan sản phẩm nhận đƣợc bằng natrisunfat rồi cất loại ete, chúng tôi nhận đƣợc sản phẩm là một chất lỏng rất sánh, màu vàng nâu. Chúng tôi đã tiến hành chƣng cất ở áp suất thấp với mong muốn thu đƣợc sản phẩm axit tinh khiết nhƣng không thành công do sự chuyển hóa (hóa nhựa) của chất trong qua trình chƣng cất. Kết qua phân tích bằng phƣơng pháp GC-MS cho thấy sản phẩm nhận đƣợc là một hỗn hợp của nhiều chất với cấu trúc rất phức tạp và hầu nhƣ chƣa đƣợc xác định (có lẽ đã xảy ra sự chuyển vị của liên kết đôi trong khung menthađien cũng nhƣ sự phá vỡ cấu trúc khung này trong môi trƣờng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao), trong đó thành phần chính (chiếm 28 khoảng 33%) có khối lƣợng phân tử giống nhƣ khối lƣợng phân tử của axit A1 mà chúng tôi dự kiến tổng hợp. I.4/ Phản ứng của muối và etylbromua trên chất mang Silicagel: Thông thƣờng, ngƣời ta thực hiện phản ứng este hóa một cách đơn giản nhờ phản ứng giữa axit và ancol với sự có mặt của H2SO4 đặc làm xúc tác. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp cụ thể, axit limonenoxyaxetic có những liên kết đôi trong phân tử, mà những liên kết đôi này rất dễ tham gia vào phản ứng cộng nƣớc khi có mặt axít. Với mong muốn tổng hợp este của axit limonenoxyaxetic, chúng tôi chọn biện pháp an toàn hơn là dùng phản ứng giữa muối của axit này với etyl bromua trên chất mang silicagel. Bản chất của phản ứng này cũng là phản ứng thế nucleophin mà lon cacboxylat là tác nhân tấn công. Khi đó, nồng độ lon này càng cao, phản ứng xảy ra càng thuận lợi. Chúng tôi lựa chọn muối kali limonenoxyaxetat cho phản ứng này. Nguyên nhân là do lon kali có bán kính lớn hơn so với lon natri nên cặp lon LOCH2COO-K+ lỏng lẻo, thuận lợi cho sự hình thành tác nhân tấn công - lon cacboxylat tự do. Chất mang silicagel vừa tạo điều kiện cho tác nhân và chất phản ứng tiếp xúc với nhau tốt hơn, vừa hoạt hóa tác nhân (làm liên kết LOCH2COO"M + trở nên lỏng lẻo hơn) nhờ cấu trúc silosan và silanol của chúng [9]: Chiết hỗn hợp phản ứng bằng ete, sau đó cất loại ete rồi cất dƣới áp suất thấp, chúng tôi thu đƣợc sản phẩm không màu, có mùi thơm dễ chịu. Điều này cho phép chúng tôi nghĩ rằng sản phẩm este đã đƣợc tạo ra. Phổ hồng ngoại của sản phẩm này cũng xác nhận điều đó. Trên phổ có thể thấy rõ vân hấp thụ với cƣờng độ mạnh ỏ 1755,4cm"1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm C=O; vân hấp thụ ở 1641,4cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết đôi C=C ... và không thấy vân hấp thụ ở vùng trên 3000 cm-1 ứng với dao động hóa trị của nhóm OH. Mặc dù vậy, kết qua phân tích bằng GC-MS cho thấy đây là một hỗn hợp sản phẩm, cấu trúc của các chất phần lớn chƣa đƣợc xác định, trong đó thành phần chính có thể có công thức nhƣ dự kiến. Có lẽ trong qua trình phản ứng tạo thành axit limonenoxyaxetic từ ancol trong môi trƣờng kiềm mạnh, cũng nhƣ trong qua trình chuyển hóa axit thành este với sự có mặt của chất mang silicagel đã tạo điều kiện cho các phản ứng chuyển vị của liên kết đôi và các phản ứng phá vỡ cấu trúc khung menthadien xảy ra. Chúng tôi chƣa phân tách đƣợc sản phẩm este ở dạng tinh khiết. I.5/ Tổng hợp dẫn xuất 9-triclometyllimonene Chúng tôi tiến hành tổng hợp 9-triclometyllimonene dựa trên quy trình tổng hợp của các tác giả [10]. Theo các tác giả này, phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn; giai đoạn đầu là phản ứng cộng của cacbontetraclorua vào liên kết đôi ngoài vòng của limonene để tạo thành 8-clo- 9-triclometyllimonene. Phản ứng này xảy ra theo cơ chế gốc với sự có mặt của chất khơi mào benzoylperoxit. Do phản ứng đƣợc thực hiện trong thời gian tƣơng đối dài (24 giờ), nên chất khơi mào đƣợc thêm vào nhiều lần để 29 đảm bảo hiệu lực của nó. Giai đoạn 2 xảy ra khi chƣng cất thu sản phẩm ở nhiệt độ cao, đó là phản ứng tách loại hiđroclorua để tạo thành 9-triclometyllimonene. Cấu trúc của sản phẩm đã đƣợc các tác giả xác nhận. Chúng tôi cũng đã thu đƣợc sản phẩm có nhiệt độ sôi phù hợp với nhiệt độ sôi của sản phẩm đƣợc các tác giả công bố. I.6/ Thủy phân dẫn xuất 9-triclometyllimonene Theo kết qủa công bố trong tài liệu [1 1], khi thủy phân 9-triclometyllimonene trong kalihiđroxit - etanol trong ống hàn kín ở nhiệt độ cao, sản phẩm nhận đƣợc là muối kali 3-(4- metylxiclohex-3-enyl)but-2-enoat. Axit hóa muối này bằng axit clo hiđric sẽ cho axit limonenecacboxylic tƣơng ứng với nhiệt độ nóng chảy 94,5°C. Theo các tác giả [11], 9- triclometyllimonene không bị thủy phân trong KOH - C2H5OH ở nhiệt độ thƣờng, nhƣng bị thủy phân trong dung dịch kalihiđroxit - etylen glycol đun sôi ở 180°C. Axít hóa sản phẩm tạo thành cũng nhận đƣợc axít limonenecacboxylat. Tuy nhiên, theo các tác giả này, axít lại có nhiệt độ nóng chảy 109,6°c. Trong cả 2 công trình trên, các tác giả đều không thấy công bố các dữ liệu chứng minh cho cấu trúc của sản phẩm axít nhận đƣợc. Vì thế. chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của sản phẩm nhận đƣợc sau khi xử lý 9-triclometyllimonene trong dung dịch kalihiđroxit - etylen glycol (có nhiệt độ nóng chảy 108 - 109°C) nhằm xác định cấu trúc chắc chắn của chất này. Phổ hồng ngoại của sản phẩm nhận đƣợc cho thấy đây có thể là một axit không no với các vân hấp thụ rộng và tù ở 2500 - 3250cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm OH (tự do hay liên kết hidro), vân có cƣờng độ mạnh ở 1687,2cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C=O; vân ở 1631,5 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C=C.... Khối phổ của chất này cho thấy khối lƣợng phân tử của chất là 180đvC (M* = 180); chất này là một axit do có vạch đặc trƣng 135 = M+ - 45. Vạch 119 = M+ - 45 -16 cho thấy axit vẫn còn có nhóm CH3 ở bên ngoài vòng xiclohexen (cấu trúc của vòng xiclohexen có thể thấy qua vạch đặc trƣng C5H7 + = 67). Phân tích phổ cộng hƣởng từ proton của axít này có thể thấy: Hai proton liên kết với cacbon sp 2 đều cho tín hiệu cộng hƣởng ở vùng trung bình và có cƣờng độ tích phân bằng 1. Tuy nhiên, proton ở ngoài vòng xiclohexen sẽ cho tín hiệu singlet ở trƣờng yếu hơn vì nó liên kết với nguyên tử cacbon ở cạnh nhóm -COOH hút electron mạnh, đồng thời proton này cũng không có tƣơng tác spin - spin với protơn nào ở gần nó. Trong khi đó, proton trong vòng xiclohexen chịu tƣơng tác spin - spin với 2 proton gần đó nên sẽ cho tín hiệu triplet. Vì thế, độ dịch chuyển hóa học tƣơng ứng của các proton này là 5,604ppm và 5,382 - 5,387ppm. Proton ở cacbon số 4 của khung menthan cho tín hiệu ở dạng multiplet ở vùng trƣờng mạnh với cƣờng độ tích phân bằng 1 do nó liên kết với nguyên tử cacbon mà bên cạch có 2 nhóm -CH2-, vì thế trên phổ proton này ứng với tín hiệu có ô = 1,445 -l,516ppm. Ba proton trong các nhóm CH3- đều cho tín hiệu ở vùng trƣờng mạnh và có cƣờng độ tích phân bằng 3. Tuy nhiên tín hiệu của các proton trong nhóm CH3- liên kết trực tiếp với vòng xiclohexen sẽ xuất hiện ở trƣờng mạnh hơn so với tín hiệu của các proton trong nhóm CH3- ở ngoài vòng, liên kết với nguyên tử cacbon mang nối đôi 30 liên hợp với nhóm COOH hút electron mạnh. Do đó các proton này có độ dịch chuyển hóa học tƣơng ứng là l,621ppm và 2,07ppm. Proton cửa nhóm axit do tham gia trao đổi với proton của nƣớc (có lẫn trong dung môi đo) nên cho tín hiệu trùng với tín hiệu của proton của nƣớc và không xuất hiện ở vùng trƣờng yếu nhƣ thƣờng thấy. Các proton trong các nhóm -CH2- trong vòng xiclohexen cho các tín hiệu chồng chất lên nhau ở vùng trƣờng mạnh. Việc quy kết riêng rẽ từng tín hiệu của từng proton là hết sức khó khăn và chƣa thực hiện đƣợc. Phổ cộng hƣởng từ cacbon 13 của axit một lần nữa xác nhận cấu trúc của nó. Vân phổ ở trƣờng yếu, ứng với dô dịch chuyển δ = 167,004ppm rõ ràng ứng với cacbon cacbonyl. Tín hiệu xuất hiện ở 114,857 - 162,413ppm là của các nguyên tử cácbon ở trạng thái lai hóa sp2 còn lại, trong đó 2 nguyên tử cacbon tham gia liên hợp với cacbon cacbonyl rõ ràng sẽ cho tín hiệu ở trƣờng yếu hơn. Nguyên tử cacbon ở gần nhóm cacbonyl hơn sẽ có độ dịch chuyển lớn hơn (ứng với δ = 162,413ppm). Trong khi đó, nguyên tử cacbon ở vị trí số 1 trong khung menthen liên kết với 2 nhóm thế có khả năng cho electron sẽ cho tín hiệu ở trƣờng mạnh hơn so với nguyên tử cacbon ở vị trí số 2. Vì thế, độ chuyển dịch hóa học tƣơng ứng của 2 nguyên tử cacbon này là δ = 114,40ppm và δ = 120,006ppm. Các nguyên tử cacbon ở vị trí số 3, 4 và 6 trong khung menthen đều ở vị trí a đối với một nguyên tử cacbon sp2 nên sẽ cho tín hiệu ở trƣờng yếu hơn so với nguyên tử cacbon còn lại; nhƣ vậy nguyên tử cacbon ở vị trí số 5 có δ = 26,788ppm. Nguyên tử cacbon ở vị trí số 4, khác hẳn với 2 nguyên tử cacbon còn lại (số 3 và 6), có tín hiệu ở trƣờng yếu nhất do tham gia liên hợp với nhóm cacbonyl hút electron, vì thế nó có độ chuyển dịch 43,262ppm. Mặc đù có tính chất gần giống nhau so với cacbon sp 2 , tuy nhiên nguyên tử cacbon ở vị tí số 3 liên kết trực tiếp với cacbon số 4 (có mật độ electron thấp) nên sẽ cho tín hiệu ở trƣờng yếu hơn so với cacbon số 6. Độ chuyển dịch tƣơng ứng của chúng là δ = 29,788ppm vàδ = 29,697ppm (trên phổ đồ có độ phân giải thấp, 2 tín hiệu này gần nhƣ trùng nhau). Các kết qua quy kết phổ cộng hƣởng từ 1H và 13C đƣợc biểi diễn tóm tắt ở các hình trên. Từ các kết qua trên, chúng tôi khẳng định axít tạo thành khi thủy phân dẫn xuất 9- triclometyllimonene là axít 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-2-enoic (axít A2). 31 Trong công trình [11], các tác giả cho biết khi thủy phân bằng kiềm - etylen glycol, bên cạnh axít limonenecacboxylic còn thu đƣợc sản phẩm khác là 4-axetyl-l-metylxiclohex-l- en. Đây là một xeton,tạo với 2,4-đinitrophenylhiđrazin một hiđrazon có nhiệt độ nóng chảy 142°C. Nhận thấy đây là một sản phẩm không tan trong nƣớc nên sau khi thủy phân 9- triclometyllimonene, chúng tôi đã tiến hành chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc để thu lấy chất này. Chúng tôi cũng đã tiến hành ngửng tụ sản phẩm nhận đƣợc với 2,4-đinitrophenylhiđrazin và thu đƣợc chất rắn màu vàng cam có nhiệt độ nóng chảy 142°C. Điều đó cho phép chúng tôi tin tƣởng rằng chúng tôi cũng đã tổng hợp đƣợc 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en. 1.7/ Tổng hợp este etyllimonenecacboxylat Các kết qua nghiên cứu từ trƣớc đã cho thấy gốc limonenyl rất dễ tham gia vào phản ứng cộng hợp với nƣớc khi có sự hiện diện của axit nhƣ là chất xúc tác. Điều này là một trở ngại đối với việc tổng hợp este với cấu trúc nhƣ dự kiến bằng phƣơng pháp tổng hợp thông thƣờng - cho axit tác dụng trực tiếp với ancol với xúc tác H2SO4 đặc. Vì thế, chúng tôi lựa chọn giải pháp thay thế xúc tác H2SO4 đặc bằng khí hidroclorua khan nhằm ngăn chặn tối đa tác dụng của nƣớc (tạo thành trong phản ứng este hóa). Cũng với mục đích này, sinh hàn đƣợc lắp thêm ống canxi clorua để tránh sự xâm nhập của nƣớc từ môi trƣờng bên ngoài. Phổ hồng ngoại của sản phẩm nhận đƣợc bƣớc đầu cho thấy este có cấu trúc nhƣ dự kiến đã đƣợc tạo ra. So với phổ của axít trƣớc đó, trên phổ không thấy các vân rộng và tù ở 2500 - 3250cm -1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm O- H; vân phổ ứng với dao động hóa trị của nhóm cacbonyl cũng chuyển lên tần số cao hơn ( 1714 , 9 c m - 1 so với 1687,2cm-1 trong phổ của axit). Điều này hoàn toàn phù hợp với quy luật thƣờng thấy khi có sự chuyển hóa axit - este. Este nhận đƣợc vẫn còn có liên kết đôi C=C, ứng với vân hấp thụ ở 1643,8 cm -1 I.8/ Tổng hợp các hiđrazit thế Các aryloxiaxetohidrazit đƣợc chúng tôi tổng hợp từ các phenol ban đầu là 3- metylphenol và 1-naphtol bằng các phƣơng pháp quen thuộc, Cấu trúc của các sản phẩm trung gian đƣợc xác nhận bằng cách so sánh với nhiệt độ nóng chảy của các chất tƣơng ứng trong tài liệu và bằng phổ hồng ngoại của chúng. Các hidrazit nhận đƣợc tiếp tục đƣợc cho phản ứng với 4-axetyl-l-metylxiclohex-1- en tạo thành trong qua trình thủy phân 9-triclometyllimonene. Phản ứng này xảy ra theo cơ chế AcB2. Theo kinh nghiệm, chúng tôi thực hiện phản ứng với dụng cụ tách nƣớc nhằm nâng cao hiệu suất phản ứng. Tuy nhiên, có lẽ cấu trúc cồng kềnh của xeton cùng với mật độ điện tích dƣơng ở nguyên tử cacbon cacbonyl của xeton đã bị giảm đi nhiều (do hiệu ứng cảm ứng dƣơng của các nhóm thế ankyl ở 2 bên) là những yếu tố làm cản trở phản ứng dẫn đến hiệu suất của phản ứng không cao. So sánh nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm nhận đƣợc với hidrazit tƣơng ứng qua bảng dƣới đây: 32 Có thể thấy: khi chuyển từ các hidrazit sang các hidrazit thế, đều có sự giảm nhiệt độ nóng chảy mặc dù có sự tăng khối lƣợng phân tử của các chất. Có lẽ nguyên nhân là do giữa các phân tử hidrazit thế không còn khả năng tạo thành liên kết hidro giữa các phân tử nhƣ trong các phân tử hidrazit ban đầu. Bảng dƣới đây ghi lại những vân hấp thụ chủ yếu trên phổ hồng ngoại của các hidrazit và hidrazit thế. Hợp chất VC=O VNH2 VNH Vc=N, VC=C VC-O-C Hi 1663 3315 3203 1595 2917 3040 1161 HTi 1708 - 3203 1584 2924(y ) 3046 1178 H2 1662 3328 3195 1580 - 3078 1113 HT2 1701 - 3195 1580 2914 3089 1117 Qua đó có thể thấy, khi chuyển từ hidrazit sang hidrazit thế, đều không còn thấy tín hiệu ở vùng SslOcm-1 đặc trƣng cho dao động của nhóm NH2; trong khi đó các tín hiệu của các liên kết CH no ở vùng 2920CIĨ1'1 mạnh lên rõ rệt; đồng thời tần số dao động hóa trị đặc trƣng của nhóm C=O đều tăng lên khoảng 40cm-1. Các dấu hiệu này cho thấy các sản phẩm ngửng tụ đã đƣợc tạo ra. Sự tăng tần số hấp thụ của nhóm cacbonyl có lẽ là do khi tạo thành hidrazit thế, khả năng liên hợp của nitơ với nhóm cacbonyl đã giảm đi, từ đó làm tăng tần số dao động của nhóm này. Chúng tôi cũng đã tiến hành đo phổ cộng hƣởng từ proton của các hợp chất HT| và HT2. Từ kết qua nhận đƣợc, chúng tôi quy kết và biểu diễn nhƣ sau: 33 Các tín hiệu tƣơng đối rõ ràng là của proton trong nhón NH (ở vùng trƣờng yếu, ứng với δ = 10,39 - 10,5ppm). Các proton trong nhóm CH2 ở gần nhóm cacbonyl có pic ứng với cƣờng độ tích phân bằng 2 và proton liên kết với nguyên tử cacbon sp2 trong vòng xiclohexen - với cƣờng độ tích phân là 1 - cho tín hiệu ở vùng trƣờng trang bình, vì thế chúng sẽ tƣơng ứng với các tín hiệu có δ = 4,92ppm trong HT1 (hay 5,17ppm trong HT2) và δ = 5,388 ppm ƣơng HT1 (hay 5,396ppm trong HT2). Ngoài ra, có thể thấy rằng nguyên tử hiđro gắn với các bon ở vị trí số 4 trong vòng xiclohexen cho tín hiệu ở trƣờng, mạnh với cƣờng độ tích phân là 1 và bị tách thành rất nhiều vạch (multiplet) do nó liên kết với nguyên tử cacbon mà bên cạnh có 2 nhóm CH2. Vì thế, trên phổ, proton này ứng với tín hiệu có δ = l,481ppm. So sánh 2 phổ HT1 và HT2 có thể thấy ngay nhóm tín hiệu có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 2,26 - 2,33ppm và có cƣờng độ tích phân bằng 3 là của các proton trong nhóm CH3 liên kết trực tiếp với vòng thơm. Ba proton trong các nhóm CH3 còn lại đều cho các tín hiệu ở vùng trƣờng mạnh và có cƣờng độ tích phân bằng 3 song các proton của nhóm CH3 liên kết trực tiếp với vòng xiclohexen sẽ có tín hiệu ở trƣờng mạnh hơn vì nhóm CH3 này liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon mang liên kết đôi C=C còn nhóm CH3 kia liên kết trực tiếp với nguyên tử cacbon mang liên kết C=N. Do đó trong HT1 và HT2, chúng sẽ cho các tín hiệu tƣơng ứng là l,624ppm và l,86ppm (trong HT1)`; l,629ppm và l,89ppm (trong HT2). Các proton trong các nhóm CH2 trong vòng xiclohexen cho các tín hiệu chồng chất lên nhau ở vùng trƣờng mạnh. Việc quy kết riêng rẽ từng tín hiệu của từng proton là hết sức khó khăn, đòi hỏi phải có thiết bị hiện đại hơn nữa. Trong vùng thơm, hợp chất HT1 cho 2 nhóm tín hiệu, một có cƣờng độ tích phân là 1 và là vân bội, một là một đám vạch có cƣờng độ tích phân bằng 3. Vì thế chúng tôi cho rằng vân có cƣờng độ tích phân 1 tƣơng ứng với proton ỏ vị trí meta đối với 2 nhóm thế trên vòng thơm: proton này chịu tƣơng tác spin - spin với 2 proton ở 2 nguyên tử cacbon gần kề và gây ra sự tách vạch bội (multiplet). Nhóm vạch kia tƣơng ứng với 3 proton còn lại trên vòng thơm. Trong khi đó, hợp chất HT2 cho 4 nhóm tín hiệu, một ở 8,247ppm (vân đôi - doublet) - có cƣờng độ tích phân bằng 1; một ở 7,879ppm (doublet) - có cƣơng độ tích phân bằng 1; một đám vạch ở 7,369ppm - 7,549ppm với cƣờng độ tích phân bằng 4; một ở 6,769ppm - 6,784ppm (vân 4- quartet) - có cƣờng độ tích phân là 1. Có thể thấy vân 4 này là của proton ở vị trí số 3 so với nhóm thế - khi đó nó chịu tƣơng tác spin - spin với 2 proton ở xung quanh và cho vân bội. Các proton ỏ vị trí số 2 và số 4 so với nhóm thế đều cho vân đôi vì có tƣơng tác spin - spin với 1 proton bên cạnh. Tuy nhiên, proton ở vị trí số 2 nằm gần nguyên tử oxi (có độ âm điện lớn) hơn, do đó sẽ nằm ở trƣờng yếu hơn, vì thế sẽ có độ dịch chuyển là 8,246ppm còn proton kia sẽ có 34 độ dịch chuyển 7,879ppm. Bốn proton ở vòng benzen bên cạnh nằm cách xa nhóm thế nên ít bị dịch chuyển và tƣơng ứng với đám vạch có cƣờng độ tích phân bằng 4 ở vùng 7,349ppm - 7,549ppm. Phổ 13CNMR một lần nữa xác nhận cấu trúc của các hidrazit thế. Dƣới đây là sơ đồ biểu diễn kết qua quy kết phổ: II/ Hoạt tính sinh học Kết quả thăm dò hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của các axít A1 và A2 đƣợc biểu diễn qua các bảng dƣới đây: Bảng 1: Ảnh hưởng của axít A1 đến tỉ lệ nẩy mầm của hạt lúa L8: Công thức mg/1 Tỉ lệ nảy mầm theo thời gian ủ Sau 24h Sau 48h Số hạt nẩy mầm/50 % so với đối chứng Số hạt nẩy mầm /50 % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 49,33±0,67 49,67±0,67 49,33+1,33 50,00±0,00 49,00±1,00 100,67 101,37 100,67 102,04 100,00 49,67±0,67 49,67±0,67 49,67±0,67 50,00±0,00 50,00±0,00 99,34 99,34 99,34 100,00 100,00 Nhƣ vậy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu, axít A1 có ảnh hƣởng rất ít đến sự nảy mầm của hạt lúa. 35 Bảng 2: Ảnh hưởng của axít A1 đến sự sinh trưởng của mạ L8 sau 4 ngày: Công thức mg/1 Sinh trƣởng của cây mạ Rễ Thân min % so với đối chứng Mm % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 28,12+1,32 24,26±1,65 25,61±1,48 22,43±0,97 17,53±2,09 160,41 138,39 146,09 107,95 100,00 6,30±0,29 5,86±0,27 5J6±0,08 6,18±0,32 5,56±0,55 113,30 105,39 103,59 111,15 100,00 Kết qủa này cho thấy, trong khoảng nồng độ nghiên cứu, axít A1 có khả năng kích thích sự phát triển của rễ và thân cây mạ. Bảng 3: Ảnh hưởng của axít A1 đến sự nẩy mầm của hạt đậu xanh: Công thức mg/1 Tỉ lệ nẩy mầm theo thời gian ủ Sau 24h Sau 48h Số hạt nẩy mầm/50 % so với đối chứng Số hạt nẩy mầm /50 % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 45,7±1,67 49,3±0,67 49,7±0,33 48,0±0,41 46,7±1,67 97,86 105,70 106,43 102,85 100,00 46,0±1,00 49,7±0,33 50,0±0,00 49,0±0,43 48,0±1,00 95,83 103,48 104,17 102,08 100,00 Nhƣ thế, ở các nồng độ 10, 20 và 50 mg/ lít, axít A1 có tác dụng kích thích sự nảy mầm của hạt đậu xanh nhƣng ở nồng độ l00mg/ lít, tác dụng đƣợc thấy lại là tác dụng ức chế nảy mầm. Bảng 4: Ảnh hưởng của axít A1 đến sự sinh trưởng của mầm đậu xanh: Công thức mg/1 Sinh trƣởng của mầm đậu xanh Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 min % so với đối chứng Mm % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 59,2±1,37 57,0±2,28 66,3±0,73 58,1±1,25 48,9±0,66 160,41 138,39 146,09 107,95 100,00 67,3±1,69 72,3±1,34 81,6±2,16 63,5+1,18 60,0±0,94 112,17 120,50 136,00 105,83 100,00 36 Kết qua thử nghiệm cho thấy, ở các nồng độ khảo sát, axít A1 có tác dụng lách thích mạnh sự phát triển của mầm cây đậu xanh, đặc biệt là ở nồng độ 20mg/ lít. Bảng 5: Ảnh hưởng của axít A2 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt lứa Nàng Thơm: Công Tỉ lệ nẩy mầm theo thời gian ủ thức Sau 12h Sau 24h mg/1 Số hạt % so với Số hạt % so với nẩy mầm/50 đối chứng nẩy mầm /50 đối chứng 100 40,2±0,63 26,67 43,3±0,63 87,75 50 44,5+0,76 84,44 46,2±0,49 83,87 20 47,5±0,56 107,7 50.0±0,65 102,04 10 48,0±0,33 97,4 50,0±0,24 102,04 ĐC 46,5±0,95 100 49,1±0,66 100,00 Bảng 6: Ảnh hưởng của axít A2 đến sự sinh trưởng của lúa Nàng Thơm sau 4 ngày: Công Sinh trƣởng của cây lúa thức Rễ Thân mg/1 mm % so với mm % so với đối chứng đối chứng 100 21,0±0,56 39,06 42,0±1,16 78,65 50 59,4±1,23 109,19 58,8+1,85 110,11 20 55,0±0,69 101,10 56,1±1,78 105,06 10 55,0±0,17 101,10 60,6±0,94 113,48 ĐC 54,4±1,57 100,00 53,4±1,53 100,00 Kết quả thử nghiệm cho thấy axít A2 có khả năng kích thích sự sinh trƣởng của thân và rễ cây mạ ở các khoảng nồng độ thích hợp (10, 20 và 50mg/lít). Tuy nhiên, ở nồng độ cao (l00mg/ lít) ảnh hƣởng đƣợc thấy lại là ảnh hƣởng kìm hãm sinh trƣởng rõ rệt. Với thực vật hai lá mầm (hạt đậu xanh), tác dụng của axít A2 ở vùng nồng độ khảo sát lại khác đi. Trên cả 2 mặt ảnh hƣởng đến sự nảy mầm cũng nhƣ ảnh hƣởng đến sự phát triển của mầm cây, ở vùng nồng độ thấp (10 và 20mg/ lít), axít A2 đều có tác dụng kích thích còn ở nồng độ cao (50 và l00mg/ lít), axít này lại có tác dụng ức chế nhƣ các kết qua chỉ ra dƣới đây: 37 Bảng 7: Ảnh hưởng của axít A2 đến tỷ lệ nẩy mầm của hạt đậu xanh: Bảng 8: Ảnh hưởng của axít A2 đến sự sinh trưởng của mầm đậu xanh Công thức mg/1 Tỉ lệ nẩy mầm meo thời gian ủ Sau 12h Sau 24h Số hạt Nẩy mầm/50 % so với đối chứng Số hạt nẩy mầm /50 % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 43,2±1,53 45,5±1,26 48,5±1,34 48,6±1,85 45,8±1,46 94,32 99,34 105,89 106,11 100,00 48,5±1,16 47,5±1,85 50,0±0,94 49,6±0,48 49,5±1,26 97,98 95,96 102,04 101,02 100,00 Công thức mg/1 Sinh trƣởng của mầm đậu xanh Ngày thứ 5 Ngày thứ 6 mm % so với đối chứng mm % so với đối chứng 100 50 20 10 ĐC 32,5±2,56 41,5±2,23 57,5±2,90 71,5±1,86 46,5±2,16 69,89 89,25 123,65 153,75 100,00 51,5±1,16 57,5+2,11 75,0±2,12 86,5±1,85 60,0±0,94 85,83 95,83 125,00 144,16 100,00 38 PHẦN V PHẦN V: KẾT LUẬN Các kết qua nhận đƣợc từ đề tài "NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA LIMONENE TRONG TINH DẦU ở VIỆT NAM" cho thấy, về cơ bản chúng tôi đã hoàn thành đƣợc mục tiêu đề ra: 1. Đã tiến hành phân tách tinh dầu từ vỏ bƣởi bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc. Sau đó chóng tôi đã phân lập đƣợc limonene từ tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất dƣới áp suất thấp. Limonene nhận đƣợc có các tính chất hoàn toàn trùng hợp với D-limonene của mẫu chuẩn. 2. Đã tiến hành tổng hợp đƣợc 08 dẫn xuất của limonene thuộc các nhóm chất ancol, axít, este, xêton và hidrazit thế. cấu trúc của các sản phẩm nhận đƣợc hầu hết đã đƣợc xác nhận thông qua các phƣơng pháp nghiên cứu vật lý hiện đại nhƣ phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân và (141 phƣơng pháp khối phổ hay sắc ký - khối phổ. 3. Chúng tôi cũng đã tiến hành thử thăm dò hoạt tính sinh học của các axít tổng hợp đƣợc về hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của chúng. Kết qua cho thấy cả 2 axít A1 và A2 đều có ảnh hƣởng đến sự nảy mầm cũng nhƣ sự phát triển của mầm và rễ cây non ở những nồng độ khảo sát (10, 20, 50 và l00mg/ lít). Trong đó, axít A1 có ảnh hƣởng rất mạnh đến sự phát triển của thực vật 2 lá mầm (mầm đậu xanh). Điều này cho phép chúng tôi nghĩ tới việc tiếp tục nghiên cứu để có thể sử dụng axít này và các sản phẩm chuyển hóa của nó trong lĩnh vực sản xuất nông nghiệp cũng nhƣ các lĩnh vực liên quan. Trong số các hợp chất mà chúng tôi tổng hợp đƣợc, 02 hợp chất dạng hidrazit thế có chứa bộ khung limonene - với cấu trúc đã đƣợc nghiên cứu, xác nhận một cách chắc chắn thông qua các phƣơng pháp vật lý hiện đại - lần đầu tiên đƣợc đề cập đến. Ngoài ra, hƣớng chuyển hóa limonene qua những hợp chất dạng axít ankyloxyaxetic cũng là một hƣớng chuyển hóa mới rất đáng quan tâm. Thông qua đó, đề tài đã góp phần làm phong phú thêm về những chuyển hóa hóa học của các hợp chất hữu cơ nói riêng và hóa học của các terpen nói riêng. Do điều kiện thời gian và kinh phí có hạn, chúng tôi chƣa tiến hành nghiên cứu, thăm dò đƣợc những ứng dụng thú vị khác của các hợp chất tổng hợp đƣợc nhƣ: thăm dò khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất; nghiên cứu khả năng sử dụng các dẫn xuất chứa oxy của limonene trong việc pha chế hƣơng liệu ... Theo chúng tôi, đây cũng là những hƣớng nghiên cứu hấp dẫn và có nhiều triển vọng. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đỗ Tất Lợi. Tinh dầu Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. Thành phố Hồ Chí Minh, 45 (1985). [2]. Lã Đình Mỡi, Lƣu Đàm Cƣ, Trần Minh Hội... Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, tập I, 83-108. Nhà xuất bản Nông nghiệp (2001). [3]. Lê Ngọc Thạch. Tinh dầu. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh (2003). [4]. Nguyễn Văn Đậu. Đóng góp vào việc nghiên cứu chuyển hóa limonene và cis-β-ocimen. Tóm tắt luận án Phó Tiến sĩ Hóa học. Đại học Tổng hợp Hà nội (1988). [5]. Vũ Ngọc Lộ, Đỗ Chung Võ, Nguyễn Mạnh Pha, Lê Thúy Hạnh. Những cây tinh dầu Việt Nam, 100-110. Nha xuất ban Khoa học Kỹ thuật, Hà nội (1996). [6]. Phùng Thị Bạch Yến. Nghiên cứu khai thác, sử dụng một số loại tinh dầu citrus Việt Nam. Luận án Phó Tiến sĩ. Đại học Bách Khoa Hà nội (1990). [7}. Nguyễn Văn Tòng, Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Tiến Công, Nguyễn Hữu Đĩnh. Tác dụng điều hòa sinh trƣởng thực vật của axít ơgenoxy axetic. Thông báo Khoa học. Đại học Sƣ phạm, Đại học Quốc gia Hà nội. số 2, 22 - 26 (1995). [8]. Nguyễn Đình Triệu. Các phƣơng pháp vật lý ứng dụng trong hóa học. NXB Đại học Quốc gia Hà nội (1999). [9]. André Loupy, Trần Kim Quy, Lê Ngọc Thạch. Phƣơng pháp học mới về tổng hợp Hữu cơ. Tủ sách Đại học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh (1995). [10]. Shalom Israelashvili and Erich Diamant. The peroxid - catalyzed addition of cacbon tetrachloride to d - limonene. J. Arm. Chem. Soc. Vol 74, 3185-6 (1952). [li]. Jose Alexander and G.S.Krishna Rao. Selected cleavage of limonene vía 10 -trichloromethyllimonene to 4 - methyl - A 3 - tetrahydroacetophenone. Chem. Ind. 707 (1975). [12]. William F. Erman. Metalation of limonene and syntheses of limonene denvatives. US Patent No. 3.658.925 (1972). [13]. James Verghese. The chemistry of limonene and of it's derivatives. Perfume and essential oil Record. Voi 59 (12), 876 - 886 (1968). [14]. James Verghese. The chemistry of limonene and of it's derivatives. Perfume and essential oil Record. Vol 60 (1), 25 - 35 (1969). [15]. R. Sudha, K. Malola Narasimhan, V. Geetha Saraswathy and s. Sankararaman. Chemo- and Regioselective Conversion of Epoxides to Carbonyl Compounds in 5 M Lithium Perchlorate - Diethyl Ether Međium. J. Org. Chem. Voi 61, 1877- 1879 (1996). [16]. David R. Adams, Surandra p. Bhatnagar, Richard c. Cookson, and Robert M. Tuddenham. Stmcture and Syntheses of a new Ketone from the Essentiol oil of Cedrus species. Tetrahedron Letters, No. 44, 3903- 3904 (1974). [17]. R.B. Bates, E.s. Caldwell, and H.p. Klein. Equilibration of p-Menthadienes in Acid and Base. J. Org. Chem. Voi 34 (9), 2615-17 (1969). [18]. G.L.K. Hunter, and Wlliam B. Brogden. Isomerization and Disproportionation of d- Limonene ôn Silica Gel. J. Org. Chem. Voi. 28,1679-82 (1963). 40 [19]. William F. Newhall, Wintert Haven. Quaternary ammonium derivatives of limonene. US Patent No. 3.564.046 (1971). [20]. Newhall. Limonene derivatives used in Growth inhibition and plant abscission processes. US Patent No. 3.960.539 (1976). [21]. A.P. Pieringer and W.F. Newhall. Derivatives of (+)-Limonene: Effect of chain length in n-Ankyl Quaternary Ammonium derivatives on Plant Growth - Retardant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 16 (3), 523-524 (1968). [22]. W.F. Newhall and A.P. Pieringer. Derivatives of (+)-Limonene: Detection and Translocation of Quaternary Ammonium plant growth retardants in Young Grapefruit and Bean seedlings. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol 15 (3), 488-491 (1967). [23]. A.T. Blomquist and Richard J. Himics.Terpene-Formaldehyde Reaction. EL D- Limonene. J. Org. Chem. Vol. 33, 1156-59 (1968). [24]. Chastain et al. Method of preparing selected monocyclic monoterpenes. US Patent No. 5.574.195 (1996). [25]. L.J. Audus. Plant Growth Substances. Vol.1, 66-103. Leonard Hill Book. London (1972). [26]. A.R. Piner. The chemistry of the terpenes, 42-81. Lond chapman and Hall (1960). [27]. Neirotti, Edison; Moscatelli Monica ... Antimicrobial activity of limonene. Arg. Biol. Tecnol. Vol. 39(2), 233-237 (1996). (CA Vol.125,163111a). [28]. Ouattara, Blaise; Simard, Ronald... Antibacterial activity of selected fatty acids and essential oils against six meat spoilage organisms. Agr. And Agr. Food Canada. Vol.37 (2,3), 155-162. (1997) (CA Vol.127, 305253r). PHỤ LỤC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐHSP THANH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ 2003 "NGHIÊN CỨU CHUYỂN HÓA LIMONENE TRONG TINH DẦU Ở VIỆT NAM" CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: THs. NGUYỄN TIẾN CÔNG Tp. Hồ Chí Minh 8/ 2004 1 I/ Ý NGHĨA MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Từ lâu, tinh dầu đã đƣợc sử dụng để pha chế và tổng hợp hƣơng liệu, làm gia vị, dƣợc liệu và nhiều mục đích khác nữa. Trong những qua trình chế biến này, nhiều thành phần tinh dầu, đặc biệt là các hợp chất dạng hiđrocacbon thƣờng không đƣợc khai thác sử dụng hết. Vì thế, việc tìm thêm các hƣớng sử dụng các hiđrocacbon của tinh dầu, trong đó có việc nghiên cứu chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất chứa oxi, nitơ... không những làm phong phú thêm cho hóa học các hợp chất thiên nhiên mà còn góp phần nâng cao giá tri sử dụng của tinh dầu. Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi trong đề tài này là limonene, một loại terpen chiếm hàm lƣợng rất cao trong tinh dầu các loài cây có múi (bƣởi, cam, quýt...) song hiện nay vẫn đang bị bỏ phí.. Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu chuyển hóa limonene - thành phần chính trong tinh dầu vỏ bƣởi -thành một số dẫn xuất của chúng ở dạng ancol, xeton, axít, este và hiđrazit thế. II/ NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI 1. Phân lập tinh dầu vỏ bƣởi từ vỏ qua bƣởi; 2. Phân tách limonene từ tinh dầu vỏ bƣởi; 3. Nghiên cứu chuyển hóa limonene thông qua các phản ứng hóa học (phản ứng Prins, phản ứng thế 2 nucleophin, phản ứng cộng gốc, phản ứng thủy phân, phản ứng este hóa...); 4. Nghiên cứu cấu trúc của các sản phẩm chuyển hóa thông qua các chuyển hóa hóa học và các phƣơng pháp vật lý hiện đại (phƣơng pháp phổ hồng ngoại, phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân, phƣơng pháp khối phổ); 5. Thăm dò hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất tổng hợp đƣợc. III/ NỘI DUNG ĐỀ TÀI 1/ Phần tổng quan Trong phần tổng quan, chúng tôi đã tổng kết các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng nhƣ về hàm lƣợng tinh dầu của một số loại cây có múi (bƣởi, cam, chanh) ở Việt Nam. Trong tinh dầu của các cây này, limonene luôn là một thành phần chính (hàm lƣợng của limonene trong tinh dầu bƣởi có khi đạt tới hơn 90%). Phần tổng quan cũng giới thiệu các kết qua nghiên cứu chuyển hóa và sử dụng limonene cũng nhƣ các dẫn xuất của nó ở Việt nam và trên thế giới. Các kết qua cho thấy limonene là một đối tƣợng lý thú đối với nhiều chuyển hóa hóa học và các dẫn xuất của limonene cũng không ngừng đƣợc quan tâm cả về mặt khoa học và thực tiễn. 3 2/ Phần thực nghiệm Phần thực nghiệm mô tả cách thức tiến hành các chuyển hóa hóa học và các phƣơng pháp nghiên cứu câu trúc, nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất tổng hợp đƣợc. Sau khi phân lập đƣợc limonene từ tinh dầu vỏ bƣởi, chúng tôi đã thực hiện các chuyển hóa hóa học theo sơ đồ chuyển hóa dƣới đây: SƠ ĐỒ CHUYỂN HÓA 4 Việc nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất tổng hợp đƣợc đƣợc tiến hành thông qua các kết qua đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ proton và cacbon 13, khối phổ thực hiện tại Trung tâm dịch vụ Phân tích thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh hay tại Viện Hóa học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà nội. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thăm dò hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của 2 axít tổng hợp đƣợc (do các chất này có cấu trúc thƣờng thấy của một auxin) đối với thực vật một lá mầm (hạt lúa) và thực vật hai lá mầm (hạt đậu xanh) thông qua phƣơng pháp thử mẫu trên các hộp pepti (có mẫu đối chứng). 3/Kết quả đạt đƣợc 3.1/ Phân lập limonene Sau khi tách tinh dầu vỏ bƣởi từ vỏ qua bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc, chúng tôi đã tiến hành chƣng cất thu lấy limonene dƣới áp suất thấp. Limonene thu đƣợc có nhiệt độ sôi, phổ hồng ngoại hoàn toàn trùng hợp với với những dữ liệu của mẫu D-limonene của hãng Meck bán trên thị trƣờng cũng nhƣ những dữ liệu đã công bố trên các tài liệu liên quan. 5 3.2/ Các kết quả chuyển hóa hóa học Limonene phản ứng với paraíocmandehit với sự có mặt của chất xúctác SnCl4 ƣơng dung môi CH2C12 cho 9-hydroxymetyl-p-menthadien-l,8. Ancol này đƣợc tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng bằng phƣơng pháp chƣng cất dƣới áp suất thấp. Nhiệt độ sôi và phổ hồng ngoại của ancol nhận đƣợc tƣơng đối trùng khớp với các dữ liệu đã đƣợc công bố. Sau khi chuyển hóa thành ancolat trong huyền phù natri/ toluen, chất này đƣợc cho phản ứng với axít monocloaxetic trong môi trƣờng kiềm, sau đó axít hóa để nhận đƣợc axít 2-(3-(4- metylxiclohex-3-enyl)but-3-enyloxy)axetic (axít Ai). Do cấu trúc khung limonene rất dễ tham gia vào các quá trình chuyển hóa hóa học, đặc biệt là trong môi trƣờng axít, vì vậy chúng tôi đã tiến hành phản ứng este hóa axít này bằng cách cho muối kali của nó tác dụng với C2H5Br trên chất mang silicagel. Mặc dù chƣa phân lập đƣợc axít và este nhƣng kết qua phân tích bằng phƣơng pháp GC - MS cho thấy những hợp chất này đã đƣợc tạo thành. Hƣớng chuyển hóa thứ hai mà chúng tôi thực hiện là cho limonene tham gia phản ứng cộng với cacbontetraclorua. Trong qua tình chƣng cất thu lấy sản phẩm, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bị tách HC1 để tạo thành 9-clometyllimonene. Sản phẩm nhận 6 đƣợc có nhiệt độ sôi tƣơng đối phù hợp với sản phẩm tƣơng tự đã đƣợc công bố trong tài liệu. Thủy phân 9-clometyllimonene trong môi trƣờng kiềm/ etylenglycol, chúng tôi thu đƣợc đồng thời 2 sản phẩm là axít 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-2-enoic (axít A2) và xeton 4- axetyl-l-metylxiclohex-l-en. Xeton đìu đƣợc tạo với 2,4-dinitrophenylhidrazin sản phẩm kết tinh có nhiệt độ nóng chảy 142°c, hoàn toàn phù hợp với dữ liệu đã công bố. Tuy nhiên, không có sự thống nhất về dữ liệu nhiệt độ nóng chảy của axít mà các tài liệu trƣớc đã công bố. Vì thế, chúng tôi đã nghiên cứu xác định cấu trúc chắc chắn của axít này thông qua các phƣơng pháp cộng hƣởng từ 1H và 13C và khôi phô. Kết qua cho thấy axít có cấu trúc nhƣ dự kiến và nhiệt độ nóng chảy của nó là 109°c. Axít A2 nhận đƣợc đƣợc tiếp tục chuyển hóa thành etyl este của nó qua phản ứng với etanol cùng với sự có mặt của hidroclorua khan làm xúc tác. Phổ hồng ngoại của sản phẩm nhận đƣợc đã phần nào xác nhận cấu trúc của nó. Xeton 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en cũng tiếp tục đƣợc phản ứng với hidrazit của các axít 3- metyl-phenoxyaxetic và 1-naphtyloxy axetic để tạo thành các hiđrazit thế tƣơng ứng. cấu trúc của các hidrazit thế tổng hợp đƣợc đã đƣợc xác nhận thông qua phổ cộng hƣởng từ proton 1H và cacbon 13 C của chúng. Đây là các 7 dẫn xuất mới, chƣa đƣợc thấy ƣơng các tài liệu tham khảo. 3.3/ Kết qua thăm dò hoạt tính sinh học Kết qua thử thăm dò hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của các axít Ai và A2 cho thấy cả 2 axít này đều có ảnh hƣởng đến sự nảy mầm cũng nhƣ sự phát triển của mầm và rễ cây non ở những nồng độ khảo sát (10, 20, 50 và lOOmg/ lít). Trong đó, axit A1 có ảnh hƣởng rất mạnh đến sự phát triển của thực vật 2 lá mầm (mầm đậu xanh). Điều này cho phép chúng tôi nghĩ tới việc tiếp tục nghiên cứu để có thể sử dụng axít này và các sản phẩm chuyển hóa của nó trong lĩnh vực sản xuất nông nghiệp cũng nhƣ các lĩnh vực liên quan. IV/ KẾT LUẬN Các kết qua đạt đƣợc cho thấy, đề tài đã thực hiện đƣợc các nhiệm vụ đặt ra: Phân lập đƣợc tinh dầu từ vỏ bƣởi; Phân tách limonene từ tinh dầu vỏ bƣởi; Thực hiện các chuyển hóa hóa học từ limonene và đã tổng hợp 08 dẫn xuất thuộc các nhóm chất ancol, xeton, axít cacboxylic, este và hidrazithế. Trong đó có 02 dẫn xuất thuộc loại hidrazit thế lần đầu đƣợc công bố. Các hƣớng chuyển hoa thành axít cũng chƣa thấy nói đến trong các tài liệu tham khảo 8 - Cấu trúc của các sản phẩm nhận đƣợc hầu hết đã đƣợc xác nhận thông qua các phƣơng pháp nghiên cứu phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân và khối phổ. Các kết qua trên phần nào làm phong phú thêm về hóa học của terpen nói chung và limonene nói riêng cả về cấu trúc và phƣơng pháp chuyển hóa hóa học. Các dẫn xuất thuộc loại axít cacboxylic của limonene đều thể hiện hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật trên 2 phƣơng diện: ảnh hƣởng đến quá trình nảy mầm và quá trình phát triển của mầm và rễ của cây non, cả với thực vật 1 lá mầm và thực vật 2 lá mầm. Trong đó axít A1 tỏ ra có hoạt tính kích thích sinh trƣởng khá mạnh ở các nồng độ 10 và 20mg/ lít. Điều đó cho thấy việc quan tâm nghiên cứu các ứng dụng mới của tài nguyên tinh dầu Việt Nam vẫn là một hƣớng đi hứa hẹn nhiều triển vọng.