Đề tài Nuôi trồng và xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư (pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp

MỤC LỤC CHưƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ta i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách các chữ viết tắt .vi Danh sách các hình .vii Danh sách các bảng .viii 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 1.4. Nội dung thực hiện 2 2. TỔNG QUAN .3 2.1. Nấm trồng 3 2.1.1. Khái niệm về nấm 3 2.1.2. Sinh sản và chu trình sống .5 2.1.3 Đặc điểm biến dưỡng và sinh lý .7 2.2. Nấm bào ngư 8 2.2.1. Giới thiệu .8 2.2.2. Một số loài nấm bào ngư được nuôi trồng ở VIệt Nam 9 2.2.2.1. Nấm bào ngư Pleurotus florida 10 2.2.2.2. Nấm bào ngư Pleurotus sajor-caju . 10 2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius . 11 2.2.2.4. Nấm bào ngư Pleurotus abalonus . 11 2.3. Phương pháp sắc ký . 12 2.3.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký . 12 2.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký 12 2.4. Một số phương pháp sắc ký trong phân tich amino acid . 13 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatography) . 13 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) . 14 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 15 2.4.3.1. Pha tĩnh 15 2.4.3.2. Pha động 16 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC . 16 2.5. Các bước phân tích amino acid . 17 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) 17 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) 19 2.5.3. Phân tách trên HPLC .20 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu 21 2.4.4.1. Định tính 21 2.4.4.2. Định lượng .21 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngư 23 3. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1.Thời gian và địa điểm thực hiện .23 3.1.1. Thời gian thực hiện .23 3.1.2 .Địa điểm .23 3.1.3.Vật liệu nghiên cứu .23 3.2. Hóa chất và dụng cụ 23 3.2.1. Hóa chất .23 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị .24 3.3. Phương pháp nhân giống và trồng nấm .24 3.3.1. Môi trường .24 3.3.2. Phương pháp 24 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trường PGA .24 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trường hạt .24 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trường giá môi .25 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trường nuôi trồng 25 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình .26 3.3.3. Phân tích amino acid 26 3.3.3.1.Thủy phân mẫu .26 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất: .27 3.3.3.3. Phân tích HPLC .28 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả .28 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Kết quả .29 4.1.1. Kết quả trồng nấm 29 4.1.1.1. Sự tăng trưởng của hệ sợi trên các môi trường .29 4.1.1.2. Sự hình thành quả thể 30 4.1.2. Kết quả phân tích amino acid 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1. Kết luận 35 5.2. Đề nghị .35 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 NUÔI TRỒNG VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẨN AMINO ACID CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM BÀO NGƯ (Pleurotus spp.) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (High performance liquid chromatography - HPLC)

pdf51 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 04/06/2013 | Lượt xem: 1890 | Lượt tải: 2download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Nuôi trồng và xác định thành phẩn amino acid của một số loài nấm bào ngư (pleurotus spp.) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hƣờng có dạng nón hay phễu, với cuống đính ở giữa hay bên. Mặt dƣới mũ của nhóm này cấu tạo bởi các phiến mỏng xếp sát vao nhau nhƣ hình nan quạt. Ở một số trƣờng hợp, phiến nấm còn kéo dài từ mũ xuống cuống (chân nấm), nhƣ nấm bào ngƣ (Pleurotus) [3]. Bào tử đảm (basidiospore) tạo ra ở bề mặt phiến, trên cấu trúc đặc biệt gọi là đảm (basidium). Riêng nấm đậu (Coprinus), khi tai nấm trƣởng thành mũ nấm sẽ chảy thành dịch nƣớc đen mang theo các bào tử đảm; còn các bào tử khác sẽ rụng và bay theo gió. Đảm đƣợc tạo thành từ các đầu ngọn sợi nấm. Tế bào này phồng to và bên trong hai nhân đứng riêng lẻ, sẽ nhập lại thành một nhân. Quá trình này gọi là quá trình thụ tinh [3]. Nhân thụ tinh sẽ phân chia và cuối cùng tạo ra 4 nhân con. Bình thƣờng mỗi nhân sẽ đƣợc khối sinh chất đẩy vào một cái gai nhỏ (xuất hiện trên đảm) để tạo ra một đảm bào tử, nhƣng đôi khi một đảm bào tử có thể cùng lúc hai nhân nhƣ nấm rơm (tỉ lệ chiếm đến 1/4) hoặc đặc biệt ở nấm mỡ (Agaricus bisporus) chỉ sinh ra hai đảm tử, mỗi bào tử chứa hai nhân. Các tế bào đảm hợp lại thành lớp trên bề mặt của phiến, đƣợc gọi là lớp thụ tầng (hymennium) và vì vậy đảm bào tử cũng thành lớp phủ trên trên bề mặt phiến. Điều này thấy rõ nấm rơm, khi trƣởng thành phiến nấm chuyển sang màu đỏ là do màu của bào tử. 6 Ngƣời ta phân biệt nấm đồng đảm (homobasidiomycetidae) và nấm dị đảm (hemibasidiomycetidae) là dựa vào cấu trúc của đảm. Nấm đồng đảm có đảm là một tế bào đồng nhất, còn nấm dị đảm hay tiền đảm chia làm 4 phần, mỗi phần tạo ra một đảm bào tử. Đảm bào tử là bào tử hữu tính, khi rụng sẽ bay đi khắp nơi. Khi gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm. Hệ sợi nấm thƣờng chỉ có một nhân nên đƣợc gọi là sợi nấm sơ cấp (primary mycelium). Đối với nấm dị tản (heterothallic), phải có sự phối hợp giữa hai sợi nấm sơ cấp phát sinh từ hai bào tử có đặc tính di truyền khác nhau mới hoàn thành sợi nấm thứ cấp (secondary mycelium). Trong khi đó nấm đồng tản (homothallic) chỉ cần hệ sợi sơ cấp từ bào tử nẩy mầm cũng có thể tự phối cho ra hệ sợi nấm thứ cấp. Từ hệ sợi nấm thứ cấp chứa hai nhân, nấm phát triển thành mạng sợi, lan khắp nơi trên cơ chất để hút chất dinh dƣỡng. Trong trƣờng hợp bị đứt khúc, các sợi nấm tự làm lành vết thƣơng và tái lập lại hệ sợi, tƣơng tự nhƣ cây trồng trong giâm hay chiết cành. Ở những điều kiện nhất định, nhƣ ẩm độ, nhiệt độ thích hợp, hệ sợi nấm sẽ bện lại và tạo thành hạch nấm. Hạch nấm sẽ tiếp tục phát triển cho quả thể trƣởng thành.[3]. Quả thể Phiến nấm Giảm phân hình thành bào tử đảm Bào tử đảm Sợi nấm sơ cấp (đơn nhân) Hợp tử Sợi âm Sợi dƣơng Quá trình dung hợp Sợi nấm thứ cấp (song nhân) Hình thành quả thể Sợi nấm song nhân Hình 2.2. Chu kỳ sống của nấm đảm ( Peter H. Raven và ctv, 1992) 7 Ở nấm đảm, sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm cấp một xảy ra rất sớm, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm. Quả thể là do các sợi nấm song nhân liên kết lại tạo thành. Sợi nấm song nhân về mặt di truyền đuợc biểu thị là (n+n) khác với sợi nấm đơn nhân là n và hợp tử là 2n [1]. Ở một số loài còn có một dạng bào tử khác gọi là hậu bào tử hay bào tử màng dày (Chlamydospore), thí dụ nhƣ nấm rơm. Hậu bào tử giống nhƣ một bào tử thu nhỏ với đầy đủ nguyên sinh chất và hai nhân nhƣng cô đặc hơn và có vách tƣơng đối dày bao bọc. Có thể xem đây là một dạng sống tiềm sinh của nấm vì sau đó bào tử này có thể nẩy mầm và cho lại hệ sợi nấm thứ cấp [3]. 2.1.3. Đặc điểm biến dƣỡng và sinh lý Nấm chủ yếu sống dị dƣỡng, lấy thức ăn từ các nguồn hữu cơ (động vật hoặc thực vật). Ngoại trừ niêm khuẩn thay đổi hình dạng tế bào để nuốt lấy thức ăn (tƣơng tự động vật), còn lại hầu hết các loài nấm đều nấm lấy dinh dƣỡng qua màng tế bào hệ sợi (giống rễ cây thực vật). Nhiều loài nấm có hệ enzym phân giải tƣơng đối mạnh, giúp chúng có thể sử dụng các dạng thức ăn phức tạp, bao gồm các đại phân tử nhƣ (cellulose, hemicellulose), chất đạm (protein), chất bột (amidon, polysaccharide), lignin.Với cấu trúc sợi, tơ nấm len lỏi sâu vào trong cơ chất (rơm, rạ, mạt cƣa và nhiều cơ chất khác) rút lấy thức ăn đem nuôi toàn bộ cơ thể nấm (tản dinh dƣỡng hay tản sinh sản) [3]. Dựa theo cách thức dinh dƣỡng của nấm có thể chia thành 3 nhóm: Hoại sinh: Đặc tính chung của hầu hết các loài nấm, trong đó có nấm trồng. Thức ăn của chúng là xác bã động thực vật. Nhóm nấm này có hệ enzym tiêu hoá tƣơng đối mạnh, phân giải đƣợc nhiều loại cơ chất. Chúng có khả năng biến các chất này thành những chất có thành phần đơn giản để có thể hấp thụ đƣợc. Tuy nhiên, cũng có những trƣờng hợp nấm không thể phân giải cơ chất mà phải nhờ vào các vi sinh vật khác (vi khuẩn, nâm mốc, xạ khuẩn) tiến hành trƣớc một bƣớc[3]. Ký sinh: Bao gồm chủ yếu các loại nấm gây bệnh. Chúng sống bám vào các loài sinh vật khác (động vật, thực vật, các loài nấm khác). Thức ăn của chúng chính là các chất lấy từ cơ thể ký chủ, làm suy yếu hoặc làm tổn thƣơng ký chủ. Một số nấm ăn có thể sống trên cây còn tƣơi nhƣng đời sống thực sự vẫn là hoại sinh, nên đƣợc xếp vào nhóm trung gian, gọi là nhóm bán ký sinh (trƣờng hợp nấm mèo). 8 Cộng sinh: Đây là nhóm đặc biệt, lấy thức ăn từ cơ thể chủ nhƣng không làm chết hoặc gây tổn thƣơng ký chủ, ngƣợc lại còn giúp chúng phát triển tốt hơn. Vì vậy các loài này đối với ký chủ có mối quan hệ mật thiết với nhau. Do đó, việc nuôi trồng trở nên phức tạp hơn, thƣờng giống nấm đƣợc cấy cùng lúc với việc trồng cây (thí dụ nấm Tuber hoặc Boletus). 2.2. Nấm bào ngƣ 2.2.1. Giới thiệu Nấm bào ngƣ (còn gọi là nấm sò, nấm bình cô, oyster mushroom) gồm nhiều loài thuộc: Chi Pleurotus Họ Pleurotaceae Bộ Agaricales Lớp phụ Hymenomycetidae Lớp Hymenomycetes Ngành phụ Basidiomycotina Ngành nấm thật-Eumycota Giới nấm Mycota hay Fungi Nấm bào ngƣ có tới 50 loài khác nhau. Tuy nhiên, số loài đƣợc nuôi trồng đƣợc không nhiều, khoảng 10 loài [2]. Nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng rộng rãi trên thế giới. Ở châu Âu nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở Hungary, Đức, Ý, Pháp, Hà Lan. Ở Châu Á nấm bào ngƣ đƣợc trồng ở Trung Quốc với sản lƣợng rất cao (khoảng 12 nghìn tấn mỗi năm) giá khoảng 2.2 triệu đồng Việt Nam. Ngoài Trung Quốc, nấm này còn đƣợc trồng ở Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc, Thái Lan Ấn Độ [2]. Nấm bào ngƣ không chỉ ăn ngon mà còn có giá trị dinh dƣỡng cao. Trong nấm chứa đầy đủ các amino acid. Ngoài giá trị dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ còn có giá trị dƣợc liệu. Nhiều nghiên cứu cho thấy nấm bào ngƣ cùng một số nấm ăn khác có tác dụng chống ung thƣ. Bằng phƣơng pháp khuếch tán vào thạch nhóm nghiên cứu của Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã cho thấy nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju ở dạng bán cầu lệch có tác dụng ức chế 2 chủng Vi khuẩn Gran dƣơng S. aureus và B. subtilis và 2 chủng Gram 9 âm E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài ra, theo nghiên của nhà khoa học Trung Quốc – Phó Liên Giang nấm bào ngƣ còn có khả năng làm giảm lƣợng cholesterol trong máu [3]. Một trong những đặc điểm quan trọng của nấm là hệ enzym. Nhờ enzym cellulase và một số enzym khác, nấm bào ngƣ khả năng chuyển hoá cellulose thành nhƣng chất cơ bản góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trƣờng do chất thải nông nghiệp tạo ra nhƣ bã mía, rơm rạ. Ngoài ra, nấm còn có khả năng phân hủy thuốc trừ cỏ Antrazin nhờ vào sự gia tăng các enzym P – 450 của hệ Cytochromeoxxygenase và peroxydase (Sannia và ctv, 1990) [3] . Nấm bào ngƣ có đặc điểm chung là tai nấm dạng phễu lệch, phiến nấm mang bào tử kéo dài xuống chân. Cuống nấm gần gốc có lông mịn. Tai nấm còn non có màu sắc tối, nhƣng khi trƣởng thành trở nên sáng hơn. Quả thể nấm bào ngƣ phát triển qua nhiều giai đọan, dựa theo hình thái tai nấm mà tên gọi cho từng giai đoạn khác nhau. Dạng san hô: quả thể mới tạo thành dạng sợi mãnh hình chùm. Dạng dùi trống: mũ xuất hiện dƣới dạng khối tròn. Dạng phễu: mũ mở rộng trong khi cuống còn ở giữa Dạng bán cầu lệch: cuống lớn nhanh một bên so với vị trí trung bình. Dạng lục bình: cuống ngừng tăng trƣởng, nhƣng mũ vẫn phát triển. Nấm bào ngƣ có chu trình phát triển cũng nhƣ các loài nấm đảm khác, bắt đầu đảm bào tử hữu tính, nẩy mầm cho hệ sợi tơ dinh dƣỡng (sơ cấp và thứ cấp) và “kết thúc” bằng việc hình thành cơ quan sinh sản là tai nấm. Tai nấm sinh ra đảm bào tử và chu trình lại tiếp tục [3] . 2.2.2. Một số loài nấm bào ngƣ đƣợc nuôi trồng ở VIệt Nam. Hiện nay, nấm bào ngƣ đƣợc trồng rộng rãi ở Việt Nam cả miền Bắc lẫn miền Nam vì khí hậu nƣớc ta rất thuận lợi cho việc phát triển loài nấm này. Hiện nay, nấm bào ngƣ đƣợc trồng với nhiều chủng loại (khoảng 7 loại) tập trung nhiều ở Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh. Hầu hết các dòng nấm đƣợc nuôi trồng ở nƣớc ta là các giống đƣợc nhập từ nƣớc ngoài. Tuy nhiên vẫn có một số ít đƣợc khai thác ngay trên địa lý của Việt Nam sau đó đêm về nuôi trồng trên điều kiện nhân tạo. 10 Bảng 2.1. Nhiệt độ thích hợp đối với một số nấm bào ngƣ (Lê Duy Thắng, 1999) Loài nấm Nhiệt độ thích hợp cho tơ tăng trƣởng ( 0C) Nhiệt độ thích hợp cho ra nấm ( 0C) Pleurotus floridanus Pleurotus sajor - caju Pleurotus pulmonarius Pleurotus abalonus Pleurotus flabellatus 25-30 25-30 22-28 27-32 20-28 25 25 25 25 20-25 2.2.2.1. Nấm bào ngƣ Pleurotus floridanus (Hình 2.6) Đây là loài thích nghi với nhiệt độ khá rộng từ 8 - 30oC. Quả thể màu trắng sữa. Có tính kháng tạp nấm, tạp khuẩn cao. Sợi nấm có họat tính mạnh đối với việc phân giải cellulose. Sản lƣợng trên đơn vị nguyên liệu tƣơng đối cao. Nấm này có thể thích nghi với nhiều loại cơ chất khác nhau: bã mía, mùn cƣa, rơm, trấu. Khi trồng trên trấu, năng suất có thể đạt đƣợc đợt ra quả thể đầu tiên là 114g nấm tƣơi trên 360 g nguyên liệu khi có bổ sung ure, KH2PO4, cám gạo [4]. 2.2.2.2. Nấm bào ngƣ Pleurotus sajor - caju (nấm sò phƣợng vỹ hay nấm sò dạng phễu) Quả thể đƣợc hình thành ở nhiệt độ tƣơng đối cao so với các loài nấm khác. Gần đây, nấm này đang dần chiếm thị trƣờng vì quả thể chắc, ăn ngon và rất thích hợp đối với khí hậu Việt Nam. Ngoài ra, dịch chiết từ nấm này có thể ức chế một số loài vi khuẩn: S. aureus và B. subtilis, E. coli và Pseudomonas aeruginosa [5]. Ngoài các cơ chất thông thƣờng, gần đây nấm này còn đƣợc trồng trên cơ chất là cây mai dƣơng để chống sự xâm lấn của chúng góp phần giải quyết nạn môi trƣờng. Loài nấm này đƣợc nhập từ Nhật Bản và đƣợc nuôi trồng thành công trên mùn cƣa đầu tiên ở Thành phố Hồ Chí Minh. 11 2.2.2.3. Nấm bào ngư Pleurotus pulmonarius Phần lớn đƣợc nhập từ nƣớc ngoài (Hình 2.3). Nhƣng gần đây, GS. Lê Xuân Thám và cộng sự (1999) phát hiện đƣợc một loại khác ở Daklak - Tây Nguyên, sau đó đƣa về Đà Lạt và đã hoàn thiện quy trình trồng trên mùn cƣa [7] . 2.2.2.4. Nấm bào ngƣ Pleurotus abalonus Nấm này có nguồn gốc từ Đài Loan. Là một loài nấm ƣa nóng nên rất thuận lợi để phát triển nuôi trồng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam [1]. Nấm này có đặc điểm là quả thể rất to (Hình 2.4), đƣờng kính mũ nấm có thể đạt đến 35 cm [2]. Ngoài ra còn một loài khác cũng đang đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ Pleurotus eryngii, Pleurotus flabellatus. Và mới đây (2005) Thạc sĩ Cổ Đức Trọng đã trồng thành công 2 loài nấm bào ngƣ mới: Pleurotus citrinopileatus Singer Pleurotus (quả thể màu vàng) và Pleurotus djamor (quả thể có màu hồng)[7]. Hình 2.6. Pleurotus floridanus Hình 2.3. Pleurotus pulmonarius Hình 2.4. Pleurotus abalonus Hình 2.5 Pleurotus sp. 12 2.3. Phƣơng pháp sắc ký - Phân tích amino acid 2.3.1. Đặc điểm chung của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký đƣợc phát triển vào đầu tiên bởi Mikhail Semyonovich Tsvet (1901) trong quá trình nghiên cứu về chlorophyll. Đến năm 1952, Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách. Từ đó kỹ thuật sắc ký ngày vàng đƣợc phát triển cao hơn cho đến ngày nay [24]. Sắc ký là phƣơng pháp phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan). Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tính sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn với pha này. Nhờ vậy mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [10]. 2.3.2. Cơ sở của phƣơng pháp sắc ký Phƣơng pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đƣa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhƣng chính sự lặp đi lặp lại hiện tƣợng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký. Hầu hết các phƣơng pháp sắc lý đều đƣợc dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phƣơng pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh [8]. 2.3.3. Phân loại quá trình sắc ký Trong phƣơng pháp sắc ký pha động phải là các lƣu thể còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, ngƣời ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng. Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh mà ngƣời ta lại chia các phƣơng pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn. 13 Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tƣơng tác và sự hình thành sắc ký mà ngƣời ta phân biệt các loại sắc ký nhƣ bảng 2.2. Bảng 2.2. Các dạng sắc ký cơ bản [9] Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Cách bố trí pha tĩnh Cơ chế trao đổi chất Khí Khí- hấp phụ Khí -lỏng Lỏng Lỏng - rắn Lỏng - lỏng Lỏng - nhựa trao đổi Lớp mỏng Rây (sắc ký gel) Khí Khí Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Lỏng Rắn Lỏng Rắn Lỏng Rắn Rắn Lỏng Cột Cột Cột Cột Cột Lớp mỏng Cột Hấp phụ Phân bố Hấp phụ Phân bố Trao đổi ion Hấp phụ Theo kích thƣớc phân tử 2.4.. Một số phƣơng pháp sắc ký trong phân tích amino acid Phân tích amino acid là phƣơng pháp xác định thành phần amino acid cũng nhƣ định lƣợng chúng trong mẫu protein hay peptide. Phân tích amino acid có thể sử dụng sắc ký giấy (paper chromatography), sắc ký lớp mỏng (thin layer chomatography- TLC), sắc ký khí (gas chromatography), sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography), sắc ký lỏng cao áp (high performance liquid chromatography), điện di mao quản (capillary electrophoresis) [15]. 2.4.1. Sắc ký giấy (Paper chromatograhhy) - Quá trình phân tách đƣợc thực hiện trên giấy sắc ký hoặc giấy lọc (Hình 2.7). - Dùng viết chì, vẽ một đƣờng mảnh trên gốc của giấy (1,5 - 2 cm). đánh những dấu nhỏ dọc theo đƣờng vừa kẻ. - Dùng pipett hút lƣợng mẫu với thể tích nhất định cho vào những dấu vừa mới đánh. Để khô, tiếp tục cho vào mẫu thứ 2 trên đầu tube khác nhau. Làm khô. - Đặt chúng vào bồn sắc ký (cho dung môi ngập khoảng 1cm giấy sắc ký). - Để bồn ở nơi mát tránh ánh sáng trực tiếp, khoảng 1 giờ. 14 - Lấy ra, dùng viết chì kẻ đƣờng đánh dấu nơi mà dung môi di chuyển. Làm khô. - Phun ninhydrin vào toàn bộ mặt giấy. Để khô. Tính giá trị Rf. [24] - Đối với sắc ký giấy dùng cho phân tích amino acid, các nhà phân tích còn dùng sắc ký cuộn tròn và sắc ký giấy tròn. 2.4.2. Sắc ký lớp mỏng ( Thin layer chromatography _TLC) Trong phƣơng pháp này, pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ đƣợc gắn vào một giá mang thƣờng là bản thủy tinh và pha động đi qua lớp mỏng này bằng lực mao dẫn. Trong TLC một chiều, các thành phần trong mẫu đƣợc tách rời nhau bằng một lần chạy sắc ký với một dung môi nào đó, còn TLC hai chiều là một kỹ thuật sắc ký có khả năng tách mạnh bằng hai lần chạy sắc ký với hai chiều vuông góc nhau và với hai hệ dung môi khác nhau [7]. Quy trình phân tích amino acid trên TLC [23] - Lấy tấm TLC, dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh cách mép dƣới của tấm TLC khoảng 2 cm, đánh „dấu‟ trên đƣờng bút chì vừa đƣợc vẽ. Chú ý đánh dấu từng vết đều nhau và dán nhãn trƣớc để có thể không nhần lẫn khi phát hiện. - Nhỏ trên mỗi đánh dấu một giọt dung dịch amino acid mẫu, làm khô tấm TLC. - Thêm dung môi cho vào một beaker rộng điều chỉnh lƣợng dung môi để có thể phủ toàn bộ chiều ngang của tấm TLC ( chú ý phủ khoảng 1cm chiều cao của lớp mỏng). 15 - Cho tấm TLC vào beaker, mẫu đƣợc đặt phía dƣới. - Khi dung môi di chuyển đƣợc khoảng 85 % của tấm mỏng thì lấy tấm mỏng ra dùng viết chì vẽ một đƣờng mảnh ngang với đƣờng dung môi vừa di chuiyển đến. Để chúng khô hoàn toàn. - Cho bảng mỏng vào tủ hút, nhỏ ninhydrin vào để có thể thấy màu. Làm khô. .Khi đó amino acid sẽ xuất hiện màu trên bảng mỏng. Đánh dấu từng vết bằng bút chì ngay ở tâm. Tính giá trị Rf ( retardation factor). - Lƣu giá trị Rf để tính toán những amino acid chƣa biết. Ngoài ra, amino acid cò đƣợc phân tích trên sắc ký trao đổi ion thông qua phát hiện sau khi bị tách qua cột, sắc ký khí,, điện di mao quản, HPLC. Tuy nhiên, đối với phân tích amino acid, sắc ký lỏng cao áp (HPLC) thƣờng đƣợc sử dụng nhất bởi vì nó có nhiều ƣu điểm hơn nhƣ: thời gian ngắn. độ phân tách cao, dẫn xuất ổn định và có thể phát hiện thông qua UV (Ultraviolet). 2.4.3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC đƣợc ra đời vào đầu những năm1970 là một trong những công cụ phân tích đầu tay của các nhà phân tích. HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau. Những thành phần này đầu tiên đƣợc hòa tan vào trong dung môi và sau đó dƣới tác dụng của áp suất cao , chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký. Trong cột, hỗn hợp sẽ đƣợc phân tách thành những cấu tử của chúng. Sự tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh. Kết quả HPLC sẽ thu đƣợc nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện đƣợc và nó dễ dàng phân tách số lƣợng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau. 2.4.3.1. Pha tĩnh Tùy theo mẫu phân tích mà ta có có mô hình pha tĩnh khác nhau. Liquid - Solid Dựa trên độ phân cực. Những cấu tử nào có độ phân cực mạnh sẽ liên kết chặ với pha tĩnh hơn những chất có độ phân cực yếu hơn. Vì thế những chất ít phân cực sẽ bị lôi cuốn ra khỏi cột nhanh hơn. 16 Size - Exclusion Dựa trên kích thuớc phân tử của thành phần đƣợc phân tích. Pha tĩnh chứa các hạt xốp bên trong có nhiều lỗ nhỏ. Những thành phần có kích thƣớc lớn hơn hạt sẽ bị loại ra ngoài và đƣợc tách rửa đầu tiên. Những cấu tử có kích thƣớc phù hợp sẽ bị hấp thu và lỗ và đƣợc tách rửa sau. Normal phase (pha bình thƣờng) Pha tĩnh phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động . Reverse Phase (ngƣợc pha) pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn. Ion-Exchange đƣợc tiến hành dựa trên sự thay thế những ion trong mẫu với những ion trái dấu trong pha tĩnh. Khi đó pha tĩnh sẽ giữ lại mẫu và pha động di chuyển qua cột sẽ thế chỗ cho ion mẫu và đẩy mẫu ra khỏi cột. 2.4.3.2. Pha động Tùy thuộc vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi. Đối với pha bình thƣờng, thì dung môi thƣờng là không phân cực còn đối với mô hình ngƣợc pha thì thì thƣờng sử dụng có sự pha trộn giữa nƣớc và một vài dung môi hữu cơ phân cực nhƣ acetonitrile. Đối với mô hình size - exclusion, yêu cầu đối với pha động là ngăn cản mẫu gắn kết trên bề mặt của pha tĩnh. 17 2.4.3.3. Bộ dụng cụ HPLC Bơm: Bơm trong HPLC đuợc xem là một trong những thành phần rất quan trọng trong hệ thống sắc ký lỏng. Bởi vì hệ thống sắc ký lỏng đòi hỏi phải có tỉ lệ dòng ổn định liên tục gắn liền với injector, cột và detector. Có hai loại bơm cơ bản - Bơm áp suất liên tục. - Bơm dòng liên tục. Cột: Hiện nay có rất nhiều loại cột đang đƣợc sử dụng. Tuy nhiên tùy thuộc vào loại mẫu, tính chất của mẫu mà ta có loại cột và kích thƣớc cột khác nhau. Đối với sắc ký ngƣợc pha thì cột C-18 và Pico-Tag column, 3.9 mm x 15 cm thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Detector: Một số detector thƣờng đƣợc sử dụng: - Detector Ultraviolet/visible: thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các chất hữu cơ. - Detector chuỗi diode. - Detector huỳnh quang. Và một số detector khác nhƣ detector điện hóa học,detector dẫn điện… Hệ thống dữ liệu. Để chuyển dữ liệu phân tích, detector thƣờng đƣợc nối trực tiếp với một máy vi tính. Khi đó dữ liệu đƣợc chuyển thành những peak trên sắc ký đồ và đƣợc tính toán. 2.5. Các bƣớc phân tích amino acid Phân tích amino acid đƣợc thực hiện thông qua các bƣớc sau đây [17]. - Chuẩn bị mẫu - Thủy phân protein thành những amino acid đơn. - Tạo dẫn xuất. - Phân tách amino acid trên hệ thống sắc ký - Phân tích dữ liệu và tính toán. Trƣớc khi tiến hành phân tích amino acid, quá trình chuẩn bị mẫu cũng đóng vai trò rất quan trọng vì nếu không chuẩn bị kỹ sẽ rất dễ bị nhiễm trong quá trình phân tích. - Mẫu đƣợc đặt trong một tube sạch. - Tất cả mẫu đƣợc làm khô trƣớc khi phân tích. Trong quá trình tiến hành phải đeo găng tay , tuy nhiên tránh các bụi trên găng tay bám vào mẫu. 18 2.5.1. Quá trình thủy phân (Hydrolysis) Để phân tích amino acid trong mẫu protein, mẫu phải đƣợc thủy phân tạo thành những amino acid đơn. Thủy phân bằng acid là phƣơng pháp thông thƣờng nhất để thủy phân protein trƣớc khi tiến hành pnân tích amino acid. Phƣơng pháp thủy phân bằng acid có thể tạo ra sự phân cắt khác nhau đối với một vài amino acid- phá hủy hoàn toàn hoặc một phần. Một số khó khăn khi thủy phân bằng acid. - Trytophan bị phá hủy hoàn toàn - Serine và threonine bị phá hủy một phần - Methionine có thể bị oxy hóa - Cysteine thƣờng đƣợc phát hiện nhƣ là cystine (nhƣng cystine thƣờng đƣợc phát hiện rất kém bởi vì chúng bị phân hủy một phần). - Asparagine và glutamine tƣơng ứng bị chuyển thành acid aspartic và acid glutamic. Nhƣ vậy, nếu kỹ thuật thủy phân không tốt có thể gây ra nhiều kết quả không chính xác. Một số phƣơng pháp thủy phân thƣờng đƣợc sử dụng trong HPLC. Phƣơng pháp 1: Dùng HCl 6N và phenol (từ 0.1- 1 %) Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất là dùng HCl có chứa phenol. Thêm phenol vào để ngăn cản phản ứng halogen hóa tyrosine.Dung dịch thủy phân: HCl 6N chứa từ 0,1 đến 1 % phenol. Phƣơng pháp tiến hành: - Cho mẫu vào tube thủy phân và làm khô (mẫu đƣợc làm khô để nƣớc không pha loãng acid). Hình 2.10. Thủy phân protein bằng HCl [17] 19 - Thêm dung dịch thủy phân vào mẫu với tỷ lệ nhất định. - Làm lạnh tube chứa mẫu. - Mẫu thƣờng đƣợc thủy phân ở 110oC, trong 24h trong chân không hoặc trong khí trơ để ngăn cản quá trình oxy hóa. Thời gian thủy phân có thể thay đổi tùy theo mục đích phân tích. - Sau khi thủy phân làm khô mẫu trong chân không để loại bỏ acid thừa. Phƣơng pháp 2: Dùng Mercaptoathanesulfonic (MESA) 2.5M. - Mẫu đƣợc làm khô trong một tube trƣớc khi thủy phân. - Tube chứa mẫu này cho vào một tube lớn hơn đã chứa dung dịch thủy phân. - Tube thủy phân này đƣợc tiến hành trong chân không để làm bay hơi dung dịch thủy phân. Tube thủy phân đƣợc gia nhiệt từ 170oC đến 185oC khoảng 12 phút. - Sau khi thủy phân tube đƣợc làm khô trong chân không để loại bỏ acid dung dịch thừa [17]. 2.5.2. Quá trình tạo dẫn xuất (Derivatisation) [17] Những amino acid sẽ không đƣợc phát hiện nếu chúng không đƣợc tạo dẫn xuất. Hiện nay có rất nhiều phƣơng pháp tạo dẫn xuất, sự chọn lựa bất kỳ một kỹ thuật nào phụ thuộc vào độ nhạy, thời gian phân tích và độ chính xác của phƣơng pháp. Nói chung một nữa trong số kỹ thuật phân tách amino acid là kỹ thuật sắc ký trao đổi ion kèm theo postcolumn (ninhydrin hay o – phthaladehyde). Kỹ thuật phát hiện bằng postcolumn chỉ yêu cầu với lƣợng mẫu nhỏ (khoảng 5-10 µg protein trong một lần phân tích). Kỹ thuật phân tích amino acid liên quan đến tạo dẫn xuất precolumn cũng đƣợc ứng dụng rất rộng rãi và yêu cầu là HPLC ngƣợc pha. Kỹ thuật này rất nhạy nên đòi hỏi lƣợng mẫu phân tích rất nhỏ chỉ khoảng 0.5-1 µg. Phƣơng pháp phát hiện bằng ninhydrin postcolumn Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion với ninhydrin postcolumn là một trong những phƣơng pháp đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong kỹ thuật định lƣợng amino acid. Sau khi amino acid đƣợc phân tách trên sắc ký sẽ đƣợc phát hiện thông qua phản ứng của chúng với ninhydrin sẽ tạo màu vàng hay màu tím. Những amino acid thƣờng cho màu tím sẽ đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng hấp thụ là 570 nm. Những amino acid cho màu nhƣ là proline thƣờng đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 440 nm. Ngoài 20 ninhydrin, o – phthalaldehyde (OPA) cũng đƣợc sử dụng trong phân tích postcolumn. Bƣớc sóng phát hiện của phƣơng pháp này thƣờng vào khoảng 348 - 450 nm. Đối với phƣơng pháp precolumn thì tác nhân tạo dẫn xuất thƣờng đƣợc sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC). PITC phản ứng với amino acid ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-10 phút (Pierce Chemical company, 1999) tạo thành phenylisocarbamyl (PTC) và có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 254 nm. Vì thế tạo dẫn xuất amin acid với PITC thông qua sắc ký ngƣợc pha (reversed-phase HPLC) có thể đƣợc sử dụng để phân tích định lƣợng amino acid với detector UV. Với phƣơng pháp này, giới hạn phát hiện cho phần lớn những amino acid là khoảng 1pmol. Độ tuyến tính tƣơng ứng (response linearity) thu đƣợc từ 20 đến 500 pmol. Để thu đƣợc kết quả tốt, lƣợng mẫu lớn hơn 500 ng trƣớc khi thủy phân là tốt nhất. Ngoài sử dụng các thành phần phản ứng nêu trên, các hợp chất sau đây cũng đƣợc sử dụng để phát hiện amino acid trong các mẫu sinh hóa. o - phthaladehyde (OPA).(dẫn xuất sau khi qua cột) Hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) (dẫn xuất tiền cột) Dimethylaminoazobenzenesulfonyl chloride (DABS-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 9-Fluornylmethyl choloformate (FMOC-Cl) (dẫn xuất tiền cột) 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole (NBD-F) (dẫn xuất tiền cột) 2.5.3. Phân tách trên HPLC [17] Đầu tiên, chuẩn amino acid đƣợc phân tách trƣớc với các nồng độ khác nhau để làm dữ liệu cho công việc tính toán sau này. Mẫu thƣờng đƣợc bơm với thể tích nhất định. Hình 2.11. Tạo dẫn xuất amino acid bằng PITC [10]. 21 Tùy theo phƣơng pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha động, pha tĩnh, cột cũng nhƣ điều chỉnh bƣớc sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi đó thời gian phát hiện cũng khác nhau. Nếu là PTC-aa thƣờng đƣợc phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký ngƣợc pha; pha động thƣờng là acetonitrile; bƣớc sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các aa thƣờng đƣợc phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian thêm để tạo cho đƣờng nền trở lại. 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10] 2.5.4.1. Định tính Để phát hiện đƣợc các amino acid, phƣơng pháp thông thƣờng là dựa vào thời gian lƣu của chuẩn đã đƣợc thực hiện chạy sắc ký trƣớc. sau đó, thời gian lƣu của mẫu đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng diện tích peak để định lƣợng. 2.5.4.2. Định lƣợng Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng phần trăm về số mol (mol%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn nhƣ nếu protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể cả Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu đƣợc sẽ tạo nên một profile riêng biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể. 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đã đƣợc tiến hành phân tích từ rất lâu, nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời. .Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15]. 22 L: lycine IL:Isoleucine Ph Al: Phenylalanine Glu: Glutamic acid Thr: Threonine Ser: Serine Gly: Glycine Asp: Aspartic acid Arg: Agrinine, Pep: Peptide Lys:Lysine, His: Histidine Cys: Cysteine Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bằng sắc ký giấy tròn (Zakia Bano, 1962) 23 PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian, địa điểm thực hiện và vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện Khóa luận đƣợc thực hiện từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phòng Hóa Lý, Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.3. Vật liệu nghiên cứu Giống nấm Pleurotus floridanus Pleurotus sajor – caju Pleurtus abalonus Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Nguồn cung cấp Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) 3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 3.2.1. Hóa chất HCl 6N Phenol PITC (phenylisothiocyanate). Methanol Ethanol Nƣớc khử ion TEA (Triethylamine) Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid ACN (Acetonitril). Glucose Saccharose KH2PO4 MgSO4 Sodium acetate HNO3 đậm đặc EDTA 24 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Tủ mát Nồi hấp khử trùng Máy HPLC Thiết bị thổi khí trơ Cột Pico-Tag Dụng cụ Ống nghiệm Đĩa petri Φ 9 cm Bình tam giác Bình quả lê Pipett 0.1-10 µl Pipett 10-100 µl Filter Φ 0.20 µm 3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm 3.3.1. Môi trƣờng Môi trƣờng thạch (PGA) Khoai tây Glucose Agar Môi trƣờng hạt Cám gạo CaCO3 Lúa Môi trƣờng giá môi Khoai mì Cám gạo KH2PO4 MgSO4 CaCO3 Môi trƣờng giá thể Mùn cƣa Cám gạo KH2PO4 MgSO4 25 3.3.2. Phƣơng pháp 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA - Khoai tây bóc vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc. - Thêm 20 g agar, cho thêm nƣớc cất để đủ 1 lít, đun tan agar. - Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút bông. - Hấp khử trùng ở 121oC, 1.2 atm, trong 20 phút. - Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền. - 5 dòng nấm bào ngƣ sau khi đem về phòng thí nghiệm, đƣợc tiến hành cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng PGA.. 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt - Lúa đƣợc đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO3 (2%) , cám gạo (10%). - Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng ở 121oC, 1,2 atm, trong 90 phút. - Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng sẽ đƣợc cấy sang môi trƣờng hạt. đem để trong bóng tối. Tùy theo mỗi loài mà thời gian phát triển đầy bình sẽ khác nhau. Trong quá trình đó, chuẩn bị môi trƣờng giá môi. 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi - Cọng mì đƣợc cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thƣớc của túi ny lông, ngâm khoảng 24 giờ, trộn với một số hóa chất khác nhƣ KH2PO4, MgSO4 với tỉ lệ nhất định ( 2% đối với MgSO4 và 1 % đối với KH2PO4). - Hấp khử trùng ở 121oC , 1,2 atm trong 90 phút. - Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy sang môi trƣờng giá môi. 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng - Mùn cƣa đƣợc sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thƣớc lớn. - Ngâm trong nƣớc vôi 5% trong 24 giờ - Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh. - Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121oC để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp nhƣ lần thứ nhất. 26 - Cấy giống từ môi trƣờng giá môi sang. - Ủ trong tối, khi nào thấy tơ phát triển đầy trắng , phủ kín bịt phôi, có những giọt nƣớc li ti trên thành túi thì tiến hành cắt túi bằng dụng cụ đã khử trùng. - Đem ra nhà nuôi trồng, tƣới và đón nấm - Nấm sau khi hái, đƣợc cân tính trọng lƣợng tƣơi, sau đó đem sấy khô, bảo quản trong tủ lạnh, để chuẩn bị cho phân tích amino acid. - Tiếp tục tƣới và đón nấm. - Sau khi hái nấm lần hai, nấm lƣợng nấm cũng đƣợc đem cân trọng lƣợng tƣơi, cơ chất đem sấy khô, tính trọng lƣợng của chúng. - Tính năng suất sản phẩm. - Tất cả nấm hái đƣợc đem đo đƣờng kính để tính trung bình. 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình [1, 2] Tƣới đón nấm Thu quả thể Môi trƣờng hạt - Lúa nấu (88 %) - CaCO3 (2%) - Cám gạo (10%) Môi trƣờng giá môi - Cọng mì (87 %) - MgSO4 ( 2%) - KH2PO4 (1 %) - Cám gạo (10 %) - Mùn cƣa (84 %) - Cám gạo (10 %) - Bột bắp (5,5 %) - KH2PO4 (0,5 %) Giá thể trồng Giống nấm - Khoai tây 200 g / lít - Glucose 20 g / lít - Agar 20 g / lít Cấy sang môi trƣờng giá môi ủ trong tối 27 3.3.3. Phân tích amino acid Mẫu nấm sau khi thu hoạch đƣợc đem phân tích thành phần amino acid. Chúng tôi tiến hành phân tích 2 trên 4 mẫu: Pleurotus pulmonarius, Pleurotus flabellatus. Quá trình phân tích thành phần amino acid trong 2 loại nấm trên đƣợc thực hiện theo quy trình Thomas T. Andersen và cộng sự. 3.3.3.1.Thủy phân mẫu - Cho 2 g mẫu đã đƣợc cắt nhỏ vào tube chịu nhiệt và làm khô. - Thêm vào 10 ml dung dịch HCl 6N. - Loại bỏ không khí bằng cách thổi khí trơ vào khoảng không của tube đựng dung dịch mẫu. - Thủy phân ở 152oC trong 1h. - Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc. - Cho vào lọ, dán nhãn và để trong tủ mát. Với nhiệt độ cao và trong điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), các protein sê đƣợc phân cắt thành những amino acid đơn (Hình 2.10). 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn. - Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng 2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào. - Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1 khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng). 28 - Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng pháp thổi khô với khí trơ. Nếu PITC không đƣợc loại thải tốt thì nó sẽ làm hƣ cũng nhƣ phá hủy cột HPLC. - Mẫu đƣợc pha loãng trong 2 ml dung dịch pha loãng trong mẫu và đƣợc lọc qua bộ phận lọc đƣờng kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC. 3.3.3.3. Phân tích HPLC Quá trình thực hiện phân tách trên HPLC đƣợc thực hiện với: Buffer A: sodium acetate và TEA, pH 6,8. Buffer B: 60% acetonitile, nƣớc 40% (v/v). Cột: Pico- Tag, 3.9 mm x 15 cm. Detector: Ultra-violet (UV). Tốc độ dòng: 1 ml / phút. Bƣớc sóng: 254 nm. Quá trình thực hiện: - Hút 20 µl dung dịch chuẩn 17 amino acid, bơm và theo dõi. - Lƣu lại các thông số cần thiết để tiến hành định tính cũng nhƣ định lƣợng (thời gian lƣu, diện tích peak,…) - Hút 20 µl mẫu, tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với chuẩn. 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả Sau khi bơm chuẩn, ta sẽ có những dữ liệu thu từ máy tính nhƣ là thời gian phát hiện peak, diện tích của từng peak thể hiện trên sắc ký đồ. Các thông số này đƣợc lƣu lại để tính hay để định lƣợng cho mẫu phân tích. Có rất nhiều cách để định lƣợng amino acid đơn: Dùng chuẩn với các nồng độ khác nhau, sau đó lập phƣơng trình hồi quy giữa diện tích peak và nồng độ với hệ số tƣơng quan xác định. Từ diện tích peak của mẫu đã biết qua quá trình chạy ta có thể tính nồng độ tƣơng ứng cho từng amino acid. Đây là phƣơng pháp chính xác nhất để tính nồng độ các amino acid. 29 Chỉ bơm chuẩn 1 lần, ghi lại các diện tích peak thu đƣợc trên sắc ký đồ sau khi phân tích kết thúc. Sau đó lặp tỷ lệ giữa diện tích peak và nồng độ của chuẩn và mẫu, từ đó tính đƣợc nồng độ từng amino acid trong mẫu. 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả trồng nấm 4.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng Sau khi chúng tôi thực hiện nuôi trồng theo quy trình ở mục 3.2.2.5, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả trình bày ở bảng 4.1. Nhận xét: Tất cả các loài nấm đều đƣợc thực hiện đều đƣợc tiến hành trên các thiết bị giống nhau tƣơng ứng với từng môi trƣờng (môi trƣờng lúa trong bình tam giác, môi trƣờng cọng mì trên túi ny lông) khi chuyển sang môi trƣờng nuôi trồng, chúng tôi thực hiện Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus trên túi ny lông, đồng thời với hai loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius chúng tôi thực hiện trên những lọ bằng thủy tinh. Vì thế, chúng tôi chỉ so sánh trên hai môi trƣờng đầu với 4 dòng nấm còn môi trƣờng nuôi trồng chúng tôi phân ra từng cặp để so sánh. Với kết quả thu đƣợc (Bảng 4.1), chúng tôi nhận thấy rằng: Thời gian tăng trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus abalonus là chậm nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius có thời gian tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau. Cả 3 dòng nấm Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius đều có hệ sợi tơ trắng nhƣng Pleurotus floridanus thì trắng hơn và hệ sợi không thƣa nhƣ hai dòng còn lại (Hình 4.1) Khi cấy sang môi truờng giá môi, thì kết quả cũng giống nhƣ trên môi trƣờng hạt, thời gian sinh trƣởng của Pleurotus abalonus vẫn là chậm nhất. Và trên môi trƣờng này, thì nấm này vẫn khác so với các nấm còn lại là trên đầu mỗi sợi nấm có màu đen, trong đó chứa các bào tử.( Hình 4.2 và Hình 4.3). Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy của các dòng nấm Dòng nấm Môi trƣờng lúa Môi trƣờng giá môi Môi trƣờng nuôi trồng Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Pleurotus floridanus Pleurotus abalonus 15 ngày 15 ngày 18 ngày 30 ngày 17 ngày 18 ngày 20 ngày 40 ngày 25 ngày 27 ngày 30 ngày 40 ngày 31 4.1.2. Sự hình thành quả thể Năng suất sản phẩm = Trọng lƣợng nấm tƣơi / Trọng lƣợng cơ chất khô Về hình thái Sau khi đem ra nhà trồng, tuới đón nấm, chúng tôi đã thu đƣợc hình thái của 4 dòng nấm nhƣ sau - Pleurotus floridanus (Hình 4.1) quả thể màu trắng, hơi phủ lông mịn ở gốc. các quả thể mọc thành từng chùm. Khi đem quan sát duới kính hiển vi có thể thấy đƣợc bào tử đảm (Hình 4.4) - Pleurotus abalonus (Hình 4.2) quả thể có màu trắng đục, rất dày, chắc, trên bề mặt có những vảy nhỏ. Cuống nấm cũng rất to. Đem quan sát dƣới kính hiển vi quang học, chúng tôi cũng thấy đƣợc bào tử đảm tuơng đối lớn hơn so với Pleurotus floridanus (Hình 4.5) - Pleurotus pulmonarius (Hình 4.3) Phiến nấm mỏng, có màu trắng hơi ngả xám, hơi xẻ thùy ở mặt ngoài của phiến - Pleurotus flabellatus (Hình 4.4) phiến nấm có màu xám đậm, cánh mỏng, rất giống với Pleurotus pulmonarius. Nhƣ vậy , về hình thái 4 dòng nấn này hoàn toàn khác nhau. Pleurotus abalonus có quả thể to và dày nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; hai loài còn lại về mặt hình thái tƣơng đối giống nhau, chỉ khác nhầumu sắc trên mặt phiến nấm. Về năng suất sản phẩm: năng suất sản phẩm đƣợc tính bằng trọng lƣợng nấm tƣơi/trọng ƣợng cơ chất khô. Theo bảng 4.2 thì năng suất của Pleurotus floridanus cao nhất. Các dòng còn lại năng suất cũng tƣơng đối cao. Bảng 4.2. Đặc tính quả thể của các loài nấm Loài nấm Đƣờng kính trung bình quả thể Năng suất sản phẩm (%) Pleurotus floridanus Pleurotus abalonus Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus. 8 cm 13 cm 11 cm 10 cm 70 62 60 56 32 Bào tử đơn Hình 4.1. Sinh trƣởng tơ nấm trên môi trƣờng lúa của Pleurotus floridanus, Pleurotus flabellatus, Pleurotus flabellatus Hình 4.3. Bào tử Pleurotus abalonus quan sát trên hệ sợi tơ (bào tử đơn) Hình 4.2. Pleurotus abalonus trên môi trƣờng thân cây mì bổ sung MgSO4 ( 2%), KH2PO4 (1 %), Cám gạo (10 %) Thân cây mì Bào tử đảm Hình 4.4. Bào tử đảm quan sát trên quả thể của nấm Pleurotus floridanus Bào tử đảm Hình 4 .5. Bào tử đảm quan sát trên quả thể nấm Pleurotus abalonus 33 4.2. Kết quả phân tích amino acid Sau khi tiến hành phân tích, trên 2 dòng nấm Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus trên HPLC, chúng tôi đã thu đƣợc thành phần của từng amino acid đƣợc liệt kê trong bảng 4.3. Hình 4.6. Quả thể nấm Pleurotus floridanus trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) KH2PO4 (0,5 %) Quả thể Hình 4.7. Quả thể nấm Pleurotus abalonus trên túi ny lông chứa mùn cƣa có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) KH2PO4 (0,5%) ) Quả thể Hình 4.8 Quả thể nấm Pleurotus flabellatus trên bình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) KH2PO4 (0,5%) Quả thể Hình 4.9 Quả thể nấm Pleurotus pulmonarius trên bình thủy tinh chứa mùn cƣa có bổ sung: Cám gạo (10 %) Bột bắp (5,5 %) KH2PO4 (0,5%) Quả thể 34 Hình 4.9. Sắc ký đồ chuẩn amin acid ASP: Aspartic acid; GLU Glutamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine Hình 4.10. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus flabellatus ASP: Aspartic acid; GLU Glucine; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine 35 Theo bảng này, thì cả trong 2 dòng đều chứa đầy đủ 17 amino acid. Trong nấm Pleurotus pulmonaius hàm lƣợng Leu chiếm với tỷ lệ cao nhất, trong khi đó thì các amino acid nhƣ Val, Asp, Cys, Met, Ileu, Lys, Glu chiếm với tỷ lệ rất thấp, đặc biệt là Glu chiếm tỷ trọng thấp nhất trong 17 amino acid đƣợc phát hiện. Với nấm Pleurotus flabellatus cũng tƣơng tự nhƣ Pleurotus pulmonaius , Leu chiếm tỷ lệ cao nhất trong 17 amino acid; Val chiếm tỷ lệ thấp nhất. Trong 17 amino acid này, chứa đến 7 trong 8 amino acid thiết yếu (đƣợc in nghiêng trong bản) đối với ngƣời, ngoại trừ Tryp chƣa đƣợc xác định. Những amino acid này cơ thể con ngƣời không thể tổng hợp đƣợc mà phải đƣợc cung cấp từ bên ngoài. Các amino acid thiết yếu này chiếm đến 42 % trong tổng số amino acid đối với Pleurotus pulmonaius và 44 % trong tổng số amino acid của nấm Pleurotus flabellatus. Tỷ lệ này cao hơn so với nấm rơm (38,2 %) và nấm mỡ (38,4 %) [Nguyễn Lân Dũng, 2002]. Khi đƣợc so sánh với thành phần amino acid với thực vật nhƣ bắp, đậu nành thì thành phần amino acid của nấm bào ngƣ vẫn cao hơn. Hình 4.11. Sắc ký đồ của mẫu nấm Pleurotus pulmonarius ASP: Aspartic acid; GLU Gluatamate; SER: Serine; GLY: Glycine ; HIS: Histidine ARG: Arginine; THR: Threonine; ALA :Alanine; PRO: Proline; TYR: Tyrosine ; VAL: Valine ; MET: Methionine; CYS: Cysteine; ILEU: Isoleucine; LEU: Leucine; PHE : Phenylalanine; LYS: lysine 36 Bảng 4. 3. Thành phần amino acid trên Pleurotus pulmonaius, Pleurotus flabellatus Nhƣ vậy, nấm bào ngƣ có thể đƣợc xem nhƣ là một thực phẩm giàu dinh dƣỡng chứa gần nhƣ đầy đủ các amino acid thiết yếu. Thành phần amin acid của nó cao hơn hầu hết các loại rau quả. Khi so sánh giữa 2 loài nấm, thành phần amino acid (aa) giữa chúng tƣơng đƣơng nhau (đều chứa 17aa). Nhƣng khi xét riêng từng amino acid, thì giữa chúng có sự khác biệt. Glu của nấm Pleurotus flabellatus cao gấp 8 lần so với Glu (chỉ phát hiện ở dạng vết: 0,25 mg) của Pleurotus pulmonaius, và Ileu cũng cao hơn gấp 10 lần. Tất cả các aa còn lại có sự khác biệt không lớn lắm. Số thứ tự Amino acid Pleurotus pulmonarius (mg/g) Pleurotus flabellatus (mg/g) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Leucine Glycine Serine Arginine Alanine Proline Histidine Tyrosine Threonine Phenylalanine Valine Asparagine Cysteine Methionine Isoleucine Lysine Glutamate 21, 15 8, 92 7, 74 6, 49 5, 93 4, 50 4, 42 3, 75 3, 67 2, 21 1, 88 1, 88 1, 79 1, 77 1, 31 1, 15 0, 25 17, 15 11, 39 7, 85 5, 26 4, 95 3, 08 5, 48 6, 78 2, 68 0, 97 0, 91 1, 63 2, 59 4, 49 13, 19 0, 89 2, 04 37 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận. Đã trồng đƣợc 4 loại nấm bào ngƣ. Trong đó, có hai loài chƣa đƣợc trồng ở Thành Phố Hồ Chí Minh: Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus. Với năng suất sản phẩm đạt đƣợc khoảng 55- 70%, trong điều kiện nhiệt độ 28 2 0C, ẩm độ 70%. Bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC, chúng tôi đã phát hiện và định lƣợng đƣợc thành phần amino acid trên 2 loài nấm Pleurotus pulmonarius và Pleurotus flabellatus. Hai loài này chứa đầy đủ 17 amino acid, trong đó leucine chiếm tỷ lệ cao nhất 21,15% đối với Pleurotus pulmonarius và 17,15% đối với Pleurotus flabellatus. Trong nấm Pleurotus pulmonarius thì Glutamate chiếm tỷ lệ thấp nhất, nhƣng đối với nấm Pleurotus flabellatus (0,25%), Valine chiếm tỷ lệ thấp nhất (0,91%). 5.2. Đề nghị Sau khi phân tích amino acid, nên tiến hành trồng trên các loại cơ chất khác nhau sau đó phân tích tiếp amino acid để xem sự khác biệt do ảnh hƣởng của cơ chất . 38 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 200 trang. 2. Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 2. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 244 trang. 3. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật trồng nấm, tập 1. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 4. Nguyễn Lê Chung Sơn, 2004, Sử dụng sinh khối cấy mai dương làm nguyên liệu trồng nấm bào ngư (Pleurotus sajor- caju ) góp phần kiểm soát sự xâm lấn của loài thực vật ngoại lai. Khóa luận tốt nghiệp cử nhân công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 5. Huỳnh Hữu Tín, 2004, nghiên cứu sử dụng trấu làm nguyên liệu trồng nấm bào ngư (Pleurotus florida). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Hoàng Trâm Anh, Đinh Hoàng Anh Khoa, Lê Thúy Anh, Lê Duy Thắng, 2003. Nghiên cứ kháng khuẩn của nấm bào ngư (Pleurotus sajor- caju). Tạp chí y dƣợc học. tr 201-204. 7. Lâm Thị Nhạn, 2001. Cải tiến kỹ thuật định lượng aflatoxin trong thực phẩm. Luận án thạc sĩ khoa học chuyên ngành hóa phân tích, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. tr 16-19 8. Nam Phƣơng, 2005. Trồng thành công hai loài nấm bào ngư mới tại Việt Nam. Báo khoa học phổ thông số 25: tr 14. Tòa soạn báo khoa học phổ thông, Thành phố Hồ Chí Minh. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Archer J.P. Martin 1952. The development of partition chromatography. Nobel lecture, December 10. Alexander Efimov, 2005. HPLC introduction. 11. Hans Neurath. The Protein - Composition, Structure, Function. 2nd edition. Volume 1. Academic Press, New York and London p. 2-39. 12. Royer Y. Stainer, Michael Doudoroff, and Edward A. Adelberg. The Microbial World. Prentice-Hall, Inc. p.88-90. 39 13. Thomas D. Brock. Biology of microorganism. Pretice-Hall, Inc. p.684-681. 14. Arthur T. Henrici, M.D. A handbook for students of Bacteriology. Molds, Yeast, And Actinomycetes. John Wiley & Sons, Inc, New York. p.7-9. 15. Zakia Bano, K.S. Srinivasan, and H.C. Srivastava, 1963. Amino acid composition of the Protein from a Mushroom (Pleurotus sp.). Appl. Microbiol. 11. p.184-187 16. Bernard Wathelet, 1999. Nutritional analyses for proteins and amino acids in beans (Phaseolus sp.). Biotechnol. Agron. Soc. Environ, p 197–200 17. <www.nihs.go.jp/dbcb/amino.pdf 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 40 PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ THU HOẠCH CÁC NẤM BÀO NGƢ Nấm Pleurotus flabellatus Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 75 85 83 75 85 79 Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 44 45 50 43,5 42 45,6 Nấm Pleurotus floridanus Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 341 370 360 380 350 Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 250,3 260 255 254 240 Nấm pleurotus pulmonarius Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 80 82 80 79 75 Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 43,7 49,2 50,4 42,5 51,8 Nấm Pleurotus abalonus Trọng lƣợng cơ chất khô (g) 350 364 352 380 370 Trọng lƣợng nấm tƣơi (g) 220,9 230,5 223,4 230 222 PHỤ LỤC 2 41 Bảng. Thành phần amino acid trên một số thực phẩm, nấm I: Nấm rơm (volvariella volvacea) II: Nấm mỡ (Agaricus bisropus) III: Bắp (maize) IV: Nấm bào ngƣ Pleurotus pulmonarius V: Nấm bào ngƣ Pleurotus flabellatus KPH: Không phát hiện - Số thứ tự Amino acid I II III IV V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Leucine Glycine Serine Arginine Alanine Proline Histidine Tyrosine Threonine Phenylalanine Valine Asparagine Cysteine Methionine Isoleucine Lysine Glutamate 5,5 4,5 4,3 5.3 6,3 5,5 4,1 KPH 4,7 4,1 6,5 5,3 Vết 1,6 4,2 9,8 17,6 7,2 5,1 3,2 5,5 9,6 6,1 2,2 2,2 4,2 4,4 5,3 10,7 Vết Vết 4,3 10,0 17,2 0,98 0,46 0,40 0,52 0,69 0,97 0,49 0,45 0,34 0,39 0,43 0,78 0,18 0,18 0,30 0,45 0,79 21,15 8,92 7,74 6,49 5,93 4,50 4,42 3,75 3,67 2,21 1,88 1,88 1,79 1,77 1,31 1,15 0,25 17,15 11,39 7,85 5,26 4,95 3,08 5,48 6,78 2,68 0,97 0,91 1,63 2,59 4,49 13,19 0,89 2,04

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfKHOA LUAN HOAN CHINH.pdf
Luận văn liên quan