Công nghệ sinh học ứng dụng trong sản xuất và chế biến thực phẩm chức năng

ị cao nhất khi lượng tế bào là 20% (w/w). Các sợi gluten cố định sợi nấm được nhồi vào trong cột phản ứng để sản xuất FOS liên tục. Sản lượng thu được là 173g/h trong 1 lít thể tích cột phản ứng với tốc độ dòng chảy là 0.8ml/phút. Khối lượng các phân đoạn FOS tăng từ 0.2 – 0.54 w/w khi dòng chảy giảm từ 1 còn 0.1ml/phút, cùng với thời gian lưu tăng từ 0.35 lên 3.5h. Hệ sợi nấm được bẫy trong mạng gluten và tế bào cố định trong đó ổn định trong thời gian dài. Gluten được nhận thấy là vật liệu thích hợp để cố định sợi nấm cùng với enzyme sản xuất FOS. Gluten là một dạng polymer tự nhiên, và là phụ phẩm của công nghiệp sản xuất bột mì. Sử dụng gluten có các ưu điểm như nó là chất có thể phân giải được, rẻ tiền, không độc và là nguồn nguyên liệu có sẵn.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  226 Chương 2: Fructooligosaccharide 2.4.2. Nguyên liệu và phương pháp Chủng và tế bào nuôi cấy: Aspergillus japonicus TIT-KJ1 được cung cấp bởi tiến sĩ K-J Duan ở bộ môn công nghệ sinh học, trường đại học Tatung, Taipei, Đài Loan. Môi trường lỏng chứa 20% đường sucrose, 1% dịch trích đường maltose, và 1% dịch chiết nấm men đã được dùng. Các tế bào được nuôi ở chế độ lắc (200v/p) ở 300C trong 36 giờ. Để thu được những sợi nấm dùng cho cố định, tế bào sẽ được thu nhận, và trộn đều với chất làm đồng nhất polytron trong dung dịch đệm chứa Triton X-114 ở 40C trong 24 giờ, và làm đông khô ở -850C. Cố định tế bào: Bột gluten (10g, Sigma) được hòa tan trong 200ml dung dịch NaOH 0.05N. Sau khi ly tâm loại những phần không tan, phần dd gluten còn lại được điều chỉnh với HCl 0.1N. Khi pH giảm còn 11, tiếp tục thêm 5ml dung dịch tinh bột đã bị oxy hóa vào (22%, w/v), và sau đó pH được giảm tiếp xuống 6. Sau khi đã làm lắng gluten dạng keo và loại bỏ những phần nổi lên trên bề mặt, phần keo lắng được trộn đều với sợi nấm đã nghiền nhỏ của A.japonicus. Phần gel này sau đó được làm khô ở dạng những sợi tế bào cố định với đường kính 0.25cm. Những gel khô sau cùng được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 0.25cm x 0.4 cm và trữ ở 40C trước khi đem sử dụng. Sản xuất fructooligosacchride: Bổ sung 1g (hoặc 1 lượng cụ thể nào đó) mảnh tế bào cố định vào 100 ml dung dịch đường sucrose (40%, w/v) để sản xuất FOS ở 370C dưới chế độ lắc 125v/p đặt trong bể nước. Quá trình sản xuất FOSs được kiểm soát bằng cách đo hàm lượng FOS tạo thành trong dung dịch. FOS được sản xuất liên tục bằng cách nhồi 8g các mảnh tế bào cố định vào cột kích thước 18cm x 1.55cm. Dung dịch sucrose (40%, w/v) được cho đi qua cột với vận tốc dòng chảy xác định. Nhiệt độ của cột được duy trì ở 370C. Sản phẩm trong hỗn hợp phản ứng được phân tích bằng HPLC sử dụng cột Econosphere NH2 (5μ  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  227 Chương 2: Fructooligosaccharide cartridge, 250 mm x 4.6 mm). Sắc ký tiến hành trong điều kiện như sau: nhiệt độ cột 300C, tốc độ dòng chảy 1.5 ml/phút; pha di động là acetonitrile – H2O (75:25); máy dò Water 410 RI. Tổng FOS tạo thành được giả định là tổng của 1-kestose và nystose. Lượng FOS cao hơn thường chỉ chiếm 3% và được bỏ qua. Trong tất cả các phép phân tích, lượng nhỏ fructose được xem như là glucose. Vận tốc phản ứng ở giờ đầu tiên: Để xác định tốc độ phản ứng được xúc tác bởi β-D-fructofuranosidase, 55 ml dung dịch sucrose (40%, w/v) được ủ với 0.2g tế bào cố định ở 370C, trong 1 giờ. Hàm lượng các loại đường trong hỗn hợp được xác định bằng HPLC. Vận tốc phản ứng được tính như là lượng sucrose bị chuyển hóa trên một đơn vị thời gian với hoạt động xúc tác của enzyme kèm theo sợi nấm cố định. 2.4.3. Kết quả Sản xuất FOS theo mẻ với tế bào cố định: Hình 2.16 biểu diễn động học của phản ứng transfructosyl ở sucrose, sử dụng các mảnh gluten nhỏ bẫy những sợi nấm của Aspergillus japonicus. Khi ủ 100 ml dung dịch sucrose 40% (w/v) với 1g tế bào cố định có mật độ tế bào là 20% (w/w), sucrose nhanh chóng biến đổi thành glucose và 1-kestose (GF2) theo tiến trình phản ứng. Sau 4 giờ hàm lượng 1-kestose tạo ra đạt giá trị cao nhất. 1-kestose sau đó được chuyển hóa thành nystose (GF3). Tổng lượng FOS, mà chủ yếu là 1-kestose và nystose, đạt đến giá trị cực đại là khoảng 61% lượng đường trong hỗn hợp phản ứng sau 5h. Phần khối lượng của FOS tổng tạo thành gần như không đổi cho đến khi hàm lượng nystose vượt qua 1-kestose tại thời điểm phản ứng diễn ra được 8 giờ. Mặc dù vậy, lượng FOS tổng đã hạ xuống dần sau đó.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  228 Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.17: Nồng độ và phần khối lượng của các loại đường theo thời gian [23] Khi dùng một lượng nhỏ tế bào cố định, ví dụ như 0.2g, thì thời gian để đạt tới hàm lượng FOS cực đại là 15h, và hàm lượng 1-kestose và nystose bằng nhau là 18 giờ. Như biểu diễn ở hình 2.17, phần khối lượng FOS tổng tại những thời điểm này thì giống như khi sử dụng 1g tế bào cố định. Khi một lượng tương đương sợi nấm khô (0.04g khối lượng tế bào khô) được dùng trực tiếp để sản xuất FOS từ đường sucrose thì tốc độ phản ứng diễn ra nhanh hơn và thời gian thu lượng FOS lớn nhất cũng đươc rút ngắn so với khi sử dụng 0.2 g tế bào cố định. Thời gian để hàm lượng FOS đạt cực đại và lượng 1-kestose và nystose bằng nhau lần lượt là 12 và 15 giờ khi xúc tác phản ứng bằng tế bào nguyên vẹn.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  229  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.18: Sản xuất FOS sử dụng tế bào cố định và tế bào không cố định [23] Ảnh hưởng của mật độ tế bào trong gluten: Hình 2.18 biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng tế bào có trong gluten lên hoạt tính enzyme sản xuất FOS. Để xác định vận tốc phản ứng, 0.2 g tế bào cố định đã được trộn với 50 ml dung dịch sucrose (40% w/v) và phản ứng xảy ra trong 1 giờ. Tốc độ phản ứng ở giờ đầu tiên (g/h) được tính dựa trên lượng sucrose đã biến đổi. Ngoại trừ trường hợp tỷ lệ tế bào là 2.5% hoặc ít hơn, nếu nồng độ cơ chất vượt quá 5% có thể làm tốc độ phản ứng không đạt như thời kỳ đầu. Tốc độ phản ứng ở giờ đầu tiên có thể gần với vận tốc ban đầu. Ở hình 2.18, tốc độ phản ứng tăng đến giá trị cực đại là 5.2 g/h cùng với sự tăng hàm lượng tế bào, trong khi vận tốc riêng trên 1 đơn vị khối lượng tế bào đạt đến giá trị tối đa (190g/hg trọng lượng khô tế bào) ở tỉ lệ tế bào 5% w/w, và sau đó giảm xuống mặc dù hàm lượng tế bào tăng do sự cản trở không gian và sự khuếch tán vật chất qua thành tế bào gặp khó khăn.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  230  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.19: Ảnh hưởng của lượng tế bào cố định trong mạng gluten [23] Sản xuất FOS liên tục: Sucrose với nồng độ 400 g/l được bơm liên tục vào cột phản ứng đã nhồi các mảnh gluten chứa sợi nấm cố định. Hình 2.19 biển diễn ảnh hưởng của lưu lượng dòng chảy lên năng suất tạo FOS. Phần khối lượng của FOS tăng lên cùng với sự giảm đi của tốc độ dòng chảy đồng thời thời gian lưu tăng lên. Phần khối lượng FOS tăng từ 0.2 đến 0.54 w/w khi tốc độ dòng chảy giảm từ 1 đến 0.1 ml/phút, tương ứng với thời gian tăng từ 0.35 đến 3.5 giờ. Hình 2.19 cũng cho thấy năng suất theo tốc độ dòng chảy và phần khối lượng FOS tổng, tăng theo tốc độ dòng chảy, và khả năng tạo FOS cao nhất khi sử dụng tốc độ chảy 0.8 ml/phút. Khi thể tích hỗn hợp phản ứng trong cột còn 34 ml, năng suất cao nhất đạt được khi tốc độ dòng chảy là 0.8 ml/phút được tính là 173 g FOS sản xuất trong 1 giờ trên 1 lít thể tích phản ứng. Cột phản ứng được hoạt động trong thời gian dài với ống dẫn sucrose có nồng độ 400g/l. Khi lưu lượng dòng chảy là 0.1 ml/phút, tương ứng với thời gian lưu trung bình là  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  231  Chương 2: Fructooligosaccharide 3.5 giờ, phần khối lượng của FOS tổng ở chỗ thoát của cột gần bằng 0.53 w/w sau 4 giờ khởi động. Phần khối lượng của FOS duy trì ở hàm lượng từ 0.52-0.54 w/w trong khoảng 4 ngày đầu. Những sợi nấm sau khi được bẫy trong mạng gluten và những tế bào liên kết cố định sản sinh ra enzyme có hoạt tính duy trì ở mức cao. Mặt khác, phần khối lượng FOS giảm dần khoảng 0.4 w/w khi tiếp tục hoạt động trong 18 ngày sau đó. Hoạt động sản xuất FOS giảm khoảng 50% giá trị ban đầu sau khi cột phản ứng được dùng liên tục 34 ngày. Hình 2.20: Phần khối lượng FOS và năng suất tạo FOS theo tốc độ dòng chảy [23]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  232  Chương 2: Fructooligosaccharide 2.5. Sản xuất Fructooligosaccharide cao độ từ sucrose sử dụng hệ enzyme- fructofuranosidase và glucose oxidase [57] 2.5.1. Tóm tắt nghiên cứu FOS cao độ được nghiên cứu sản xuất từ sucrose bằng phương pháp lên men không liên tục sử dụng hệ enzyme-fructofuranosidase và glucose oxidase. Hệ enzyme này được tiếp vào thiết bị phản ứng dạng khuấy trộn chứa 0.7l sucrose, phản ứng xảy ra trong 25h. Nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho thí nghiệm nhằm sản xuất hàng loạt FOS cao độ với hệ 2 enzyme-fructofuranosidase và glucose oxidase. Các điều kiện hoạt động tối ưu cho hệ 2 enzyme như sau: pH 5.5, nhiệt độ 400C, hàm lượng sucrose 400 g/l, tốc độ khuấy trộn 550 vòng/phút, lưu lượng oxy 0.7 l/phút., tỉ lệ enzyme phối trộn: 10 đơn vị-fructofuranosidase kết hợp với 15 đơn vị glucose oxidase trong 1g sucrose. Phản ứng diễn ra trong điều kiện tối ưu, hệ 2 enzyme đã phản ứng hết với sucrose và glucose, FOS tạo thành với hàm lượng lên đến 98%. So với phương pháp sản xuất FOS chỉ sử dụng enzyme-fructofuranosidase, FOS cao độ được sản xuất bởi hệ enzyme-fructofuranosidase và glucose oxidase có điểm khác biệt cơ bản là hàm lượng nystose tích lũy cao hơn, và chỉ có một lượng nhỏ fructofuranosyl nystose tạo thành. 2.5.2. Nguyên liệu và phương pháp Hóa chất: Đường sucrose sử dụng trong thí nghiệm là đường thực phẩm, các hóa chất khác ở dạng tinh chế. Oxy 99.5% được sử dụng cho phản ứng enzyme glucose oxidase. Enzyme: -fructofuranosidase thu nhận từ việc nuôi cấy chủng Aureobasidium pullulans KFCC 10524 (Hàn Quốc) đã được mô tả bởi Jung và cộng sự. Dung dịch enzyme được chuẩn bị như sau: các tế bào ở log phase được thu nhận bằng ly tâm và hòa tan lại vào  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  233 Chương 2: Fructooligosaccharide nước đã khử hết ion. Dịch treo tế bào được xử lý với 2% (w/v) kitalase trong 2h ở 450C sau đó lọc sử dụng chất trợ lọc điatomit. Nước lọc chứa nhiều protein khác nhau được sử dụng làm enzyme thô mà không cần tinh sạch. Glucose oxidase (từ Aspergillus niger, hoạt tính riêng 25000 U/g) mua từ Sigma (USA), sử dụng ngay không cần tinh sạch thêm. Phân tích enzyme: Hoạt tính của-fructofuranosidase được xác định bằng cách đo lượng glucose sinh ra trong điều kiện sau: hỗn hợp phản ứng gồm 7.5ml sucrose 800g/l, 2.3ml đệm Natri citrate 0.1M pH 5.5, và 0.2ml dung dịch enzyme; pH 5.5; nhiệt độ 550C; thời gian phản ứng 1h. Một đơn vị hoạt tính-fructofuranosidase được xác định bằng lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính của glucose oxidase được tính theo lượng glucose biến mất trong bình phản ứng khuấy trộn 2l theo các điều kiện khảo nghiệm sau: cơ chất 0.7l-D-glucose 400g/l, lưu lượng oxy 0.7 l/phút, tốc độ khuấy trộn 550 vòng/phút, 1ml dd glucose oxidase hòa trong đệm citrate 0.1M, nhiệt độ 400C, pH 5.1. Một đơn vị hoạt tính của glucose oxidase là lượng enzyme cần thiết để oxy hóa 1mol glucose trong điều kiện phản ứng đã mô tả. Lượng glucose sinh ra được xác định theo phương pháp glucose oxidase-peroxidase (dùng bộ kit chẩn đoán Sigma). Phương pháp phân tích: Tất cả sản phẩm phản ứng được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng cột HPX 42C (0.78 x 30cm, Bio-Rad) và máy dò khúc xạ RI-4. Nhiệt độ cột được giữ ở 850C. Nước được sử dụng làm pha động với tốc độ chảy 1.0ml/phút. FOS tổng số được cho là tổng của 1-kestose (GF2) và nystose (GF3). FOS mạch dài hơn thường nhỏ hơn 3% nên bỏ qua.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  234 Chương 2: Fructooligosaccharide Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho-fructofuranosidase và glucose oxidase: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động của enzyme glucose oxidase được nghiên cứu trong thiết bị phản ứng 2l của BIOLAB. Thể tích phản ứng là 0.7l, lưu lượng oxy 0,7l/phút , và lượng enzyme sử dụng là 10 đơn vị cho mỗi gram sucrose. Tuy nhiên, cơ chất được thay thế bởi-D-glucose 400 g/l và thời gian phản ứng giảm xuống còn 30 phút. Nhiệt độ tiến hành ở 400C. Ảnh hưởng của nhiệt độ được nghiên cứu ở pH 5.5. Để tối ưu hóa pH và nhiệt độ cho-fructofuranosidase, phản ứng được tiến hành trong 30 phút với 10 đơn vị enzyme cho mỗi gram sucrose , sử dụng hỗn hợp phản ứng tương tự như cho thí nghiệm phân tích enzyme. Ảnh hưởng của nhiệt độ được nghiên cứu ở pH 5.5 và ảnh hưởng của pH thì tiến hành ở nhiệt độ 55°C. Các kết quả đã được trình bày là hoạt tính tương đối (% lớn nhất) sau khi phân tích các sản phẩm phản ứng bằng HPLC. 2.5.3. Kết quả và bàn luận Nhiệt độ và pH tối ưu cho glucose oxidase và-fructofuranosidase: Những tác động của nhiệt độ và pH lên hoạt tính enzym của-fructofuranosidase và glucose oxidase được kiểm tra riêng biệt (Hình 2.20). Nhiệt độ tối ưu của 2 enzyme có sự khác biệt đáng kể. Các nhiệt độ tối ưu cho glucose oxidase và-fructofuranosidase tương ứng là 35°C và 55°C. Đối với glucose oxidase, nhiệt độ tăng có nghĩa là nồng độ oxy giảm. Về cơ bản tính hòa tan của oxy giảm khi nhiệt độ tăng lên. Mặt khác, pH tối ưu cho glucose oxidase gần như tương tự với- fructofuranosidase, trong khoảng 5 – 6. Kobayashi và cs. báo cáo một kết quả tương tự rằng điều kiện phản ứng tối ưu cho glucose oxidase nguồn gốc từ Penicillium amagasakiense là ở nhiệt độ 40°C và pH 5 – 6. Căn cứ vào kết quả này, tất cả các thí nghiệm phản ứng được thực hiện trong phạm vi nhiệt độ 35 - 45°C và pH cố định là 5.5 để tối ưu hóa hệ 2 enzyme.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  235 Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên hỗn hợp enzyme [57] Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hỗn hợp enzyme: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình sản xuất FOS cao độ được tiến hành nghiên cứu với 600g/l sucrose ở ba nhiệt độ 35, 40 và 45°C (Hình 2.21). Ở cả ba nhiệt độ, ban đầu FOS được tạo ra rất nhanh, và giảm dần theo thời gian phản ứng. Ngoài ra, tốc độ tạo FOS ban đầu nhanh hơn khi nhiệt độ phản ứng tăng, mặc dù hiệu suất chuyển hóa FOS đạt giá trị tương đương 83% sau 25h. Điều này có thể được giải thích do mức độ kích hoạt enzyme khi nhiệt độ tăng không đủ bù đắp cho lượng oxy hòa tan giảm trong hệ thống. Vì vậy, 40°C được chọn làm nhiệt độ phản ứng cho sản xuất FOS cao độ.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  236  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ FOS tạo thành [57] Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn: Ảnh hưởng sự truyền khối đến hoạt tính chung của hỗn hợp enzyme được khảo nghiệm với 600 g/l sucrose (với các tốc độ khuấy trộn khác nhau), với kết quả đưa ra là tỷ lệ sản xuất FOS. Bộ phận truyền động là một turbin 6 cánh khuấy (đường kính 5.8cm, làm bằng thép không gỉ) đặc cách đáy thiết bị phản ứng 5cm. Tsukamoto và cs. đã nghiên cứu vai trò quan trọng của tốc độ khuấy trộn đến tỷ lệ phản ứng của glucose oxidase cố định trên chất mang và thấy rằng tỷ lệ ban đầu là hầu như không đổi với tốc độ khuấy trên 1.300 vòng/phút. Tuy nhiên, trong hệ thống này, không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ sản xuất FOS nếu tốc độ khuấy trên 550 vòng/phút (Hình 2.22). Điều này cho thấy vai trò của sự truyền khối, không giống như  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  237  Chương 2: Fructooligosaccharide quá trình phản ứng bằng enzyme cố định, là không quan trọng khi tốc độ khuấy cao hơn 550 vòng/phút. Sau đây, tất cả các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện với chế độ khuấy đảo 550 vòng/phút. Hình 2.23: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến tỉ lệ FOS tạo thành [57] Ảnh hưởng của lưu lượng oxy: Hình 2.23 cho thấy ảnh hưởng của tốc độ dòng chảy khí oxy lên sản xuất FOS. Khi không cung cấp oxy, cả tỷ lệ sản xuất và chuyển đổi được rất thấp, năng suất gần như giống nhau khi chỉ sử dụng một loại enzyme-fructofuranosidase. Lưu lượng oxy cần thiết để đạt được lượng FOS mong muốn được xác định là phải lớn hơn 0.7 l/phút. Sự hạn chế khuếch tán của oxy vào dd đường nồng độ cao (nồng độ sucrose ban đầu 600 g/l) làm hàm lượng oxy hòa tan trong hỗn hợp phản ứng không đạt  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  238  Chương 2: Fructooligosaccharide độ bão hòa. Kết quả là, 0,7 l/phút được chọn là lưu lượng oxy cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2.24: Ảnh hưởng của lưu lượng oxy đến sản xuất FOS [57] Ảnh hưởng của nồng độ sucrose: Tiến hành khảo nghiệm nồng độ sucrose trong khoảng 400 – 700 g/l để xác định giá trị tối ưu. Hình 2.24 cho thấy hỗn hợp enzyme có hoạt động tương tự trên một dải nồng độ sucrose và sau 15h phản ứng thì hầu như không đổi. Ở nồng độ đường cao thì oxy hòa tan giảm nên tỉ lệ tạo FOS cũng giảm. Do đó chọn nồng độ sucrose cho các thí nghiệm về sau là 400 g/l.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  239  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.25: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến tỉ lệ tạo FOS [57] Ảnh hưởng của nồng độ glucose oxidase: Theo báo cáo trước đó của nhóm tác giả thì hàm lượng-fructofuranosidase tối ưu cho sản xuất FOS là 5 đơn vị cho mỗi gram sucrose ở 55°C. Trong nghiên cứu này thì hệ hỗn hợp 2 enzyme cần một lượng-fructofuranosidase cao hơn bởi vì nhiệt độ tối ưu của hỗn hợp enzyme (40°C) là thấp hơn nhiều so với 55°C. Với lượng cố định 10 đơn vị- fructofuranosidase cho mỗi gram sucrose thì lượng glucose oxidase dao động trong khoảng 5-15 đơn vị cho mỗi gram sucrose (400 g/l). Khi thêm 5 hoặc 10 đơn vị glucose oxidase thì lượng glucose còn lại sau 25h phản ứng tương ứng là 18% và 5%.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  240  Chương 2: Fructooligosaccharide Tuy nhiên, hoạt tính ban đầu của glucose oxidase không được duy trì ở mức cao trong suốt thời gian phản ứng 25h vì enzyme bị vô hiệu hoá bởi H2O2, một trong những sản phẩm phản ứng. Hình 2.25 và 2.26 cũng cho thấy khi sử dụng 15 đơn vị glucose oxidase, sucrose và glucose phản ứng hết và lượng FOS tạo thành đạt gần 98%. Có thể kết luận 15 đơn vị glucose oxidase đủ để sản xuất FOS cao độ. Lượng catalase lẫn trong glucose oxidase (dưới 1%) cũng góp phần phân hủy H2O2 (Lưu ý rằng ngay cả một dấu vết nhỏ của catalase cũng là một số lớn đơn vị). Hình 2.26: Ảnh hưởng của nồng độ glucose oxidase lên tỉ lệ tạo FOS [57]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  241  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.27: Tỉ lệ các loại đường trong hỗn hợp phản ứng ở điều kiện tối ưu [57] Hình 2.28: Sắc ký đồ HPLC của FOS và FOS cao độ [57] Thời gian lưu 5.2, 5.9, 6.9, 8.2 phút tương ứng nystose, 1-kestose, sucrose, glucose  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  242  Chương 2: Fructooligosaccharide Bảng 2.8 cho thấy thành phần đường trong sản phẩm FOS cao độ thu được dưới các điều kiện phản ứng tối ưu đã mô tả và một số khác biệt chủ yếu khi so sánh với sản xuất FOS chỉ sử dụng-fructofuranosidase. Bảng 2.8: Thành phần đường so sánh giữa FOS và FOS cao độ a  Đường Glucose Sucrose 1-kestose Nystose FOS tổng  FOSb 27.73 14.01 39.78 18.48 58.26  FOS cao độ c 0 1.68 43.63 54.69 98.32d [57] a: % theo hàm lượng chất khô; b: điều kiện phản ứng: 10 đơn vị-fructofuranosidase cho 1 gram sucrose, 400C, pH 5.5, 25h c: điều kiện phản ứng: 10 đơn vị-fructofuranosidase và 15 đơn vị glucose oxidase cho 1 gram sucrose trong điều kiện tối ưu đã mô tả. d: acid gluconic đã được loại ra bằng cột resin trao đổi cation trước khi phân tích HPLC. Các dạng đường FOS cao hơn nystose chỉ thấy ở dạng vết, mặc dù hàm lượng cao của nystose được duy trì trong suốt thời gian phản ứng. Theo cơ chế phản ứng của- fructofuranosidase thì dạng đường FOS cao hơn, chẳng hạn như fructofuranosylnystose (GF4), sẽ được tạo ra bằng cách sử dụng nystose như cơ chất nền. Kết quả này cho thấy sự khác biệt đáng kể trong động học của-fructofuranosidase giữa một hệ thống chỉ sử dụng duy nhất-Fructofuranosidase và hệ thống hỗn hợp 2 enzyme này. Có thể kết luận đây là một phương pháp đầy hứa hẹn cho sản xuất FOS cao độ lên đến 98% bằng cách sử dụng một hệ hỗn hợp enzyme-fructofuranosidase và glucose oxidase. Hệ hỗn hợp enzyme rõ ràng đóng một vai trò quan trọng trong việc nâng cao độ tinh khiết của FOS, không chỉ bởi việc loại bỏ glucose, mà sucrose cũng được sử dụng tối đa.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  243 Chương 2: Fructooligosaccharide  2.6. Ứng  dụng  công  nghệ  enzyme  để  thu  nhận  đường  chức  năng fructooligosaccharide từ dịch mía ở Việt Nam [10] 2.6.1. Tóm tắt nghiên cứu Nước ta là nước có ngành công nghiệp mía đường khá phát triển, các vùng nguyên liệu mía phân bố khá rộng rãi (5 vùng sinh thái) trải rộng từ Bắc vào Nam. Do đó, chúng ta sản xuất đường FOS từ nguyên liệu ban đầu là mía khá thuận lợi. Mục đích của nghiên cứu là tìm hiểu các đặc tính của enzyme-fructofuranosidase trong chế phẩm enzyme thương mại Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) nhằm ứng dụng thu nhận đường chức năng FOS từ dịch mía. Chế phẩm Pectinex Ultra SP-L chứa-fructofuranosidase với hoạt lực 58.1 U/ml. Các điều kiện tối ưu được chọn: nhiệt độ 400C, pH 5.6, 240ml và tỉ lệ enzyme : dịch mía là 2 : 100 (v/v). Sirô FOS thu được sau khi sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L chứa các thành phần đường như sau: 50.4% FOS, 10.4% saccharose, 3.9% fructose và 35.3% glucose. 2.6.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu: DÞch mÝa cña gièng mÝa chÝn trung b×nh F156 trång trong vô 2005 - 2006 ®ưîc sö dông ®Ó nghiªn cøu. §ưêng saccharose là lo¹i ®ưêng tr¾ng tinh luyÖn cã hàm lưîng 99,62%, cã ®é Èm 0,05% và ®ưêng khö: < 0,05%. ChÕ phÈm enzyme pectinex Ultra SP-L (hãng Novozymes, §an M¹ch) là chÕ phÈm d¹ng láng, màu n©u ®en, ®Æc s¸nh, cã mïi th¬m ®Æc trưng, trong ®ã cã chøa enzyme-D- fructofuranosidase ®ưîc s¶n xuÊt tõ chñng aspergillus niger. Phư¬ng ph¸p: TiÕn hành 4 ®ît lÊy mÉu mÝa ë 4 giai ®o¹n (thêi ®iÓm) kh¸c nhau ®Ó kiÓm tra thành phÇn ®ưêng trong dÞch mÝa. Mçi ®ît tiÕn hành kiÓm tra 3 mÉu ®Ó lÊy kÕt qu¶ trung b×nh.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  244 Chương 2: Fructooligosaccharide Ho¹t tÝnh cña enzyme b-D Fructofuranosidase ®ưîc x¸c ®Þnh theo phư¬ng ph¸p do Seikagaku ®Ò xuÊt (tham kh¶o tài liÖu cña Whitaker &cs, 2004), hàm lưîng ®ưêng khö theo phư¬ng ph¸p Lane - Eynone (tham kh¶o tài liÖu cña §Æng ThÞ Thu & cs, 1997), hàm lưîng ®ưêng theo phư¬ng ph¸p ®ưîc NguyÔn V¨n Mïi m« t¶ (2001) và thành phÇn và hàm lưîng ®ưêng trong s¶n phÈm FOS thu ®ưîc b»ng phư¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) trªn hÖ thèng s¾c ký HP 1100 (hãng Aligence, Mü) t¹i Phßng ph©n tÝch và kiÓm ®Þnh chÊt lưîng thùc phÈm, ViÖn C«ng NghiÖp Thùc PhÈm. C¸c lo¹i ®ưêng trong mÉu chuÈn (Trung Quèc) và mÉu nghiªn cøu ®ưîc ph©n chia trªn cét s¾c ký supelco Ca 30cm x 7,8mm ID (hãng Supelco, Mü), tèc ®é dßng ch¶y 1ml/min, Detector là Detector ®o chØ sè khóc x¹ - RI. 2.6.3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận: X¸c ®Þnh ho¹t tÝnh cña enzyme-D-fructofuranosidase trong chÕ phÈm Pectinex Ultra SP-L và hàm lưîng ®ưêng saccharose trong dÞch mÝa: §Ó cã ®Þnh hưíng sö dông chÕ phÈm enzyme pectinex-Ultra SP-L, ho¹t tÝnh cña enzyme-D fructofuranosidase ®ã ®ưîc x¸c ®Þnh. Sè ®¬n vÞ ho¹t tÝnh trong 1ml dung dÞch chÕ phÈm enzyme là 58,1 U/ml. Do chÕ phẩm Pectinex Ultra SP-L chøa enzyme-D fructofuranosidase, do ®ã cã thÓ sö dông chÕ phÈm này ®Ó thu nhËn c¸c fructooligosaccharide (FOS) tõ ®ưêng saccharose. Hàm lưîng 3 lo¹i ®ưêng chÝnh trong dÞch mÝa thu ®ưîc tr×nh bày ë b¶ng 2.9. Bảng 2.9: Thành phần đường trong dịch mía Đợt kiểm tra Saccharose Glucose Fructose (% w/w) (% w/w) (% w/w) 1 90.6 6.2 3.2 2 91.6 6.3 2.1 3 90.6 6.2 3.2 4 90.6 6.2 3.2 Trung bình 90.9 6.2 2.9 [10]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  245 Chương 2: Fructooligosaccharide Sè liÖu cña b¶ng 2.9 cho thÊy thành phÇn ®ưêng trong nưíc mÝa tư¬ng ®èi ®ång ®Òu trªn 4 mÉu nưíc mÝa ph©n tÝch. Trong sè 3 lo¹i ®ưêng x¸c ®Þnh, dÞch mÝa chøa hàm lưîng ®ưêng saccharose là chñ yÕu (~ 90%). Ngoài ra dÞch mÝa cßn chøa ®ưêng glucose (~6%) và ®ưêng fructose (~3%). X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn tèi ưu cho enzyme ho¹t ®éng: Ảnh hưëng cña nhiÖt ®é, pH và thêi gian ph¶n øng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzyme và kh¶ n¨ng vËn chuyÓn ®ưêng fructose ®Ó t¹o thành ®ưêng FOS ®ã ®ưîc nghiªn cøu. H×nh 2.28 cho thÊy hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng dÇn tõ nhiÖt ®é 25- 400C và ®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ nhiÖt ®é 400C víi hàm lưîng là 6,9%. Sau ®ã hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn gi¶m dÇn tõ nhiÖt ®é 45- 500C. §iÒu ®ã chøng tá kh¶ n¨ng ph¶n øng thÓ hiÖn ho¹t tÝnh transferase cña enzyme ®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ nhiÖt ®é 400C. Hình 2.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng vận chuyển Fructose [10] H×nh 2.29 cho thÊy khi gi¸ trÞ pH t¨ng tõ 4,5-5,5, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS còng t¨ng lªn và ®¹t cùc ®¹i t¹i gi¸ trÞ pH 5,5 víi hàm lưîng fructose chuyÓn hãa ®¹t 6,9%. Sau ®ã, khi tiÕp tôc t¨ng tõ pH 5,5-7, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn l¹i gi¶m xuèng. T¹i gi¸ trÞ pH = 7 hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn chØ b»ng 09%. T¹i gi¸ trÞ pH 5,5 hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS ®¹t gi¸ trÞ cao nhÊt.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  246  Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.30: Ảnh hưởng của pH đến khả năng vận chuyển Fructose [10] H×nh 2.30 cho ta thÊy thêi gian ph¶n øng càng t¨ng th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS càng t¨ng. Thêi gian ph¶n øng t¨ng tõ 30 ®Õn 240 phót th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng cao trªn 1%. Hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn ë møc thÊp nhÊt là 0.3% ë 30 phót. Víi thêi gian tõ 240 phót ®Õn 300 phót th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¨ng lªn kh«ng ®¸ng kÓ. V× vËy, thêi gian ph¶n øng cña chÕ phÈm enzyme ®ưîc chän là 240 phót. Lóc này, hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS ®¹t 7,0%. Trªn c¬ së c¸c kÕt qu¶ thu ®ưîc nhiÖt ®é 40oC, pH 5,5 và thêi gian ph¶n øng 240 phót ®ã ®ưîc chän cho ph¶n øng thu nhËn ®ưêng FOS tõ dÞch mÝa. Hình 2.31: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng vận chuyển Fructose [10]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  247  Chương 2: Fructooligosaccharide Ảnh hưëng cña tû lÖ enzyme/c¬ chÊt tíi sù biÕn ®æi thành phÇn ®ưêng: Lưîng chÕ phÈm enzyme bæ sung là mét yÕu tè rÊt quan träng nh»m t¨ng kh¶ n¨ng thñy ph©n và vËn chuyÓn, chÊt lưîng và gi¸ thành s¶n phÈm. NÕu bæ sung víi lưîng enzyme thÊp th× kh¶ n¨ng thñy ph©n thÊp, thêi gian thñy ph©n kÐo dài làm cho s¶n phÈm biÕn màu, chÊt lưîng và thành phÇn ®ưêng biÕn ®æi kh«ng như mong muèn. Ngưîc l¹i nÕu lưîng chÕ phÈm enzyme bæ sung càng cao th× hiÖu qu¶ thñy ph©n còng càng cao (®¹t ®Õn ®iÓm cùc ®¹i). Tuy nhiªn bæ sung enzyme trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt cÇn ph¶i quan t©m ®Õn gi¸ thành cña enzyme. V× vËy ®Ó ®¶m b¶o c¶ yÕu tè kinh tÕ và yÕu tè kü thuËt ph¶i chän ra mét tû lÖ thÝch hîp gi÷a c¸c yÕu tè ®ã. Khi bæ sung enzyme víi c¸c lưîng kh¸c nhau tõ 0,005 ®Õn 0,04 và tiÕn hành ph¶n øng ë ®iÒu kiÖn: nhiÖt ®é: 400C, pH 5,5 và thêi gian ph¶n øng 240 phót, lưîng enzyme t¨ng th× hàm lưîng fructose vËn chuyÓn t¹o FOS còng t¨ng theo (b¶ng 2.10). §iÒu ®ã chøng tá ho¹t tÝnh transferase cña enzyme còng t¨ng khi nång ®é enzyme t¨ng. Khi lưîng enzyme t¨ng tõ 0,005 - 0,02 th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¹o FOS t¨ng tõ 0,6% ®Õn 6,9%. Nhưng khi lưîng enzyme t¨ng tõ 0,02 ®Õn 0,04 th× hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn chØ t¨ng tõ 6,9% ®Õn 7,9% (=1%). Như vËy là hàm lưîng fructose ®ưîc vËn chuyÓn t¨ng rÊt chËm tõ nång ®é ezyme trong kho¶ng này. Bªn c¹nh ®ã hàm lưîng saccharose+FOS gi¶m dÇn theo chiÒu t¨ng cña lưîng enzyme, cßn ngưîc l¹i hàm lưîng glucose t¨ng dÇn theo chiÒu t¨ng cña lưîng enzyme. Sè liÖu còng cho thÊy kh¶ n¨ng thñy ph©n cña enzyme t¨ng dÇn khi t¨ng nång ®é enzyme. KÕt qu¶ thu ®ưîc ë b¶ng 2.10 cho phÐp chän tû lÖ enzyme/c¬ chÊt: 2ml chÕ phÈm enzyme cho 100ml dÞch mÝa trong quy tr×nh s¶n xuÊt là hîp lý h¬n ®¸p øng yªu cÇu vÒ gi¸ thành cho s¶n phÈm.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  248 Chương 2: Fructooligosaccharide Bảng 2.10: Ảnh hưởng của tỉ lệ Enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đường Tỉ lệ Enzyme/nước mía Saccharose + FOS (%w/w) Glucose (%w/w) Fructose (%w/w) Fructose vận chuyển (v/v) (%w/w) 0 90.6 6.2 3.2 0 0.005 85.7 9.0 5.3 0.6 0.01 82.2 11.7 6.1 2.6 0.015 80.1 13.9 6.0 4.8 0.02 73.5 18.2 8.2 6.9 0.025 73.4 18.4 8.1 7.2 0.03 71.7 19.5 8.8 7.6 0.035 70.6 20.1 9.3 7.7 0.04 69.7 20.6 9.7 7.9 [10] Thành phÇn ®ưêng FOS cã trong s¶n phÈm: Thành phÇn và hàm lưîng c¸c lo¹i ®ưêng cã trong chÕ phÈm FOS ®ã ®ưîc x¸c ®Þnh và ®Þnh lưîng (h×nh 2.31, 2.32 và b¶ng 2.11). Siro FOS thu nhËn ®ưîc theo quy tr×nh s¶n xuÊt tr×nh bày ë s¬ ®å 1 ®ưîc ph©n tÝch thành phÇn và hàm lưîng c¸c lo¹i ®ưêng trªn m¸y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC). MÉu ®èi chøng là ®ưêng FOS b¸n trªn thÞ trưêng Trung Quèc. Sè liÖu b¶ng 2.11 và s¾c ký ®å (h×nh 2.31 và 2.32) cho thÊy hàm lưîng FOS ®¹t gi¸ trÞ cao nhÊt, chiÕm 50,4%, hàm lưîng fructose chiÕm tû lÖ thÊp nhÊt 3,9%. Bªn c¹nh ®ã hàm lưîng saccharose cßn l¹i víi tû lÖ thÊp (10,4%) và lưîng glucose chiÕm tû lÖ kh¸ cao (35,3%). §iÒu này chøng tá hiÖu qu¶ thñy ph©n và kh¶ n¨ng vËn chuyÓn fructose cña chÕ phÈm enzyme pectinex Ultra SP-L ®¹t tû lÖ cao. Víi hàm lưîng fructose chiÕm 3,9% cho thÊy hiÖu suÊt chuyÓn hãa rÊt cao. Víi viÖc sö dông chÕ phÈm enzyme Pectinex Ultra SP-L cho siro FOS cã chÊt lưîng tư¬ng ®ư¬ng như ®ưêng FOS cña Trung Quèc b¸n trªn thÞ trưêng.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  249 Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.32: Sắc ký đồ của đường FOS và các loại đường trong mẫu nghiên cứu [10] Hình 2.33: Sắc ký đồ của đường FOS chuẩn [10] Bảng 2.11: Thành phần và hàm lượng đường có trong sản phẩm FOS  Loại đường FOS Saccharose Glucose Fructose  Hàm lượng (%) 50.4 10.4 35.3 3.9  [10]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  250  Chương 2: Fructooligosaccharide Quy tr×nh s¶n xuÊt đề nghị: Hình 2.34: Sơ đồ quy trình sản xuất siro FOS từ nước mía sử dụng Pectinex Ultra SP- L [10] 2.6.4. Kết luận Hoạt tính của enzyme-D-fructofuranosidase có trong chế phẩm Pectinex Ultra SP- L là 58.1U/ml. C¸c ®iÒu kiÖn cho viÖc xö lý enzyme Pectinex Ultra SP-L ®ã ®ưîc lùa chän gåm: NhiÖt ®é thÝch hîp là 400C, pH thÝch hîp là 5.5, thêi gian ph¶n øng là 240 phót, tû lÖ enzyme/nưíc mÝa (200Bx) là 2ml/100ml dÞch mÝa.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  251  Chương 2: Fructooligosaccharide Tõ ®ã nghiªn cøu ®Ò xuÊt mét quy tr×nh s¶n xuÊt siro FOS tõ nưíc mÝa cã sö dông chÕ phÈm Pectinex Ultra SP-L víi Siro FOS thành phÈm cã thành phÇn và hàm lưîng c¸c lo¹i ®ưêng là: ®ưêng FOS: 50,4%, saccharose: 10,4%, fructose: 3,9% và glucose: 35,3%. 2.7. Nghiên cứu sử dụng đường FOS trong sản xuất một số thực phẩm chức năng ở Việt Nam [18] 2.7.1. Sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em Nghiªn cøu s¶n xuÊt dét dinh dưìng trÎ em ®· ®ưîc thùc hiÖn t¹i Viện C«ng nghiÖp thùc phÈm tõ nh÷ng n¨m 90 cña thÕ kû trưíc. KÕt qu¶ nghiªn cøu ®· ®ưîc chuyÓn giao ®Õn nhiÒu c¬ së s¶n xuÊt và ngay t¹i ViÖn C«ng nghiÖp thùc phÈm chóng t«i còng cã mét d©y chuyÒn s¶n xuÊt theo c«ng nghÖ nÊu Ðp næ ®· nghiªn cøu. §Ó ®¹t ®ưîc môc ®Ých là ®ưa s¶n phÈm ®ưêng FOS vào bét dinh dưìng trÎ em nh»m n©ng cao gi¸ trÞ dinh dưìng còng như gi¸ trÞ sinh häc, chóng t«i ®· tËn dông d©y chuyÒn thiÕt bÞ cã s½n, c¶i tiÕn c«ng nghÖ c¬ së trong nghiªn cøu sö dông ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt bét dinh dưìng trÎ em. §èi tưîng nghiªn cøu cña chóng t«i là bét dinh dưìng lo¹i ngät.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  252 Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.35: Sơ đồ quy trình sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em có bổ sung FOS [18] Bột dinh dưỡng có bổ sung đường chức năng FOS sau đó được đem đi phân tích thành phần dinh dưỡng và đánh giá cảm quan. Kết quả được trình bày ở bảng 2.12 và 2.13. Bảng 2.12: Thành phần của bột dinh dưỡng trẻ em  Các chỉ tiêu  Đơn vị tính  Bột dinh dưỡng  Bột dinh dưỡng FOS thường Ẩm Đạm Béo Glucid tổng Đường FOS % % % % % 6.0 12.5 4.5 75.5 0 6.0 12.0 4.0 76.5 5 [18]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  253  Chương 2: Fructooligosaccharide Bảng 2.13: Kết quả đánh giá cảm quan bột dinh dưỡng trẻ em (thang điểm 10)  Các chỉ tiêu Màu Mùi Vị Hương Trạng thái Tổng thể  Bột thường 9 9 8 9 9 8.8  Bột có bổ sung FOS 9.5 9 9 9 8.5 9 [18] KÕt qu¶ nghiªn cøu cho thÊy viÖc bæ sung ®ưêng FOS thay thÕ ®ưêng kÝnh trong s¶n xuÊt bét dinh dưìng trÎ em là hoàn toàn dÔ dàng và kh¶ thi trong s¶n xuÊt lín v× c«ng nghÖ s¶n xuÊt mÆt hàng míi này kh«ng cÇn sù thay ®æi lín vÒ thiÕt bÞ còng như c«ng nghÖ mà s¶n phÈm thu ®ưîc l¹i cã hư¬ng vÞ th¬m ngon h¬n so víi s¶n phÈm th«ng thưêng l¹i mang ®Æc tÝnh chøc n¨ng gióp cho trÎ dÔ tiªu ho¸, ¨n ngon miÖng và cßn phßng chèng mét sè bÖnh kh¸c n÷a như ®Æc tÝnh cña ®ưêng FOS ®· giíi thiÖu. VÒ mÆt gi¸ thành s¶n phÈm này sÏ ®¾t h¬n so víi mÉu ®èi chøng là 2334 ®/kg. Sù t¨ng gi¸ này qu¸ nhá so víi gi¸ thành bét dinh dưìng bán trên thị trường. 2.7.2. Sản xuất bánh bích quy B¸nh bÝch quy là s¶n phÈm ®ưîc s¶n xuÊt tõ hai nguyªn liÖu chÝnh là bét m× và ®ưêng cïng víi c¸c chÊt bæ dưìng như b¬, trøng, s÷a... th«ng qua qu¸ tr×nh nưíng, dưíi t¸c dông cña nhiÖt ®é, s¶n phÈm thu ®ưîc là mét lo¹i thùc phÈm th¬m ngon dÏ tiªu ho¸, giàu hydratcabon, protein và lipit. Víi ®Æc tÝnh là s¶n phÈm kh«, hàm lưîng nưíc thÊp nªn b¸nh quy rÊt dÔ b¶o qu¶n và thuËn tiÖn cho viÖc chuyªn chë còng như tiªu dïng. V× thÕ b¸nh quy tõ bao ®êi nay lu«n là s¶n phÈm ®ưîc ngưêi tiªu dïng ưa thÝch. C¸c ®èi tưîng sö dông b¸nh quy rÊt ®a d¹ng, tõ trÎ em ®Õn ngưêi già, tõ ngưêi khoÎ ®Õn ngưêi bÖnh. Ph¹m vi sö dông còng rÊt réng tõ thành phè ®Õn c¸c miÒn xa x«i hÎo l¸nh. V× ®ưêng FOS cã c¸c tÝnh chÊt và hư¬ng vÞ gÇn gièng như ®ưêng kÝnh, nªn hưíng bæ sung ®ưêng FOS vào b¸nh bÝch quy như mét chÊt thay thÕ ®ưêng kÝnh. Còng như trong  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  254 Chương 2: Fructooligosaccharide s¶n xuÊt bét dinh dưìng, môc tiªu cña s¶n phÈm là ph¶i chøa tõ 5% – 10 % ®ưêng FOS. §èi tưîng sö dông sÏ là FOS 50 ®Ó gi¶m gi¸ thành. S¶n phÈm b¸nh bÝch quy cã bæ sung ®ưêng FOS sau ®ã ®ưîc ®em ®i ph©n tÝch thành phÇn dinh dưìng và ®¸nh gi¸ chÊt lưîng c¶m quan, kÕt qu¶ ®ưîc thÓ hiÖn trªn b¶ng 2.14 và 2.15. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn ta thÊy viÖc sö dông ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt b¸nh bÝch quy c«ng nghiÖp là hoàn toàn kh¶ thi. S¶n phÈm míi này ngoài gi¸ trÞ c¶i thiÖn chÊt lưîng cña b¸nh quy ra nã cßn cã t¸c dông c¶i thiÖn và phßng chèng bÖnh tËt cña ®ưêng FOS n÷a. Hình 2.36: Sơ đồ quy trình sản xuất bánh bích quy sử dụng đường FOS [18]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  255  Chương 2: Fructooligosaccharide Bảng 2.14: Thành phần của bánh bích quy  Các chỉ tiêu Ẩm Đạm Béo Glucid tổng Đường FOS  Đơn vị tính % % % % %  Bánh quy thường 6.20 6.80 3.90 69.3 0  Bánh quy FOS 6.2 6.8 3.92 70.0 7 [18]  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  256 Chương 2: Fructooligosaccharide Bảng 2.15: Kết quả đánh giá cảm quan bánh bích quy (thang điểm 10)  Các chỉ tiêu Màu Mùi Vị Hương Trạng thái Tổng thể  Bánh quy thường 9 9 8 9 9 9  Bánh quy FOS 9.5 9 9 9 9 9.1 [18] 2.7.3. Sản xuất kẹo KÑo là mét trong nh÷ng s¶n phÈm chÝnh, chiÕm khèi lưîng bËc nhÊt trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn ®ưêng. Phô thuéc vào ®Æc tÝnh như tr¹ng th¸i, thành phÇn, mÉu mã và hư¬ng vÞ, kÑo ®ưîc chia ra làm nhiÒu chñng lo¹i như kÑo cøng, kÑo mÒm, kÑo dai ... Do ®Æc tÝnh dÔ b¶o qu¶n, thuËn tiÖn sö dông và hư¬ng vÞ th¬m ngon nªn kÑo ®· ®ưîc s¶n xuÊt và tiªu dïng réng r·i tõ bao ®êi nay trªn kh¾p thÕ giíi, cho mäi ®èi tưîng. §Ó t¨ng cưêng gi¸ trÞ cña kÑo chóng t«i tiÕn hành nghiªn cøu sö dông ®ưêng chøc n¨ng FOS víi môc ®Ých gióp cho ®«ng ®¶o ngưêi tiªu dïng ®ưîc tiÕp nhËn s¶n phÈm ®ưêng chøc n¨ng FOS ®Ó c¶i thiÖn và t¨ng cưêng kh¶ n¨ng phßng chèng bÖnh tËt. Trong khu«n khæ thêi gian và kinh phÝ cã h¹n nên chØ chän lo¹i kÑo cøng kh«ng nh©n làm ®èi tưîng nghiªn cøu.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  257 Chương 2: Fructooligosaccharide Hình 2.37: Sơ đồ quy trình sản xuất đường cứng sử dụng đường FOS [18] ViÖc bæ sung ®ưêng FOS vào s¶n xuÊt kÑo thùc tÕ cho kÕt qu¶ rÊt tèt, ngoài nh÷ng ®Æc tÝnh cã ®ưîc nhê hàm lưîng ®ưêng FOS cã chøa trong nã, gi¸ trÞ c¶m quan cña kÑo cßn ®ưîc ®¸nh gi¸ rÊt cao bëi hư¬ng th¬m vÞ ngät dÞu m¸t và ®é xèp dÎo. Trong sè c¸c chuyªn gia cña héi ®ång c¶m quan cßn cho biÕt, vÞ ngät m¸t cña kÑo khi thay thÕ ®ưêng FOS cã ®ưîc là do kh«ng nh÷ng tù b¶n th©n ®ưêng FOS mang ®Õn mà h×nh như ®ưêng FOS cßn cã kh¶ n¨ng c¶i thiÖn vÞ ngät cña ®ưêng kÝnh và c¸c lo¹i ®ưêng kh¸c làm cho chóng dÞu h¬n, m¸t h¬n.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  258  Chương 2: Fructooligosaccharide B¶ng 2.16 và 2.17 dưíi ®©y là kÕt qu¶ ph©n tÝch so s¸nh thành dinh dưìng và ®iÓm c¶m quan cña s¶n phÈm kÑo cøng bæ sung 200 g/kg ®ưêng FOS víi mÉu kÑo ®èi chøng. Bảng 2.16: Thành phần của hai loại kẹo  Các chỉ tiêu Ẩm Đạm Béo Glucid tổng Đường FOS  Đơn vị tính % % % % %  Kẹo cứng thường 6.2 2.2 3.1 80 0  Kẹo cứng FOS 6.2 2.15 3.0 82 7.5 [18] Bảng 2.17: Kết quả đánh giá cảm quan của hai loại kẹo  Các chỉ tiêu Màu Mùi Vị Hương Trạng thái Tổng thể  Kẹo cứng thường 9 8.5 7.5 9 9 8.6  Kẹo cứng FOS 9.5 9 9 9 9 9.1  [18]  2.8.  Kết luận chung về sản xuất FOS và ứng dụng cho đến nay  FOS được sản xuất trên quy mô công nghiệp sử dụng hệ enzyme fructosyltransferase từ vi sinh vật. Cho đến nay quy trình sản xuất đã có nhiều bước tiến vượt bậc cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học trên toàn cầu. Các phương pháp cố định enzyme, cố định tế bào giúp FOS được sản xuất hàng loạt với quy mô lớn hơn. FOS cao độ được sản xuất với các phương pháp sử dụng hệ đa enzyme, lọc nano, lên men… đảm bảo độ tinh khiết của FOS khi bổ sung vào thực phẩm. Phương pháp phân tích thành phần FOS được sử dụng phổ biến hiện nay với độ chính xác cao là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  259 Chương 2: Fructooligosaccharide Một bước tiến mới trong kĩ thuật di truyền đã mở ra một kỉ nguyên mới cho FOS. Các nhà khoa học đã nghiên cứu tạo dòng gene sản xuất fructosyltransferase vào E.coli, giúp việc sản xuất FOS trên quy mô công nghiệp dễ dàng hơn với năng suất cao hơn gấp bội. Như vậy, với các đặc tính chức năng quan trọng, FOS ngày càng được biết đến là một trong những thực phẩm chức năng hàng đầu hiện nay, tạo nên bước tiến mới trong ngành công nghiệp thực phẩm. Ở nước ta, FOS chưa được sản xuất hàng loạt mà mới chỉ thử nghiệm trên quy mô nhỏ. Trong tương lai không xa, với nguồn nguyên liệu tại chỗ dồi dào là mía, tiềm năng cho sản xuất FOS của Việt Nam là rất lớn và cần được đầu tư đúng mức.  SVTH: Vũ Thị Ngọc An  260 KẾT LUẬN CHUNG ĐỀ TÀI Đồ án “Công nghệ sinh học ứng dụng trong sản xuất và chế biến thực phẩm chức năng” đã trình bày một cách tổng quát những vấn đề liên quan đến thực phẩm chức năng hiện nay và đi sâu vào 2 hướng lớn: ứng dụng công nghệ di truyền để làm giàu các chất dinh dưỡng chức năng với nhóm sản phẩm bổ sung folate và ứng dụng công nghệ vi sinh trong sản xuất và chế biến thực phẩm chức năng với 2 sản phẩm được quan tâm hiện nay là tảo Spirulina và đường chức năng Fructooligosaccharide. Bước đầu các hướng nghiên cứu của đề tài đã khái quát tình hình phát triển và sản xuất các sản phẩm đã nêu, tổng hợp lại một số nghiên cứu đã được khoa học công nhận và đề ra hướng phát triển trong thực trạng Việt Nam hiện nay./. - 261 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo trong nước: [1]. Clive James (2007). Báo cáo tóm tắt : Hiện trạng cây trồng CNSH/ cây trồng chuyển đổi gen trên toàn cầu năm 2007, ISAAA. [2]. Công nghệ gen trong nông nghiệp. Giáo trình Đại học Huế. [3]. Dương Thanh Liêm (2009), Thực phẩm chức năng và sức khỏe bền vững, NXB ĐH Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh. [4]. Glick, B. R., Pasternak, J. J. (2007). Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý và ứng dụng của DNA tái tổ hợp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. [5]. Huỳnh Lâm Minh Thùy (2008), Ứng dụng Spirulina vào sản xuất sữa chua, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. [6] Lã Tuấn Nghĩa, Trần Duy Quý (2005). Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam trong 20 năm qua (1985-2005). Tạp chí Sinh học, 28, 1-9. [7]. Lê Văn Lăng (1999), Spirulina, NXB Y Học. [8]. Lương Đình Quát (2007), Nghiên cứu các phương pháp xử lý sinh khối vi khuẩn lam S.platensis để sản xuất một số loại nước uống giàu dinh dưỡng, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. [9]. Mai Ngọc Thảo (2008), Ứng dụng Spirulina vào sản xuất bánh mì ngọt và bánh mì lạt, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. [10]. Ngô Xuân Mạnh và cộng sự (2006), Ứng dụng công nghệ Enzyme để thu nhận đường chức năng Fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, tập IV, số 6, 105 – 111. - 262 - [11]. Nguyễn Đình Thị Như Nguyện (2009), Nghiên cứu quá trình tinh sạch Fructooligosaccharide bằng phương pháp lọc nano, Luận văn cao học công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh. [12] Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2002). Công nghệ gen. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp.HCM. [13]. Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh tập 2 - Vi sinh vật học công nghiệp, NXB ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. [14]. Nguyễn Tài Lương (2005). Thực phẩm chức năng-Thức ăn của con người ở thế kỷ 21. Ứng dụng công nghệ sinh học tạo các chế phẩm thực phẩm chức năng phục vụ sức khỏe của cộng đồng. Tạp chí sinh học, 27, 1-5. [15]. Nguyễn Thị Như Ngọc (2003), Nghiên cứu chế biến một số thực phẩm có bổ sung tảo Spirulina, Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. [16]. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998). Giáo trình sinh hóa hiện đại. Nhà xuất bản Giáo Dục. [17]. Trần Hồng Hà (2004). An toàn sinh học- Đánh giá và quản lý rủi ro các sinh vật biến đổi gen, Nhà xuất bản Bộ tài nguyên và môi trường. [18]. Trịnh Thị Kim Vân và cộng sự (2004), Nghiên cứu sản xuất đường fructooligosaccharide bằng công nghệ đa enzyme và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng, Báo cáo tổng kết Khoa học và kỹ thuật, Bộ Khoa học và công nghệ - Viện công nghiệp thực phẩm. Tài liệu tham khảo nước ngoài: [19]. Ahsan, M., Habib, B., Parvin, M. (2008), A review on culture, production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish, Department of Aquaculture, Bangladesh Agricultural University, Mymensingh, Bangladesh. - 263 - [20]. Bagley, P. J. & Selhub, J. (2000). Analysis of Folate Form Distribution by Affinity Followed by Reversed-Phase Chromatography with Electrochemical Detection. Clin. Chem. 46, 404–411. [21]. Basset, G., Quinlivan, E. P., Ziemak, M. J., Díaz de la Garza, R., Fischer, M., Schiffmann, S., Bacher, A., Gregory, J. F., III, & Hanson, A. D. (2002). Folate synthesis in plants: The first step of the pterin branch is mediated by a unique bimodular GTP cyclohydrolase I. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12489–12494. [22]. Bekaert, S. et al. (2008). Folate biofortification in food plants. Trends in Plant Science. 13, 28-35. [23]. Chien, C.S., Lee, W.C, Lin, T.J. (2001), Immobilization of Aspergillus japonicus by entrapping cells in gluten for production of fructooligosaccharides, Enzyme and Microbial Technology 29, 252 – 257. [24]. Daniell. H; Singh, N. D; Mason, H; Streatfield, S. J (2009) Plant-made vaccine antigens and biopharmaceuticals. Trends in Plant Science, 14, 669-679. [25]. Datta, S. and Bouis, H.E. (2000) Application of biotechnology to improving the nutritional quality of rice. Food Nutr. Bull. 21, 451–456. [26]. Deikman, J., Kline, R. & Fischer, R. L. (1992) Organization of Ripening and Ethylene Regulatory Regions in a Fruit-Specific Promoter from Tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Physiol. 100, 2013–2017. [27]. Díaz de la Garza, R. et al. (2004) Folate biofortification in tomatoes by engineering the pteridine branch of folate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13720–13725. [28]. Díaz de la Garza, R.I. et al. (2007) Folate biofortification of tomato fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4218–4222. [29]. Fell, D. A. (1998) Increasing the flux in metabolic pathways: A metabolic control analysis perspective.Biotechnol. Bioeng. 58, 121–124. - 264 - [30]. Fukushima, T. & Nixon, J. C. (1980) Anal. Biochem. 102, 176–188. [31]. Hanson, A.D. and Roje, S. (2001) One-carbon metabolism in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52, 119–137. [32]. Henrichkson, R. (2009), Earth Food Spirulina, Ronore Enterprises, Inc., Hana, Maui, Hawaii. [33]. Hossain, T., Rosenberg, I., Selhub, J., Kishore, G., Beachy, R. & Schubert, K.(2004). Enhancement of folates in plants through metabolic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 5158–5163. [34]. Klee, H. J. & Kishore, G. M. (1996). U.S. Patent 5,512,466. [35]. Kohashi, M., Tomita, K. & Iwai, K. (1980). Analysis of Conjugated Pterins in Food Resources and Human Urine. Agric. Biol. Chem. 44, 2089–2094. [36]. Konings, E. J., Roomans, H. H., Dorant, E., Goldbohm, R. A., Saris, W. H. & van den Brandt, P. A. (2001). Folate intake of the Dutch population according to newly established liquid chromatography data for foods. Am. J. Clin. Nutr, 73, 765–776. [37]. Koziel, M. G., Carozzi, N. B. & Desai, N. (1996) Optimizing expression of transgenes with an emphasis on post-transcriptional events. Plant Mol. Biol. 32, 393–405. [38]. Lin, T.J., Lee, Y.C. (2008), High content fructooligosaccharides production using two immobilized microorganisms in an internal-loop air [39]. Lobo, A.R., Colli, C., Tullia, M.C, Filisetti, C. (2006), Fructooligosaccharide improve bone mass and biomechanical properties in rats, Nutrition Research 26, 413 – 420. [40]. Mesa, M.D., Silván, J.M., Olza, J., Gil, A., Castillo, M.D. (2008), Antioxidant properties of soy protein–fructooligosaccharide glycation systems and its hydrolyzates, Food Research International 41, 606 – 615. - 265 - [41]. Murr, C. et al. (2002) Neopterin as a marker for immune system activation. Curr. Drug Metab. 3, 175–187. [42]. Nestel, P. et al. (2006) Biofortification of staple food crops. J. Nutr. 136, 1064– 1067. [43]. Nguyen, Q.D., Szabó., J.M.R., Bhat, M.K., Hoschke, A. (2005), Purification and some properties of-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386, Process Biochemistry 40, 2461 – 2466. [44]. Patarca, R. J. (2003). The Role of Pteridines in Physiology and Pathology Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 22, 117–127. [45]. Pfeiffer, C. M. & Gregory, J. F., III (1996). Enzymatic deconjugation of erythrocyte polyglutamyl folates during preparation for folate assay: investigation with reversed- phase liquid chromatography .Clin. Chem. 42,1847–1854. [46]. Quinlivan, E. P., Roje, S., Basset, G., Shachar-Hill, Y., Gregory, J. F., III, & Hanson, A. D. (2003). The Folate Precursor p-Aminobenzoate Is Reversibly Converted to Its Glucose Ester in the Plant Cytosol. J. Biol. Chem. 278, 20731–20737. [47]. Jiménez, C., Cossío, B.L, Labella, D., Niell, F.X. (2007), Screening of functional compounds in supercritical fluid extracts from Spirulina platensis, Food Chemistry, 102, 1357-1367. [48]. Sakakibara, M., Fukuda, Y. (2006), Process for treating Spiruilna, United States Patent. [49]. Sangeetha, P.T., Ramesh, M.N., Prapulla, S.G. (2005), Fructooligosaccharide production using fructosyl transferase obtained from recycling culture of Aspergillus oryzae CFR 202, Process Biochemistry 40, 1085 – 1088. - 266 - [50]. Sangeetha, P.T., Ramesh, M.N., Prapulla, S.G. (2005), Recent trends in the microbial production, analysis and application of Fructooligosaccharides, Trends in Food Science & Technology 16, 442 – 457. [51]. Santos, A.M.P., Maugeri, F. (2007), Synthesis of Fructooligosaccharides from sucrose using inulinase from Kluyveromyces marxianus, Food Technol. Biotechnol. 45 (2) 181 – 186. [52]. Stein, A.J. et al. (2006) Potential impact and cost-effectiveness of golden rice. Nat. Biotechnol. 24, 1200–1201. [53]. Storozhenko, S. et al. (2007) Folate fortification of rice by metabolic engineering. Nat. Biotechnol. 25, 1277–1279. [54]. Stover, P.J. (2004) Physiology of folate and vitamin B-12 in health and disease. Nutr. Rev. 62, S3–S12. [55]. Varga, L., Szigeti, J., Kovács, R., Földes, T., Buti, S. (2002), Influence of a Spirulina platensis Biomass on the Microflora of Fermented ABT Milks During Storage, Journal of Dairy Science, 85, 1031-1038. [56]. Wang, L., Pan, B., Sheng, J., Xu, J., Hu, Q. (2007), Antioxidant activity of Spirulina platensis extracts by supercritical carbon dioxide extraction, Food Chemistry, 105, 36-41. [57]. Yun, J.W., Lee, M.G., Song, S.K. (1994), Batch production of High-content Fructooligosaccharids from sucrose by the mixed-enzyme system of-fructofuranosidase and glucose oxidase, Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.77, No.2, 159 – 163. [58]. Yun, J.W. (1996), Fructooligosaccharide – occurrence, preparation and application, Enzyme and Microbial Technology 19, 107 – 117. - 267 - Web tham khảo: [59]. thuc-an-ky-dieu. [60]. 8603-f8c9285051b6. [61]. [62]. 2003.htm. [63]. [64]. [65]. [66]. [67]. [68]. www.healthlinkbc.ca/healthfiles/index.stm [69]. [70]. [71]. Gov/dms~/OPA-appa.html [72]. [73]. - 268 -