Báo cáo thí nghiệm công nghệ protein – enzyme

TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA: KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ PROTEIN – ENZYME (Nhóm 2-Chiều thứ 4)  Giáo viên hƣớng dẫn: Th.S Trần Dƣơng Thùy  Nhóm thực hiện: 1. Nguyễn Vũ Vương 61303919 2. Trần Thanh Vinh 61303917 3. Phan Thị Trinh 61303859 4. Phan Thị Thanh Vy 61303413 Thành Phố Hồ Chí Minh, Tháng 10 Năm 2016 Bài 1 . SẢN XUẤT ĐẬU PHỤ I. Giới thiệu Đậu phụ (tiếng Trung: 荳腐 - đậu hũ) là một món ăn dân dã của người dân một số quốc gia Đông Á như Trung Hoa, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đông Nam Á như Việt Nam. Đậu phụ có nguồn gốc từ Trung Quốc Món này có nhiều cách gọi: đậu khuôn ở miền Trung và đậu hũ ở miền Nam. Đậu phụ là món ăn có thể giúp phòng chống xơ vữa động mạch, cũng thường được làm món ăn chay cho những người theo đạo Phật. Nguyên liệu làm đậu phụ là hạt đậu nành, được xay lên rồi ngâm vào nước. Tinh bột chảy vào nước thành hình dáng theo người làm tự tạo, bả được lọc ra ngoài. Các hình dáng thường thấy là hình vuông, tròn hay chữ nhật dài. Khi sản phẩm hoàn thành thì có thể sao chế thêm, như cắt thành hình chữ nhật rán với dầu. Thành một màu vàng bọc ngoài thêm gia vị thếm, là thành một bữa. Nếu không rán thì có thể cắt lát làm thêm phần phụ trong nồi canh rau hay cá. Giá trị dinh dưỡng cho mỗi 100 g (3,5 oz) [[Năng lượng]] 318 kJ (76 kcal) Carbohydrates 1.9 g Chất béo 4.8 g Chất béo bão hòa 0.7 g Chất đạm 8.1 g Chất khoáng Canxi (35%) 350 mg Sắt (42%) 5.4 mg Magiê (8%) 30 mg Natri (0%) 7 mg II. Thực hành Đậu hũ có thể sản xuất bằng phương pháp xay ướt hoặc xay khô 1. Quy trình công nghệ của phương pháp xay ướt Đậu nành Ngâm (Đãi vỏ ) Xay ướt Lọc thu dịch Đun sôi (950 c, khuấy liên tục) Kết tủa Định hình _ép Sản phẩm Nước Na2CO3 Nước Chất phá bọt Bã Rửa bã Thức ăn gia súc Chất gây tủa 2. Thuyết minh quy trình a. Nguyên liệu: lựa chọn đậu vàng hạt, to đều , không có sâu bọ, tạp chất . b. Ngâm : trong phương pháp xay ướt, hạt đậu phải qua giai đoạn ngâm, nhăm mực đích .Làm cho hạt hút nước trương lên , nước tác động lên các phân tử trong hạt  Xảy ra quá trình solvat  Liên kết trong đậu bị phá vở ( hình thành lớp áo nước giửa các tế bào )  Chuyển sang thể keo linh động nằm trong các tế bào hạt đậu Có 3 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình ngaamlaf thời gian, lượng nước, nhiệt độ ngâm  Tỉ lệ ngâm với nước là 1 : 2.5  Nhiệt độ 250c – 300c  Thời gian 3-4 giờ c. Xay Xay là quá trình cơ học phá vỡ tế bào nhằm giải phóng protein, lipit và các gluxid , có nước hòa tan và chuyển các chất này sang dạng huyền phù Yếu tố quan trọng trong giai đoạn này là lượng nước Tủ lệ là 1:6 Trong quá trình xay saponin sẽ tạo bọt . và gây ảnh hưởng tới quá trình sản xuất  Chiếm diện tích  Gây hại cho sản phẩm  Va đâp vào thành thiết bị  Giảm hiệu suất Sử dụng chất phá bọt 0.05% so với lượng đậu d. Lọc : lọc qua vải nhiều lần để loại bỏ triệt để bã e. Gia nhiệt Sử dụng nhiệt để phá các enzyme kháng trypxin và độc tố afltoxin. Diệt vi sinh vật , khử mùi tanh của đậu nành phá vỡ lớp solvat ( màng áo nước bên ngoài tế bào) Thời gian gia nhiệt càng nhanh càng tốt . thời gian trong phạm vi từ 5- 10 phút là tốt nhất kết hợp khuấy đảo liên tục chống khét f. Kết tủa Dùng muối ( CaSO4, MgCl, MgSO4, nước chua tự nhiên như nước cốt chanh giấm ) để thay đổi PH về vùng đẳng điện. kết hợp với nhiệt độ 95 0 c tới 1000c để gây biến tính protein tác dụng gây tủa của protein Dùng CaSO4.pha cao CaSO4 trong 200ml nước .cho vào một vật chứa rồi đổ mạnh sữa đã đun sôi và để nguội 850c vào . để yên 5 phút để tạo tửa Dùng nước chua: PH nước chua 4-4.5 .lượng nước chua chiếm 20%- 22% lượng sữa cần kết tủa g. Định hình – Ép Đưa hoa đậu vào khuông ép đã lót sẵn vải . Gấp vai ép, lấy vật nặng đè lên trên nhiệt độ tốt nhất 700c -800c 3. Kết quả thí ngiệm 3.1 hình ảnh thí nghiệm Sữa đun sôi Dịch lọc sau khi tủa Kết tủa sau khi lọc Đậu hũ thành phẩm Nhận xét cảm quan Đánh giá của nhóm thực hành Màu : màu trắng ngà Vị : hơi chát và chua nhẹ ( do còn ảnh của giấm và võ hạt ). Hơi béo Mùi :thơm của sữa .không có mùi khét Trạng thái : khối đậu chắc . vết cắt hơi thô. Không có lỗ khí . không mịn lắm 3.2 Xác định hàm lƣợng chất khô Tiến hành sử dụng máy đo độ ẩm . Đồ ẩm ban đầu của máy là 100% độ ẩm sau của máy là 38% Vậy độ ẩm của sản phẩm đậu hũ là Độ ẩm sản phẩm = 100% -38% =62% Độ ẩm đậu hũ là 62% 3.3 xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp kjendahl a. Nguyên tắc Tất cả các dạng nito có trong cơ thể hay các mô được gọi là nito tổng số. Nito có trong thành phần amino acid của protein là nito protein. Nito không có trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptid,ure và các dẫn xuất ure, purin và pirimidin là nito phi protein. Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị phân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Quá trình được thực hiện theo các bước sau: Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu R-CH-COOH + H2SO4 CO2+H2O+(NH4)2SO4 NH2 Bước 2: Cất đạm phản ứng xảy ra trong thiết bị cất đạm (NH4)2SO4 +2NaOH Na2SO4 +2NH3 +2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4 +H2SO4 dư Bước 3: Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH b. Kết quả và tính toán Gọi X là hàm lượng nitơ tính bằng g/kg Gọi a là số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 Gọi b là số NaOH 0.1 N tiêu tốn khi chuẩn điị H2SO4 thừa V là số ml mẫu đem vô cơ hóa 0.0014 là lượng gam nitow ứng với 1ml H2SO4 0.1 N F là hệ số hiệu chỉnh nồng độ đ NaOH 0.1 N Ta đo được kết quả a = 10 ml b = 4.6 ml V = 3 ml F = 1 Hàm lượng nito tính theo công thức X= ( ) = ( ) = 25.2 g/kg Vậy N(%)= 2.25 % Protein (%)= N(%) x 5.7 = 2.25 x 5.7 = 12.85 (%) Nhận xét . Hàm lượng protein trong đậu hủ tương đối cao . Sai số tương đối lương do quá trình thao tác và sai số dụng cụ 3.3 xác đinh hàm lượng chất béo theo phương pháp soxhlet Nguyên tắc Lipid trong nguyên liệu được trích ly bằng ether ethylic hoặc etrer dầu hỏa trên máy soxhlet . Xác định lượng lipid bằng cách tính lượng mẩu bị mấy đi sau khi trích ly hoặc cân khối lượng của chất béo thi được sai khi đuổi dung môi Tính toán kết quả Thực hiện định lượng lipid gián tiếp m : trọng lượng mẫu (g) c : trọng lượng giấy lọc +mẫu trước khi chiết (g) d: trọng lượng giấy lọc + mẫu sai khi chiết (g) kết quả thí nghiệm m = 2.79 g c = ( 0.78 + 2.79) = 3.57 g d = 2.696 g L(%)= ( ) = ( ) = 37.8 % Nhận xét . lượng lipid rất cao trong đậu hũ Có sai số cao do quá trình xấy mẩu chưa tuyệt đối . sai số thiết bị III. Kết luận Bằng phương pháp xay ướt đã tạo ra sản phẩm đậu hủ có chất lượng tốt về thành phầm dinh dưởng và cảm quan . Với hàm lượng protein 12.85% và hàm lượng chất béo 37.8 % trên thực nghiệm phòng thí nghiệm đã cho thấy giá trị dinh dưởng của đậu hũ là tốt và đáp ứng đủ nhu cầu cho người sử dụng Nhưng trong thực tế , với kinh nghiệm nhà nghề và kỹ thuật làm đậu hũ lâu năm của các hộ sản xuất và danh nghiệp thì thành phần dinh dưởng còn cao hơn và cảm quan cũng tốt hơn rất nhiều .người việc đáp ứng nhu cầu dinh dưởng cho người sử dụng thì còn có giá trị cảm quan cao hơn . Bài 2: THU NHẬN CHẾ PHẨM PROTEIN TỪ PHẾ LIỆU TÔM. GIỚI THIỆU CHUNG. Tôm và phế liệu tôm. Tôm là nhóm động vật thuộc giáp sát mười chân( Deccapoda) sống trong môi trường nước, phần lớn có kích thước lớn, phần đầu và ngực bọc trong vỏ giáp( giáp đầu ngực) có 3 đoi chân hàm, 5 đôi chân ngực( một số đôi đàu tiên biến thành càng) và 6 đôi chân bụng. Cơ thể gồm phần đầu ngực,bụng và tận cùng là telson. Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn kể đến phần thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận và một số tôm bị biến màu. Phế liệu tôm chứa nhiều chất dinh dưỡng, chủ yếu là các acid amin và các nucleotide. Đến nay người ta thường dùng phế liệu tôm làm thức ăn gia súc, hoặc tách chiết chitin/chitosan từ vỏ nhưng không thể nào giải quyết hết lượng phế thải tôm khổng lồ này; Một trong những hướng tận thu phế liệu tôm là thu nhận chế phẩm từ đầu tôm. Các loại chế phẩm protein.  Protein concentrated là một loại chế phẩm protein có hàm lượng protein tối thiểu là 65%.  Protein isolated giống chế phẩm trên nhưng hàm lương protein thực vật rất cao 90%. THỰC HÀNH. Quy trình công nghệ sản suất bột tôm. Đầu tôm Dd NaOH loãng Dd HCl đậm đặc Loại dịch Dd HCl Xay nhỏ Trích ly 20p Ly tâm 6000v/5p, thu tủa Tủa protein Ly tâm 4000v/7p Lọc Bã Tách béo, cặn. Ngiền Sấy ở 50oC Chế phẩm protein Bộ tôm Phân tích chế phẩm bột tôm. Cảm quan. Bột tôm thu được là dạng bột rời, không vón cục, màu cam đỏ, có màu thơm đặc trưng của tôm. Xác định ẩm (dùng máy đo ẩm tự động). Xác định hàm ẩm (bằng máy đo ẩm tự động) - Khối lượng mẫu đem đi xác định m = 0,161g - Độ khô 91,99%  độ ẩm 8,01% xác định nito tổng theo phương pháp Kjendahl. Hàm lượng nitơ trong mẫu được tính theo công thức: X= ( ) = ( ) = 0,0827(g/g mẫu) Trong đó: X : hàm lượng nitơ tính bằng g/l a= 10 : số ml đem hấp thụ b= 6,5 : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ thừa V: số ml mẫu đem vô cơ hóa ( mẫu rắn nên thay bằng khối lượng m= 0,0827g) 0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml thừa F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N  % Nitơ = 0,0827%  % Protein = 0.0827 x 6,25 = 0,5168 1. Hiệu suất thu nhận protein từ khối lượng tôm phế liệu ban đầu: H= . 100%= 0,0134% Nguyên liệu Ứng dụng bột tôm sản suất bánh phồng tôm. Đánh giá cảm quan bánh có màu ngả vàng và mùi thơ đặc trưng. Cân nguyên liệu Khuyâý trộn bột bánh Cắt bánh-Phơi sấy (dày 1.5-2mm) Làm nguội và làm lạnh Hấp bánh cách thủy (30-45 phút ) Gói bánh( túi PE) Rán hoặc nướng ở 150-165oC Bánh thành phẩm Bánh giòn tuy nhiên độ phồng ít chưa đạt do sau khi cân nguyên liệu và khuấy trộn bánh bột bị nhão và phải thêm một lượng lớn bột mì khiến tỉ lệ phối trộn nguyên liệu bị sai lệch. H1. Bánh phồng tôm sau khi hấp chín và cắt lát H2. Bánh phồng tôm sau khi sấy H3. Sản phẩm bánh phồng tôm sau khi chiên CẢM QUAN BÁNH PHỒNG TÔM Chỉ tiêu Bánh phồng tôm trƣớc khi chiên Bánh phồng tôm sau khi chiên Trạng thái Mặt bánh phẳng, không bị rạn nứt, độ dày khoảng 1.5-2 mm. Xốp đều không chai cứng. Mùi vị Đặc trưng bánh phồng tôm, không có mùi lạ. Mùi thơm đặc trưng bánh phồng tôm, không có mùi lạ. Màu sắc Trắng đục đến trắng ngà, cho phép có màu gia vị phớt hồng. Màu vàng, cho phép có màu gia vị phớt hồng. Tạp chất Không có tạp chất. Không có tạp chất. BÀI 3: THU NHẬN ENZYME PROTEASE TỪ Aspergillus oryzae I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1. Tổng Quan Về Enzyme Protease - Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO- NH-)n trong phân tử protein, thành các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1: Cấu tạo hình học của enzyme trypsin – một enzyme protease 2. Phân Loại Hệ enzyme thủy phân gồm một số loại chủ yếu sau: Protease gồm 2 loại:  Cathepsin  Calpain Enzyme Cathepsin: Hệ enzyme protease quan trọng nhất là cathepsin (là enzym thủy phân nằm trong lysosome), trong cá chúng hoạt động rất thấp, chủ yếu có trong thịt và nội tạng cá, nhưng ngược lại hoạt động mạnh ở các loài tôm, cua và nhuyễn thể. Enzym cathepsin quan trọng nhất là cathepsin D tham gia vào quá trình thủy phân protein nội tại của tế bào tạo thành peptide. Sau đó peptide tiếp tục bị phân hủy dưới tác dụng của cathepsin A, B và C. Hình 2: Bốn loại enzyme Cathepsin - Enzym cathepsin có vai trò chính trong quá trình tự chín của cá ở pH thấp và nồng độ muối thấp. Đều này giải thích lí do tại sao khi cá chết thịt cá co cứng sau đó mềm nhũn, nguyên chính là do khi cá chết do oxi không còn cung cấp cho cơ thể làm cho các cơ thịt hô hấp yếm khí sinh ra acid lactic từ đó pH giảm, tạo điều kiện cho cathepsin hoạt động phân giải protein cơ thể làm cho thịt cá trở nên mềm lại, nhưng enzym cathepsin bị ức chế hoạt động ở nồng độ muối 5%. Enzyme Calpain: Đối với quá trình tự phân giải cơ thịt cá được tìm thấy trong thịt, các loài cá có vây và giáp xác và điều này cho thấy enzym này chỉ hoạt động mạnh khi thủy sản chết và những loài mà hàm lượng canxi bên trong chúng nhiều như các loài nhuyễn thể, Ngoài ra, các enzym calpain tham gia vào quá trình làm gãy và tiêu hủy protein trong sợi cơ. Hình 3: Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme Calpain 3. Vai Trò - Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên . - Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh, - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm, 4. Nấm Mốc Aspergillus oryzae - Asp.Oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào) - Từ những sợi nằm ngang sẽ hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử - Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa, ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. Hình 4: Nấm mốc Asp. Oryzea ở dạng mô phỏng và dạng thực tế II. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 1. Thu Nhận Chế Phẩm Protein Thô Môi trường cám gạo Hấp khử trùng (1atm,30 phút) Đổ 5ml dịch bào tử vào môi trường cám gạo (lắc đều) Nuôi ở nhiệt độ phòng (30- 36 giờ) Chế phẩm thô Cho 5ml nước cất vào ống giống A.oryae (khuất nhẹ) 2. Thu Nhận Chế Phẩm Enzyme Bán Tinh Khiết - Cân 50g chế phẩm protein thô, xay nhuyễn hòa trong 200ml nước. - Khuấy đều và giũ ở nhiệt độ 3 – 50C trong 40- 45ph - Lọc qua vải thưa - Ly tâm 5000 v/ph trong 5ph - Chiết lấy dịch enzyme chứa protease. - Bảo quản dịch lọc trong tủ đông ở 40C - Lấy ethanol lạnh (98%) đổ từ từ dọc theo thành cốc chứa dịch enzyme đã làm lạnh theo tỉ lệ 1dịch enzyme : 3 ethanol lạnh khuấy rất nhẹ để ethanol hòa đều trong dịch enzyme. Sau dó để hỗn hợp này vào tủ lạnh - Để yên trong 30ph ở 3-40C - Gạn thu tủa, lấy tủa đem ly tâm với tốc độ 5000v/ph trong 15ph - Thu tủa vừa ly tâm - Bảo quản trong tủ đá cho những thí nghiệm tiếp theo III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 1. Xác Định Hàm Lƣợng Protein Bằng Phƣơng Pháp Bradford Xây dựng phương trình đường chuẩn protein ỐNG NGHIỆM 0 1 2 3 4 5 HÀM LƢỢNG ALBUMIN (µg) 0 10 20 30 40 50 OD595 nm 0.617 0.653 0.680 0.768 0.804 0.858 ΔOD595 nm 0 0.036 0.063 0.151 0.187 0.241 Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn protein là : y = 0.005x – 0.0117 ODmẫu = 0.829 ΔODmẫu = 0.212 Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có: 0.212 = 0.005x - 0.0117 X = (0.212 + 0.0117) / 0.005 = 44.74 (µg/ml) là hàm lượng protein có trong 0.1ml dịch chế phẩm ban đầu Từ đó ta tính được hàm lượng protein trong 1ml mẫu là 44.74*10 = 447.4 (µg protein/ml) Hàm lƣợng protein tổng có trong 10ml dịch enzyme Ct = C*V = 447.4*10 = 4474 (µg/ml) = 4.474 (mg protein/ml) Trong đó: - C: là hàm lượng protein có trong 1m dịch enzyem (µg protein/ml) - V: là thể tích dịch enzyme ( 10ml) Vậy hàm lượng protein trong 1ml mẫu là 447.4 (µg/ml) và trong 10ml dịch enzym là 4.474 (mg protein/ml) 2. Xác Định Hoạt Tính Của Chế Phẩm Enzyme Theo PP Anson Cải Tiến Xây dựng phương trình đường chuẩn ỐNG NGHIỆM 0 1 2 3 4 5 DD TYROSIN CHUẨN 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD690 nm 0.023 0.226 0.348 0.426 0.581 0.685 ΔOD690 nm 0 0.203 0.325 0.403 0.558 0.662 Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn protein là y = 1.2723x + 0.0404 ODmẫu thử 1.482 ODmẫu trắng 1.291 1.416 1.195 1.424 1.226 ODmẫu thử TB 1.441 ODmẫu trắng TB 1.237 ΔOD = ODmẫu thử TB - ODmẫu trắng TB = 1.441 – 1.237 = 0.204 Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có: 0.204 = 1.2723x + 0.0404 X=(0.204 - 0.0404) / 1.2723 = 0.129 (µmol tyrosin) Từ đó ta tính được hàm lượng tyrosin trong 1ml mẫu là 0.129 µmol tyrosin Hàm lượng tyrosin trong 0.1g chế phẩm enzyme (pha trong 100ml nước cất) là 0.129*100 = 12.9 (µmol tyrosin) Số đơn vị hoạt độ proteotylic trong 1ml dung dịch enzyme = (UI/ml) Trong đó: - A : là số đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml dung dịch enzyme - V: là thể tích toàn bộ hỗn hợp phản ứng ( 5ml dd casein + 1ml enzyme + 5ml TCA) - t: là tổng thời gian xảy ra phản ứng thủy phân (10ph) Hoạt tính tổng của chế phẩm enzyme = (UI/mg CP) Trong đó: - At : là hoạt tính tổng của chế phẩm enzyme - V : là thể tích định mức của hỗn hợp enzyme ( 100ml) Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme (UI/mg protein) Vậy : Số đơn vị hoạt độ proteotylic trong 1ml dung dịch enzyme là 0.1419 (UI/ml) Hoạt tính tổng của chế phẩm enzyme là 14.19 (UI/mg CP) Hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme là 3.171 (UI/ mg protein) Hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme bán tin khiết Trong đó: - He: hiệu suất thu hồi enzyme - At1: hoạt tính tổng của enzyme ở công đoạn 1 - Ati: hoạt tính tổng của enzyme ở công đoạn i Độ tinh sạch enzyme: Trong đó: - : độ tinh sạch enzyme - Ap1: hoạt tính riêng của enzyme ở công đoạn 1 - Api: hoạt tính riêng của enzyme ở công đoạn i IV. KẾT LUẬN Ƣu điểm của pp Bradford: - Hóa chất đơn giản ,ít tốn thời gian - Có độ nhạy cao có thể xác định được tới 1µg protein. Nhạy hơn pp Lowry gấp 4 lần - Ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein Nhƣợc điểm của pp Bradford - Phụ thuộc nhiều vào việc xây dựng đường chuẩn. Dẫn đến nếu đường chuẩn sai thì kết quả thí nghiệm sai - Phụ thuộc vào máy đo OD. Nếu trong cuvet có chứa tạp chất sẽ ảnh hưởng đến việc đo mật độ quang Kết quả thí nghiệm có sự sai khác lớn khi sử dụng các phương pháp xác để xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyem. Nguyên nhân: - Mẫu thí nghiệm có lẫn tạp chất khác - Khi đo OD lấy kết quả chưa thật sự ổn định - Thể tích hóa chất hút không chính xác - Thao tác thí nghiệm không đúng - Tính toán không chính xác BÀN LUẬN Bản chất hoạt tính enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một đơn vị thời gian càng lớn Hai nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme: - Đo lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành trong một đơn vị thời gian nhất định ứng với nồng độ enzyme xác định - Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định - Sau khi có chế phẩm enzyme bán tinh khiết người ta có thể tinh sạch enzyme bằng sắc kí lọc gel để có chế phẩm enzyme tinh khiết - Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE Một số phương pháp xác định hàm lượng protein khác: - Phương pháp Kjendal - Phương pháp Biuret - Phương pháp Lowry Ngoài thu nhận protease từ vi sinh vật, ngƣời ta còn có thể thu nhận từ - Vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) : protease, amylase,cellulase,pectinase, - Thực vật (đu đủ, dứa) : papain, bromalin, urease,.. - Động vật (gan, dạ dày bê) : tripsin,pepsin,tripsinogen, Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly - Tỉ lệ nước dùng để trích ly : gấp 2-3,5 lần so với lượng chế phẩm - Thời gian trích ly: thời gian càng lâu thì dịch chiết càng chứa nhiều tạp chất. thông thường khoảng 40 -45ph là thích hợp nhất - Dung môi trích ly: lựa chọn dung môi thích hợp với chất cần trích ly MỤC LỤC HÌNH ẢNH Hình 5: Chế phẩm enzyme thô trước và sau khi sấy khô ở 40oC Hình 6: Dịch lọc enzyme thô Hình 7: Dịch lọc enzyme thô trước khi ly tâm 1 Hình 7: Dịch lọc enzyme thô sau khi ly tâm 1 Hình 8: Tủa protein bằng ethanol lạnh Hình 9: Tủa protein trước khi ly tâm 2 Hình 10: Chế phẩm enzyme bán tinh khiết Hình 11: Ống nghiệm dùng để dựng đường chuẩn protein ( trái) và các ống nghiệm mẫu (phải) đã pha loãng ở 4 nồng độ 1, 10-1,10-2,10-3 theo phương pháp Bradford Hình 12: Ống nghệm dùng để dựng đường chuẩn tyrosin ( phải) và các ống nghiệm mẫu theo phương pháp Anson cải tiến ( trái) BÀI 4: CHIẾT TÁCH VÀ TINH SẠCH UREASE TỪ ĐẬU NÀNH I. Giới thiệu về enzyme urease 1. Tổng quan về enzyme urease - Urease là enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), phân nhóm amidase. Urease có số hiệu phân loại quốc tế là EC 3.5.1.5. Tên hệ thống là: Cacbamit amido hydrolase. Trong đó: số 3 chỉ nhóm chính – hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-N khác liên kết peptide, còn số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase), số 5 chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ. - Urease được ứng dụng rất nhiều trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước chấm. Trên thế giới, có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về enzym urease và và các đặc tính của chúng, tuy nhiên các bài nghiên cứu về urease từ các nguồn nguyên liệu đậu khác nhau cho các kết quả khác nhau về đặc tính urease. Điều này chứng tỏ urease từ các nguyên liệu đậu khác nhau có thể có một số khác biệt về tính chất. Còn ở Việt Nam chỉ mới có các nghiên cứu để tinh sạch urease, hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên cứu nào về các đặc tính urease từ nguyên liệu đậu nành Việt Nam. - Để có thể ứng dụng urease trong Y học và Thực Phẩm hiệu quả rất cần thiết phải nắm được các đặc tính urease.ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease và kit urease từ nước ngoài với giá thành rất cao. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một số đặc tính urease đậu nành hạt vàng Việt Nam: phân tử lượng của urease và chuỗi tiểu đơn vị, các thông số động học của urease. Tóm tắt đặc tính của enzyme urease Đặc tính Giá trị Trọng lượng phân tử Số trung tâm hoạt động / 1 phân tử Phân tử lượng mỗi trung tâm hoạt động pHopt pI Coenzyme Topt Chất kiềm hãm Cơ chất Tính xúc tác 483.000 dalton 3 – 4 14.000 dalton Khoảng pH 6,4 – 7,6 (tùy loại đậu) 5 – 5,1 Ni2+ Trong khoảng 45 – 50oC Kim loại nặng ( Ag+, Cu2+, Hg2+ ), borat, H2O2, acid ascorbic. Urea, thiourea, hydroxyurea Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối - Trong tự nhiên có hơn 200 loài vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme urease như H.pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitia, Bacillus pasterurii, Escherchia coliEnzyme urease cũng có ở dịch tiêu hóa của các động vật như trâu, bò, dê, chó. - Enzyme urease còn có nhiều trong các cây bậc cao, đặc biệt là các cây thuộc họ đậu như đậu rựa (Canavila ensiformis, jack bean), đậu nành (Glycine hispida) - Enzyme urease xúc tác cho phản ứng thủy phân ure, tạo thành khí cacbonic và amoniac theo phương trình sau: H2N C = O + H2O urease CO2 + 2NH3 H2N - Lợi dụng tính đặc hiệu của urease, người ta ứng dụng urease trong việc nhận biết sự có mặt của ure trong thực phẩm, nước giải khát lên men và trong sữa. II. Thực hành 1. Thu nhận bột enzyme urease thô: Hạt đậu Xay nhỏ Trích ly loại lipid Trích ly urease (12h) Chỉnh pH 7 Ly tâm (4000v/p, 15p) Hoặc lọc chân không Thu dịch trích ly M Đông khô (chân không, -40oC) Ete dầu hỏa (tỷ lệ 1g bột:2mL ete) Dung dịch EDTA 5.10-3M, Cystein 5.10-3 Lipid Bã Bột urease thô Lưu ý: các quá trình đều phải được thực hiện ở nhiệt độ lạnh, thấp hơn 4oC. 2.Tinh sạch sơ bộ enzyme urease Tiến hành thu nhận dịch trích ly urease giống như quy trình thu nhận đã trình bày ở trên với tỷ lệ bột : dung dịch trích ly là 12g: 100mL thu dung dịch M. Lấy dung dịch M pha loãng khoảng 20-30 lần để phân tích hàm lượng protein và hoạt lực urease. Dịch enzyme thô M tiếp tục được tiến hành tinh sạch bằng 2 phương pháp: - Tủa aceton: làm lạnh dịch trích ly rồi rót dung môi aceton đã làm lạnh đến -20oC theo tỷ lệ 60% cho chảy thành dòng theo thành cốc hay nhỏ từng giọt, khuấy nhẹ để hạn chế biến tính protein. Để lắng tủa trong 30 phút, ly tâm 4000v/p trong 10 phút. Tủa cho bay hết acetone trong tủ lạnh và sấy đông khô. - Tủa phân đoạn sunfate amon theo phương pháp sau: tất cả các công đoạn đều phải thực hiện ở 4oC. Tính toán lượng (NH4)2SO4 Dịch trích ly M Tủa (NH4)2SO4 20% bão hòa Để yên 30p, to phòng Ly tâm thu dịch Tủa (NH4)2SO4 55% bão hòa Ly tâm thu tủa Bột urease thô Để yên 30p, to phòng Hòa tan tủa Thẩm tích Đông khô III. Phân tích chế phẩm  Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford Xây dựng phương trình đường chuẩn protein ỐNG NGHIỆM 0 1 2 3 4 5 HÀM LƯỢNG ALBUMIN (µg) 0 10 20 30 40 50 ΔOD595 nm 0.673 0.69 0.716 0.739 0.765 0.79 Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn protein là : y = 0.002x + 0.669 ODmẫu = 1.354 ΔODmẫu = 0.766 Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có: 0.766= 0.002x + 0.669 X =(0.766 – 0.669) / 0.002 = 48.5 (µg/ml) là hàm lượng protein có trong 0.1ml dịch chế phẩm ban đầu y = 0.0024x + 0.6693 R² = 0.997 0.66 0.68 0.7 0.72 0.74 0.76 0.78 0.8 0 10 20 30 40 50 60 Từ đó ta tính được hàm lượng protein trong 1ml mẫu là 48.5*10 = 485 (µg protein/ml) Hàm lƣợng protein tổng có trong 10ml dịch enzyme Ct = C*V = 485*10 = 4850 (µg/ml) = 4.85 (mg protein/ml) Trong đó: - C: là hàm lượng protein có trong 1m dịch enzyem (µg protein/ml) - V: là thể tích dịch enzyme ( 10ml) Vậy hàm lƣợng protein trong 1ml mẫu là 485 (µg/ml) và trong 10ml dịch enzym là 4.85 (mg protein/ml).  Xác định hoạt tính urease thro phƣơng pháp nessler. Xây dựng phương trình đường chuẩn Nessler: ỐNG NGHIỆM 0 1 2 3 4 5 HÀM LƯỢNG NH3 (µg) 0 5 10 15 20 25 ΔOD595 nm 0.610 0.653 0.690 0.724 0.820 0.893 y = 0.0062x + 0.6408 R² = 0.9443 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 5 10 15 20 25 Từ kết quả trên ta tính được phương trình đường chuẩn NH3 là : y = 0.009x + 0.601 ODmẫu = 0.834 ΔODmẫu = 0.672 Ta xác định được hoạt tính của urease: *10 -3 1.4.10-3 UI/mL Trong đó: F: độ pha loãng m: khối lượng bột đông khô đem thử nghiệm (mg) mt: tổng khối lượng bột (mg) Vt: tổng thể tích dịch (mL) Tính hoạt tính tổng: At = A *100 = 1,4.10 -3 * 100 = 0.14 UI/mg Tính hoạt tính riêng: Ap = = 0.03 UI/mg Độ tinh sạch: Hiệu suất thu hồi: IV. Hình ảnh  Cảm nghĩ sau khi kết thúc môn thí nghiệm: Sau khi học xong môn này chúng em hiểu rõ hơn về các quy trình sản xuất đậu hũ, thu nhận chế phẩm bột tôm, thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae, chiết tách và tinh sạch Urease từu đậu nành và các ứng dụng trong đời sống. Bên cạnh đó chúng em được thực hành làm đậu hũ miếng và bánh phồng tôm, học được cách làm việc tập thểCảm ơn cô đã tận tình và giúp đỡ chúng em trong suốt môn học này.