Đa dạng hóa các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn acetobacter xylinum

1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cuộc sống ngày càng hiện đại, số lượng người bị các chứng béo phì và các bệnh về tiêu hóa cũng ngày một nhiều hơn. Đó là hậu quả của việc sử dụng “fast food” - thức ăn nhanh và những loại thực phẩm quá nhiều chất béo. Do đó, vấn đề đặt ra là cần phải có một loại thực phẩm năng lượng thấp, không lipid, lại giúp kích thích sự tiết thực để hạn chế phần nào các nguy cơ bệnh trên, mà vẫn phải thơm ngon, hấp dẫn đối với người tiêu dùng. Thạch dừa – Nata de Coco là một ví dụ. Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi trên môi trường nước dừa già, có thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC). Thuận lợi của việc sản xuất thạch dừa theo phương pháp lên men truyền thống chính là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ… Tuy nhiên, điểm hạn chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. Môi trường nước dừa già là nguyên liệu thường dùng để sản xuất thạch dừa nhưng chỉ có sẵn ở một số vùng (mang tính địa phương), còn những vùng khác lại rất khan hiếm do các yếu tố địa lí. Công tác vận chuyển nước dừa đến các vùng này cũng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là môi trường lên men phải xuất phát từ những nguồn nguyên liệu sẵn có, đa dạng, rẻ, có số lượng lớn, dễ vận chuyển và mang quy mô công nghiệp, không mang tính cục bộ, điạ phương, có thể tận dụng được phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác. Xuất phát từ những yêu cầu trên, tôi thực hiện đề tài “Đa dạng hóa các môi trƣờng sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum”. 2 1.2 Mục đích của đề tài - Tìm môi trường thay thế môi trường nước dừa già truyền thống để nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum - Tìm được công thức tối ưu nhất để sản xuất bacterial cellulose trên các môi trường thay thế. 1.3 Yêu cầu - Thuần khiết giống và giữ giống Acetobacter xylinum - Khảo sát và đánh giá sinh khối cellulose thô trên các môi trường: Nước dừa già (đối chứng) Nước ép dứa Nước cốt dừa - Khảo sát và đánh giá khả năng phát triển của Acetobacter xylinum khi thay đổi các thành phần bổ sung. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về thạch dừa Thạch dừa (Nata de Coco) là một loại thức ăn tráng miệng phổ biến, có nguồn gốc từ Philippin, được tạo ra từ sự lên men nước dừa bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum, và là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ bacterial cellulose (BC). “Nata” là một từ Tây Ban Nha, xuất phát từ một từ Latin “Nata” có nghĩa là “nổi trôi” [Africa,1944]. Theo từ điển Bách khoa toàn thư mô tả thì Nata là “một khối cơ chất dày nổi trên bề mặt các loại môi trường”. Nata đã được nghiên cứu và mô tả bởi rất nhiều nhà khoa học từ năm 1949 – 1987. Trong số đó, định nghĩa của Sanger là rõ ràng và chính xác nhất: “Cellulosic có màu trắng đến vàng kem là cơ chất được hình thành bởi Aceti sp. xylinum trên bề mặt các loại môi trường có chứa đường như nước dừa, nước cốt dừa, dịch chiết thực vật, nước ép trái cây và các vật liệu phế phẩm khác” [Sanger, 1987]. Hình 2.1: Hình ảnh chung về Nata [29] 4 Bản chất của váng này là lớp màng hemicellulose bao quanh vi khuẩn, lớp màng này dày hơn rất nhiều so với kích thước tế bào. Hemicellulose là một loại polysaccaride được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy, chúng tích tụ đáng kể trong môi trường nhưng do không hoà tan trong nước (chỉ tan trong dung dịch kiềm - đồng amoni hydroxit) nên rất dễ tách ra khỏi môi trường nuôi cấy [Vương Thị Việt Hoa, 2000]. Thạch dừa không có giá trị dinh dưỡng cao nhưng tạo cảm giác ngon miệng nên là món ăn thú vị dùng tráng miệng và đặc biệt tốt đối với người đang ăn kiêng do nó không chứa các chất hóa học, chất bảo quản, chất tăng trưởng, lại giàu chất xơ, ít calories, không cholesterol. Ngoài ra, thạch dừa cũng rất có ích trong việc bài tiết của cơ thể do đặc tính kích thích nhu động ruột làm cho việc điều hòa bài tiết được tốt hơn. Vì thế, thạch dừa còn được xem như chất xơ tiết thực tối hảo. Chế phẩm từ dừa này còn là món ăn tuyệt diệu có tác dụng phòng ngừa ung thư, ngăn nguy cơ nghẽn mạch vành, nguy cơ tăng đột ngột lượng đường trong nước tiểu, giúp giữ làn da mịn màng, tươi trẻ [Trần Phú Hoà,1996]. 2.2 Đặc điểm của vi khuẩn acetic và vi khuẩn Acetobacter xylinum trong quá trình lên men tạo BC 2.2.1 Vi khuẩn acetic Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acetic, vì vậy nó còn được gọi là vi khuẩn acetic. Đây là loại vi khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập được từ dấm, rượu bia, hoa quả; từ không khí, đất, nước… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó nhiều loài có ý nghĩa về kinh tế [Nguyễn Lân Dũng, 1976]. 2.2.1.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn acetic là những trực khuẩn hình que đến elip, kích thước trung bình 0,6 – 0,8 m x 1 – 3 m. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành dạng chuỗi 5 dài. Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, xoắn, chùy, hình chỉ hay hình bán nguyệt tùy thuộc điều kiện pH môi trường và nhiệt độ nuôi cấy. Vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử. Một số loài có thể di động nhờ tiên mao ở một đầu – đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này. Đây là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, bắt màu Gram âm khi còn non, khi già có thể đổi Gram. Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn, nhỏ, đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm. Một số loài như A.aceti, A. xylinum có khuẩn lạc rất nhỏ (d = 1 mm), bề mặt trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh. Một số loài có khuẩn lạc lớn (d = 4 – 5 mm), bề mặt trơn bóng, không có màu, mỏng như những hạt sương nhỏ, dễ dùng que cấy gạt ra khỏi môi trường. Một số loài tạo thành khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường nên khó lấy ra bằng que cấy. Trên môi trường lỏng, vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành những lớp màng dày, mỏng khác nhau. Một số loài tạo thành lớp màng dày như sứa, nhẵn, trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Màng này có chứa sợi cellulose giống như sợi bông. Loại thứ hai có màng mỏng như giấy xelofan. Một số khác có màng không nhẵn mà nhăn nheo. Một số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong [Đinh Thị Kim Nhung, 1996; Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1975]. Hình 2.2: Vi khuẩn acetic [30; 35] 6 2.2.1.2 Đặc điểm sinh trƣởng Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với các nguồn carbon, nitơ và các chất sinh trưởng rất đa dạng. Chúng sử dụng đường, rượu và các acid hữu cơ làm nguồn carbon, dùng muối amon làm nguồn nitơ [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003] Vi khuẩn acetic không những oxy hoá được rượu etylic thành acid acetic mà còn oxy hoá được rượu propylic thành acid propionic, rượu butylic thành acid butyric, nhưng chúng không oxy hoá được rượu metylic và các rượu bậc cao khác. Trong môi trường đủ rượu etylic (5 – 13%) thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid acetic, còn nếu nồng độ rượu thấp hơn thì các vi khuẩn acetic oxy hoá triệt để rượu thành CO2 và H2O [Lương Đức Phẩm, 1998]. Vi khuẩn acetic có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. Ngoài khả năng oxy hoá etanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hoá được sorbit thành đường sorbose – dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C, oxy hoá glycerin thành dioxyaceton, glucose thành acid gluconic. Đa số các loài Acetobacter có khả năng đồng hoá muối amon, khả năng phân giải pepton yếu. Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin như acid pantothenic, valin, alanin, prolin …, một số chất kích thích sinh trưởng như p – aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin… và một số chất khoáng K, Ca, Mg, Fe, S, P … ở dạng muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ. Do đó, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của Acetobacter [Trần Phú Hòa, 1996]. Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003]. Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của các loài vi khuẩn acetic là 20 – 300C, pH tối thích là 5,5 – 6,2. Chúng có tính chịu acid cao, một số loài vẫn phát triển được ở pH = 3,2 [C.S. Pedeson, 1995]. 7 2.2.1.3 Phân loại vi khuẩn acetic Vi khuẩn acetic thuộc vào 2 giống chính: Acetobacter : có chu mao hoặc không Gluconobacter (còn gọi là Acetomonas) : đỉnh mao (đơn mao) Acetobacter và Gluconobacter là 2 giống vi khuẩn acetic quan trọng nhất của họ Acetobacteriaceae. Gluconobacter không có chu trình ATC trong hoạt động tế bào nên không thể oxy hoá acetat (nhưng có chu trình glyoxylat thay thế). Ngược lại, Acetobacter có khả năng này [Đinh Thị Kim Nhung, 1996]. Những vi khuẩn này có nhiều điểm tương tự so với vi khuẩn thuộc giống Pseudomonas. Chúng khác Pseudomonas ở chỗ chịu được độ acid cao hơn, khả năng chuyển hóa pepton yếu, ít di động và không sinh sắc tố [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003]. Bảng 2.1: Những đặc điểm phân biệt Acetobacter và Gluconobacter (so sánh với Pseudomonas) Đặc điểm Acetobacter Gluconobacter Pseudomonas Tiên mao Chu mao hoặc không có Đỉnh mao hoặc không có Đỉnh mao Sinh trưởng ở pH = 4.5 + + - Oxy hoá: Etanol thành acid acetic Acid acetic thành CO2 Lactat thành CO2 Glucose thành gluconat + - - + + - + +/- - +/- + +/- Thủy phân tinh bột và lactose - - +/- Phân giải gelatin - - +/- Tạo sắc tố lục huỳnh quang - - +/- 8 Từ trước đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trong giống Acetobacter (Rothenbach - 1989, Beijerinch - 1899, Hoyer - 1899, Hansen - 1911, Janke - 1916, Vissert Hoft - 1925, Henneberg - 1926, Hermann - 1931, Vaughm - 1948) nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J – Frateur. Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa trên các tính chất sinh hoá cụ thể sau: Khả năng tạo catalase Khả năng tổng hợp các chất ceto từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol, sorbitol… Khả năng oxy hóa acetat thành CO2 và H2O Khả năng oxy hóa glucose thành acid gluconic Khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nitơ trong môi trường Hoyer và sử dụng rượu etylic làm nguồn carbon Khả năng tạo sắc tố nâu Khả năng tổng hợp cellulose Trên cơ sở này, Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydans, mesoxydans, oxydans, peroxydans. Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter melanogennum. Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và Acetobacter mesoxydans. Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ceto: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens. Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans, Acetobacter paradoxum không chứa catalase và không oxy hoá được glucose. [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] 9 Bảng 2.2: Những khác biệt giữa các loài Acetobacter Đặc điểm tiên mao Chu mao Đỉnh mao Giống Acetobacter Glucono bacter Loài a ce ti xy li n u m m es o xy - d a n s lo va n i - en si s ra n ce s a sc en - d en s p er o xy - d a n s p a ra -d o xu m oxydans 1. Oxy hóa tiếp tục etanol thành CO2 và H2O + + + + + + + + - 2. Catalase + + + + + + - - + 3. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer + - - + - - + - - 4. Chuyển hóa glucose thành acid gluconic + + + + + - - - + 5. Chuyển hóa glycerol thành dihydroxy – aceton + + + - - - - - + 6. Tổng hợp cellulose - + - - - - - - - 7. Tạo sắc tố nâu - - - - - - - - + [Nguyễn Thị Cẩm Tú, 2003] 2.2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Quá trình lên men acetic được coi là quá trình lên men dấm nhưng thực chất là một quá trình oxy hóa [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum là loài vi khuẩn tạo được BC nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [Brown và ctv, 1976]. 10 Theo khóa phân loại của Bergey, Acetobacter xylinum thuộc: Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadiace Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] 2.2.2.1 Đặc điểm hình thái Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 2 m thay đổi tùy loài. Các tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể bị thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường. Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, vì vậy chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí. Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm Iod và acid sulfuric (do phản ứng của hemicellulose) [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. Acetobacter xylinum có thể tích lũy 4,5% acid acetic, sinh trưởng ở pH thấp hơn 5. Acid acetic sinh ra do quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng sinh ra quá mức giới hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng. Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh [Trần Phú Hòa, 1996]. A. xylinum có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 5 mm. Khi nuôi cấy trong môi trường thạch, lúc còn non, A. xylinum phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhầy và trong suốt. Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cụm mọc theo đường cấy. 11 Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và ngày càng dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985]. Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31] 2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính; có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH3COOH, CO2 và H2O; chuyển hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; tổng hợp được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu [Nguyễn Lân Dũng, 1978]. Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25 – 300C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 350C và nồng độ ethanol lên đến 10% [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a. Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]. 12 2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một vài tác giả cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose đuợc xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum. Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh. Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A. xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [theo Ross và ctv, 1993 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. 2.3 Bacterial cellulose (BC) 2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu sự hình thành BC Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được nhà bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886. Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC. Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng A. xylinum có thể sử dụng đường và O2 để tạo nên cellulose. Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Càng ngày, cấu trúc của BC càng được hiểu rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật. 13 Năm 1989, nhóm I.M. Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử là 83 và 93kD. Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose). Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc, cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004]. 2.3.2 Cấu trúc của BC BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối - 1,4 – glucan. Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals. Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm. So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000 [dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27] 14 Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II. Cellulose I có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành cellulose I. Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn. Cellulose I: dài 0,05 – 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi khuẩn A. xylinum trong môi trường lên men tĩnh. Các chuỗi - 1,4 – glucan xếp song song với nhau theo một trục. Năm 1984, Atalla và V. Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay . Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như Sarcinaventriculi. Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do. Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc. Khi đó BC tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 – 0,2 m [Trương Thị Anh Đào, 2003; Fumihiro Y., 1997]. 2.3.3 Đặc điểm của BC A.J. Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo ra trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose. Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính. Một số tính chất của BC: Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I) Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao). [Trần Thị Diễm Chi, 2000]; [25]; [32] 15 2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A. xylinum Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim Nhung, 1996] Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J. A. Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996]. Hình 2.5: Con đƣờng dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004] Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharid. Tất cả các oligo và 16 polysaccharid được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước. Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X) nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung sau: …X-X-X-X + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n + 1) nhánh Trong trường hợp polysaccharid gồm 2 loại monosaccharid liên tiếp (X và Y) thì phản ứng chung xảy ra theo 2 bước sau: Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nay vẫn còn chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 1980]. Cellulose UDPG Glc UGP GHK G6PD (NAD) G1P G6P PGA G6PD PGI (NADP) Chu trình Pentose Frc F6P phosphate PTS FBD F1P FDP EMP TCA Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum PGM FHK 1PFK 17 Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase Frc: fructose F6P: fructose – 6 – phosphate PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase FDP:fructose – 1,6 – diphosphate dehydrogenase 2.3.5 Ứng dụng của BC Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực: Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail, Kombucha, trà Manchurian…) - Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp - Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad - Màng bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây - Chất ổn định thực phẩm Y tế: - Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo) - Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào chế viên nén - Băng gạc, băng trị phỏng Mỹ phẩm: - Ổn định kem dưỡng da - Chất làm se (astringent) - Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn móng tay Môi trường: - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn - Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc 18 Xăng dầu và than đá: - Phát hiện và thu hồi các mỏ khoáng, dầu Công nghiệp dệt: - Sợi nhân tạo cao cấp - Các loại lều, bạt, tã lót có thể vứt đi hay tái sử dụng Công nghiệp giấy: - Làm giấy cao cấp (có độ dai, độ bền cao, vì vậy ứng dụng làm giấy lưu trữ tài liệu, làm tiền, giấy vẽ…) Công nghiệp gỗ: - Ván mỏng nhân tạo (plywood laminate) - Chất tạo độ dai cho giấy, container Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy bay, tên lửa… - Màng siêu âm thanh - Thiết bị siêu lọc nước - Màng thẩm thấu 2 chiều [Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32] 2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC 2.4.1 Nƣớc dừa già Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất thạch dừa là nước dừa. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần). Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol. 19 Bảng 2.3: Lƣợng đƣờng khử và protein có trong nƣớc dừa vào các giai đoạn khác nhau [Angaido và ctv, 1985] Tuổi (tháng) Đƣờng khử tổng (g/100g) Protein (g/100ml) 4 5 6 7 8 9 10 2,20 2,25 2,39 2,56 2,63 2,89 2,79 0,140 0,210 0,262 0,356 0,504 0,512 0,512 Bergonia và ctv (1984) đã phân tích thành phần carbohydrate trong nước dừa bằng HPLC, thấy: Nồng độ tổng của sucrose, glucose, fructose 3,0 3 gr/100ml mannose, galactose 2.23gr/100ml mannitol 0.3gr/100ml  nồng độ đường tổng 5,15 gr/100ml Ngoài ra, trong nước dừa già còn chứa nhiều vitamin, acid amin, chất kích thích sinh trưởng… rất tốt đối với sự phát triển của A. xylinum. 20 Bảng 2.4: Thành phần hoá học của nƣớc dừa già [Anzaldo và ctv, 1985] Thành phần % khối lƣợng Tỷ trọng Chất rắn tổng số Đường tổng số Tro Dầu béo Protein Clorua pH Nước 1,02 4,71 2,56 0,46 0,74 0,55 0,17 5,60 90,81 Bảng 2.5: Hàm lƣợng vitamin và chất khoáng trong nƣớc dừa [ Vanderberlt, 1945; Trần Phú Hòa, 1996] Vitamin Hàm lƣợng ( g/ml) Khoáng vi lƣợng Hàm lƣợng ( g/ml) Acid ascorbic Acid nicotinic Acid pantothenic Acid folic Biotin Riboflavin Thiamine Pyridoxine 2200 – 3700 0,64 0,52 0,003 0,02 0,01 dạng vết (trace) dạng vết (trace) K Na Ca Mg Fe Cu S P 3,12 1,50 2,09 3,00 0,01 0,04 3,40 3,70 21 Bảng 2.6: Hàm lƣợng acid amin trong nƣớc dừa [Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003] Acid amin Hàm lƣợng (% khối lượng/amin tổng số) Acid amin Hàm lƣợng (% khối lượng/amin tổng số) Acid cysteric Acid aspartic Acid glutamic Xerin Glycerin Threonin Alanin 3,86 2,94 12,47 3,25 7,61 1,07 1,41 Histidin Lysin Arginin Prolin Valin Leucin Phenylalanin 7,86 11,23 3,40 8,57 1,28 3,85 0,18 Ngoài ra, trong nước dừa còn có một số chất kích thích sinh trưởng như 1,3 – diphenyl urea, hexitol, phyllococosine, ribosid, myo-imisitol, sorbitol, cylleinositol, zeatin … Hoạt tính chung của nước dừa là do tác dụng tổng hợp của từng loại hợp chất có trong nước dừa. Các chất này tương đối chịu nhiệt, vì vậy nước dừa còn phát huy được tác dụng tốt sau chế độ thanh trùng [Lê Thị Khánh Vân, 1985 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]. 2.4.2 Nƣớc cốt dừa Có những vùng miền do đặc tính địa lí nên không có đủ nước dừa để sản xuất thạch dừa, và công việc vận chuyển nước dừa cũng gặp rất nhiều khó khăn, nhất là khi sản xuất với quy mô lớn. Vì vậy, người ta có thể sử dụng nước cốt vắt ra từ cơm dừa để làm môi trường lên men. Nước cốt dừa rất giàu chất béo, carbohydrate và protein. Các protein cơm dừa có giá trị dinh dưỡng cao, nhiều lysine, methionine và tryptophan. 22 Bảng 2.7: Thành phần hóa học của cơm dừa Thành phần (%) Hạch cơm dừa chƣa chín Hạch cơm dừa chín Độ ẩm Protein Chất béo Carbohydrate Xơ thô Tro 90,80 0,90 1,40 6,30 0,60 46,30 4,08 37,29 11,29 3,39 1,03 Bảng 2.8: Thành phần các vitamin trong nƣớc cốt dừa Vitamin Hàm lƣợng ( g/ml) Niacine Acid pantothenic Biotine Riboflavin Acid folic 0,64 0,52 0,02 0,01 0,003 [Subtahmanyan & Swammatha, 1969] Bảng 2.9: Thành phần hóa học của nƣớc cốt dừa Thành phần Hàm lƣợng (%) Theo Hagenmaire (1980) Theo Thampan (1975) Độ ẩm Chất béo Protein Tro Carbohydrate 56,3 33,4 4,1 1,2 5,0 52,0 38,0 3,5 0,9 5,6 23 Nước cốt dừa được vắt lần đầu tiên có pH = 6, vì vậy nó được xếp vào loại thực phẩm có nồng độ acid thấp. Dừa để vắt lấy nước cốt thì nên chín hoàn toàn (12 tháng), càng chín nẫu càng tốt. Lúc này, dừa đã phát triển tối đa, cho lượng nước ít, còn cơm dừa thì cứng và dày. 2.4.3 Nƣớc dứa Bảng 2.10: Thành phần hóa học của nƣớc dứa [33; 34] Thành phần Hàm lƣợng (tính trên 100g) Calories (kcal) Protein (g) Lipid (g) Glucid (g) CHO tổng (g) CHO xơ (g) Tro (mg) Nước (g) 47 – 54 0,4 – 0,7 0,0 – 0,3 11,6 – 13,7 12,39 0,4 – 0,54 0,29 – 0,4 85,3 – 86,5 Bảng 2.11: Hàm lƣợng vitamin và khoáng chất trong nƣớc dứa [28; 33; 34] Thành phần vitamin Hàm lƣợng (mg/100g) Thành phần khoáng Hàm lƣợng (mg/100g) - Caroten Thiamin Riboflavin Niacin Acid ascorbic 32 – 42 0,06 – 0,08 0,03 – 0,04 0,2 – 0,3 17 – 61 Na K Ca P Fe 1 – 2 113 – 146 7 – 18 7 – 12 0,37 – 0,5 24 Bảng 2.12: Hàm lƣợng acid amin trong nƣớc dứa [36] Amino acid Hàm lƣợng (% khối lƣợng/amin tổng số) Amino acid Hàm lƣợng (% khối lƣợng/amin tổng số) Alanine Arginine Asparagine Aspartic acid Cystein Glutamine Glutamic acid Glycerin Histidin Isoleucine 5,60 2,06 7,96 7,96 0,88 3,54 5,31 8,26 0,88 4,42 Leucine Lysine Methionine Phenyl alanine Proline Serine Threonine Tryptophan Tyrosine Valine 5,60 6,49 3,54 5,31 3,83 6,19 5,31 4,42 7,37 5,01 25 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: đề tài được tiến hành từ 03/2005 đến 08/2005. Địa điểm: đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ thực phẩm, trường ĐH Nông Lâm TP.HCM 3.2 Vật liệu – hoá chất – trang thiết bị 3.2.1 Vật liệu 3.2.1.1 Nguồn giống Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ thực phẩm cung cấp 3.2.1.2 Nguyên liệu - Nước dừa: lấy từ trái dừa già - Nước cốt dừa: vắt từ cơm dừa, sau đó pha loãng theo các tỷ lệ - Nước dứa: ép lấy nước cốt dứa từ phần cùi dứa, sau đó pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau 3.2.2 Hoá chất - Nhóm hoá chất bổ sung vào môi trường: DAP (diamonium phosphate) SA (sulphate amon) Saccharose Agar Acid acetic Cao nấm men - Hoá chất nhuộm Gram 26 3.2.3 Trang thiết bị Một số trang thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh: nồi hấp autoclave, tủ cấy vô trùng, kính hiển vi, tủ sấy, cân điện tử, các dụng cụ thủy tinh, hộp nhựa… 3.3 Môi trƣờng dinh dƣỡng 3.3.1 Môi trƣờng I: môi trường hoạt hóa Nước dừa già 1lít Saccharose 50g SA 8g DAP 2g Cao nấm men 10g Acid acetic 5ml 3.3.2 Môi trƣờng II: môi trường nhân giống và giữ giống Nước dừa già 1lít Saccharose 20g SA 8g DAP 2g Acid acetic 12ml Chế độ khử trùng của môi trường hoạt hóa và môi trường nhân giống là 1210C, 1atm, 15 phút. Acid acetic được bổ sung sau khi nấu sôi môi trường. 3.3.3 Môi trƣờng thí nghiệm - Môi trường III: môi trường nước cốt dừa - Môi trường IV: môi trường nước dứa 27 3.4 Nội dung và phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết Mục đích thí nghiệm: tạo ra đủ giống thuần khiết cung cấp cho quá trình lên men. Phương pháp: Từ giống chai sẵn có ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa (công thức môi trường I + 2 % agar). Tìm các khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn A. xylinum, cấy chuyền nhiều lần để thu được khuẩn lạc thuần khiết (quan sát đại thể). Sau khi có khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành nhuộm Gram, quan sát ở vật kính X100 nhằm quan sát hình thái và cách sắp xếp tế bào (quan sát vi thể). Sơ đồ nhân giống: Giống thuần khiết  Nhân giống cấp 1 5% thể tích Nhân giống cấp 2 (Trong môi trường (môi trường II (môi trường II trong thạch đĩa) trong ống nghiệm) chai nước biển) 3.4.2 So sánh hiệu quả hoạt hóa giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Mục đích thí nghiệm: đánh giá xem môi trường nào giúp hoạt hóa giống tốt hơn Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại. Nghiệm thức NT1 NT2 Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: theo thành phần môi trường I NT2: môi trường I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Dung dịch Skeggs & Wright: MgSO4.7H2O 40g MnSO4.4H2O 2g FeCl3 0,4g HClđ 1ml H2O đến 1lít Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) sau 8 ngày lên men ở nhiệt độ phòng. 28 3.4.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Mục đích thí nghiệm: tìm hiểu sự tương tác giữa các thành phần bổ sung (đường, khoáng) vào môi trường lên men đến trọng lượng BC thô, từ đó suy ra công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại Yếu tố Tỉ lệ cơm dừa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Sacccharose (%) Nồng độ 1/10 1/20 1/30 0,2 0,4 0,6 0,6 0,8 1,0 2 4 6 MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) 1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2 2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4 3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6 4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2 5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4 6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6 7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2 8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4 9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6 10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2 11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4 12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6 13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2 14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4 15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6 16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2 17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4 18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6 19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2 20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4 21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6 22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2 23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4 24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6 25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2 26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4 27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6 29 Ghi chú: MT: môi trường TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose Đối chứng là môi trường II. Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10%. Hàm lượng acid acetic là 1,2 %. Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa Mục đích thí nghiệm: tìm công thức tối ưu nhất cho việc sản xuất BC trên môi trường nước dứa. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên 4 yếu tố với 2 lần lặp lại Yếu tố Tỉ lệ nƣớc dứa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) Nồng độ 1/10 1/20 1/30 0,2 0,4 0,6 0,6 0,8 1,0 2 4 6 MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) MT TLPL (lần) DAP (%) SA (%) Sac (%) 1 10 0,2 0,6 2 28 20 0,2 0,6 2 55 30 0,2 0,6 2 2 10 0,2 0,6 4 29 20 0,2 0,6 4 56 30 0,2 0,6 4 3 10 0,2 0,6 6 30 20 0,2 0,6 6 57 30 0,2 0,6 6 4 10 0,2 0,8 2 31 20 0,2 0,8 2 58 30 0,2 0,8 2 5 10 0,2 0,8 4 32 20 0,2 0,8 4 59 30 0,2 0,8 4 6 10 0,2 0,8 6 33 20 0,2 0,8 6 60 30 0,2 0,8 6 7 10 0,2 1 2 34 20 0,2 1 2 61 30 0,2 1 2 8 10 0,2 1 4 35 20 0,2 1 4 62 30 0,2 1 4 9 10 0,2 1 6 36 20 0,2 1 6 63 30 0,2 1 6 10 10 0,4 0,6 2 37 20 0,4 0,6 2 64 30 0,4 0,6 2 11 10 0,4 0,6 4 38 20 0,4 0,6 4 65 30 0,4 0,6 4 12 10 0,4 0,6 6 39 20 0,4 0,6 6 66 30 0,4 0,6 6 13 10 0,4 0,8 2 40 20 0,4 0,8 2 67 30 0,4 0,8 2 14 10 0,4 0,8 4 41 20 0,4 0,8 4 68 30 0,4 0,8 4 15 10 0,4 0,8 6 42 20 0,4 0,8 6 69 30 0,4 0,8 6 16 10 0,4 1 2 43 20 0,4 1 2 70 30 0,4 1 2 30 17 10 0,4 1 4 44 20 0,4 1 4 71 30 0,4 1 4 18 10 0,4 1 6 45 20 0,4 1 6 72 30 0,4 1 6 19 10 0,6 0,6 2 46 20 0,6 0,6 2 73 30 0,6 0,6 2 20 10 0,6 0,6 4 47 20 0,6 0,6 4 74 30 0,6 0,6 4 21 10 0,6 0,6 6 48 20 0,6 0,6 6 75 30 0,6 0,6 6 22 10 0,6 0,8 2 49 20 0,6 0,8 2 76 30 0,6 0,8 2 23 10 0,6 0,8 4 50 20 0,6 0,8 4 77 30 0,6 0,8 4 24 10 0,6 0,8 6 51 20 0,6 0,8 6 78 30 0,6 0,8 6 25 10 0,6 1 2 52 20 0,6 1 2 79 30 0,6 1 2 26 10 0,6 1 4 53 20 0,6 1 4 80 30 0,6 1 4 27 10 0,6 1 6 54 20 0,6 1 6 81 30 0,6 1 6 Ghi chú: MT: môi trường TLPL: tỷ lệ pha loãng Sac : saccharose Đối chứng là môi trường II. Tỷ lệ giống cấp 2 cấy vào môi trường là 10 %. Hàm lượng acid acetic là 1,2 %. Thời gian lên men là 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trƣờng nƣớc dừa, nƣớc cốt dừa và nƣớc dứa. Mục đích thí nghiệm: so sánh khả năng tạo sinh khối BC thô từ các môi trường thay thế với môi trường nước dừa già truyền thống để ứng dụng sản xuất ở quy mô rộng rãi hơn, công nghiệp hơn. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại Nghiệm thức NT1 NT2 ĐC Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: môi trường nước cốt dừa theo kết quả mục 3.4.3 NT2: môi trường nước dứa theo kết quả mục 3.4.4 ĐC : môi trường nước dừa theo thành phần môi trường II Tỷ lệ giống cấy vào môi trường: 10 % Hàm lượng acid acetic: 1,2 % 31 Thời gian lên men: 8 ngày ở nhiệt độ phòng Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của các loại acid đến quá trình lên men tạo BC Mục đích thí nghiệm: đa dạng hóa các loại acid bổ sung để lên men tạo BC. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố với 3 lần lặp lại Nghiệm thức NT 1 NT 2 NT 3 Trọng lƣợng BC thô (g) NT1: bổ sung HCl đến pH = 4,5 NT2: bổ sung H2SO4 đến pH = 4,5 ĐC : bổ sung acid acetic đến pH = 4,5 Các thành phần khác cố định theo môi trường II. Tỷ lệ giống cấy vào môi trường là 10%, lên men 8 ngày ở nhiệt độ phòng. Chỉ tiêu theo dõi: trọng lượng BC thô (g) 3.4.7 Các phƣơng pháp đánh giá 3.4.7.1 Xử lí thống kê Từ trọng lượng BC thô thu hoạch được sau các thí nghiệm, tiến hành xử lí thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0. 3.4.7.2 So sánh giá trị kinh tế giữa các môi trƣờng lên men sản xuất BC Sau khi tìm được công thức tối ưu để lên men sản xuất thạch dừa trên các môi trường thay thế, tiến hành so sánh giá trị kinh tế của các loại nguyên liệu làm môi trường lên men theo những tỷ lệ pha loãng thích hợp với môi trường lên men truyền thống là nước dừa già. Đơn vị tính là trên 100 lít môi trường. 32 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thuần khiết giống và nhân giống đã thuần khiết Từ giống chai A. xylinum ở phòng thí nghiệm, tiến hành phân lập lại trên môi trường thạch đĩa. Kết quả quan sát đại thể và vi thể như sau: 4.1.1 Quan sát đại thể Sau khi phân lập, mỗi tế bào tách riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có dạng tròn lồi, nhầy và trơn bóng, rìa mép khuẩn lạc nhẵn, màu trắng trong hơi đục. Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm . 4.1.2 Quan sát vi thể Sau khi chọn khuẩn lạc điển hình, tiến hành nhuộm Gram, quan sát tế bào vi khuẩn ở vật kính X100 dưới giọt dầu cerde thu được kết quả như sau: Bảng 4.1: Kết quả quan sát vi thể Acetobacter xylinum Chỉ tiêu Kết quả Hình dạng Kích thước Nhuộm Gram Hình que, xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi dài 2– 4 m Gram âm (G-) 33 Hình 4.1: Quan sát đại thể và vi thể vi khuẩn A. xylinum Hình 4.2: Giống A. xylinum cấp I và cấp II Như vậy từ giống chai sẵn có chúng tôi đã thuần khuyết được giống A. xylinum và tiến hành giữ giống trong môi trường lỏng (môi trường II) 4.2 So sánh hiệu quả hoạt hoá giống bằng môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Giống giữ vai trò quyết định đến năng suất lên men. Vì vậy, hoạt hóa giống sau một thời gian dài bảo quản là công việc hết sức quan trọng. Môi trường hoạt hóa sao cho tiện dụng, rẻ, đem lại hiệu quả cao là vấn đề đặt ra. 34 Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.3 Bảng 4.2: So sánh sinh khối BC thô giữa môi trƣờng I và môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Môi trƣờng Môi trƣờng 1 Môi trƣờng I có bổ sung dung dịch Skeggs & Wright Trung bình trọng lượng BC thô (g) 111,4 114,2 Hình 4.3: Biểu đồ so sánh trọng lƣợng BC thô giữa 2 môi trƣờng Qua bảng kết quả 4.2 và hình 4.3 chúng tôi thấy sinh khối BC thô tạo ra bởi vi khuẩn A. xylinum sau quá trình hoạt hóa bởi 2 loại môi trường là tương đương nhau, không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê (trắc nghiệm F, độ tin cậy 95 % - phụ lục 1). Việc bổ sung thêm dung dịch Skeggs & Wright là nhằm cung cấp thêm các loại muối khoáng, các thành phần vô cơ để kích thích sự phát triển của A. xylinum. Nhưng kết quả cho thấy rằng không có sự gia tăng đáng kể về trọng lượng BC. Có nghĩa là lượng khoáng chất trong nước dừa (môi trường I) đã đủ cho sự sinh trưởng và phát triển của A. xylinum, không cần phải bổ sung thêm, giúp tiết kiệm chi phí sản xuất. 111.4 114.2 0 50 100 150 NT1 NT2 Nghiệm thức Tr ọn g lư ợn g BC (g ) 35 4.3 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Bảng 4.3: Kết quả sinh khối BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) Qua bảng kết quả 4.3 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p << 0.05 (phụ lục 2), chúng tôi thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose đều có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 21, 24, 27 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác, khác biệt này là rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Tuy nhiên, khác biệt về trọng lượng BC thô giữa 3 môi trường 21, 24 và 27 không có ý nghĩa về mặt thống kê (độ tin cậy 95%). Tỷ lệ cơm dừa/nước = 1/10 cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ pha loãng 1/20 và 1/30. MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 81.7 97.1 89.4 28 72.2 70.5 71.4 55 63 62.6 62.8 2 89.5 95.1 92.3 29 78.9 79.2 79.1 56 72.2 68.2 70.2 3 90.1 91.3 90.7 30 77.3 75.3 76.3 57 65.4 64.5 65 4 91.2 90 90.6 31 88.4 85 86.7 58 82 85.6 83.8 5 93.5 95.3 94.4 32 86.5 85 85.8 59 83.1 78.5 80.8 6 91.0 91 91 33 77.5 80.4 79 60 70 68.4 69.2 7 100 97.8 98.9 34 88.2 90.1 89.2 61 63.6 62.2 62.9 8 92.6 93.2 92.9 35 81 82.3 81.7 62 70.1 69.5 69.8 9 90.8 90.1 90.5 36 83 82 82.5 63 80.2 80.5 80.4 10 88.8 85 86.9 37 74.4 75.2 74.8 64 62.3 60 61.2 11 97.1 88.9 93 38 81.2 85 83.1 65 66.6 65.2 65.9 12 98 90.5 94.3 39 88 90.1 89.1 66 80.1 83 81.6 13 101.3 90.1 95.7 40 70.7 80.7 75.7 67 85 91 88 14 98.1 88.9 93.5 41 88 80.2 84.1 68 75.4 78.5 77 15 96.3 86.9 91.6 42 91 90 90.5 69 79.9 87 83.4 16 95.2 90.7 93 43 78.5 82 80.3 70 87.5 90 89 17 96.1 92.4 94.3 44 93 90.3 91.7 71 90 92.3 91.1 18 97.4 95.6 96.5 45 92 95 93.5 72 93.1 95 94 19 97 94.6 95.8 46 88.8 90 89.4 73 73.5 79.1 76.3 20 96.7 97 96.8 47 86 90.1 88 74 75 75.4 75.2 21 126.4 117.8 122.1 48 86.6 88.2 87.4 75 75 77.7 76.4 22 95.6 96.2 95.9 49 78.9 80 79.5 76 80.9 80.6 80.8 23 92.1 90.5 91.3 50 85.6 86 85.8 77 90.2 91.9 91 24 117.8 120.4 119.1 51 97 95.1 96 78 83 86 84.5 25 95.5 95 95.3 52 108 98.8 103.4 79 88 89.2 88.6 26 109.8 100 104.9 53 101.1 100.2 100.7 80 90.7 96 93.3 27 116.4 115.6 116 54 100.2 99.8 100 81 84 85.4 84.7 36 Hàm lượng DAP = 0,6 % cho trọng lượng BC cao nhất, khác biệt này có ý nghĩa thống kê so với các tỷ lệ 0,2 và 0,4 %. Hàm lượng phosphate này là cần thiết để A. xylinum phát triển tạo cellulose. Nếu xét riêng từng yếu tố thì hàm lượng SA = 1% cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với hàm lượng SA = 0,6 % và 0,8 %. Nhưng do cả 4 yếu tố có tương tác với nhau nên hàm lượng SA = 0,6 % cũng tạo ra một lượng BC tương đương với khi dùng 0,8 % hay 1% SA. Như vậy, để có hiệu quả kinh tế trong sản xuất, chúng tôi đề nghị chọn SA = 0,6 % làm công thức lên men. Từ sự tương tác 4 yếu tố, chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng đường = 6 % cho trọng lượng BC cao nhất. Công thức tối ưu để sản xuất BC trên môi trường nước cốt dừa được trình bày trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Công thức tối ƣu để sản xuất BC trên môi trƣờng nƣớc cốt dừa Yếu tố Tỷ lệ cơm dừa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) Nồng độ 1/10 0,6 0,6 6 Như vậy, với công thức trên, ta có thể sản xuất BC từ môi trường nước cốt dừa thay cho môi trường nước dừa già truyền thống. Điều này sẽ hạn chế được những khó khăn, tốn kém của việc vận chuyển nước dừa khi sản xuất BC ở những vùng miền không có nguyên liệu là nước dừa già. 37 4.4 Khảo sát sự hình thành BC trên môi trƣờng nƣớc dứa Bảng 4.5 : Kết quả trọng lƣợng BC thô thu đƣợc từ các môi trƣờng (g) MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB MT Đợt 1 Đợt 2 TB 1 89.5 75 82.3 28 103.3 100 101.7 55 86.3 85.3 85.8 2 98.8 109.3 104 29 65.4 65 65.2 56 70.1 69.1 69.6 3 78.7 86 82.3 30 70.5 62 66.3 57 96.5 95.1 95.8 4 89 92 90.5 31 75.6 72.6 74.1 58 104 95 99.5 5 77.7 92.5 85.1 32 72.1 72.1 72.1 59 74.2 74 74.1 6 94.5 99 97 33 82.5 82.5 82.5 60 77.8 77.8 77.8 7 84.5 88 86.3 34 98 100 99 61 87.5 70.3 78.9 8 80 99 89.5 35 70.5 70.2 70.35 62 78.6 87.5 83 9 91.5 103 97.3 36 75.2 65.6 70.4 63 74.5 75.2 75 10 68.2 77 72.6 37 70.1 70.1 70.1 64 69.1 65 67 11 64.5 74.5 69.5 38 69.5 66.6 68 65 75.6 74.5 75 12 79.7 81 80.3 39 67.7 74.5 71.1 66 80.5 72.6 76.5 13 86.2 116 101.1 40 90.7 79.4 85 67 78.5 73.2 76 14 90.3 99 95 41 88.9 95.1 92 68 89.1 89.9 89.5 15 80.1 92.2 86.2 42 93.2 90 91.6 69 86.2 90 88.1 16 91.7 76 84 43 102.4 72.3 87.4 70 84.4 84.5 84.5 17 85.5 80 82.8 44 74.5 60.1 67.3 71 94.6 104.6 99.6 18 84.2 71 77.6 45 82.5 72.8 77.7 72 77.6 73.7 75.7 19 95.2 92.6 93.9 46 93.1 78.8 86 73 93 76.1 84.6 20 104 103 103.5 47 86.6 79.4 83 74 91.1 91.1 91.1 21 88.4 91.2 89.8 48 81.2 81.2 81.2 75 91.2 71.2 81.2 22 118.6 115 116.8 49 108.2 77.5 93 76 112.3 108 110 23 92.1 91.5 91.8 50 97.7 84 91 77 101.5 103 102.3 24 98 104 101 51 97.1 97.1 97.1 78 116.2 106.2 111.2 25 100.3 88 94.2 52 107.4 96.8 102.1 79 104.3 104.3 104.3 26 99.2 88.2 93.7 53 99.1 97.8 98.5 80 103.7 103 103.7 27 109.8 92 100.9 54 93.7 93.7 93.7 81 100.7 95 98 Qua bảng kết quả 4.5 và qua xử lí thống kê bằng trắc nghiệm F, xác suất p < 0,05 (phụ lục 3), chúng tôi nhận thấy rằng cả 4 yếu tố tỷ lệ pha loãng, DAP, SA và saccharose có tương tác với nhau. Công thức môi trường số 22 và 78 cho trọng lượng BC cao hơn hẳn so với các công thức môi trường khác. Khác biệt này rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Công thức tối ưu cho việc sản xuất thạch dừa trên môi trường nước dứa được trình bày trong bảng 4.6 38 Bảng 4.6 : Công thức tối ƣu để sản xuất thạch dừa trên môi trƣờng nƣớc dứa Công thức môi trƣờng Tỷ lệ dứa/nƣớc (g/ml) DAP (%) SA (%) Saccharose (%) 22 78 1/10 1/30 0,6 0,6 0,8 0,8 2 6 Ở công thức môi trường 22, khi ta pha loãng theo tỷ lệ dứa / nước = 1/10 thì lượng đường có trong nước dứa còn khá đủ để lên men tạo BC. Vì vậy ta chỉ cần bổ sung thêm 2 % saccharose để tạo công thức tối ưu cho lên men sản xuất BC. Đối với công thức môi trường 78, tỷ lệ dứa / nước = 1/30, nghĩa là pha loãng 30 lần, lượng saccharose có trong nước dứa sẽ giảm đi, vì thế cần phải bổ sung thêm đường. Lúc này hàm lượng saccharose phải là 6 % mới đảm bảo đủ cho quá trình lên men. Như vậy, ứng dụng vào thực tế, tùy thuộc tình hình, điều kiện và quy mô sản xuất mà ta chọn pha môi trường theo công thức 22 hay 78. 4.5 So sánh sinh khối BC thô thu hoạch từ môi trƣờng nƣớc dừa, nƣớc cốt dừa và nƣớc dứa Sinh khối BC thô thu hoạch từ các môi trường nước dừa (công thức môi trường II), nước cốt dừa (theo công thức tối ưu mục 4.3) và nước dứa (công thức tối ưu mục 4