Đánh giá tình trang nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato stotted will virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacuml) và cây đậu phộng (arachis hypogaeal) tại tỉnh Tây Ninh và chẩn đoán tobacco mosaic vius bằng kỹ thuật RT - PCR

Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV. Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA. Kết quả thu được: Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh. Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%). Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các hình .xi Danh sách các bảng xii Danh sách các biểu đồ .xiii 1. MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu .2 1.2.1 Mục đích .2 1.2.2 Yêu cầu .2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 3 2.1.1 Vị trí phân loại 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3 2.1.3 Đặc điểm di truyền .3 2.1.4 Đặc điểm hình thái 3 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt .4 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu 4 2.1.5.2 Yếu tố đất đai 4 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật 4 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng .4 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng 7 2.2.1 Vị trí phân loại 7 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố 7 2.2.3 Đặc điểm di truyền .7 2.2.4 Đặc điểm hình thái 8 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt .8 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu 8 2.2.5.2 Yếu tố đất đai 8 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật 8 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng .9 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra . 11 2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật . 11 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá . 12 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng . 13 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus 14 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV . 15 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV . 15 2.4.3 Phân loại TSWV . 15 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV . 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV . 17 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV .20 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus .20 2.5.1 Nguồn gốc của TMV 20 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV .21 2.5.3 Phân loại TMV .21 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV .21 2.5.5 Con đường truyền bệnh 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV .22 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV .24 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus 24 2.6.1 Nguồn gốc của CMV 24 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV .24 2.6.3 Phân loại CMV .24 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV .25 2.6.5 Con đường truyền bệnh 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV .27 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV .27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra .29 2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị .29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng .29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA .30 2.8.2 Phân loại ELISA .30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA .31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA .31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) 31 2.9.1 Nguyên tắc 31 2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) .34 2.10.1 Nguyên tắc 34 2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA .34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác .35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo .35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) .35 2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra .36 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới 36 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam .36 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .37 3.2 Phương pháp lấy mẫu .37 3.3 Dụng cụ 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA .38 3.4.1 Hóa chất 38 3.4.2 Phương pháp thực hiện .38 3.4.2.1 Ly trích mẫu .38 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR 40 3.5.1 Hóa chất 40 3.5.2 Phương pháp thực hiện .41 3.5.2.1 Ly trích RNA 41 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR .42 3.5.2.3 Đổ gel điện di .43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .45 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA .45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu .46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu .48 4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá .51 4.2 Kết quả RT – PCR .55 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .60 7. PHỤ LỤC 63

pdf79 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 25/01/2013 | Lượt xem: 2181 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đánh giá tình trang nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato stotted will virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacuml) và cây đậu phộng (arachis hypogaeal) tại tỉnh Tây Ninh và chẩn đoán tobacco mosaic vius bằng kỹ thuật RT - PCR, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002-2006 Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui buồn trong cuộc sống. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập cho em trong suốt bốn năm đại học. Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh - Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp. Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận. TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Văn Ngọc Dung iv TÓM TẮT VĂN NGỌC DUNG. Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/ 2006. “ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.) TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”. Hội đồng hướng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN. Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006. Nội dung tiến hành: Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh. Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra. Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với TMV, CMV và TSWV. Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA. Kết quả thu được: Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập mẫu ở tỉnh Tây Ninh. Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó, huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%). Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác. v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x Danh sách các hình ............................................................................................... xi Danh sách các bảng .............................................................................................. xii Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2 Mục đích – Yêu cầu ......................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá ................................................................................ 3 2.1.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 3 2.1.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 3 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 4 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 4 2.1.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 4 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 4 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 4 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng ............................................................................ 7 2.2.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 7 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 7 vi 2.2.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 7 2.2.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 8 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 8 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 8 2.2.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 8 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 8 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 9 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra ..................................................... 11 2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật ............................................ 11 2.3.1.1 Đặc điểm chung .................................................................... 11 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật ......................................... 11 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá ................... 12 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng ............... 13 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus ...................................................... 14 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV ............................................. 15 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV ................................................................... 15 2.4.3 Phân loại TSWV ................................................................................. 15 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV ....................................................................... 16 2.4.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 16 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 17 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV ........................................... 17 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV ................................................................. 20 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus ............................................................. 20 2.5.1 Nguồn gốc của TMV .......................................................................... 20 2.5.2 Cấu trúc của virus TMV ..................................................................... 21 2.5.3 Phân loại TMV ................................................................................... 21 2.5.4 Dãy ký chủ của TMV ......................................................................... 21 2.5.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 21 2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 22 2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV ............................................. 22 2.5.8 Khống chế bệnh do TMV ................................................................... 24 vii 2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus .......................................................... 24 2.6.1 Nguồn gốc của CMV .......................................................................... 24 2.6.2 Cấu trúc của virus CMV ..................................................................... 24 2.6.3 Phân loại CMV ................................................................................... 24 2.6.4 Dãy ký chủ của CMV ......................................................................... 25 2.6.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 25 2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 26 2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV ............................................. 27 2.6.8 Khống chế bệnh do CMV ................................................................... 27 2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra ............................................... 29 2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................ 29 2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ........................................... 29 2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng..................................... 29 2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .......................................... 30 2.8.1 Nguyên lý ELISA ............................................................................... 30 2.8.2 Phân loại ELISA ................................................................................. 30 2.8.2.1 ELISA trực tiếp .................................................................... 30 2.8.2.2 ELISA gián tiếp .................................................................... 30 2.8.2.3 Sandwich ELISA .................................................................. 31 2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA ................................... 31 2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ......................... 31 2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................ 31 2.9.1 Nguyên tắc .......................................................................................... 31 2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR .................................................... 33 2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) ............. 34 2.10.1 Nguyên tắc ........................................................................................ 34 2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................. 34 2.11 Một số kỹ thuật PCR khác ........................................................................... 35 2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo ............................................................................. 35 2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR ................................................................ 35 2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) ................... 35 viii 2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra ........................................................................................................... 36 2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 36 2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam ....................................................... 36 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 37 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 37 3.2 Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 37 3.3 Dụng cụ .......................................................................................................... 37 3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA ....... 38 3.4.1 Hóa chất .............................................................................................. 38 3.4.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 38 3.4.2.1 Ly trích mẫu ......................................................................... 38 3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA .................................................. 38 3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR ............................................ 40 3.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 40 3.5.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 41 3.5.2.1 Ly trích RNA ........................................................................ 41 3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR ................................................. 42 3.5.2.3 Đổ gel điện di ....................................................................... 43 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 45 4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA ................................................................... 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu ........................................................................................ 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ............................................................. 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ...... 47 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ....... 48 4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp CMV và TMV trên số mẫu thu thập được ........................................ 50 4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá ............. 51 4.2 Kết quả RT – PCR ......................................................................................... 55 ix 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60 7. PHỤ LỤC .......................................................................................................... 63 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pairs cDNA : complementary DNA CMV : Cucumber Mosaic Virus Da : Dalton DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay DEPC : Diethyl pyrodicarbonate DNA : Deoxyribonucleic acic DNase : Deoxyribonuclease dNTP : Deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ig : Immunoglobulin mRNA : Messenger ribonucleic acid OD : Optical density p – NPP : p – nitrolphenol phosphate PBS – T : Phosphate buffer saline with Tween – 20 PCR : Polymerase Chain Reaction PVP : Polyvinylpyrolydol RT – PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction ssRNA : Single strand RNA Ta : Annealing temperature TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting temperature TMV : Tobacco Mosaic Virus TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus UV : Ultra violet xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. ......................................................................... 3 Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. ..................... 6 Hình 2.3 Arachis hypogaea L. ......................................................................... 7 Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. ................ 10 Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV ....................................................................... 15 Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm ........................................................... 17 Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật .............................. 19 Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV ......................................................................... 21 Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật ............................................ 23 Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV ......................................................................... 25 Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật ................................ 28 Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu ................ 53 Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên ............... 54 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Tân Biên ........................................................................................... 56 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện Bến Cầu ............................................................................................ 57 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng ...................................... 45 Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá .... 46 Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá ............................................ 47 Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá ............................................ 48 Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ................................................... 50 Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá ......... 51 xiii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV .. 46 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ....................... 47 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ...................... 48 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ........................................................... 50 Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá ............................. 51 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích. Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia. Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên. Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật. Tỉnh Tây Ninh có diện tích trồng thuốc lá và đậu phộng khá lớn, sản lượng thu hoạch hàng năm khá cao và mang lại nhiều lợi nhuận. Nhưng trong những năm gần đây, việc trồng trọt hai loại cây này đã gặp nhiều tổn thất vì bệnh do virus gây ra. Trong đó, Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) là ba loại virus mà tác hại của nó vô cùng nghiêm trọng, dẫn tới giảm năng suất và chất lượng nguyên liệu cây trồng. Một khi bệnh đã phát triển thành dịch thì rất khó khống chế và có khi phải tiêu hủy tất cả diện tích đã trồng trọt. Việc làm này sẽ gây nhiều khó khăn và đem lại tổn thất lớn cho người trực tiếp canh tác cũng như cho kinh tế đất nước. Chính vì lý do đó mà chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá tình trạng nhiễm Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”, nhằm đưa ra phương pháp phát hiện bệnh sớm nhất, từ đó có biện pháp ngăn chặn kịp thời, với mong muốn giảm bớt được thiệt hại do các virus này gây 2 ra, góp phần ổn định được nguồn thu nhập từ thuốc lá và đậu phộng cho tỉnh Tây Ninh nói riêng và cả nước nói chung. 1.2 Mục đích Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Chẩn đoán bệnh Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Phát hiện Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2 Yêu cầu Lấy mẫu thuốc lá có triệu chứng nhiễm CMV, TMV, TSWV và đậu phộng có triệu chứng nhiễm TSWV ngoài đồng ruộng, tại các huyện trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật DAS – ELISA và RT – PCR, sau đó mới tiến hành chẩn đoán. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá 2.1.1 Vị trí phân loại Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotyledones Họ : Solanaceae Tên khoa học : Nicotiana tabacum L. Tên tiếng Anh : Tobacco Tên tiếng Việt : Thuốc lá 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Hàng ngàn năm trước Công nguyên, người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác. Họ dùng thuốc lá với mục đích nghi lễ và chữa bệnh. Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là Tabaccos. Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới. Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào Việt Nam. 2.1.3 Đặc điểm di truyền Bộ nhiễm sắc thể 2n = 48. Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 3,9 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể. Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 3,73 × 109 bp. 2.1.4 Đặc điểm hình thái. Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm: Rễ cái, rễ nhánh, rễ hấp thụ và rễ bất định. Rễ thường ăn sâu xuống đất từ 1,5 – 2 m. Thuốc lá là cây cỏ nhất niên, cây trưởng thành thường cao 1 – 2 m, chỉ phân nhánh ở ngọn. Trên thân cây có nhiều lóng, được phân cách bởi những đốt. Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. 4 Lá cây thuốc lá rất to, đơn nguyên, hình bầu dục, đầu hơi nhọn, mọc cách, mềm, có lông dính ở hai mặt. Số lá trên thân chính trung bình từ 20 – 35 lá. Hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, màu trắng hồng, hồng tươi, dài 1 – 2 cm. Quả nang, hai ngăn. Mỗi cây có 100 – 150 quả trên một chùm hoa, có những cây (tùy giống) có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa. Hạt thuốc lá rất nhỏ, rất cứng, bề mặt vỏ hạt sù sì, nhiều nếp nhăn. 2.1.5 Đặc điểm trồng trọt 2.1.5.1 Yếu tố khí hậu Thuốc lá là cây ưa sáng trực tiếp. Cây có thể thích nghi với một phổ khí hậu rộng. Nhiệt độ lý tưởng cho cây thuốc lá: 25oC – 28oC. Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%. Độ ẩm đất thích hợp: Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%. Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%. Giai đoạn già chín của lá: 60%. 2.1.5.2 Yếu tố đất đai Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt, thoát nước dễ. Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9. Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 – 110kg/ ha. 2.1.5.3 Yếu tố sinh vật Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá. Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều. Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá. Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu. 2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng 5 Lợi nhuận đối với người trồng thuốc lá rất cao. Sản phẩm chính của cây thuốc lá là sản xuất ra các loại thuốc hút, nhai, ngửi. Các bộ phận trên cây thuốc lá có tỷ lệ: Lá: 30%, thân: 40%, hạt: 20% và rễ: 10%. Như thế, đối với các nước có nền công nghiệp chưa phát triển, thì việc sử dụng năng suất sinh học còn rất thấp vì ngoài lá ra không tận dụng được các bộ phận còn lại để sản xuất các sản phẩm khác. Thành phần độc hại trong thuốc lá có nhiều, quá trình nhiệt phân, ngưng tụ trong khi đốt, cháy (hút) đã tạo ra một số chất, ảnh hưởng sâu sắc đến hóa tính của lá thuốc. Vì thế, để hạn chế độc hại của thuốc lá đòi hỏi nhà sản xuất thuốc lá phải nỗ lực tìm ra các biện pháp để giảm bớt các thành phần này. Người ta tận dụng các loại phế thải thân, lá thuốc lá để sản xuất ra sunfat nicotin, có tác dụng tốt trong phòng trừ sâu bệnh trên đồng ruộng. Từ thân và lá thuốc lá, giáo sư R. L. Wain (Anh) đã chiết xuất được sclareol và 13 epi sclareol có tác dụng phòng trừ được bệnh rỉ sắt trong cây họ đậu. Sản xuất nước hoa từ hoa thuốc lá, acid nicotinic, acid citric lấy từ cây thuốc lá nhiều hơn từ 2 – 3 lần trong cam chanh để sử dụng vào công nghiệp thực phẩm. Chiết xuất được trong hạt thuốc lá 35% 40% dầu sử dụng trong công nghiệp. Thân cây thuốc lá còn được chế biến thành thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng cao, thu được 3 – 3,5 tấn/ ha hoặc thu được 12% 15% protein cao cấp trong cây thuốc lá để làm thực phẩm. Ngoài ra, các phế thải của thuốc lá trong quá trình chế biến như vụn, bụi được tận dụng chế biến làm phân hữu cơ khá tốt. Về mặt nghiên cứu, cây thuốc lá được coi là đối tượng thử nghiệm các nghiên cứu sinh học. Nicotiana spp. được dùng làm mô hình nghiên cứu in vitro về sự tái sinh ở thực vật từ năm 1957. Trong những nghiên cứu cổ điển của Skoog và Miller thì Nicotiana tabacum là đối tượng được chú ý sớm nhất. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô, về sinh học phân tử đã đạt được nhiều thành công ở cây thuốc lá. Hy vọng trong tương lai, cây thuốc lá sẽ còn có nhiều công dụng khác để phục vụ cho nhu cầu xã hội. 6 (C) (A) (B) (A): Vườn cây thuốc lá Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. (D) (E) (F) (B): Đặc điểm hình thái (C), (D), (E), (F): Sự đa dạng về chủng loại và màu sắc ( 7 2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng 2.2.1 Vị trí phân loại Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Phân họ : Faboideae Giống : Aeshynoenaeae Tên khoa học : Arachis hypogaea L. Tên tiếng Anh : Peanut, groundnut Tên tiếng Việt : Đậu phộng, lạc 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố Cây đậu phộng đã có từ khoảng 1500 – 1200 năm trước Công nguyên. Người Inca trồng đậu phộng như một loại rau tên là “ynchis” dọc theo vùng duyên hải Peru. Đến 1609, người Tây Ban Nha phát hiện thấy các vùng trồng đậu phộng ở Nam Mỹ, đặc biệt trên những vùng đảo Tây Ấn, Mexico, vùng biển Đông – Đông Bắc Braxin, trên những dãi đất ấm áp của vịnh Ria Plata (Argentina, Paragoay, cực Tây Nam Braxin, Peru), và gọi tên là “mani”. Có nhiều quan điểm của nhiều tác giả tranh luận về trung tâm khởi thủy chính xác của loài Arachis hypogaea. Nhìn chung các quan điểm cho rằng Braxin là trung tâm khởi nguyên của loài Arachis hypogaea, một số tác giả lại cho rằng nơi xuất xứ là ở Bolivia (Krapovickas, 1968, Cardenas, 1969), vùng thượng lưu sông Plata. Hiện nay, cây đậu phộng được trồng rộng rãi trên 100 nước từ 40o Bắc đến 40o Nam thuộc vùng nhiệt đới và các vùng ấm áp trên thế giới. Châu Á đứng hàng đầu thế giới về diện tích trồng đậu cũng như là sản lượng, tiếp theo là châu Phi, Bắc Mỹ rồi đến Nam Mỹ. Trong số 25 nước trồng đậu phộng ở Châu Á, Việt Nam đứng hàng thứ 5, và đậu phộng đã được trồng khá phổ biến từ xưa đến nay ở nhiều nơi. 2.2.3 Đặc điểm di truyền Bộ nhiễm sắc thể: 2n = 40. Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 4,31 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể. Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 4,2 × 109 bp. Hình 2.3 Arachis hypogaea L. 8 2.2.4 Đặc điểm hình thái Đậu phộng có rễ cọc phát triển tốt. Rễ dạng bò khoẻ hơn dạng mọc đứng. Đây là cây cỏ nhỏ, nhất niên, nhánh sà, có lông, chiều cao từ 20 – 40 cm. Thân chính mọc từ đốt cuối của trụ trên lá mầm, hai lá mầm đối xứng nhau. Có 4 hoặc 3 lá chét ( chỉ có ở Erectoides), hình dạng lá thay đổi từ thuôn, lưỡi mác đến elip, elip thuôn dài, có lông bao phủ. Hoa đậu phộng dạng cánh bướm, màu vàng, cánh rời, cây phát hoa ở nách lá, các hoa ở gần mặt đất. Quả hình thành dưới đất, thắt từ 1 – 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt với 2 lá mầm và 1 phôi thẳng. Bế quả có quả bì chạm trổ. Hạt có vỏ lụa mỏng, đỏ, chiều dài 7 – 21 mm, đường kính 5 – 13 mm. 2.2.5 Đặc điểm trồng trọt 2.2.5.1 Yếu tố khí hậu Cây sinh trưởng cần nhiều ánh sáng mặt trời và thời tiết ấm nóng. Không mẫn cảm với chiều dài ngày. Ở những vùng có lượng mưa từ 500 – 1250 mm phân phối đều, cây sẽ cho sản lượng cao. Đậu phộng không chịu đông giá và úng nước. 2.2.5.2 Yếu tố đất đai Đất đai lý tưởng cho đậu phộng là thoát nước nhanh, màu sáng, lỏng, dễ vỡ, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và một lượng chất hữu cơ vừa phải (York và Codwell, 1951). Có thể đạt sản lượng cao trên đất hơi chua pH = 6 – 6,4 (Woodrof, 1966). Cây khá mẫn cảm với đất mặn. Đậu phộng có nhu cầu về chất dinh dưỡng các loại cao. 2.2.5.3 Yếu tố sinh vật Có trên 90 loài sâu, 9 giống tuyến trùng gây hại cho đậu phộng trên đồng ruộng. Ngoài ra cây còn chịu ảnh hưởng của các loại bệnh nấm. Bên cạnh đó thì cỏ dại tranh với cây về độ ẩm của đất, chất dinh dưỡng, ánh sáng và còn là ký chủ chuyển giao một số bệnh cây. Ngoài ra, đậu phộng còn chịu thiệt hại bởi các loài sâu hại lá trong kho như mọt. 9 2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng Đậu phộng là cây thực phẩm, cây có dầu quan trọng dùng chế biến thành dầu thực vật. Trong số các loại cây hạt có dầu trồng hàng năm trên thế giới, đậu phộng đứng thứ hai sau đậu tương về diện tích trồng cũng như về sản lượng. Giá trị dinh dưỡng trong 100g đậu phộng gồm có: 22g cacbonhydrat, 50g chất béo và hàm lượng protein là 24g. 100g đậu phộng cung cấp 590 KCalo. Các nhà khoa học thuộc Đại học Y Harvard (Mỹ) đã rút ra kết luận: Người thường xuyên ăn đậu phộng hay bơ lạc sẽ ít có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường type 2 so với những người khác. Ăn 140g đậu phộng hay bơ lạc mỗi tuần sẽ giảm được 27% nguy cơ mắc bệnh. Điều đó được giải thích là do trong đậu phộng có chứa chất béo chưa bão hòa giúp cải thiện độ ổn định của insulin đường máu. Ngoài các chất chống oxy hóa ra thì đậu phộng có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng khác nên nó còn giúp ngăn ngừa bệnh tim nhờ làm giảm lượng cholesterol trong máu. Đậu phộng là một trong những cây xuất khẩu thu ngoại tệ của nước ta. Hiện nay, ngoài những vùng chuyên canh, thì nó đã và đang được trồng khá phổ biến ở nhiều vùng trong nước. Mặc dù có vai trò quan trọng như vậy, nhưng nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu các ứng dụng về đậu phộng ở nước ta nhìn chung vẫn còn nhiều hạn chế. 10 ( Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. (A) (B) (C) (D) (A): Đặc điểm hình thái (B): Hoa đậu phộng (C): Cây đậu phộng trưởng thành (D): Hạt đậu phộng 11 2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra 2.3.1 Sơ lƣợc chung về virus gây hại thực vật 2.3.1.1 Đặc điểm chung Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ. Chúng thiếu hệ thống men, hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số lượng. Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều virus. Chúng không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành nhiều virus mới. Cơ thể thực vật kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết. Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thước rất nhỏ bé, cấu tạo rất đơn giản: Là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy nhiên, cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA. Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan. Các acid nucleic (RNA hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng. Trọng lượng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da. Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: Hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh trùng. Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trường có thể tạo thành các tinh thể. 2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dưới rồi lại từ dưới lên trên khi các dòng chất dinh dưỡng được vận chuyển về các cơ quan sinh thực. Virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn. Các con đường truyền bệnh: Truyền qua nhân giống vô tính: Ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép, cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay thân cây. Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: Có khoảng 100 loài virus có khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí. 12 Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Trồng cây với mật độ dày, giao tán, lá cọ sát nhau giữa cây bệnh với cây khỏe. Hay truyền qua vết thương do gió, chăm sóc, thu hái, gia súc. Truyền bệnh bằng côn trùng môi giới (nhện, tuyến trùng): Côn trùng là nhóm môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên đồng ruộng. Một loại côn trùng thường chỉ là môi giới truyền bệnh cho một loại virus mà thôi. Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng: Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây tới 30 phút sau khi chích hút ở cây bệnh và có thể lây ngay. Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền bệnh cho cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời. Đây là kiểu truyền bệnh theo phương pháp sinh học. Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian giữa hai nhóm trên. Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi: Tăng về số lượng, tăng cường tính ký sinh gây bệnh và được đưa vào đúng tầng mô mẫn cảm bệnh. Nhưng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức sống giảm. Truyền bệnh nhờ nấm: Đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng truyền bệnh virus cho cây. Truyền bệnh bằng dây tơ hồng (Cuscuta sp.): Đây là thực vật thượng đẳng ký sinh tạo rễ ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa. Do vậy, có nhiều loại virus thực vật di chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh. 2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá  Bệnh virus Y khoai tây Triệu chứng: Rất đa dạng, điển hình nhất là khảm và gân xanh đậm, lá nhăn nheo, biến dạng, cây bị lùn. Virus gây bệnh: Potato Virus Y (PVY), thuộc nhóm Potyvirus. 13  Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá Triệu chứng: Bao gồm triệu chứng của TMV, CMV, lá bị khảm và có những vệt xanh đậm dọc theo gân lá. Virus gây bệnh: Tobacco Etch Virus (TEV), thuộc nhóm Potyvirus.  Bệnh virus đốm gân thuốc lá Triệu chứng: Đa dạng tùy theo những dòng thuốc lá khác nhau, lá bị khảm nhẹ, biến dạng, triệu chứng điển hình là hóa vàng dọc theo gân chính. Virus gây bệnh: Tobacco Vein Mottling Virus (TVMV), nhóm Potyvirus.  Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng Triệu chứng: Trên tàn lá xuất hiện dạng khảm có màu vàng trắng hay trắng, đôi khi mất màu vùng mô giữa các gân lá, thường được xem như là bệnh khảm calico, các dạng sọc vàng và chết hoại cũng có thể xảy ra. Thông thường, lá không bị biến dạng, cây có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng. Virus gây bệnh: Alfalfa Mosaic Virus (AMV).  Bệnh virus cong lá thuốc lá Triệu chứng: Lá cong và biến dạng, lốm đốm vàng và chết hoại, cây bị lùn. Virus gây bệnh: Tobacco Leaf Curl Virus (TLCV). 2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng  Bệnh hoại tử chồi (thối ngọn) Triệu chứng: Lá có các vòng đồng tâm úa vàng hoặc các mảng vàng xanh xen lẫn nhau, cây thối ngọn, rồi lan sang các phần khác, cây bị ức chế sinh trưởng, nách lá nảy chồi nhanh, các lá ở chồi nách giảm kích thước, bị vặn, đốm khảm và úa vàng. Cây bị nhiễm sớm lá xoăn lại và thành dạng bụi. Virus gây bệnh: Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV).  Bệnh chùn đậu phộng do virus Triệu chứng: Đầu tiên xuất hiện các vết và đốm tròn úa vàng, sau đó mờ dần, phiến lá màu xanh đậm với đốm nhạt, cây cằn lại, xanh tối, tạo thành một búi, lá có đốm khảm, vòng vàng, quả nhỏ, rễ kém phát triển, đen tối, vỏ dễ bong, dễ nhiễm các vật hại khác. Virus gây bệnh: Peanut Clump Virus (PCV). 14  Bệnh hoa lá đậu phộng do virus Triệu chứng: Cụm xanh tối rải rác xen kẽ với các vòng úa vàng xuất hiện ở các lá non nhất, cây bị nhiễm không có dấu hiệu cằn cỗi. Virus gây bệnh: Peanut Mottle Virus (PMV), thuộc virus khoai tây nhóm Y.  Bệnh virus đốm nhạt ở cây đậu bò Triệu chứng: Gân lá trong, lá bị uốn cong, các vết hoại tử hình thành ở lá và cuống làm rụng lá, cây lùn, quả ít, lá non có từng dải sọc. Virus gây bệnh: Cowpea Mild Mottle Virus (CMMV).  Bệnh khảm xanh đậu phộng Triệu chứng: Đốm úa vàng, ở lá chết non gân lá trong, cây bị hại nặng bị lùn. Virus gây bệnh: Peanut Green Mosaic Virus (PGMV).  Bệnh đốm vàng đậu phộng do virus Triệu chứng: Lá có khảm xanh rõ rệt. Virus gây bệnh: Groundnut Chlorotic Spotting Virus (GCSV).  Bệnh khảm vàng Triệu chứng: Lá non bị nhiễm có các đốm vàng sáng, nhăn nheo, mép lá cuốn lên phía trên. Virus gây bệnh: Được truyền bởi bọ phấn trắng Bemisia tabaci. 2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV Năm 1915, TSWV được phát hiện lần đầu tiên khi gây thiệt hại lớn trên cà chua trồng ở Australia. Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và nhiều vùng trên thế giới. Năm 1926, TSWV xuất hiện trên cây thơm (dứa) ở Hawaii và phát triển thành dịch ở California vào năm 1935. Năm 1938, phát hiện thấy TSWV trên cà chua trồng trong nhà kính tại Ohio. Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng tại Hawaii. Năm 1970, lần đầu tiên, TSWV được xác định là gây bệnh tại Georgia. Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng nề các cánh đồng trồng đậu phộng vào năm 1985 – 1986. 15 Năm 1972, TSWV được phát hiện thấy lần đầu tiên tại Louisiana. Năm 1989, TSWV gây thiệt hại nặng cho thuốc lá, đậu phộng và cà chua ở miền Nam Georgia. Trong hai năm 1997 và 1998, tại Florida, ước tính thiệt hại khoảng 40 triệu USD mỗi năm do TSWV gây bệnh trên đậu phộng trồng tại đây (University of Florida, 2000). 2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV TSWV là virus thuộc họ Bunyaviridae, giống Tospovirus. Bunyaviridae là một họ lớn gồm những virus được mang bởi động vật chân đốt, gồm năm giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó, Tospovirus được đánh giá là một trong mười nhóm virus gây bệnh cây nghiêm trọng nhất. Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA. Genome của TSWV gồm ba phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba sợi RNA này khác nhau về kích thước và được gọi là Large (L), Middle (M), Short (S). Mỗi RNA được bao bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwyk và cộng sự, 1993). Giữa các đoạn L, M, S có trình tự kết thúc như nhau. TSWV hình cầu, đường kính 80 – 110 nm (Lindsey Irons and Emily Sims). 2.4.3 Phân loại TSWV TSWV được phân loại như là đại diện duy nhất của nhóm cây đơn thân (Mathew, 1979). Năm 1989, được phân chia thành 2 dòng: TSWV dòng L và TSWV dòng I. Những năm 1989 - 1992, 2 dòng này được xác định là có đặc tính huyết thanh học khác nhau và được đổi tên thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I). Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV 16 Hiện nay, TSWV được phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Người ta dựa trên tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I). Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II). Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III). Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV). Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V). Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV. 2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp các lục địa. Nó bao gồm những cây cảnh như Aster, Vinca, Impatiens, Ranunculus, Zinna và các cây trồng như Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum, Lactuca sativa và Solanum tuberosum, và Arachis hypogaea. Trong số đó, cỏ dại là nguồn chứa TSWV chính (Y.Antignus và cộng sự, 1997). 2.4.5 Con đƣờng truyền bệnh TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác nhau. Có ít nhất 4 loài bọ trĩ: Thrips tabaci Lind, Western Flower Thrips (bọ trĩ hoa) (Frankliniella occidentalis), Frankliniella schultzei (Trybom), Frankliniella fusca (Hind). Trong đó, do có sự phân bố rộng rãi nên Western Flower Thrips (Frankliniella occidentalis) và Onion Thrips (bọ trĩ hành) (Thrips tabaci) là các vectơ chính truyền bệnh. Bọ trĩ (Thrips) là những côn trùng có kích thước rất nhỏ (0,5 1mm), khó thấy bằng mắt thường, thân thon, di chuyển nhanh nhẹn bằng cách nhảy, con trưởng thành có thể bay. Chúng thường di chuyển với số lượng lớn và bay theo gió tới hàng dặm. Con trưởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh sản không cần con đực, đẻ trứng vào mô mềm của thân cây, lá hay hoa. Một ổ trứng có từ 50 – 60 trứng, ấp trứng trong 7 ngày. Sau khi trứng nở, ấu trùng sẽ ăn ngay, trong khoảng 6 – 7 ngày trước khi bắt đầu chuyển vào giai đoạn “ngủ”. Ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng đưa virus vào bên trong cơ thể. Thời gian ăn càng kéo dài thì khả năng mang virus càng tăng lên. Chỉ ấu trùng mới có khả năng mang virus. 17 Sau đó, chúng không ăn nữa, chui vào đất, sâu khoảng 8 cm, trở thành nhộng, và bắt đầu “ngủ”. Kết thúc giai đoạn “ngủ”, chúng trở thành bọ trĩ trưởng thành, có cánh và lên mặt đất. Thời gian để từ trứng trở thành bọ trĩ trưởng thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện phát triển. ( Ấu trùng bọ trĩ chưa lan truyền bệnh cho cây ngay được mà phải chờ đến khi chúng trưởng thành. TSWV sản sinh trong bọ trĩ sẽ tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Có hai lý do để cần thời gian cho bọ trĩ trưởng thành: Thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, từ miệng vào tuyến nước bọt, để truyền cho cây khác. Con non không có cánh nên khả năng di chuyển sang cây khác khó thực hiện được, vì vậy phải đợi trưởng thành di chuyển dễ dàng hơn. Mỗi năm có nhiều thế hệ bọ trĩ sinh ra và trưởng thành, nên số lượng của chúng khá nhiều. Vòng đời trung bình của bọ trĩ vào khoảng 30 ngày. 2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh TSWV thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ dao động từ 20oC đến 37 o C. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp gây bất lợi cho bọ trĩ. Nhiệt độ lạnh trong mùa đông cũng làm giảm đáng kể số lượng bọ trĩ. TSWV phát triển trong suốt giai đoạn sinh trưởng, sinh dưỡng của cây, giai đoạn mà virus được bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác. Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân tới, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây Hình 2.6 Bọ trĩ trƣởng thành dài 1mm 18 nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây (Ray Cerkauskas, 2004). 2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy thuộc vào tuổi cây, điều kiện môi trường, mức độ lây nhiễm, số lượng và thành phần các virus gây hại cho cây ký chủ. Sự nhiễm bệnh cho cây ký chủ được biểu hiện thấy trên những tế bào biểu bì, được truyền bệnh thông qua những vết thương do bọ trĩ cắn. Triệu chứng của bệnh sẽ xuất hiện trong vòng từ 2 đến 4 ngày, hoặc từ 10 ngày đến 6 tuần, có khi lại lâu hơn. Những cây con có thể bị héo và chết trong vòng 1 tuần kể từ khi nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhưng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Từ cây con đến cây trưởng thành đều có thể bị TSWV tấn công. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, như bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thường. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thương phẩm. Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trường gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác. 19 Cây thuốc lá Lá thuốc lá Lá đậu phộng Cây đậu phộng Lá cà chua Trái cà chua Trái ớt Thân Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật ( 20 2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Cây con rất dễ bị nhiễm TSWV, do đó nên trồng cây con trong nhà kính hoặc sử dụng màng che cẩn thận, phun thuốc diệt côn trùng để ngăn ngừa bọ trĩ tấn công. Có mật độ trồng phù hợp để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những vùng nhiễm bệnh đến. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trên cùng một vùng đất. Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị ảnh hưởng của TSWV. Loại bỏ các loài cỏ dại và cây mọc tự nhiên quanh khu vực trồng trọt. Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3 – 4 tuần. Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm để kháng bệnh. Khống chế bọ trĩ bằng các biện pháp sinh học để có hiệu quả và có lợi nhất, mà không gây ô nhiễm môi trường. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lượng và thời gian hợp lý để tiêu diệt được nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt được kết quả tốt nhất. Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để tránh sự kháng thuốc. 2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.5.1 Nguồn gốc của TMV Năm 1892, nhà bác học Nga D. I. Ivanopski khi nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc lá đã phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh”, không phải là vi khuẩn, không nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học mà có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn. Năm 1898, M. Baijerinck, Đan Mạch, cũng đã phát hiện và xác nhận nguồn gây bệnh đó mang tên tượng trưng là “virus” có nghĩa là “chất độc”. Năm 1939, Kaushe Pfankuch và Ryska sử dụng

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfVAN NGOC DUNG - 02125142.pdf