Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang

TỔNG QUAN TÀI LIỆU .5 1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu 5 1.1.1. Hình thái: .5 1.1.2. Sinh thái 5 1.1.3. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh 8 1.1.4. Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: .13 1.2. Tổng quan về Aflatoxin .16 1.2.1. lịch sử phát hiện aflatoxin [8]: . 16 1.2.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8] 16 1.2.3. Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên: 17 1.2.4. Tác hại của Aflatoxin: .19 1.2.5. Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]: .24 1.3. Phương pháp phát hiện A. flavus 27 1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: .27 1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]: 28 1.4. Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] .30 1.4.1. Đặc tính .30 1.4.2. Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin .32 1.4.3. Đặc điểm của phức bao cyclodextrin 33 1.4.4. Ứng dụng của phức bao: .35 1.4.5. Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15] 35 1.5.Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14].37 1.5.1. Giới hạn phát hiện .37 1.5.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả .37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . .38 2.1. Vật liệu: . .38 2.1.1. Chủng chuẩn Aspergillus và mẫu thực phẩm .38 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính 39 2.1.3. Môi trường và hóa chất .40 2.2. Phương pháp nghiên cứu . .40 iii 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị phòng ẩm nuôi cấy mốc [13] 40 2.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] 41 2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14] .41 2.2.4. Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) để phân tích HPLC [11] .44 2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phát huỳnh quang của các chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin 44 2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang. 45 2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] .47 2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 3.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin (dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang trên môi trường thạch) của một số chủng Aspergillus flavus. 51 3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện tác động đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus 56 3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .57 3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .61 3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .66 3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .70 3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: .74 3.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: . .78 3.3. xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang của Aflatoxin khi kết hợp với cyclodextrin .80 3.4. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp mới xây dựng. 80 3.5. Xác định các thông số phương pháp mới: 85 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ .90 4.1. Kết luận 90 4.2. Đề nghị: 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO .91 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG . 94 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ KIỂM TRA AFLATOXIN BẰNG HPLC .97 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT 98

pdf4 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 2570 | Lượt tải: 4download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 1 MỞ ĐẦU HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ MỞ ĐẦU Hiện nay, chất lượng thực phẩm được quan tâm nhiều bởi có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Có rất nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá trị dinh dưỡng, vấn đề an toàn thực phẩm được đặc biệt chú trọng, trong đó nhiễm các chất gây hại cho người như các độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim lọai nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, dư lượng phân bón,… Trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao, điều kiện bảo quản trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm gây ảnh hưởng đến chất lượng lương thực thực phẩm cung cấp cho người dân. Trong điều kiện như vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư. Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin B1 (AFB1). Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus, mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1 (AFB1) chủ yếu do loài Aspergillus flavus sinh ra có độc tính rất cao (Nabil Saad, 2004; Victoria, 2001; Roberts, 2002) [8]. Các loài động vật, kể cả con người, nếu ăn phải thức ăn có chứa AFB1, hoặc sử dụng nguyên liệu, thức ăn có nguồn gốc từ ngũ cốc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có thể nguy hại đến tính mạng. Trong khi hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng. Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]. Phương pháp phân tích định danh loài nấm mốc Aspergillus flavus hiện nay chủ yếu dựa vào các đặc tính hình thái như: Tiêu chuẩn ngành y tế 52 TCN – TQTP 0001:2003: “Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm” [1] dựa trên các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào để định danh. Tuy nhiên, đối với phương pháp định danh dựa vào hình thái và màu sắc thì rất khó phân biệt với loài GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 2 MỞ ĐẦU HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Aspergillus oryzae mà chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai loài này. Do đó, để kiểm soát được chất lượng nông sản, các nhà quản lý cần kiểm soát cả hai yếu tố : sinh học - có nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus hay không và yếu tố hóa học - có nhiễm độc tố Aflatoxin vượt ngưỡng cho phép hay không từ đó có thể đề xuất những biện pháp kỹ thuật phù hợp nhằm tránh được những nguy hại của các loại ngũ cốc có chứa Aflatoxin. Bên cạnh đó, trên thế giới để kiểm soát chất lượng thực phẩm đã sử dụng quy trình định lượng nấm mốc A. flavus theo hướng dẫn của FAO 1414-1992 chủ yếu cũng dựa trên đặc điểm hình thái để phân lập định danh [10]. Gần đây, nhóm tác giả Fente C.A., Jaimez Ordaz J., B. I., Vázquez C. M. (2001) [11] đã nghiên cứu đưa ra phương pháp mới dùng để sàng lọc các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng cách thêm cyclodextrin vào môi trường nuôi cấy nấm mốc để kích thích sự phát huỳnh quang của Aflatoxin. Sự phát huỳnh quang được quan sát trực tiếp trên môi trường nuôi cấy dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm. Khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin có được là do sự hình thành cấu trúc dị vòng 5 bị oxi hóa. Cyclodextrin là những phân tử được hình thành do phản ứng của enzyme cyd – transglycolase lên dextrans. Các phân tử cyclodextrin có các kích thước khác nhau [cyclodextrin chứa 6- 8 đơn phân glucose liên kết với nhau bằng liên kết (1-4) do đó chúng được gọi là -, -, or -cyd]. Các phân tử này được dùng để làm tăng khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin. Với cơ sở lý thuyết nêu trên và với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện nấm mốc A. flavus sinh độc tố Aflatoxin, được sự đồng ý của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang” GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 3 MỞ ĐẦU HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ * Mục tiêu của đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố Aflatoxin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp những dẫn liệu khoa học về những sự tồn tại khả năng có hoặc không có sinh độc tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả. * Luận điểm mới của đề tài: Ở nước ta hiện nay, trong các quy trình phát hiện nấm mốc A. flavus dựa trên đặc điểm hình thái là chủ yếu và do đó chỉ phân biệt được loài mà không phân biệt được khả năng sinh độc tố Aflatoxin của loài đó. Vì vậy, điểm mới của đề tài là xây dựng được phương pháp phát hiện nấm mốc A. flavus trong đó có thể phân biệt được những loài có khả năng sinh độc tố với những loài không có khả năng sinh độc tố. Với đối tượng đã chọn, chúng tôi đã khảo sát các yếu tố tác động đến việc sinh Aflatoxin để đưa ra các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng một phương pháp mới phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin được ghi nhận bằng việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dười đèn UV ở bước sóng 365nm. Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành đánh giá, xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp mới theo tiêu chuẩn ISO 16140:2003 [14] trên 2 dạng nền mẫu thức ăn chăn nuôi có cấu trúc khác nhau: dạng hạt và dạng bột làm cơ sở để mở rộng phạm vi áp dụng trên các nền mẫu khác như ngũ cốc dạng hạt và dạng bột… * Ý nghĩa đề tài ¾ Ý nghĩa khoa học: - Làm cơ sở để xây dựng phương pháp định danh, định lượng và phân tích nấm mốc trong lương thực thực phẩm, trong thức ăn chăn nuôi. - Làm cơ sở cho việc nghiên cứu sự đa dạng của A. flavus và các loại nấm mốc khác sinh Aflatoxin. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 4 MỞ ĐẦU HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ ¾ Ý nghĩa thực tiễn: - Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và hiệu quả hơn so với các phương pháp nuôi cấy hiện nay. - Việc phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin là công cụ quan trọng trong việc kiểm tra, quản lý chất lượng nông sản, lương thực thực phẩm và thức ăn trong chăn nuôi. * Nội dung nghiên cứu ¾ Sàng lọc các chủng A. flavus sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang ¾ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các chủng A. flavus sinh Aflatoxin ¾ Xây dựng dự thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”. ¾ Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp * Nơi thực hiện - Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 - Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. * Thời gian thực hiện: Từ tháng 07/2008 đến tháng 7/2009

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf7.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf11.pdf
  • pdf12.pdf
  • pdf13.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf8.pdf
  • pdf9.pdf
Luận văn liên quan