Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp real - Time pcr

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHÚ DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh 09/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Ts. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN PHÚ DŨNG Cn. LƯU PHÚC LỢI Thành Phố Hồ Chí Minh - 09 / 2005 - 3 LỜI CẢM TẠ Z Y Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: ™ Cha và Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay. ™ Ts. Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất đề tài. ™ Thầy Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. ™ Các Thầy – Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ™ Các anh chị thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. ™ Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã cùng tôi chia sẻ vui buồn, thành công và thất bại trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005 Nguyễn Phú Dũng 4 TÓM TẮT Đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" được thực hiện tại phòng thí nghiệm CNSH – Trung tâm phân tích thí nghiệm – trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ ngày 15/3/2005 đến ngày 15/8/2005. Đề tài được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Phú Dũng thuộc lớp CNSH khóa 27 dưới sự hướng dẫn của Ts. Trần Thị Dung - trưởng Bộ môn CNSH. Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne. Bệnh đang hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới, gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người trồng vì chưa có thuốc phòng trị đặc hiệu. Mục đích của đề tài là xây dựng quy trình phát hiện PMWaV-1 trên chồi giống dứa Cayenne bằng cách khuếch đại đoạn gen HSP 70 của virus với phương pháp RT-PCR. Nội dung nghiên cứu bao gồm: ¾ Thu thập chồi giống dứa Cayenne. ¾ Thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. ¾ Áp dụng quy trình vừa xây dựng, giám định PMWaV-1 trên 90 chồi dứa Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng. Các kết quả thu được: ¾ Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa. ¾ Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho phản ứng. ¾ Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện PMWaV-1 ¾ Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp phòng trừ bệnh hiệu quả. 5 MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ.................................................................................................................. iii Tóm tắt .......................................................................................................................iv Mục lục........................................................................................................................v Danh sách các chữ viết tắt.........................................................................................vii Danh sách các bảng................................................................................................. viii Danh sách các hình.....................................................................................................ix Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2 Mục đích ..........................................................................................................2 1.3 Yêu cầu ............................................................................................................2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của cây dứa. ..........................................................................3 2.2 Phân loại...........................................................................................................4 2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam......................7 2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa ......................................................................9 2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam. .......13 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV...........................................................15 2.7 Gene HSP 70 của PMWaV-1.........................................................................16 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)..........................................17 2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................17 2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR .......................................19 2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer).............................................................19 2.8.2.2 Mg2+ .........................................................................................................................................19 2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs).............................19 2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) ......................................................................20 2.8.2.5 Taq – polymerase .......................................................................20 2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR.....................................................21 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR)...................................21 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing)...................................................24 6 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu. ......................................................................................25 3.1.1 Mẫu .......................................................................................................25 3.1.2 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................25 3.1.3 Hóa chất ................................................................................................26 3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA .............................................26 3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR........................................26 3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA .................................................27 3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA .................................................28 3.2 Phương pháp nghiên cứu...............................................................................28 3.2.1 Tách chiết RNA ....................................................................................28 3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA.............................................................29 3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR ................................................................30 3.2.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu của primer .................................................30 3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu .......................................................30 3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp.............................................31 3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR......................31 3.2.4 Điện di sản phẩm RT-PCR ...................................................................31 3.2.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR............................................................32 3.2.6 Giám định chồi giống dứa.....................................................................32 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả ly trích RNA.....................................................................................33 4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR............................................................34 4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer ..............................................34 4.2.2 Kết quả xác định chu kỳ nhiệt tối ưu ....................................................36 4.2.2 Kết quả xác định nồng độ primer thích hợp..........................................38 4.2.3 Kết quả xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. .................39 4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự ..........42 4.4 Kết quả giám định chồi giống dứa ................................................................46 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận. ........................................................................................................49 5.2 Đề nghị ..........................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................50 PHỤ LỤC..................................................................................................................53 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : base pair cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphophate ddNTP : Dideoxyribonucleotide triphophate DNA : Deoxyribo nucleic acid ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay HSP 70 : Heat shock protein 70 mRNA : messenger Ribonucleic acid NCBI : National Center for Biotechnology Information Nu : Nucleotide PCR : Polymerase Chain Reaction PCV : Pineapple Closterovirus PMWaV-1 : Pineapple mealybug wilt associated virus – 1 RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TBIA : Tissue Blotting Immuno Assay Taq-polymerase : Thermos aquaticus - polymerase Tm : Melting temperature 8 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát............30 Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 ...............................34 Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất ................35 Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226.........................36 Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR ...................................................42 Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCR ..........................44 Bảng 4.6: Kết quả phân tích BLAST của 2 trình tự D1, D2..........................46 Bảng 4.7: Tổng kết giám định PMWaV-1 trên chồi dứa...............................47 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Cây dứa ................................................................................................ 3 Hình 2.2: Dứa Cayenne........................................................................................ 7 Hình 2.3: Cây dứa Cayenne bị héo đỏ đầu lá .................................................... 10 Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá ...................................................... 10 Hình 2.5: Rệp xám (Dysmicoccus neobrevipes), rệp hồng (Dysmicoccus brevipes) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa ....................... 11 Hình 2.6: Sự cộng sinh của kiến đầu to (Pheidole megacephala) với rệp sáp .. 12 Hình 2.7: Phản ứng PCR.................................................................................... 18 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 22 Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm...................................... 25 Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226 ......................................... 27 Hình 3.3: Thang DNA........................................................................................ 28 Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA............................................. 33 Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt........................................... 37 Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp....................................... 39 Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp ................................. 40 Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1................................. 41 Hình 4.6: Kết quả giám định PMWaV-1 trên 10 mẫu chồi dứa Thái Lan......... 47 10 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây dứa (Ananas comosus) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng trên thế giới. Ngoài giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao, cây dứa còn được xem là hoàng hậu của các loại quả vì có hương vị thơm ngon và rất hợp khẩu vị của người phương Tây. Bên cạnh đó, dứa còn được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều sản phẩm chế biến: dứa hộp, dứa khoanh, nước dứa cô đặc, điều chế bromelin... nên hiện nay, dứa đang được xem là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Về mặt trồng trọt, cây dứa vốn không kén đất, các vùng gò, đồi, đất xấu, nghèo dinh dưỡng... đều có thể trồng dứa. Vì vậy ở nước ta, từ những vùng đồi khô hạn đến các vùng chịu nhiều thiên tai, gió bão, nắng nóng, từ vùng trung du bán sơn địa ở miền Bắc đến những vùng đất nhiễm phèn, chua, mặn ở miền Nam đâu đâu cũng trồng được dứa. Chính vì vừa là một loại cây công nghiệp có giá trị cao, vừa thích hợp phát triển qui mô ở những vùng đất xấu, kén cây trồng nên có thể nói, đối với nước ta cây dứa chứa đựng một tiềm năng kinh tế - xã hội rất lớn. Trong các giống dứa chính, cây dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm phù hợp với công nghệ chế biến đồ hộp (quả lớn, mắt cạn, cùi nhỏ) nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, dứa Cayenne chiếm 80% diện tích trồng dứa trên toàn thế cầu. Ở nước ta, do trước đây dứa Cayenne ít được trồng phổ biến nên từ năm 1998 đến nay, Chính phủ và các địa phương đã đầu tư nhiều tỷ đồng để nhập chồi dứa Cayenne từ Trung Quốc, Thái Lan... nhằm tăng diện tích trồng dứa, mở rộng các vùng dứa nguyên liệu cho chế biến trong nước. Ở miền Nam, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang nằm trong chương trình cung cấp giống cây, con chất lượng cao của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cây dứa Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng nhiễm bệnh wilt - bệnh héo đỏ đầu lá rất cao. 11 Bệnh héo đỏ đầu lá là một bệnh rất nghiêm trọng và phổ biến ở các vùng trồng dứa nói chung, đặc biệt gây hậu quả nặng nề đối với dứa Cayenne nói riêng. Theo những nghiên cứu gần đây, bệnh do 1 loại virus thuộc họ Closterovirus được gọi là Pineapple Mealybug Wilt associated Virus (PMWaV) gây ra. Tuy tác nhân lây truyền của virus này là rệp sáp (mealybug) nhưng mầm bệnh vẫn có thể truyền sang đời sau qua chồi giống. Hiện nay, các phương pháp thông thường không thể xác định được chồi giống mang mầm bệnh mà chỉ khi trồng đến giai đoạn sắp thu hoạch, cây mới phát bệnh, gây thiệt hại rất lớn cho người trồng. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" nhằm xây dựng một phương pháp hữu hiệu để kiểm tra virus PMWaV gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa, đồng thời là cơ sở cho những nghiên cứu kế tiếp hướng tới mục tiêu cung cấp chồi giống dứa sạch bệnh cho việc và phát triển các vùng dứa Cayenne. 1.2 Mục đích Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR. 1.3 Yêu cầu - Tách chiết RNA tổng số từ mẫu dứa. - Khảo sát các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer, số chu kỳ thích hợp để thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1. - Giải trình tự đoạn khuếch đại để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm. - Giám định PMWaV-1 trên chồi dứa các giống Thái Lan, Trung Quốc, Lâm Đồng 12 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của cây dứa Cây dứa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Châu Mỹ, được tìm thấy lần đầu tiên bởi Christopher Columbus khi ông cùng các thủy thủ đặt chân lên đảo Guadeloupe năm 1943. Ở cuối thế kỷ 16, cây dứa được du nhập vào châu Á và đến cuối thế kỷ 17, nó đã được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới trên thế giới. Ở Việt Nam, cây dứa đã được du nhập và trồng từ hơn 130 năm trước. Dứa được trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam (75,43% tổng diện tích dứa cả nước), trong đó các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long chiếm 69,36% diện tích dứa cả nước (Đường Hồng Dật, 2003) Cây dứa có lá hình ống máng, có gai, chiều dài lá tương đối đồng đều, phân bố đều, xòe ra tứ phía hình hoa thị. Do có nguồn gốc là cây khí sinh nên hệ rễ dứa cắm xuống đất khá cạn và yếu. Trên thân ở nách lá có một số chồi. Chồi dứa cũng như thân chính có nhiều rễ khí sinh sẽ bật thành rễ ngầm khi tiếp xúc với đất, do đó người ta dùng chồi dứa để nhân giống, không dùng hạt. Quả dứa phức hợp hình chóp cụt, giữa có lõi (thực chất là phần nối tiếp của thân chính), trên đầu quả còn có chồi gồm nhiều lá ngắn (gọi là chồi ngọn) cũng được dùng để nhân giống. Hình 2.1: Cây dứa 13 Dứa là cây thân thảo lâu năm. Sau khi thu hoạch trái thứ nhất, các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước, cũng cho một trái. Nhiều thế hệ sinh trưởng có thể tiếp nối nhau như vậy, nhưng trong thực tế đối với nhiều giống dứa, thu hoạch hai hay ba lứa thường không có lợi lắm do cây thoái hóa, trái nhỏ dần và không đồng đều. Dứa sinh trưởng và ra hoa tốt ở 20 – 30oC, lượng mưa hàng năm khoảng 1000 - 2000 mm nên rất thích hợp với điều kiện khí hậu của nước ta với nhiệt độ bình quân là 22oC và lượng mưa bình quân 1300 - 1500 mm/năm. Về thổ nhưỡng, dứa thích hợp với đất đồi, đất badan, thậm chí đất xấu. Đặc biệt với đất phèn, không thể trồng lúa, trồng hoa màu nhưng trồng dứa lại rất tốt. Dứa có khả năng chống xói mòn, giữ màu cho đất nếu trồng với mật độ hợp lý (45.000 - 65.000 cây/ha). Cây dứa lại bảo đảm cho thu hoạch chắc chắn vì dứa không có hiện tượng ra hoa khó, rụng đài như nhiều loại cây ăn quả khác nên năng suất ổn định, không có hiện tượng mất mùa. Như vậy, ngoài vùng đồng bằng chúng ta có thể trồng dứa trên toàn bộ vùng đất đồi có độ dốc dưới 20 độ với khoảng 8.700 ha ở miền Bắc, hơn 10.000 ha ở miền Trung, Tây Nguyên và hàng ngàn hecta đất phèn ở Nam Bộ. 2.2 Phân loại Dứa có tên khoa học là Ananas comosus thuộc: Chi: Ananas Merr Họ: Bromeliaceae Bộ: Farinosae Theo Trần Thế Tục (2001), các giống dứa đang được trồng hiện nay được chia thành 3 nhóm chính: dứa Cayenne, dứa Queen và dứa Spanish. * Nhóm dứa Cayenne Lá dài và dày, không gai hoặc có ít ở đầu chóp lá. Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước, vỏ mỏng nên dễ dập, cây đẻ yếu, xử lý ra hoa khó và dễ nhiễm bệnh. 14 Tuy nhiên, quả to (nặng bình quân 1,5 - 2,0 kg) có dạng hình trụ, mắt rất nông nên rất phù hợp cho việc chế biến đồ hộp. Thịt vàng nhạt, có vị chua. * Nhóm dứa Queen Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi cứng, do đó ít hư hỏng khi vận chuyển xa. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Cây có hệ số nhân giống cao nhưng có khuyết điểm là quả nhỏ, dạng hơi bầu dục nên khó xử lý trong chế biến, đóng hộp, hạn chế khả năng xuất khẩu. * Nhóm dứa Spanish Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng. Quả ngắn, kích thước to hơn dứa Queen nhưng bé hơn so với nhóm dứa Cayenne. Thịt quả màu vàng trắng không đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Dứa Spanish có chồi cuống nhiều làm ảnh hưởng đến phẩm chất quả. Cũng theo tài liệu "Kỹ thuật trồng dứa " của Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2001), thì ở nước ta có các giống dứa phổ biến sau: * Dứa Phú Thọ Viện Cây Ăn Trái ở Phú Hộ gọi giống này là giống Queen cổ điển, vì có những đặc tính điển hình nhất của Queen, trái nhỏ dù bón nhiều phân, nặng trung bình 700 - 800g / trái. Mắt nhỏ, gai ở rìa lá nhỏ và cứng. Thịt vàng giòn rất thơm, cho nên là nguyên liệu tốt để chế biến đồ hộp. Thậm chí ép các giống dứa khác người ta cũng thường pha thêm nước dứa Hoa Phú Thọ để cho vàng hấp dẫn hơn. Có rất nhiều chồi nách và không có chồi cuống nhưng gầy yếu, khó ra hoa vụ sau nên vườn dứa Phú Thọ chóng bị còi, ngay vụ thứ hai năng suất đã thấp và phá đi để trồng lại có thể kinh tế hơn. Dứa Phú Thọ chịu được đất xấu, giỏi chịu đất chua, rất dễ ra hoa, có khi chỉ 4 - 5 tháng sau khi trồng đã ra hoa, 4 - 5 tháng sau khi ra hoa sẽ chín. Xử lý bằng ethylen dễ đạt 100% cây ra hoa. Xử lý xong một vài giờ sau gặp mưa vẫn ra hoa tốt. Nhược điểm lớn nhất là trái nhỏ, năng suất thấp, độ chua cao và ít nước nên dùng để ép nước thì không có lợi. Giống dứa Hoa Phú Thọ trồng phổ biến ở vùng trung du Bắc Bộ, và được coi là một giống quảng canh. 15 * Dứa Na Hoa (Hoa Bali) Giống này có đủ đặc tính của dứa hoa, tức là có mắt nhỏ lồi, khi chín da trái màu vàng, thịt vàng. Lá ngắn và to, trái to hơn dứa Hoa Phú Thọ, nặng trung bình 1 kg/trái ở miền Bắc và 1 - 1,5 kg/trái ở miền Nam. Nước cũng nhiều hơn và khi chín muồi thì thịt dứa hơi có mùi thối. Nhiều chồi cuống và ít chồi nách, chỉ cần tỉa chồi một cách thích đáng vụ thứ hai vẫn cho trái to. Ở Phú Hộ người ta trồng quanh nhà giống này, có thể dễ dàng giữ 4 - 5 năm, trong khi dứa Phú Thọ chỉ sau 2 - 3 năm thì không cho trái nữa. Chất lượng vẫn tốt nếu thu hoạch kịp thời. * Dứa Ta Spanish (dứa nếp, dứa mật) Về mặt thực vật học, lá tương đối mỏng, thân dài có khi bò ngang mặt đất, ít chồi nách và chồi cuống. Trái ngắn, khối lượng nhỏ hơn dứa Cayenne. Chất lượng và năng suất dứa Ta thấp. Dứa Ta sống lâu, chịu được bóng râm và có vỏ dày, dễ dàng trong vận chuyển. Năng suất dứa Ta cao hơn dứa Hoa và thấp hơn dứa Cayenne, về chất lượng thì thấp hơn cả hai. * Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức Dân địa phương gọi là khóm. Một số tác giả liệt giống này vào cùng giống Na Hoa. Trong điều kiện khí hậu ở miền Nam, cây sinh trưởng mạnh và trái cũng có kích thước lớn hơn so với ở miền Bắc. So sánh giữa khóm Kiên Giang và khóm Bến Lức, có thể nhận ra một số đặc điểm khác nhau như trái khóm Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt trái lớn hơn và thịt trái nhiều hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. * Dứa Cayenne Đặc điểm chung của dứa Cayenne là lá dài không gai, dày, lòng máng sâu, chậm ra hoa, trái to (to nhất có thể đạt 3 - 4 kg/trái). Khi chưa chín, trái màu xanh đen, khi chín chuyển sang đỏ da hồng, khác với dứa Hoa khi chín màu vàng. 16 Hình 2.2: Dứa Cayenne Dứa Cayenne chứa rất nhiều nước, vỏ lại mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển đi xa. Tuy nhiên, nước lại có tỷ lệ đường cao, vị chua nhẹ (acid trong dứa Cayenne thấp hơn dứa Hoa), mùi thanh, rất hợp khẩu vị người phương Tây. Mắt dứa Cayenne lại rất cạn, gọt vỏ xong không cần lấy mắt có thể ăn ngay. Những ưu điểm trên rất thuận lợi cho việc chế biến, đóng hộp qui mô công nghiệp nên dứa Cayenne là nguyên liệu chính cho ngành công nghịêp chế biến - xuất khẩu dứa và hầu như toàn bộ diện tích dứa Cayenne ở nước ta hiện nay đều là vùng nguyên liệu của các nhà máy chế biến dứa. 2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam Theo tài liệu hội thảo của Viện Nghiên Cứu cây Ăn Quả Miền Nam, trong những năm gần đây sản lượng dứa xuất khẩu của thế giới dao động khoảng 12,15 - 13,7 triệu tấn/năm. Châu Á có sản lượng dứa xuất khẩu lớn nhất, chiếm 52% sản lượng dứa thế giới, tiếp theo là Châu Mỹ (31%), Châu Phi (15,4%), Châu Âu và Châu Đại Dương chỉ chiếm 1,4%. Các sản phẩm chế biến của dứa được lưu thông trên thế giới dưới dạng dứa hộp và nước dứa. Dứa hộp gồm có dứa khoanh, dứa rẻ quạt, dứa miếng, dứa nghiền. Nước dứa gồm nước dứa cô đặc và nước dứa thường. Trong đó các nước sản xuất và 17 xuất khẩu dứa nhiều nhất là Philippines, Thái Lan, Dominica, Honduras, Mexico, Costarica, Malaysia… Còn các nước là thị trường tiêu thụ dứa chính trên thế giới gồm: Nhật, Italia, Anh, Pháp, Đức, Hà Lan, Canada, Mỹ, Tây Ban Nha, Bỉ… Ở Việt Nam, theo Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (1996) thì diện tích trồng dứa toàn quốc đạt 36.541 ha. Trong đó, diện tích của các tỉnh miền Bắc là 9.675 ha (chiếm 26,48%), diện tích dứa của các tỉnh miền Nam là 26.866 ha (chiếm 73,52%), trong đó diện tích dứa của các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long lên đến 22.787 ha, chiếm đến 62,36% diện tích dứa cả nước. Một số tỉnh trồng nhiều dứa trong nước là: Kiên Giang: 12.006 ha, Minh Hải: 4704 ha, Tiền Giang: 3889 ha, Thanh Hoá: 3097 ha …… Về sản lượng dứa tươi, những năm gần đây cả nước đạt 234.000 tấn/năm (Tài liệu thống kê ngành Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 1996). Tốc độ tăng sản lượng đạt khoảng 10,7% / năm. Vào những năm đầu thập niên 1990, khi thị trường tiêu thụ chính của nước ta là Đông Âu tan rã thì ngành dứa bước vào giai đoạn suy thoái. Tuy nhiên, bất chấp sự cạnh tranh gay gắt của những nước xuất khẩu dứa khác, sự mở rộng thì trường xuất khẩu và tốc độ tăng trưởng sản lượng đều đặn trong những năm gần đây là những tín hiệu đáng mừng cho thấy ngành sản xuất dứa của Việt Nam đang phục hồi dần (Đường Hồng Dật, 2003). Dứa tươi Việt Nam hầu hết được tiêu thụ ở thị trường nội địa còn với dứa chế biến thì xuất khẩu là chính, thị trường nội địa chiếm tỷ trọng không đáng kể (2 - 5%). Trong những năm gần đây, các sản phẩm dứa chế biến của Việt Nam đã được xuất khẩu đi nhiều nước với nhiều mặt hàng khá đa dạng. Theo số liệu của Tổng Công Ty Rau Quả Việt Nam (VEGETEXCO), năm 2000, Tổng Công Ty đã xuất khẩu được 4.967 tấn, năm 2001 đạt 5.269 tấn sản phẩm. 18 2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa * Tác hại Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới. Xuất hiện và gây thiệt hại nặng cho dứa ở Hawaii từ năm 1900, đến nay, theo Sether D.M. và Hu J.S. (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore, Brazil, Jamaica, Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam. Đây là bệnh rất nguy hiểm, ảnh hưởng lớn đến nghề trồng dứa khi bệnh xuất hiện và phát triển. Không như các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến trùng đều có các loại thuốc phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001). Virus gây bệnh được bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi giống và tàn dư của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh lại thường chỉ biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho người trồng dứa. Năm 1920, ở Hawaii, sản lượng dứa bị giảm thấp đáng kể do sự lan tràn mạnh mẽ của bệnh đã làm nhiều nhà sản xuất phải bỏ nghề trồng dứa. Còn ở Cuba hiện nay, bệnh héo đỏ đầu lá đã làm giảm 40% sản lượng dứa hằng năm (Borroto E.G. và ctv, 1998). * Triệu chứng Theo Nguyễn Văn Kế (2002), cây bị héo đỏ đầu lá thì lá bị đỏ, bắt đầu từ lá phía dưới đỏ lên, lá như bị mất nước, vặn vẹo, bìa lá cuốn về phía dưới, đầu lá cong xuống đất, chuyển qua nâu rồi hoại dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hư hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi như một cái ống. 19 Hình 2.3: Cây dứa bị bệnh héo đỏ đầu lá Bệnh héo đỏ đầu lá thường trải qua 4 giai đoạn phát triển: xâm nhiễm, lây lan, gây héo lá và gây chết cây. Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất. Hậu quả là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thương phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải, 2001) Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá 20 * Nguyên nhân Theo Gunashinge và German (1989), bệnh héo đỏ đầu lá do 1 loại virus được đặt tên là Pineapple mealybug wilt associated virus (PMWaV) gây ra. Virus này thuộc họ Closterovirus phân nhóm B và có 2 dòng gây bệnh đã được phát hiện là PMWaV-1 và PMWaV-2 (Sether D.M. và Hu J.S., 2001) Có 2 loại rệp sáp là môi giới trung gian truyền bệnh héo đỏ đầu lá: Dysmicoccus brevipes và Dysmicoccus neobrevipes. Theo Nguyễn Văn Kế (2002), hai loại rệp này đã được tìm thấy ở Việt Nam, loại rệp màu xám (Dysmicoccus neobrevipes) hay bám ở mắt quả, ở lá. Còn loại rệp màu hồng (Dysmicoccus brevipes) thường bám vào rễ, vào các phần bên dưới của cây. Hình 2.5: Rệp xám (Dysmicoccus neobrevipes), rệp hồng (Dysmicoccus neobrevipes) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa. (Nguồn: 21 Sether D.M. và Hu J.S., (2002) còn nghiên cứu thấy nếu không có sự hiện diện của rệp thì dù cây có mang PMWaV cũng không xuất hiện triệu chứng bệnh. Từ đó, các ông đặt giả thuyết rằng bệnh héo đỏ đầu lá khi phát sinh có liên quan đến chất độc trong nước bọt của rệp - rệp sáp không chỉ là trung gian lây truyền bệnh mà còn là nguyên nhân gây bệnh. Bên cạnh rệp sáp, một loại côn trùng khác cũng ảnh hưởng đến sự lây lan và phát tán của bệnh héo đỏ đầu lá là kiến. Kiến và rệp có thể sống cộng sinh với nhau. Kiến ăn các chất mật do rệp tiết ra, đổi lại kiến làm tổ cho rệp và tha rệp đi phát tán khắp nơi. Nhờ có các tổ do kiến tạo ra, rệp được bảo vệ khá chắc chắn trước sự ảnh hưởng của thời tiết. Với sự cộng sinh này, kiến thúc đẩy sự phát tán rệp, từ đó làm lây lan virus gây bệnh. Có 3 loại kiến chính trên những vùng trồng dứa sống cộng sinh với rệp sáp: Pheidole megacephala (kiến đầu to), loài này chiếm ưu thế ở những vùng có cao độ dưới 700 m; Iridomyrmex humilis (kiến Argentina), loài này sống ở vùng có cao độ trên 600m và ở những vùng đất thấp, khô ráo thì Solenopsis germinata (kiến lửa) là loài nổi trội nhất (Rohrbach K.G. và ctv, 1988) Hình 2.6: Sự cộng sinh giữa kiến đầu to (Pheidole megacephala) và rệp sáp (Nguồn: t-star/mealybug.htm) Mealybug 22 * Biện pháp phòng trừ Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2002), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như: - Chọn giống từ vùng ít bệnh. - Khử chồi bằng cách nhúng vào dung dịch thuốc trừ sâu như: Bi58, Supracid trong 5 phút, dựng đứng chồi lên cho thuốc tác dụng vào tận nách lá. - Trước khi trồng, khử đất bằng Diazon để trừ kiến và các ổ rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến. - Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp và kiến. Tuy nhiên, những biện pháp này chỉ có tác dụng kiểm soát trung gian gây bệnh, tránh bệnh lây lan, phát tán chứ không thể phòng trừ bệnh triệt để. 2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam Tuy bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện từ rất lâu trên thế giới, nhưng mãi đến gần đây, các nghiên cứu về bệnh mới đạt được những thành tựu mong muốn. - Năm 1989, German và Gunasinghe đã tìm thấy những thể tương tự như Closterovirus ở những cây dứa bị héo đỏ đầu lá ở Hawaii và đặt tên là Pineapple closterovirus (PCV). - Kháng thể đa dòng (Polyclonal Anti-body – PAb) sản xuất ở Hawaii (Ullman D.E. và ctv, 1989) và Australia (Wakmen W. và ctv, 1995) được dùng để phát hiện PCV. Tuy nhiên, PAb cũng tương tác với protein của dứa nên không đem lại kết quả chính xác với kỹ thuật ELISA. - Năm 1996, Hu, Sether và Ullman đã thiết kế kháng thể đơn dòng (Monoclonal Anti-body) cho PMWaV. Tuy nhiên, thí nghiệm thiếu độ nhạy cần thiết nên phải dùng những mẫu rễ và lá giàu virus mới thu được kết quả. 23 - Năm 1997, Hu và cộng sự áp dụng phương pháp TBIA vào việc test PCV cho thấy kể cả cây có triệu chứng bệnh lẫn cây không có triệu chứng bệnh đều mang virus. - Năm 1998, Hu, Sether và Ullman tìm thấy PMWaV trên rệp sáp Dysmicoccus brevipes và Dysmicoccus neobrevipes. Xác định được rệp sáp là trung gian lây truyền PMWaV. - Năm 2001, Sether và cộng sự xác định được PMWaV gồm 2 dòng: PMWaV-1 và PMWaV-2. Bộ gene của chúng đã được giải trình tự và phân loại. Cũng trong nghiên cứu này, các mẫu dứa thu thập từ 17 nước trên thế giới đã được test PMWaV với kỹ thuật TBIA và RT-PCR với kết quả 100% các quốc gia trong thí nghiệm đều có dứa nhiễm PMWaV. - Năm 2002, Sether và Hu chứng minh cây mang PMWaV nhưng không có rệp sáp thì không xuất hiện bệnh. Tác giả đã đề ra giả thuyết độc tố trong nước bọt của rệp sáp cũng là một tác nhân cần thiết để gây bệnh. Tiến hành xử lý nhiệt để khử PMWaV trên các chồi dứa mang virus. Ở Việt Nam, nhìn chung chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá. Các thí nghiệm chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan giữa mật độ rệp với mức độ bệnh trên dứa và thống kê tình hình phân bố bệnh ở một số địa phương. - Theo nghiên cứu của Phan Gia Tân (1984), trên giống dứa Queen, nếu chỉ có 6% số cây có rệp và mỗi cây có 1 – 10 con rệp thì cây chưa bị nhiễm bệnh hoặc nhiễm rất nhẹ. Với 90 – 92% cây có rệp và lượng rệp lẫn ấu trùng trên mỗi cây là 51 – 200 con thì cây bị nhiễm bệnh ở mức độ trung bình. Với 92% cây có rệp và mật độ ấu trùng trên 300 con/cây thì cây bị nhiễm bệnh nặng. - Một số thống kê về tình hình bệnh đỏ đầu lá của trường Đại học Nông Lâm TP.HCM cho thấy bệnh héo đỏ đầu lá xuất hiện ở các vùng được nghiên cứu với tỷ lệ bệnh cao: ở Bến Lức – Long An, Tân Phước – Tiền Giang và Đức Trọng – Lâm Đồng, tỷ lệ bệnh lần lượt là 9.3%, 8.1% và 4.1%. Còn tỷ lệ bệnh ở các nông trường: nông trường Phạm Văn Hai, nông trường Lê Minh Xuân – Tp.HCM và nông trường Thọ Vực – Đồng Nai lần lượt là 6%, 7% và 12.1% (Phạm Văn Khánh, 2003, Võ Thị Thúy Huệ, 2003, và Võ Thị Mỹ Hân, 2004). 24 Như vậy, hiện nay bệnh héo đỏ đầu lá đã xuất hiện ở nước ta với mật độ rộng và tỷ lệ cao, khi gặp điều kiện có thể lây lan thành dịch, gây thiệt hại lớn cho người trồng. Bên cạnh đó chúng ta vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh hữu hiệu mà chỉ có thể hạn chế bệnh bằng cách khống chế những nguồn trung gian gây bệnh. Tuy nhiên với những vùng chuyên canh quy mô lớn hàng trăm, hàng ngàn hecta thì các phương pháp như: trồng giãn cách xa giữa các luống, dùng thuốc trừ rệp, kiến không có tính khả thi cao. Vì vậy với những dự án đầu tư lớn cho cây dứa hiện nay (chương trình 3 cây, 3 con của thành phố Hồ Chí Minh) thì rất cần phải xây dựng một quy trình phòng trừ bệnh thật sự hiệu quả. Từ thành quả của những nghiên cứu đã được thực hiện trên thế giới, ta có thể đề ra một mô hình phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá như sau: 1. Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV. 2. Test các chồi đã xử lý nhiệt để xác định những mẫu sạch PMWaV. 3. Nhân nhanh các mẫu sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn chồi giống sạch bệnh, cung cấp cho người trồng. Với mô hình trên, các chồi giống sạch virus khi trồng sẽ không phát bệnh dù có xuất hiện rệp sáp. Vậy nếu xử lý nhiệt tốt và có một phương pháp phát hiện PMWaV thật chính xác thì ta sẽ phòng chống được bệnh héo đỏ đầu lá thật sự hữu hiệu, nâng cao năng suất của cây dứa, đem lại hiệu quả kinh tế cao cho xã hội 2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV Từ các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá đã thực hiện trên thế giới cho thấy, hiện nay có 3 phương pháp chính để chẩn đoán PMWaV-1 trên cây dứa. - Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): năm 1978, Clark và Adam đã lần đầu tiên áp dụng thành công phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus hại khoai tây. Phương pháp này hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Hiện nay đây là phương pháp huyết thanh hiện đại và nhanh chóng để chẩn đoán các bệnh virus. 25 - Phương pháp TBIA (Tissue Bloting Immuno Assay): phương pháp này được Lin và ctv sử dụng lần đầu tiên năm 1990 cũng hoạt động dựa trên nguyên tắc kháng nguyên – kháng thể. Phương pháp này có nhiều ưu điểm hơn ELISA vì nó không đòi hỏi phải chuẩn bị mẫu tỷ mỉ và có thể cung cấp thông tin về sự phân bố virus trong mẫu bệnh. - Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): là phương pháp nhân nhanh mRNA, gồm 2 bước: mRNA của virus được phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA này sẽ được khuếch đại. Kỹ thuật cho phép phát hiện và phân biệt được nhiều dòng virus gần giống nhau. Các phương pháp trên đều có những ưu điểm riêng. Với ELISA, TBIA tuy giá thành cao, nhưng có thể thực hiện rất dễ dàng, nhanh chóng, rất thích hợp cho việc test cây đang trồng trên đồng ruộng với qui mô lớn. TBIA còn có thể cung cấp thông tin về sự phân bố của virus trong mẫu bệnh nên có thể ứng dụng tốt vào những nghiên cứu về đặc điểm của bệnh. Còn với phương pháp RT-PCR, tuy cần nhiều thời gian thực hiện nhưng giá thành thấp và chính xác hơn 2 phương pháp trên. RT-PCR đòi hỏi lượng mẫu bệnh cần thiết cho phản ứng ít hơn ELISA rất nhiều, nhưng lại có thể phát hiện được những mẫu có lượng virus ban đầu rất thấp. Như vậy, với mô hình cung cấp giống sạch bệnh tập trung mà đề tài hướng tới, một mô hình đòi hỏi một phương pháp chẩn đoán PMWaV-1 thật chính xác thì phương pháp RT-PCR là phương pháp phù hợp nhất. 2.7 Gene HSP 70 của PMWaV Heat shock protein 70 kD (HSP 70) là một nhóm protein đặc biệt của sinh vật. Chức năng ban đầu của chúng là giúp tái đóng xoắn các protein bị biến tính vì nhiệt, giúp sinh vật có thể tồn tại được ở những điều kiện khắc nghiệt bất thường. Cũng chính vì thế mà chúng được đặt tên là heat shock protein. Ngoài ra, chúng còn có một số chức năng khác như giúp các protein mới được tạo ra hình thành các cấu trúc bậc cao, vận chuyển protein xuyên qua các màng tế bào và riêng ở Closterovirus, HSP 70 là một thành phần của protein vỏ trong quá trình tạo virion của virus. (Dolja V.V. và ctv, 1999) 26 Gene mã hóa HSP 70 là một gene có tính bảo tồn cao ở nhiều loài. Đặc biệt với nhóm Closterovirus, đã có rất nhiều nghiên cứu dựa vào gene này để xây dựng cây phân loài. Vì vậy, đối với PMWaV, HSP 70 là một gene rất quan trọng. Đây là vùng gene chính cho các thí nghiệm khuếch đại gene để phát hiện PMWaV và cũng dựa vào HSP 70 mà PMWaV được phân ra thành 2 loài: PMWaV-1 và PMWaV-2 (Sether D.M. và ctv, 2001). 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học phân tử, do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985 và đã liên tục được hoàn thiện và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuyếch đại một đoạn DNA mong muốn lên nhiều lần để có thể phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp PCR chủ yếu dựa trên khả năng tự nhân đôi, biến tính, và hồi tính của DNA. 2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự tìm ra enzyme Taq-polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), người ta đã thiết lập được hàng loạt các chuỗi phản ứng nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi (primer) chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp bổ sung với 2 đầu của đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới. Như vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA trên được lặp lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu được 1 lượng khuyếch đại rất lớn của đoạn DNA cần nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm có nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn: - Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ được nâng lên 93 - 100 oC. Ở nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều được tách ra. - Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ phản ứng được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy - Tm của các primer (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của một sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép các primer bắt cặp với 27 DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40 - 70oC, tuỳ thuộc vào Tm của các primer và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. - Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ được nâng lên 68 - 72oC. Ở nhiệt độ này Taq - polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2 primer được tổng hợp. Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra được 2 DNA mới. Và sau mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước (tăng theo cấp số nhân). Hình 2.7: Phản ứng PCR. Chú thích: (A): giai đoạn biến tính (B): giai đoạn bắt cặp (C): giai đoạn kéo dài Tổng số DNA khuếch đại sau phản ứng PCR được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m * 2n Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ 28 2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR 2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer) Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (ionic strength) cần thiết cho phản ứng xảy ra. Nồng độ các chất, pH của dung dịch đệm tùy thuộc vào nguồn enzyme DNA polymerase được dùng. Các thành phần của một dung dịch đệm điển hình gồm: KCl, MgCl2, gelatin và Tris – HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng). 2.8.2.2 Mg2+ Nồng độ Mg2+ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR. Nó làm tăng hoạt động của DNA polymerase, tăng Tm của DNA và sự tương tác giữa primer - nhiệt độ. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên trong khoảng từ 0,5 đến 5 mM. Nồng độ MgCl2 từ 1,5 đến 2 mM thường được xem là tối ưu, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm phân tử dây đôi ổn định hơn, kềm hãm sự biến tính hoàn toàn của các sợi đôi, làm cho kết quả PCR ít đi. Sự dư thừa Mg2+ còn làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra nhiều hơn. Hiện tượng này làm primer bắt cặp ở những vị trí không chuyên biệt trên DNA khuôn tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lượng khá lớn. Ngược lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0.5 mM), thì quá trình kéo dài sẽ xảy ra không hoàn toàn, tạo ra những sản phẩm DNA ngắn hơn bình thường. Đó là do trong phản ứng PCR, Mg2+ đóng vai trò Co – factor của Taq polymerase nên nếu lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu, 1999). 2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA. Hỗn hợp dNTPs gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP và thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 µM cho mỗi nucleotide. Điều quan trọng là chúng ta phải giữ cho nồng độ của cả 4 dNTPs bằng nhau vì sự mất cân bằng thành phần các nucleotide sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. 29 2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) Primer là một trong những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng PCR. Chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR và cần tuân theo một số nguyên tắc sau: - Primer cho 1 phản ứng PCR gồm có 1 primer xuôi (forward) và 1 primer ngược (reverse). Xuôi và ngược là so với chiều sao mã. Trong hầu hết các ứng dụng phản ứng PCR, 2 primer xuôi và ngược đều phải có nồng độ bằng nhau. - Trình tự của primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa 2 primer hay giữa 1 primer với chính nó (trình tự của chúng không được bổ sung nhau). - Tm của 2 primer không cách xa nhau. - Trình tự của primer phải đặc trưng cho trình tự của DNA được khuyếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen. Trình tự giữa 2 primer không nên quá lớn, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). 2.8.2.5 Taq – polymerase Là một DNA polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq - polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của phản ứng PCR và hoạt động tối ưu ở 68 – 72oC . Nồng độ enzyme Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0.5 – 5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, phản ứng sẽ không có đủ lượng enzyme cần thiết để tạo ra sản phẩm PCR theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999). 30 2.8.2.6 Số lượng chu kỳ trong phản ứng PCR Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc vào số lượng bản sao ban đầu của mẫu. Ví dụ nếu lượng bản mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ, nếu lượng bản mẫu là 102 – 103 thì số lượng chu kỳ là 35 – 40 . Trong thực tế không nên thiết lập số chu kỳ quá lớn cho 1 phản ứng PCR. Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, ở giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân của lượng mẫu, sau đó hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: - Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng - Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng - Các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001). 2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RT-PCR là một kỹ thuật cho phép ta khuếch đại các đoạn mRNA (RNA thông tin) để làm cơ sở cho việc nghiên cứu về sự biểu hiện gene (sự sao mã tạo ra các mRNA của các gen) hay nghiên cứu các retrovirus (các loại virus mang thông tin di truyền là mRNA). RT-PCR hoạt động dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR nhưng trước khi thực hiện phản ứng khuếch đại, có thêm giai đoạn tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ sợi mRNA khuôn. Giai đoạn này được thực hiện nhờ enzyme reverse transcriptase, enzyme phiên mã ngược được phân lập từ retrovirus. Nếu cung cấp một primer bắt cặp với mRNA, enzyme reverse transcriptase sẽ thực hiện phản ứng phiên mã ngược, tổng hợp nên một sợi DNA bổ sung với sợi mRNA khuôn, gọi là sợi cDNA. Sau khi được tạo ra, sợi cDNA sẽ được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường. (Bùi Trang Việt, 2002) 31 Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR Có 3 loại primer chính thường dùng trong giai đoạn tổng hợp cDNA * Primer là các oligo T Tất cả các loại mRNA đều có đuôi poly A ở đầu 3' nên với primer là một đoạn oligo T (ví dụ: TTTTTT) thì nó sẽ bắt cặp với sợi mRNA ở đoạn poly A và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài ứng với toàn bộ sợi mRNA khuôn. Phương pháp này rất thuận lợi cho những nghiên cứu tổng quát về mRNA. * Primer random hexamer Là những đoạn oligo nucleotide gồm 6 nucleotide với trình tự ngẫu nhiên. Chúng bám lên nhiều điểm khác nhau dọc theo suốt sợi mRNA và tổng hợp nên những đoạn cDNA ngắn phủ khắp sợi mRNA khuôn mẫu. Random hexamer thích hợp cho những sợi mRNA đích quá dài hoặc có nhiều cấu trúc thứ cấp gây cản trở cho oligo T hoạt động hiệu quả. 32 * Primer chuyên biệt Primer được thiết kế với một trình tự chuyên biệt cho một đoạn trình tự nhất định trên sợi mRNA. Primer sẽ bắt cặp ở trước đầu 3' của đoạn gene mong muốn và phản ứng tổng hợp sẽ tạo ra sợi cDNA có độ dài từ điểm bắt cặp kéo dài đến hết sợi mRNA khuôn. Do primer chỉ bắt cặp tại một điểm chuyên biệt nên cDNA tạo ra sẽ chứa đoạn trình tự mong muốn với xác suất rất cao, vì vậy, loại primer này đặc biệt hữu hiệu trong việc khuếch đại các mRNA có số lượng bản sao thấp. (O'Connell J., 2002). Phản ứng RT-PCR có thể được thực hiện theo 2 bước (two steps) hay diễn ra liên tục (one step). * Phản ứng qua 2 bước Trước tiên, thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA với mRNA khuôn, primer và enzyme reverse transcriptase trong khoảng 45 phút ở 42 - 45oC (là nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme reverse transcriptase). Sau đó, bổ sung primer cho PCR, Taq - polymerase để thực hiện tiếp phản ứng khuếch đại. Phương pháp này thường được sử dụng với các primer tổng hợp cDNA là oligo T hay hexamer, giúp người thực hiện có thể khống chế được từng qui trình. Tuy nhiên dễ xảy ra nhiễm các DNA lạ khi bổ sung hóa chất giữa 2 giai đoạn. * Phản ứng liên tục Cho tất cả các yếu tố cần thiết cho cả phản ứng tổng hợp cDNA và phản ứng khuếch đại vào một lần rồi thực hiện cả 2 qui trình liên tục. Phương pháp này thường được thực hiện với các primer được thiết kế chuyên biệt chung cho cả phản ứng tạo cDNA lẫn phản ứng khuếch đại và ít gây nhiễm DNA lạ trong quá trình thao tác. 33 2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA (Sequencing) Để xác định trình tự của một đoạn DNA mong muốn, phương pháp Sanger là phương pháp thường được sử dụng nhất hiện nay. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: thực hiện sự tổng hợp sợi DNA bổ sung với sợi cần xác định trình tự (thực hiện phản ứng PCR), nhưng ngoài 4 loại dNTP thông thường còn bổ sung thêm các dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP). Các ddNTP này không có nhóm -OH ở đầu 3' nên khi chúng gia nhập vào chuỗi sẽ làm cho sự kéo dài chuỗi bị dừng lại (do không thể tạo được liên kết giữa nhóm -OH 3' của nucleotide trước với nhóm phosphate 5' của nucleotide sau). Sự gia nhập của các ddNTP vào chuỗi là hoàn toàn ngẫu nhiên nên phản ứng kéo dài sẽ ngừng lại ở một vị trí bất kỳ. Do đó, nếu cung cấp một lượng DNA mẫu đủ lớn thì các phản ứng tổng hợp sẽ cho hàng loạt các sản phẩm có độ dài tăng dần: 1, 2, 3, 4… nucleotide. Như vậy, chỉ cần biết được ở mỗi đoạn kết thúc bằng loại ddNTP nào thì sẽ có thể tìm ra được trình tự của đoạn DNA mong muốn. Để làm được điều đó, người ta thực hiện 4 phản ứng PCR cho mẫu DNA muốn giải trình tự cùng lúc, ở mỗi phản ứng chỉ cho thêm một loại ddNTP (A, T, G hoặc C). Sau phản ứng, kết quả điện di sản phẩm của cả 4 trên cùng một gel acrylamide sẽ giúp xác định được tr