Đề tài Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được

MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 1.1. Giới thiệu về cây lạc. 7 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, và phân bố. 7 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc. 9 1.1.4. Một số phương pháp chọn tạo giống cây lạc. 11 1.2. Giới thiệu về cây vừng. 13 1.2.1. Nguồn gốc, Phân loại và phân bố. 13 1.2.2. Tình hình sản xuất vừng. 14 1.3. ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân tích đa hình kiểu gen. 15 1.3.1. Phương pháp phân tích RAPD (Random Aplified Polymorphic DNA). 16 1.3.2. Phương pháp phân tích SSR (Simple Sequence Repeats). 22 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu. 25 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 25 2.1.2. Thiết bị và hóa chất 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 25 2.2.1. Tách chiết ADN từ lá. 25 2.2.2. Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN 27 2.2.4. Phương pháp PCR-SSR 30 2.2.5. Phân tích số liệu. 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Kết quả Tách ADN tổng số. 33 3.1.1. Cải tiến quy trình tách ADN tổng số. 33 3.1.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số. 35 3.2. Đánh giá tính đa hình ADN tập đoàn giống lạc/vừng. 36 3.2.1. Phân tích tính đa hình ADN lạc bằng phương pháp SSR 36 3.2.2. Phân tích tính đa hình ADN vừng bằng phương pháp RAPD 44 3.3. Xác định mức độ sai khác của các dòng lạc/vừng đột biến bằng phương pháp phân tử 53 3.3.1. Xác định mức sai khác của các dòng lạc đột biến bằng phương pháp SSR 53 3.3.2. Xác định mức sai khác của các dòng vừng đột biến bằng phương pháp RAPD 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 1. Kết luận. 71 2. Đề nghị. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 72 Tài liệu tiếng Việt:. 72 Tài liệu tiếng Anh. 73 MỞ ĐẦU Lạc, vừng là những cây lấy dầu quan trọng ở Việt Nam. Trong đó cây lạc được Bộ công nghiệp đề ra mục tiêu quy hoạch phát triển quy mô rộng từ năm 2001 đến 2010. Riêng cây vừng mặc dù có hàm lượng dầu rất cao chiếm hơn 50%, nhưng do năng suất thấp, hay bị rủi ro nên hiện chưa được đầu tư thích đáng [15]. Trong những năn gần đây, hạn hán ngày càng trở nên khắc nghiệt. Vì vậy, trồng nhóm cây đậu đỗ sẽ kinh tế hơn so với trồng lúa nước. Đặc biệt đối với những vùng đất bạc màu có khó khăn về tưới nước thì trồng vừng được xem như là có hiệu quả kinh tế hơn cả. Cho nên, một số tỉnh bị hạn hán không có điều kiện tưới đã và đang tăng dần diện tích trồng các loại cây này. Việc cải thiện giống bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo, đột biến đã làm năng suất tăng đáng kể đối với cây lạc, vừng. Chọn tạo giống cổ điển thường mất rất nhiều thời gian và công sức Hơn nữa, vệc lựa chọn các giống làm bố mẹ thường chỉ dựa vào kiểu hình để đánh giá kiểu gen, vì thế nên hiệu quả tạo giống chưa cao Với sự hỗ trợ của sinh học phân tử đã giúp đẩy nhanh quá trình chọn tạo giống mà không bị chi phối bởi môi trường. Hàng loạt các chỉ thị phân tử dựa trên các kĩ thuật như: AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) đã được nghiên cứu và từng bước áp dụng vào chọn giống cây trồng trong đó có mục đích để bảo tồn giống và đánh giá đa dạng kiểu gen. Chỉ thị phân tử đã khắc phục được những thiếu sót, hạn chế của phương pháp truyền thống trước đây, đặc biệt là xác định khoảng cách di truyền. Chỉ thị RAPD và SSR hiện đang được áp dụng rất có hiệu quả ngay ở Việt Nam trong chọn tạo các giống lúa mới kháng rày nâu, đạo ôn (Nguyễn Thị Lang và CS, 2002). Tuy nhiên ở nước ta, việc cải tạo các giống cây lạc/vừng bằng ứng dụng các chỉ thị phân tử mới bắt đầu được nghiên cứu. Nhằm bước đầu cung cấp các thông tin di truyền, góp phần lưu giữ, duy trì nguồn gen đa dạng của tập đoàn giống lạc và vừng ở phía Nam, đồng thời làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn bố mẹ sử dụng trong các tổ hợp lai phù hợp theo mục đích của người tạo giống, công trình nghiên cứu này là sử dụng hai loại chỉ thị RAPD và SSR để “ Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được”.

doc76 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 05/06/2013 | Lượt xem: 1584 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Phân tích đa dạng ADN tập đoàn một số giống cây lấy dầu (lạc, vừng) và đánh giá mức độ thay đổi phân tử của các dòng cây mới chọn tạo được, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
th× tÝnh ®a h×nh cµng cao vµ ng­îc l¹i. B¶ng 13 cho thÊy, gi¸ trÞ PIC dao ®éng tõ 0 (måi OPH04; OPH08; RA50) ®Õn 0,57 (måi RA46; UBC3). Trong ®ã, 3/19 måi RAPD (RA-46; UBC3; UBC302) cho tÝnh ®a h×nh cao, víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. Hµm l­îng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (PIC) cña tËp ®oµn võng TT måi PIC TT måi PIC 1 OPH04 0 11 RA45 0.306122 2 OPH08 0 12 RA46 0.576531 3 OPP13 0.238338192 13 RA50 0 4 OPP04 0.233560091 14 UBC133 0.104082 5 RA142 0.124362245 15 UBC3 0.577041 6 RA159 0.06122449 16 UBC336 0.478664 7 RA31 0.215986395 17 UBC391 0.166837 8 RA32 0.406462585 18 UBC302 0.532143 9 RA36 0.054664723 19 UBC355 0.331633 10 RA40 0.241651206 Tõ b¶ng 13 ta thÊy, viÖc sö dông c¸c bé måi RAPD ®èi víi tËp ®oµn võng nµy cho tÝnh ®a h×nh ch­a cao nh­ng còng ®· thÓ hiÖn ®­îc tÝnh ®a h×nh cña c¸c gièng võng nghiªn cøu. D­íi ®©y chóng t«i sÏ ph©n tÝch ®iÖn di ®å s¶n phÈm RAPD cña c¸c måi cô thÓ S¶n phÈm RAPD víi måi UBC336 Chóng t«i chØ tiÕn hµnh ph©n tÝch s¶n phÈm RAPD cña tËp ®oµn võng nghiªn cøu víi c¸c måi thÓ hiÖn t­¬ng ®èi râ tÝnh ®a h×nh khi ®iÖn di trªn gel agarose 2%. Khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña tËp ®oµn võng nghiªn cøu víi måi UBC336 chóng t«i thu ®­îc tæng sè 11 ph©n ®o¹n, trong ®ã cã 8 ph©n ®o¹n ®a h×nh. Sè l­îng ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn cña mçi gièng võng nghiªn cøu lµ kh¸c nhau, dao ®éng tõ 5 ph©n ®o¹n (gièng VD11) ®Õn 10 ph©n ®o¹n (gièng V6) (h×nh 8, b¶ng 14). TÝnh ®a h×nh ®­îc thÓ hiÖn t­¬ng ®èi râ víi måi UBC336. Ch¼ng h¹n, ë vÞ trÝ 1050pb cã c¸c gièng §en tuyªn quang (cét 2); §á Th¸i Lan (cét 8); Tr¾ng Trung Quèc (cét 9); V6 (cét 10); HQ 03-4 (cét 11); HQ03-5 (cét 12); HQ03-6 (cét 13); MTTQ (cét 14), xuÊt hiÖn b¨ng ADN. C¸c gièng cßn l¹i kh«ng xuÊt hiÖn b¨ng ADN. C¸c kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn cho phÐp nhËn xÐt tËp ®oµn võng nghiªn cøu ®· cã sù sai kh¸c trong ADN hÖ gen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1000pb 500pb KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña quÇn thÓ võng víi måi UBC336 Ghi chó: giÕng 1: ADN 100 pb; giÕng 2-15: thø tù gièng ®­îc s¾p xÕp theo sè thø tù c¸c gièng võng nghiªn cøu trong phô lôc 2 C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn khi tiÕn hµnh ph¶n øng RAPD víi måi UBC336 Ký hiÖu gièng V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 Tæng Måi 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 13 UBC336 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 9 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 4 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 9 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 5 Tæng 8 7 8 7 5 6 7 7 9 10 8 8 7 7 104 S¶n phÈm RAPD víi måi UBC302 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña c¸c dßng võng nghiªn cøu víi måi UBC302 ®­îc tr×nh bµy trong h×nh 9 vµ b¶ng 15. Trong tæng sè 10 ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n, cã 8 ph©n ®o¹n ®a h×nh (chiÕm 80%). Gièng cã nhiÒu ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n nhÊt lµ tr¾ng Trung Quèc (víi 7 ph©n ®o¹n) cßn gièng cã Ýt ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n lµ ®á Th¸i Lan (víi 4 ph©n ®o¹n). 500pb 1000pb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña tËp ®oµn võng nghiªn cøu víi måi UBC302 Ghi chó: giÕng 1: ADN 100 pb; giÕng 2-15: thø tù gièng ®­îc s¾p xÕp theo sè thø tù c¸c gièng võng nghiªn cøu trong phô lôc 2 C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n ngÉu nhiªn khi tiÕn hµnh ph¶n øng RAPD víi måi UBC302 Ký hiÖu gièng V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 Tæng Måi 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 UBC302 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 14 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 7 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 13 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 6 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 12 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 Tæng 6 6 6 5 6 7 6 4 7 5 6 5 6 6 81 Qua h×nh 9, b¶ng 15 tÝnh ®a h×nh cña quÇn thÓ võng nghiªn cøu ®­îc chØ ra rÊt râ t¹i c¸c vÞ trÝ 220pb (®­îc ®¸nh dÊu b»ng mòi tªn trªn h×nh 9). C¸c gièng §en B×nh §Þnh (cét 1); VD11 (cét 5); Tr¾ng Trung Quèc (cét 9); V6 (cét 10); HQ 03-4 (cét 11); HQ03-6 (cét 13); MTTQ (cét 14) xuÊt hiÖn b¨ng ADN. C¸c gièng cßn l¹i kh«ng xuÊt hiÖn b¨ng ADN. Tõ c¸c kÕt qu¶ nµy cã thÓ thÊy ®­îc r»ng ®· cã sù ®· cã sù sai kh¸c vÒ mÆt di truyÒn ë mét sè gièng võng nghiªn cøu. Mèi quan hÖ di truyÒn cña c¸c gièng võng nghiªn cøu Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh cña c¸c gièng võng b»ng c¸ch so s¸nh c¸c ph©n ®o¹n RAPD. C¸c ph©n ®o¹n RAPD ®­îc ghi nhËn dùa trªn sù cã mÆt hay kh«ng cã mÆt cña chóng trªn ¶nh ®iÖn di ®å. NÕu xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN th× kÝ hiÖu lµ 1 cßn kh«ng th× kÝ hiÖu lµ 0. C¸c sè liÖu thu ®­îc sÏ ®­îc xö lý vµ ph©n tÝch trong ch­¬ng tr×nh NTSYSpc 2.0 ®Ó t×m ra mèi t­¬ng quan gi÷a c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu th«ng qua hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn vµ biÓu ®å h×nh c©y. Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh theo 3 ph­¬ng ph¸p tÝnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau (Dice, Jaccard, SM) vµ 4 kiÓu ph©n nhãm (UPGMA, WPGMA, liªn kÕt hoµn toµn vµ liªn kÕt ®¬n lÎ) (b¶ng 16). Khi ®ã, biÓu ®å h×nh c©y sÏ ®­îc thiÕt lËp dùa trªn gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh cao nhÊt theo ba hÖ sè di truyÒn gièng nhau vµ bèn kiÓu ph©n nhãm. Gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh (r) UPGMA WPGMA Complete linkage Simple linkage SM 0.63797 0.60942 0.54434 0.57949 Dice 0.64739 0.57984 0.50947 0.61185 Jaccard 0.65450 0.58930 0.51785 0.61905 KÕt qu¶ trªn chØ ra r»ng, ba c¸ch tÝnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau vµ bèn kiÓu ph©n nhãm ®Òu ph¶n ¸nh mèi t­¬ng quan kiÓu h×nh lµ t­¬ng quan yÕu (tõ 0,509 ®Õn 0,656). ë ®©y, gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh (r) tÝnh theo hÖ sè di truyÒn gièng nhau Jaccard vµ kiÓu ph©n nhãm UPGMA lµ cao nhÊt (r = 0,654). MÆt kh¸c, chØ thÞ RAPD lµ chØ thÞ tréi cßn hÖ sè gièng nhau Jaccard lµ c«ng thøc tÝnh ­u tiªn cho chØ thÞ tréi. V× thÕ s¬ ®å h×nh c©y sÏ ®­îc thiÕt lËp theo hÖ sè di truyÒn gièng nhau Jaccard vµ kiÓu ph©n nhãm UPGMA. Dùa theo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c gièng võng nghiªn cøu theo ph­¬ng ph¸p cña Jaccard (b¶ng 17). HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn lµ gi¸ trÞ ph¶n ¸nh quan hÖ vÒ nguån gèc di truyÒn gi÷a c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu. C¸c cÆp dßng cã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn t­¬ng øng cµng gÇn 1 th× cµng gÇn nhau, ng­îc l¹i hÖ sè nµy cµng gÇn 0 th× chóng cµng xa nhau vÒ ph­¬ng diÖn di truyÒn. Nh­ vËy, hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng võng trong nghiªn cøu dao ®éng tõ 70% khi so s¸nh gi÷a gièng §en Srilanka (V3) víi gièng V6 (V10) vµ cao nhÊt lµ 91% khi so s¸nh gi÷a dßng §en B×nh §Þnh (V1) víi dßng HQ03-6 (V13). HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn trung b×nh gi÷a c¸c gièng võng sö dông trong nghiªn cøu lµ 82%. HÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c gièng võng nghiªn cøu V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V1 1.00 V2 0.84 1.00 V3 0.85 0.83 1.00 V4 0.84 0.86 0.81 1.00 V5 0.87 0.82 0.77 0.85 1.00 V6 0.86 0.82 0.83 0.82 0.85 1.00 V7 0.83 0.84 0.81 0.82 0.85 0.84 1.00 V8 0.85 0.83 0.78 0.81 0.86 0.80 0.83 1.00 V9 0.88 0.88 0.80 0.83 0.84 0.80 0.88 0.83 1.00 V10 0.79 0.78 0.70 0.77 0.79 0.74 0.81 0.78 0.83 1.00 V11 0.84 0.76 0.75 0.77 0.80 0.76 0.78 0.81 0.84 0.80 1.00 V12 0.81 0.81 0.72 0.76 0.82 0.79 0.84 0.80 0.84 0.86 0.84 1.00 V13 0.91 0.84 0.79 0.79 0.82 0.81 0.79 0.86 0.86 0.77 0.85 0.86 1.00 V14 0.88 0.86 0.74 0.78 0.84 0.76 0.84 0.83 0.88 0.81 0.81 0.86 0.88 1.00 Sau khi ph©n ph©n tÝch sè liÖu trong ch­¬ng tr×nh NTSYS-SIMQUAL, chóng t«i tiÕn hµnh xö lý sè liÖu trong NTSYS-UPGMA ®Ó nhãm c¸c gièng võng l¹i theo møc ®é xa gÇn vÒ mÆt di truyÒn. Cuèi cïng, chóng t«i sö dông ch­¬ng tr×nh NTSYS-Tree-Display ®Ó lËp s¬ ®å h×nh c©y. S¬ ®å h×nh c©y tÝnh theo hÖ sè Jaccard vµ ph©n nhãm UPGMA ®· chØ ra møc ®é sai kh¸c di truyÒn gi÷a c¸c gièng võng dïng trong nghiªn cøu. Møc ®é sai kh¸c gi÷a c¸c gièng võng nghiªn cøu ®­îc cô thÓ ho¸ trong s¬ ®å h×nh c©y (h×nh 10). C¸c dßng cã hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn gièng nhau t­¬ng øng ®­îc xÕp vµo mét nhãm, gi÷a c¸c nhãm còng cã sù liªn hÖ víi nhau. S¬ ®å h×nh c©y c¸c gièng võng nghiªn cøu BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña c¸c gièng võng dïng trong nghiªn cøu Dùa trªn s¬ ®å h×nh c©y vµ biÓu ®å ®a chiÒu biÓu hiÖn tÝnh ®a h×nh ADN gi÷a c¸c gièng võng nghiªn cøu, chóng t«i nhËn thÊy tËp ®oµn c¸c gièng võng nµy cã ®é sai kh¸c ë møc ®é ph©n tö. X¸c ®Þnh møc ®é sai kh¸c cña c¸c dßng l¹c/võng ®ét biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p ph©n tö X¸c ®Þnh møc sai kh¸c cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p SSR Chóng t«i tiÕn hµnh 11 måi SSR ®Ó ®¸nh gi¸ møc ®é sai kh¸c ADN cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu. Tªn vµ tr×nh tù nucleotide cña c¸c måi ®­îc tr×nh bµy trong phô lôc 6. Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu chóng t«i thÊy r»ng, c¸c dßng l¹c ®ét biÕn b»ng tia gamma thÕ hÖ M3 cã sù biÕn ®æi vÒ møc ®é ADN. Sau ®©y lµ mét sè måi thÓ hiÖn sù biÕn ®éng ADN cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn. S¶n phÈn SSR cña måi L25 ®èi víi c¸c dßng l¹c ®ét biÕn Khi ®iÖn di s¶n phÈm SSR cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu víi måi L25 chóng t«i thu ®­îc tæng sè 2 ph©n ®o¹n trong ph¹m vi quan s¸t. Trong khi, c¸c dßng ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2 kh«ng cã sù biÕn ®æi vÒ kiÓu gen ®èi víi måi L25 th× c¸c dßng ®ét biÕn tõ gièng L9801 cã sù biÕn ®æi m¹nh mÏ. §iÓn h×nh lµ c¸c dßng L9801-1-1; L9801-1-2; L9801-2-1; L9801-3-1; L9801-3-2; L9801-4-1; L9801-4-2; L9801-4-3; L9801-4-4 (h­íng mòi tªn). §iÒu nµy chøng tá, ë thÕ hÖ M3 c¸c dßng l¹c ®ét biÕn ®ang ph©n ly m¹nh kh«ng nh÷ng ë trªn cïng mét c©y mµ cßn ph©n biÖt sù kh¸c nhau trong cïng mét cñ (h×nh 12 vµ b¶ng 18). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Ghi chó: giÕng 1-26: thø tù c¸c gièng ®­îc s¾p xÕp theo sè thø tù c¸c gièng l¹c nghiªn cøu trong phô lôc 1; giÕng 27: ADN 100 pb; KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm SSR cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn víi måi L25 C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n khi tiÕn hµnh ph¶n øng SSR víi måi L25 TT Tªn KÝch th­íc TT Tªn KÝch th­íc 123pb 120pb 123pb 120pb 1 VD2(dc) 0 1 14 L9801-1-4 0 1 2 VD2-1-1 0 1 15 L9801-2-1 1 0 3 VD2-1-2 0 1 16 L9801-2-2 0 1 4 VD2-1-3 0 1 17 L9801-2-3 0 1 5 VD2-1-4 0 1 18 L9801-2-4 0 1 6 VD2-2-1 0 1 19 L9801-3-1 1 0 7 VD2-2-2 0 1 20 L9801-3-2 1 0 8 VD2-2-3 0 1 21 L9801-3-3 0 1 9 VD2-2-4 0 1 22 L9801-3-4 0 1 10 L9801(dc) 0 1 23 L9801-4-1 1 0 11 L9801-1-1 1 0 24 L9801-4-2 1 0 12 L9801-1-2 1 0 25 L9801-4-3 1 0 13 L9801-1-3 0 1 26 L9801-4-4 1 0 S¶n phÈm SSR cña måi L41 ®èi víi c¸c dßng l¹c ®ét biÕn Khi ®iÖn di s¶n phÈm SSR cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu víi måi L41 chóng t«i thu ®­îc tæng sè 4 ph©n ®o¹n trong ph¹m vi quan s¸t. Trong ®ã, c¸c dßng ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2 cã sù biÕn ®åi vÒ kiÓu gen, ®iÒu nµy thÓ hiÖn tÊt c¶ ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng ADN míi ë ph©n ®o¹n 278 pb (mòi tªn). §èi víi c¸c dßng ®ét biÕn tõ gièng L9801 cã sù biÕn ®æi m¹nh mÏ (hai dßng L9801-1-2 vµ dßng L9801-1-4 xuÊt hiÖn b¨ng ADN míi ë vÞ trÝ 273 pb); mét sè dßng kh¸c l¹i xuÊt hiÖn b¨ng ADN ë ph©n ®o¹n 178 pb. §iÒu nµy chøng tá, ë thÕ hÖ M3 c¸c dßng l¹c ®ét biÕn ®ang ph©n ly m¹nh (h×nh 13 vµ b¶ng 19). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm SSR cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu víi måi L29 Ghi chó: giÕng 1: ADN 100 pb; giÕng 2-27: thø tù gièng ®­îc s¾p xÕp theo sè thø tù c¸c gièng võng nghiªn cøu trong phô lôc 3 KÕt qu¶ ph©n tÝch 19 dßng l¹c ®ét biÕn víi måi L29 TT Tªn KÝch th­íc TT Tªn KÝch th­íc 260pb 270pb 273pb 278pb 260pb 270pb 273pb 278pb 1 VD2(dc) 1 1 0 0 14 L9801-1-4 1 1 1 0 2 VD2-1-1 1 1 0 1 15 L9801-2-1 1 1 0 0 3 VD2-1-2 1 1 0 1 16 L9801-2-2 1 1 0 0 4 VD2-1-3 1 1 0 1 17 L9801-2-3 1 1 0 1 5 VD2-1-4 1 1 0 1 18 L9801-2-4 1 1 0 0 6 VD2-2-1 1 1 0 1 19 L9801-3-1 1 1 0 0 7 VD2-2-2 1 1 0 1 20 L9801-3-2 1 1 0 0 8 VD2-2-3 1 1 0 1 21 L9801-3-3 1 1 0 1 9 VD2-2-4 1 1 0 1 22 L9801-3-4 1 1 0 1 10 L9801(dc) 1 1 0 0 23 L9801-4-1 1 1 0 0 11 L9801-1-1 1 1 0 0 24 L9801-4-2 1 1 0 1 12 L9801-1-2 1 1 1 0 25 L9801-4-3 1 1 0 1 13 L9801-1-3 1 1 0 0 26 L9801-4-4 1 1 0 0 Sau khi ph©n tÝch víi mét sè måi, chóng t«i tiÕn hµnh ®¸nh gi¸ tæng thÓ 11 måi SSR ®èi víi tËp ®oµn l¹c ®ét biÕn. Sè ph©n ®o¹n vµ tÇn sè xuÊt hiÖn c¸c ph©n ®o¹n S¶n phÈm SSR víi c¸c måi kh¸c nhau ®­îc ®iÖn di trªn gel polyacrylamide 6% ®Ó ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh ADN cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn. Måi L25 L29 L32 L33 L36 L37 L38 L41 L43 L50 L54 Tæng Gièng VD2(dc) 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 VD2-1-1 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 VD2-1-2 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 VD2-1-3 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 VD2-1-4 1 1 1 1 2 2 4 3 1 1 5 22 VD2-2-1 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 VD2-2-2 1 1 1 1 3 2 4 3 2 1 5 24 VD2-2-3 1 1 1 1 2 2 4 3 1 1 5 22 VD2-2-4 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801(dc) 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-1-1 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-1-2 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801-1-3 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-1-4 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801-2-1 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-2-2 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-2-3 1 1 2 1 2 2 4 3 2 1 6 25 L9801-2-4 1 1 2 1 2 2 4 3 2 1 6 25 L9801-3-1 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-3-2 1 1 1 1 2 2 4 2 1 1 5 21 L9801-3-3 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 6 24 L9801-3-4 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801-4-1 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 L9801-4-2 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801-4-3 1 1 1 1 2 2 4 3 2 1 5 23 L9801-4-4 1 1 1 1 2 2 4 2 2 1 5 22 Tæng 26 26 28 26 53 52 104 67 49 26 133 590 Ph©n tÝch s¶n phÈm 11 cÆp måi SSR ®èi víi 19 dßng l¹c Trong thÝ nghiÖm nµy cã 268 ph¶n øng PCR ®­îc thùc hiÖn. KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy sè ph©n ®o¹n ADN nhËn ®­îc ë mçi ph¶n øng dao ®éng tõ 1 ®Õn 6 ph©n ®o¹n. XÐt vÒ tæng sè c¸c ph©n ®o¹n ®èi víi tÊt c¶ c¸c måi, dßng L9801-3-2 cho Ýt ph©n ®o¹n nhÊt (21 ph©n ®o¹n) cßn dßng cho nhiÒu ph©n ®o¹n nhÊt lµ L9801-2-3 vµ L9801-2-4 (25 ph©n ®o¹n). Nh×n chung måi cho nhiÒu ph©n ®o¹n nhÊt lµ L54 (133 ph©n ®o¹n). Tæng céng ®èi víi 11 måi SSR, chóng t«i ®· thu ®­îc 590 ph©n ®o¹n ADN tõ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn (b¶ng 20).Sau khi ®¸nh gi¸ tæng qu¸t c¸c dßng l¹c ®ét biÕn b»ng 11 cÆp måi SSR, chóng t«i tiÕn hµnh ph©n tÝch cô thÓ víi hai nhãm dßng ®ét biÕn VD2 vµ L9801. KÕt qu¶ ph©n tÝch nhãm dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2. §Çu tiªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh b»ng c¸ch so s¸nh gi÷a sè ph©n ®o¹n ®¬n h×nh vµ ®a h×nh thu ®­îc tõ c¸c måi. TÝnh ®a h×nh thÓ hiÖn ë sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi so s¸nh gi÷a c¸c dßng víi nhau (b¶ng 21 ). Gi¸ trÞ PIC vµ c¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n Måi gi¸ trÞ PIC sè alen PD ®a h×nh PD ®¬n h×nh % ®a h×nh L25 0.00 1 0 1 0% L29 0.60 2 2 0 100% L32 0.60 2 2 0 100% L33 0.00 1 0 1 0% L36 0.58 4 3 1 75% L37 0.00 2 0 2 0% L38 0.00 4 0 4 0% L41 0.07 3 1 2 33% L43 0.55 3 2 1 67% L50 0.67 2 2 0 100% L54 0.50 8 6 2 75% Tæng 32 18 14 56% KÕt qu¶ ë b¶ng 18 cho thÊy, víi 11 måi ngÉu nhiªn chóng t«i ®· thu ®­îc 32 ph©n ®o¹n ADN (trong ®ã 18 ph©n ®o¹n mang tÝnh ®a h×nh, chiÕm 56%). Sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n víi mçi måi dao ®éng tõ 1 ph©n ®o¹n (måi L25; L33) ®Õn 8 ph©n ®o¹n (måi L54). Sè c¸c ph©n ®o¹n ®a h×nh cña mçi måi tõ 0 ph©n ®o¹n (måi L25; L33) ®Õn 6 ph©n ®o¹n (måi L54). TÝnh ®a h×nh cña c¸c måi SSR cßn ®­îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC. B¶ng 21 cho thÊy, gi¸ trÞ PIC dao ®éng tõ 0 (måi L25; L33; L37; L38) ®Õn 0,67 (måi L50). Trong ®ã, 6/11 måi SSR (L29; L32; L36; L43; L50; L54) cho tÝnh ®a h×nh cao, víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. Chøng tá, viÖc sö dông c¸c cÆp måi SSR ®èi víi c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng VD2 cho tÝnh ®a h×nh cao. Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng VD2 b»ng c¸ch so s¸nh c¸c ph©n ®o¹n SSR. Víi ch­¬ng tr×nh NTSYS version 2.0 chóng t«i t×m ra mèi t­¬ng quan kiÓu h×nh r = 0.90568 chøng tá gi¸ trÞ t­¬ng quan gi÷a c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng VD2 lµ rÊt chÆt. Dùa theo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu (b¶ng 22) tõ ®ã thiÕt lËp h×nh c©y ph¸t sinh chñng lo¹i (h×nh 14). Nh­ vËy, hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn trong nghiªn cøu dao ®éng tõ 48% khi so s¸nh gi÷a dßng VD2-2-2 víi dßng VD2-2-3 vµ cao nhÊt lµ 1 khi so s¸nh gi÷a dßng VD2-1-1, VD2-1-2 vµ VD2-1-3). HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn trung b×nh gi÷a c¸c dßng l¹c ®ét biÕn sö dông trong nghiªn cøu lµ 77%. §iÒu nµy chøng tá c¸c dßng l¹c ®ét biÕn ®· cã nh÷ng biÕn ®æi lín vÒ kiÓu gen so víi gièng gèc. HÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng l¹c V2 ®ét biÕn VD2 (dc) VD2-1-1 VD2-1-2 VD2-1-3 VD2-1-4 VD2-2-1 VD2-2-2 VD2-2-3 VD2-2-4 VD2(dc) 1.00 VD2-1-1 0.96 1.00 VD2-1-2 0.96 1.00 1.00 VD2-1-3 0.96 1.00 1.00 1.00 VD2-1-4 0.91 0.96 0.96 0.96 1.00 VD2-2-1 0.73 0.77 0.77 0.77 0.80 1.00 VD2-2-2 0.77 0.81 0.81 0.81 0.84 0.88 1.00 VD2-2-3 0.52 0.55 0.55 0.55 0.57 0.55 0.48 1.00 VD2-2-4 0.73 0.77 0.77 0.77 0.73 0.59 0.62 0.73 1.00 S¬ ®å h×nh c©y c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2 nghiªn cøu BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2 dïng trong nghiªn cøu Qua h×nh 14 vµ 15 chóng t«i nhËn thÊy, tÊt c¶ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn ®Òu cã sù kh¸c biÖt so víi gièng gèc VD2. C¸c dßng l¹c VD2-1-1; VD2-1-2; VD2-1-3 gièng nhau vÒ mÆt di truyÒn vµ kh¸c biÖt víi gièng gèc rÊt Ýt (4%). Trong khi ®ã dßng VD2-2-3 cã sù kh¸c biÖt lín nhÊt so víi gièng gèc (48%). §iÒu nµy chøng tá ë møc chiÕu x¹ 10 kr c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng VD2 ®· cã sù biÕn ®æi vÒ møc ®é gen. Tuy nhiªn, c¬ sinh v©t lu«n cã sù tù ®iÒu chØnh, söa ch÷a cho nªn c¸c dßng l¹c nµy cÇn ®ùîc theo dâi ë c¸c thÕ hÖ tiÕp theo. KÕt qu¶ ph©n tÝch nhãm dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng L9801 Còng nh­ viÖc ®¸nh gi¸ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng VD2, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh b»ng c¸ch so s¸nh sè ph©n ®o¹n ®¬n h×nh vµ ®a h×nh thu ®­îc tõ c¸c måi. TÝnh ®a h×nh thÓ hiÖn ë sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi so s¸nh gi÷a c¸c dßng víi nhau (b¶ng 23). Gi¸ trÞ PIC vµ c¸c ph©n ®o¹n (PD) ADN ®­îc nh©n b¶n Måi gi¸ trÞ PIC sè alen PD ®a h×nh PD ®¬n h×nh % ®a h×nh L25 0.75 2 2 0 100% L29 0.60 2 2 0 100% L32 0.87 4 4 0 100% L33 0.00 1 0 1 0% L36 0.40 3 2 1 67% L37 0.00 2 0 2 0% L38 0.00 4 0 4 0% L41 0.47 4 2 2 50% L43 0.52 3 2 1 67% L50 0.56 2 2 0 100% L54 0.51 9 7 2 78% Tæng 36 23 13 64% KÕt qu¶ ë b¶ng 23 cho thÊy, víi 11 måi ngÉu nhiªn chóng t«i ®· thu ®­îc 36 ph©n ®o¹n ADN (trong ®ã 23 ph©n ®o¹n mang tÝnh ®a h×nh, chiÕm 64%). Sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n víi mçi måi dao ®éng tõ 1 ph©n ®o¹n (måi L33) ®Õn 9 ph©n ®o¹n (måi L54). Sè c¸c ph©n ®o¹n ®a h×nh cña mçi måi tõ 0 ph©n ®o¹n (måi L33; L37; L38) ®Õn 7 ph©n ®o¹n (måi L54). TÝnh ®a h×nh cña c¸c måi SSR cßn ®­îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC. B¶ng 23 cho thÊy, gi¸ trÞ PIC dao ®éng tõ 0 (måi L33; L37; L38) ®Õn 0,87 (måi L32). Trong ®ã, 6/11 måi SSR (L25; L29; L32; L43; L50; L54) cho tÝnh ®a h×nh cao, víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. Tõ b¶ng 23 ta thÊy, viÖc sö dông c¸c cÆp måi SSR ®èi víi c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng L9801 nµy cho tÝnh ®a h×nh cao. Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng L9801 b»ng c¸ch so s¸nh c¸c ph©n ®o¹n SSR. C¸c ph©n ®o¹n SSR ®­îc ghi nhËn dùa trªn sù cã mÆt hay kh«ng cã mÆt cña chóng trªn ¶nh ®iÖn di ®å. Sè liÖu ®­îc xö lý vµ ph©n tÝch trong ch­¬ng tr×nh NTSYS version 2.0 ®Ó t×m ra mèi t­¬ng quan gi÷a c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu th«ng qua hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn vµ biÓu ®å h×nh c©y. KÕt qu¶ trªn chØ ra r»ng mèi t­¬ng quan kiÓu h×nh r = 0.91498 chøng tá gi¸ trÞ t­¬ng quan gi÷a c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng L9801 cã mèi t­¬ng quan chÆt. Dùa theo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu theo ph­¬ng ph¸p ®· chØ ra (b¶ng 24). Nh­ vËy, hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn trong nghiªn cøu dao ®éng tõ 44% khi so s¸nh gi÷a dßng L9801-1-2 víi dßng L9801-3-4. Cao nhÊt lµ 100% khi so s¸nh gi÷a dßng L9801-1-1 víi dßng L9801-2-1 vµ dßng L9801-4-1 víi dßng L9801-3-1. HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn trung b×nh gi÷a c¸c dßng l¹c ®ét biÕn sö dông trong nghiªn cøu lµ 75%. HÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng l¹c ®ét biÕn nghiªn cøu L9801 (dc) L98011-1 L98011-2 L98011-3 L98011-4 L98012-1 L98012-2 L98012-3 L98012-4 L98013-1 L98013-2 L98013-3 L98013-4 L98014-1 L98014-2 L98014-3 L98014-4 L9801(dc) 1.00 L9801-1-1 0.83 1.00 L9801-1-2 0.73 0.88 1.00 L9801-1-3 0.83 0.83 0.73 1.00 L9801-1-4 0.73 0.73 0.84 0.73 1.00 L9801-2-1 0.83 1.00 0.88 0.83 0.73 1.00 L9801-2-2 0.91 0.91 0.80 0.91 0.80 0.91 1.00 L9801-2-3 0.81 0.81 0.71 0.81 0.71 0.81 0.88 1.00 L9801-2-4 0.84 0.84 0.74 0.84 0.74 0.84 0.92 0.96 1.00 L9801-3-1 0.83 0.83 0.73 0.69 0.73 0.83 0.76 0.68 0.70 1.00 L9801-3-2 0.79 0.87 0.76 0.72 0.69 0.87 0.79 0.70 0.73 0.87 1.00 L9801-3-3 0.64 0.53 0.47 0.53 0.47 0.53 0.59 0.63 0.60 0.53 0.50 1.00 L9801-3-4 0.61 0.50 0.44 0.50 0.53 0.50 0.55 0.55 0.52 0.61 0.52 0.88 1.00 L9801-4-1 0.83 0.83 0.73 0.69 0.73 0.83 0.76 0.68 0.70 1.00 0.87 0.53 0.61 1.00 L9801-4-2 0.80 0.80 0.70 0.67 0.64 0.80 0.73 0.71 0.68 0.88 0.91 0.57 0.59 0.88 1.00 L9801-4-3 0.88 0.88 0.77 0.73 0.64 0.88 0.80 0.78 0.74 0.88 0.83 0.62 0.59 0.88 0.92 1.00 L9801-4-4 0.91 0.91 0.80 0.76 0.67 0.91 0.83 0.74 0.77 0.91 0.87 0.59 0.55 0.91 0.88 0.96 1.00 S¬ ®å h×nh c©y c¸c dßng l¹c ®ét biÐn tõ gièng l¹c L9801 nghiªn cøu BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn tõ gièng l¹c L9801 dïng trong nghiªn cøu Qua h×nh 16 vµ 17 chóng t«i nhËn thÊy, tÊt c¶ c¸c dßng l¹c ®ét biÕn ®Òu cã sù kh¸c biÖt so víi gièng gèc L9801. Dßng l¹c L9801-2-2 gÇn víi gièng gèc nhÊt vÒ mÆt di truyÒn (91%). Trong khi ®ã dßng L9801-3-4 cã sù kh¸c biÖt lín nhÊt so víi gièng gèc (39%). X¸c ®Þnh møc sai kh¸c cña c¸c dßng võng ®ét biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p RAPD Chóng t«i tiÕn hµnh 10 måi RAPD ®Ó ®¸nh gi¸ møc ®é sai kh¸c ADN cña c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu. Tªn vµ tr×nh tù nucleotit cña c¸c måi ®­îc tr×nh bµy trong phô lôc 5. Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu chóng t«i thÊy r»ng, c¸c dßng võng ®ét biÕn b»ng tia gamma thÕ hÖ M3 cã sù biÕn ®æi vÒ ADN rÊt m¹nh. Sau ®©y lµ mét sè måi thÓ hiÖn sù biÕn ®éng ADN cña c¸c dßng võng ®ét biÕn. S¶n phÈn RAPD cña måi RA159 ®èi víi c¸c dßng võng ®ét biÕn Chóng t«i chØ tiÕn hµnh ph©n tÝch s¶n phÈm RAPD cña c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu víi c¸c måi thÓ hiÖn t­¬ng ®èi râ khi ®iÖn di trªn gel agarose 2%. Khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu víi måi RA159 chóng t«i thu ®­îc tæng sè 20 ph©n ®o¹n trong ph¹m vi quan s¸t. Tõ h×nh 18 vµ b¶ng 25 chóng t«i nhËn thÊy c¸c dßng võng ®· cã sù biÕn ®æi vÒ kiÓu gen so víi gièng gèc. VÝ dô: ë ph©n ®o¹n 710pb c¸c giÕng 3 (V6-1-1); 13 (V6-4-2) xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN míi so víi gièng gèc V6. MÆt kh¸c, còng ë vÞ trÝ 710bp gièng V36 xuÊt hiÖn b¨ng ADN trong khi ®ã mét sè dßng nh­ 23 (V36-1-1); 24 (V36-1-2); 26(V36-2-1); 27(V36-2-2)… l¹i khuyÕt b¨ng ADN t¹i vÞ trÝ nµy. §iÒu nµy chøng tá, ë thÕ hÖ M3 c¸c dßng võng ®ét biÕn ®ang ph©n ly m¹nh. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 151617 1819 20 2122 2324 25 26 2728 2930 3132 33 3435 3637 KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm RAPD cña c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu víi måi RA159 Chó thÝch: M: marker 100pb; 1-37 thø tù c¸c dßng võng ®ét biÕn trong phô lôc 4. C¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n khi tiÕn hµnh ph¶n øng RAPD víi måi RA159 Tªn KÝch th­íc (pb) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1350 1200 920 910 850 810 710 650 630 580 530 480 440 420 380 340 300 260 220 200 V6-0-1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V6-0-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V6-1-1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V6-1-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 V6-1-3 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-2-1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-2-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 V6-2-3 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 V6-3-1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V6-3-2 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-3-3 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-4-1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 V6-4-2 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 V6-4-3 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 V6-5-1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-5-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 V6-5-3 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 V6-6-1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V6-6-2 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V6-6-3 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 V36-0-1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 V36-0-2 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 V36-1-1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 V36-1-2 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 V36-1-3 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 V36-2-1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V36-2-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 V36-2-3 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 V36-3-1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 V36-3-2 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 V36-3-3 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 V36-4-1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 V36-4-2 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 V36-4-3 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 V36-5-1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 V36-5-2 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 V36-5-3 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 Sè ph©n ®o¹n vµ tÇn sè xuÊt hiÖn c¸c ph©n ®o¹n S¶n phÈm RAPD víi c¸c måi kh¸c nhau ®­îc ®iÖn di trªn gel agasose 2% ®Ó ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh ADN cña c¸c dßng võng ®ét biÕn. Trong thÝ nghiÖm nµy cã 370 ph¶n øng PCR ®­îc thùc hiÖn. KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy sè ph©n ®o¹n ADN nhËn ®­îc ë mçi ph¶n øng dao ®éng tõ 1 ®Õn 11 ph©n ®o¹n. XÐt vÒ tæng sè c¸c ph©n ®o¹n ®èi víi tÊt c¶ c¸c måi, dßng V6-3-1 cho Ýt ph©n ®o¹n nhÊt (45 ph©n ®o¹n) cßn dßng cho nhiÒu ph©n ®o¹n nhÊt lµ V6-4-3 (65 ph©n ®o¹n). Nh×n chung måi cho nhiÒu ph©n ®o¹n nhÊt lµ OPH04 (333 ph©n ®o¹n). Tæng céng ®èi víi 10 måi RAPD, chóng t«i ®· thu ®­îc 2123 ph©n ®o¹n ADN tõ c¸c dßng võng ®ét biÕn (b¶ng 26). Tæng hîp ph©n tÝch s¶n phÈm ®iÖn di trªn gel agarose 2% cña 9 dßng võng víi 10 cÆp måi RAPD Tªn Måi RA36 RA45 RA143 RA159 OPP04 OPH04 UBC335 UBC346 UBC332 UBC348 Tæng V6-0-1 5 3 3 8 1 9 7 8 7 4 55 V6-0-2 5 3 3 8 1 9 9 8 7 4 57 V6-1-1 6 3 3 9 1 9 9 8 8 4 60 V6-1-2 6 3 3 9 1 9 9 8 8 4 60 V6-1-3 10 3 4 7 1 9 9 8 8 4 63 V6-2-1 8 2 3 7 1 9 9 8 8 4 59 V6-2-2 8 3 3 8 1 9 9 8 7 3 59 V6-2-3 5 3 3 8 1 9 8 8 7 4 56 V6-3-1 3 2 3 5 1 9 8 8 2 4 45 V6-3-2 0 2 3 6 1 9 6 8 7 3 45 V6-3-3 5 3 3 6 1 9 9 8 7 4 55 V6-4-1 7 2 3 11 1 9 9 8 3 4 57 V6-4-2 7 2 3 9 1 9 8 8 8 4 59 V6-4-3 11 2 4 11 1 9 8 8 7 4 65 V6-5-1 10 2 3 8 1 9 9 8 0 4 54 V6-5-2 10 2 3 11 1 9 9 8 7 4 64 V6-5-3 9 2 3 9 1 9 8 8 8 4 61 V6-6-1 5 2 4 7 1 9 8 8 8 4 56 V6-6-2 5 2 3 8 1 9 8 8 8 4 56 V6-6-3 3 2 3 6 1 9 4 8 6 4 46 V36-0-1 8 3 3 8 1 9 6 8 7 4 57 V36-0-2 8 3 3 8 1 9 9 8 7 4 60 V36-1-1 8 3 3 8 1 9 9 8 7 4 60 V36-1-2 10 3 3 9 1 9 9 8 7 4 63 V36-1-3 10 3 3 8 1 9 9 8 4 4 59 V36-2-1 10 3 3 7 1 9 9 8 7 4 61 V36-2-2 9 2 3 10 1 9 9 8 7 4 62 V36-2-3 8 3 3 9 1 9 5 8 4 4 54 V36-3-1 5 2 3 8 1 9 9 8 7 4 56 V36-3-2 5 2 3 7 1 9 9 8 6 4 54 V36-3-3 4 3 3 8 1 9 8 8 3 4 51 V36-4-1 5 3 3 9 1 9 8 8 7 4 57 V36-4-2 4 3 3 8 1 9 6 8 7 4 53 V36-4-3 9 3 3 10 1 9 8 8 7 4 62 V36-5-1 9 2 3 8 1 9 6 8 7 4 57 V36-5-2 10 2 3 9 1 9 7 8 3 3 55 V36-5-3 9 3 3 7 1 9 8 8 7 3 58 Tæng 259 94 114 302 37 333 297 296 235 144 2123 Sau khi ®¸nh gi¸ tæng qu¸t c¸c dßng võng ®ét biÕn b»ng 10 måi RAPD, chóng t«i tiÕn hµnh ph©n tÝch cô thÓ víi hai nhãm dßng võng ®ét biÕn V6 vµ V36. KÕt qu¶ ph©n tÝch nhãm dßng võng ®ét biÕn tõ gièng võng V6. §Çu tiªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh b»ng c¸ch so s¸nh gi÷a sè ph©n ®o¹n ®¬n h×nh vµ ®a h×nh thu ®­îc tõ c¸c måi. TÝnh ®a h×nh thÓ hiÖn ë sù xuÊt hiÖn hay kh«ng xuÊt hiÖn cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi so s¸nh gi÷a c¸c dßng víi nhau (b¶ng 27 ). Gi¸ trÞ PIC vµ c¸c ph©n ®o¹n ADN ®­îc nh©n b¶n PIC Sè alen P§ ®a h×nh P§ ®¬n h×nh % P§ ®a h×nh RA36 0.68 15 14 1 93% RA45 0.30 3 2 1 67% RA143 0.50 6 3 3 50% RA159 0.69 19 17 2 89% OPP04 0.00 1 0 1 0% OPH04 0.00 9 0 9 0% UBC335 0.17 9 5 4 56% UBC346 0.00 8 0 8 0% UBC332 0.23 8 6 2 75% UBC348 0.05 4 1 3 25% 82 48 34 59% KÕt qu¶ ë b¶ng 27 cho thÊy, víi 10 måi ngÉu nhiªn chóng t«i ®· thu ®­îc 82 ph©n ®o¹n ADN (trong ®ã 48 ph©n ®o¹n mang tÝnh ®a h×nh, chiÕm 59%). Sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n víi mçi måi dao ®éng tõ 1 ph©n ®o¹n (måi OPP04) ®Õn 19 ph©n ®o¹n (måi RA159). Sè c¸c ph©n ®o¹n ®a h×nh cña mçi måi tõ 0 ph©n ®o¹n (måi OPP04, OPH04) ®Õn 17 ph©n ®o¹n (måi RA159). TÝnh ®a h×nh cña c¸c dßng võng ®ét biÕn cßn ®­îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC. B¶ng 27 cho thÊy, gi¸ trÞ PIC dao ®éng tõ 0 (måi OPP04; OPH04) ®Õn 0,69 (måi RA159). Trong ®ã, 3/10 måi RAPD (RA36; RA143;RA159) cho tÝnh ®a h×nh cao, víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. §iÒu nµy chøng tá viÖc sö dông c¸c måi RAPD ®èi víi c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V6 nµy cho tÝnh ®a h×nh cao Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh cña c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V6 b»ng c¸ch so s¸nh c¸c ph©n ®o¹n RAPD. KÕt qu¶ ph©n tÝch sö dông phÇn mÒm NTSYSpc 2.0 trªn chØ ra r»ng hÖ sè t­¬ng quan kiÓu h×nh r = 0.80535. §iÒu nµy chøng tá gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V6 cã mèi t­¬ng quan chÆt. Dùa theo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu tõ ®ã thiÕt lËp c©y ph©n biÖt chñng lo¹i vµ biÓu ®å ®a chiÒu cña c¸c dßng võng nghiªn cøu. Nh­ vËy, hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng võng ®ét biÕn trong nghiªn cøu dao ®éng tõ 67% (khi so s¸nh gi÷a dßng V6-4-3 víi dßng V6-3-1) tíi 96% (khi so s¸nh gi÷a dßng V6-5-1, V6-5-2). HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn trung b×nh gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn sö dông trong nghiªn cøu lµ 77% (b¶ng 28). HÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu V6-0-1 V6-0-2 V6-1-1 V6-1-2 V6-1-3 V6-2-1 V6-2-2 V6-2-3 V6-3-1 V6-3-2 V6-3-3 V6-4-1 V6-4-2 V6-4-3 V6-5-1 V6-5-2 V6-5-3 V6-6-1 V6-6-2 V6-6-3 V6-0-1 1.00 V6-0-2 0.98 1.00 V6-1-1 0.89 0.92 1.00 V6-1-2 0.89 0.92 0.93 1.00 V6-1-3 0.83 0.86 0.89 0.92 1.00 V6-2-1 0.82 0.85 0.88 0.90 0.92 1.00 V6-2-2 0.86 0.88 0.89 0.89 0.88 0.92 1.00 V6-2-3 0.85 0.87 0.88 0.86 0.82 0.83 0.87 1.00 V6-3-1 0.82 0.82 0.79 0.79 0.75 0.79 0.75 0.74 1.00 V6-3-2 0.88 0.86 0.82 0.85 0.81 0.85 0.81 0.80 0.82 1.00 V6-3-3 0.90 0.93 0.92 0.94 0.90 0.89 0.88 0.87 0.85 0.90 1.00 V6-4-1 0.80 0.82 0.86 0.86 0.82 0.86 0.85 0.79 0.83 0.80 0.85 1.00 V6-4-2 0.82 0.82 0.88 0.88 0.85 0.88 0.82 0.81 0.74 0.82 0.85 0.86 1.00 V6-4-3 0.75 0.77 0.79 0.79 0.77 0.81 0.80 0.81 0.67 0.75 0.77 0.83 0.81 1.00 V6-5-1 0.85 0.87 0.86 0.90 0.89 0.90 0.87 0.81 0.79 0.85 0.89 0.86 0.86 0.86 1.00 V6-5-2 0.81 0.83 0.82 0.87 0.86 0.87 0.86 0.77 0.75 0.81 0.86 0.87 0.85 0.87 0.96 1.00 V6-5-3 0.82 0.85 0.88 0.90 0.89 0.93 0.87 0.81 0.76 0.82 0.87 0.88 0.90 0.88 0.93 0.92 1.00 V6-6-1 0.88 0.88 0.89 0.92 0.86 0.89 0.83 0.85 0.80 0.90 0.90 0.85 0.89 0.80 0.89 0.86 0.89 1.00 V6-6-2 0.88 0.88 0.92 0.87 0.83 0.87 0.83 0.85 0.80 0.83 0.86 0.82 0.94 0.77 0.85 0.81 0.87 0.90 1.00 V6-6-3 0.83 0.81 0.80 0.80 0.74 0.75 0.76 0.80 0.80 0.81 0.79 0.77 0.77 0.73 0.75 0.74 0.77 0.83 0.83 1.00 S¬ ®å h×nh c©y c¸c dßng võng ®ét biÐn tõ gièng võng VD2 nghiªn cøu BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng võng V6 dïng trong nghiªn cøu Qua h×nh 19 vµ 20 chóng t«i nhËn thÊy, tÊt c¶ c¸c dßng võng ®ét biÕn ®Òu cã sù kh¸c biÖt so víi gièng gèc V6. C¸c dßng võng VD2-1-1; VD2-1-2; VD2-1-3 gièng nhau vÒ mÆt di truyÒn vµ kh¸c biÖt víi gièng gèc rÊt Ýt (4%). Trong khi ®ã dßng VD2-2-3 cã sù kh¸c biÖt lín nhÊt so víi gièng gèc (48%). KÕt qu¶ ph©n tÝch nhãm dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V36 Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh b»ng c¸ch so s¸nh gi÷a sè ph©n ®o¹n ®¬n h×nh vµ ®a h×nh thu ®­îc tõ c¸c måi (b¶ng 29). Gi¸ trÞ PIC vµ c¸c ph©n ®o¹n (PD) ADN ®­îc nh©n b¶n PIC Sè alen PD ®a h×nh PD ®¬n h×nh %PD ®a h×nh RA36 0.57 14 10 4 71% RA45 0.17 3 1 2 33% RA143 0.00 3 0 3 0% RA159 0.65 18 14 4 78% OPP04 0.00 1 0 1 0% OPH04 0.00 9 0 9 0% UBC335 0.22 9 5 4 56% UBC346 0.00 8 0 8 0% UBC332 0.22 7 4 3 57% UBC348 0.06 4 1 3 25% 76 35 41 46% KÕt qu¶ ë b¶ng 29 cho thÊy, víi 10 måi ngÉu nhiªn, chóng t«i ®· thu ®­îc 76 ph©n ®o¹n ADN (trong ®ã 35 ph©n ®o¹n mang tÝnh ®a h×nh, chiÕm 46%). Sè l­îng c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n víi mçi måi dao ®éng tõ 1 ph©n ®o¹n (måi OPP04) ®Õn 18 ph©n ®o¹n (måi RA159). Sè c¸c ph©n ®o¹n ®a h×nh cña mçi måi tõ 0 ph©n ®o¹n (måi RA143; OPP04; OPH04; UBC346) ®Õn 14 ph©n ®o¹n (måi RA159). Th«ng qua gi¸ trÞ PIC ë b¶ng 29 cho thÊy, ®èi víi dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V36 gi¸ trÞ PIC dao ®éng tõ 0 (måi RA143; OPP04; OPH04; UBC346) ®Õn 0,65 (måi RA159). Trong ®ã, 2/10 måi RAPD (RA159; RA36) cho tÝnh ®a h×nh cao, víi gi¸ trÞ PIC ³ 0,5. Tõ b¶ng 29 cho thÊy, viÖc sö dông c¸c cÆp måi RAPD ®èi víi c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V36 nµy cho tÝnh ®a h×nh kh«ng cao. Tõ kÕt qu¶ ph©n tÝch trªn, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh møc ®é ®a h×nh cña c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V36 b»ng c¸ch so s¸nh c¸c ph©n ®o¹n RAPD. KÕt qu¶ thu ®­îc xö lý vµ ph©n tÝch trong ch­¬ng tr×nh NTSYSpc 2.0 ®Ó t×m ra mèi t­¬ng quan gi÷a c¸c ®èi t­îng nghiªn cøu th«ng qua hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn vµ biÓu ®å h×nh c©y. KÕt qu¶ trªn chØ ra r»ng r = 0.75202 chøng tá gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng V36 cã mèi t­¬ng quan chÆt. Dùa theo gi¸ trÞ t­¬ng quan kiÓu h×nh, chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸ c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu theo ph­¬ng ph¸p Jaccard (b¶ng 30). Nh­ vËy, hÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c dßng võng ®ét biÕn trong nghiªn cøu dao ®éng tõ 74% khi so s¸nh gi÷a dßng V36-2-3 víi dßng V36-3-2 vµ cao nhÊt lµ 96% khi so s¸nh gi÷a dßng V36-0-1 víi dßng V36-0-2. Trong ®ã, V36-0-1 vµ V36-0-2 lµ cïng mét gièng lµ gièng gèc V36 ®èi chøng. HÖ sè t­¬ng ®ång di truyÒn trung b×nh gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn sö dông trong nghiªn cøu lµ 84%. HÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng võng ®ét biÕn nghiªn cøu V36-0-1 V36-0-2 V36-1-1 V36-1-2 V36-1-3 V36-2-1 V36-2-2 V36-2-3 V36-3-1 V36-3-2 V36-3-3 V36-4-1 V36-4-2 V36-4-3 V36-5-1 V36-5-2 V36-5-3 V36-0-1 1.00 V36-0-2 0.96 1.00 V36-1-1 0.86 0.89 1.00 V36-1-2 0.84 0.88 0.91 1.00 V36-1-3 0.82 0.86 0.91 0.89 1.00 V36-2-1 0.82 0.86 0.91 0.92 0.89 1.00 V36-2-2 0.80 0.84 0.89 0.91 0.86 0.91 1.00 V36-2-3 0.88 0.87 0.84 0.80 0.86 0.78 0.76 1.00 V36-3-1 0.88 0.92 0.92 0.86 0.86 0.86 0.89 0.84 1.00 V36-3-2 0.80 0.84 0.84 0.83 0.78 0.80 0.84 0.74 0.89 1.00 V36-3-3 0.79 0.83 0.83 0.79 0.84 0.82 0.80 0.83 0.86 0.86 1.00 V36-4-1 0.87 0.88 0.86 0.84 0.82 0.82 0.80 0.78 0.91 0.86 0.84 1.00 V36-4-2 0.92 0.88 0.86 0.84 0.79 0.82 0.80 0.83 0.88 0.88 0.84 0.89 1.00 V36-4-3 0.83 0.87 0.95 0.88 0.91 0.88 0.87 0.84 0.89 0.82 0.80 0.83 0.83 1.00 V36-5-1 0.84 0.80 0.86 0.87 0.82 0.92 0.88 0.78 0.83 0.80 0.76 0.79 0.84 0.83 1.00 V36-5-2 0.76 0.75 0.83 0.82 0.87 0.82 0.83 0.80 0.80 0.75 0.82 0.76 0.76 0.80 0.82 1.00 V36-5-3 0.86 0.89 0.92 0.93 0.88 0.91 0.87 0.84 0.87 0.82 0.83 0.83 0.86 0.92 0.86 0.83 1.00 S¬ ®å h×nh c©y c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng võng V36 nghiªn cøu BiÓu ®å ®a chiÒu (MDS) cña c¸c dßng võng ®ét biÕn tõ gièng võng V36 dïng trong nghiªn cøu Qua h×nh 21 vµ 22 chóng t«i nhËn thÊy, tÊt c¶ c¸c dßng võng ®ét biÕn ®Òu cã sù kh¸c biÖt so víi gièng gèc V36. Dßng võng V36-4-2 gÇn víi gièng gèc nhÊt vÒ mÆt di truyÒn (92%). Trong khi ®ã dßng V36-5-2 cã sù kh¸c biÖt lín nhÊt so víi gièng gèc (24%) KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ KÕt luËn nªn viÕt TËp ®oµn 33 gièng l¹c cã.... khi phan tÝchl¹c víi 15 måi SSR thu ®­îc 114 ph©n ®o¹n ADN. Trong ®ã, cã 104 ph©n ®o¹n cho kÕt qu¶ ®a h×nh chiÕm 90%. Qua s¬ ®å h×nh c©y vµ hÖ sè t­¬ng ®ång cho thÊy tËp ®oµn l¹c nghiªn cøu cho tÝnh ®a h×nh rÊt cao (dao ®éng tõ 31%-98%). §¸nh gi¸ ®a h×nh tËp ®oµn võng víi 19 måi RAPD thu ®­îc 137 ph©n ®o¹n ADN. Trong ®ã, cã 61 ph©n ®o¹n cho kÕt qu¶ ®a h×nh chiÕm 45%. Qua s¬ ®å h×nh c©y vµ hÖ sè t­¬ng ®ång cho thÊy tËp ®oµn võng nghiªn cøu cho tÝnh ®a h×nh kh¸ cao (dao ®éng tõ 70%-91%). §¸nh gi¸ møc ®é biÕn ®éng cña c¸c dßng l¹c ®ét biÕn chóng t«i ®· sö dông 11 måi SSR. KÕt qu¶ cho thÊy, c¸c dßng l¹c ®ét biÕn cã sù biÕn ®æi vÒ møc ®é ADN so víi gièng gèc. §èi víi dßng ®ét biÕn tõ gièng l¹c VD2 th× hÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng so víi gièng gèc tõ 52%-96%. Cßn ®èi víi dßng ®ét biÕn tõ gièng l¹c L9801 th× hÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng so víi gièng gèc tõ 61%-91%. §¸nh gi¸ møc ®é biÕn ®éng cña c¸c dßng võng ®ét biÕn chóng t«i ®· sö dông 10 måi RAPD. KÕt qu¶ cho thÊy, c¸c dßng võng ®ét biÕn cã sù biÕn ®æi vÒ møc ®é ADN so víi gièng gèc. §èi víi dßng ®ét biÕn tõ gièng võng V6 th× hÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng so víi gièng gèc tõ 75%-90%. Cßn ®èi víi dßng ®ét biÕn tõ gièng võng V36 th× hÖ sè t­¬ng ®ång gi÷a c¸c dßng so víi gièng gèc tõ 76%-92%. 2. §Ò nghÞ §èi víi c¸c dßng l¹c vµ võng ®ét biÕn cÇn tiÕp tôc ®¸nh gi¸ ngoµi ®ång ruéng, cã thÓ dùa vµo hÖ sè t­¬ng ®ång cña chóng ®Ó chän läc gi¶m bít sè l­îng theo dâi ngoµi ®ång ruéng. Tµi liÖu tham kh¶o: Tµi liÖu tiÕng ViÖt: §inh ThÞ Phßng (2001), Nghiªn cøu kh¶ n¨ng chÞu h¹n vµ chän dßng chÞu h¹n ë lóa b»ng c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, LuËn ¸n TiÕn sÜ Sinh häc, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, Hµ Néi. §inh ThÞ Phßng, NguyÔn V¨n Th¾ng, Lª TrÇn B×nh, Lª ThÞ Muéi, 2005. “Sö dông chØ thÞ ph©n tö SSR ®Ó ph©n tÝch ®a d¹ng tËp ®oµn gièng l¹c (Arachis hypogaea L.) ViÖt Nam kh¸ng bÖnh rØ s¾t”. t¹p chÝ KH vµ CN 43 (1): tr 84-92 Bïi V¨n Th¾ng (2002), §¸nh gi¸ tÝnh ®a h×nh ADN vµ kh¶ n¨ng chän dßng tÕ bµo ®ét biÕn ë mét sè gièng lóa ®Æc s¶n, Kho¸ luËn Tèt nghiÖp §¹i häc, §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, Hµ Néi. Bïi V¨n Th¾ng, TrÇn V¨n D­¬ng, §inh ThÞ Phßng, NguyÔn V¨n Th¾ng, Lª ThÞ Muéi, Lª TrÇn B×nh, (2003), “§¸nh gi¸ tÝnh ®a d¹ng cña mét sè gièng l¹c trong tËp ®oµn gièng chèng chÞu bÖnh gØ s¾t b»ng kü thuËt RAPD”. B¸o c¸o khoa häc, héi nghÞ c«ng nghÖ sinh häc toµn quèc, Hµ néi, tr. 805-809 Lª §×nh L­¬ng, QuyÒn §×nh Thi (2002), Kü thuËt di truyÒn vµ øng dông, Nxb §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi, Hµ Néi, tr. 134 - 147. Lª Duy Thµnh (2001), C¬ së di truyÒn chän gièng thùc vËt, Nxb Khoa häc Kü thuËt, Hµ Néi. Lª ThÞ Muéi, §inh ThÞ Phßng, NguyÔn ThÞ Hµi, Lª Duy Thµnh, TrÇn V¨n D­¬ng, NguyÔn V¨n Th¾ng (2005), “§a h×nh genome tËp ®oµn gièng l¹c cã ph¶n øng kh¸c nhau víi bÖnh hÐo xanh vi khuÈn b»ng chØ thÞ SSR” Nh÷ng vÊn ®Ò c¬ b¶n trong nghiªn cøu sù sèng, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc kü thuËt, tr. 1321-1324. Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi (1997), C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång, Nhµ xuÊt b¶n n«ng nghiÖp Lª Xu©n §¾c, Bïi V¨n Th¾ng, Lª TrÇn B×nh, Lª Duy Thµnh, Lª ThÞ Muéi (2003), “§¸nh gi¸ ®a d¹ng di truyÒn cña mét sè gièng lóa t¸m ë ViÖt Nam”, T¹p chÝ C«ng nghÖ sinh häc, 1(4), tr. 493-501. Ng« ThÕ D©n, NguyÔn Xu©n Hång, §ç ThÞ Dung, NguyÔn ThÞ Chinh, Vò ThÞ §µo, Ph¹m V¨n Toµn, TrÇn §×nh Long, C.L.L Gowda (2000), Kü thuËt ®¹t n¨ng suÊt l¹c cao, Nhµ xuÊt b¶n n«ng nghiÖp, Hµ Néi. NguyÔn ThÞ Lang, Bïi ChÝ Böu (2002), Genome häc vÒ chøc n¨ng vµ c«ng nghÖ gen, ViÖn lóa §ång b»ng s«ng Cöu Long. NguyÔn V¨n B×nh, Vò §×nh ChÝnh, NguyÔn ThÕ C«n, Lª Song Dù, §oµn ThÞ Thanh Nh¸n, Bïi Xu©n Söu (1996), Gi¸o tr×nh c©y c«ng nghiÖp, Nhµ xuÊt b¶n n«ng nghiÖp, Nµ Néi. NguyÔn V¨n HiÓn, 2000. Chän gièng c©y trång, Nhµ xuÊt b¶n gi¸o dôc NguyÓn Vy, 2003. C©y võng, Nhµ xuÊt b¶n NghÖ An Phª duyÖt quy ho¹ch ph¸p triÓn ngµnh dÇu thùc vËt ViÖt Nam 2001 – 2010. 2003 Phan Träng Hoµng (2003), §¸nh gi¸ sù ®a h×nh ADN cña mét sè gièng lóa T¸m, Kho¸ luËn Tèt nghiÖp §¹i häc, §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, Hµ Néi. TuyÓn tËp c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu c©y võng, 2003. Trung t©m nghiªn cøu vµ thùc nghiÖm ®Ëu ®ç-ViÖn khoa häc kü thuËt n«ng nghiÖp ViÖt Nam Vò C«ng HËu, Ng« ThÕ D©n, TrÇn ThÞ Dung (1995), C©y l¹c, Nhµ xuÊt b¶n n«ng nghiÖp, TP. Hå ChÝ Minh. Tµi liÖu tiÕng Anh Aradhya M.K., Zee F.T., Manshardt R.M. (1995), “Isozyme variation in lychee (Litchi chinensis Sonn.)”, Sci. Hort., 63, pp. 21-35. B. S. Weir – Methods for discrete genetic data. Sinauer Associates, Inc., Sunderland. Mass. (1990) 125. Chiangda J. (1998), “Random Amplified Polymorphic DNA technique for genetic analysis of litchi (Litchi chinensis Sonn.)”, Acta. Hort. (ISHS), 575, pp. 253-259. Couch J.A. and Fritz P.J. (1990), “Isolation of DNA from plants high in polyphenolics”, Plant Mol. Biol. Rep., 8, pp. 8-12. D.H. Putnam, E.S. Oplinger, T.M. Teynor, E.A. Oelke, K.A. Kelling, and J.D. Doll (1991), “Peanut” Aternative field crop manual, Dawson C.R., Magee R.J. (1995), Plant tyrosinase (polyphenol oxidase - Colowick SP, Kaplan NO (Eds) Methods in Enzymology (Vol 2), Academic Press New York, pp. 817-827 Demeke T., Adams R.P. (1992), "The effect of plant polysaccharides and buffer additives of PCR", Biotechniques, 12, pp. 332-334. Ding X.D., Lu L.X., Chen X.J. (2001), “Segregation patterns of RAPD makers in an F1 population of Litchi chinensis Sonn.”, Acta. Hort. (ISHS), 558, pp. 167-172. Do N., Adams R.P. (1991), "A simple technique for removing plant polysaccharides contaminants from DNA", Biotechniques, 10, pp. 162-166. Doyle J.J. and Doyle J.L. (1990), "Isolation of Plant DNA from fresh tissue", Focus, 12, pp. 13-15. Draper J., Scott R. (1991), Gene transfer to plants-Grierson (Ed) Plant Genetic Engineering (Vol 1), Chapman and Hall Publishers, New York, pp. 40 - 43. Dwivedi S.L., Gurtu S., Chandra S., Yuejin W., Nigam S.N. (2000), “Assessment of genetic diversity among selected groundnut germplasm”, Plant Breeding, 120, pp. 345 - 394. Egnin M. (1996), “Protocol of DNA isolation”, Plant biotechnology lab., Milbank Hall RM, pp. 104. Fang G.S., Hammer S., Grumet R. (1992), "A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA", Biotechniques, 13, pp. 52-57. Gupta V.S. and Ranjekar P.K. (1994), “Use of RFLP/RAPD approach in genetic diversity analysis, bacterial blight resistance gene tagging and DNA fingerprinting in rice”, 3rd Annual Meeting (3-5 March), India. Gustine D.L., Voigt P.W., Brummer E.C., Papadopoulos Y.A. (2002), "Genetic variation of RAPD marker for North American white clover collections an cultivars", Crop Sci., 42, pp. 343-347. Harvey M., Botha F.C. (1996), “Use of PCR-based methodologies for the determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, 89, pp. 257-265 He G., Meng R., Newman M., Gao G., Pittman R. N., Prakash C. (2003), “Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.), BMC. Plan. Boil., 3 (1), pp. 3. Li Q.B., Cai Q.Y., Guy C.L. (1994), “A DNA extraction method for RAPD analysis from plants rich in soluble polysaccharides”, Plant Mol. Biol. Rep., 12, pp. 215-220. Mace E.S., Lester R.N., Gebhardt C.G. (1999), “AFLP analysis of genetic relationships among the cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae)”, Theor. Appl. Genet., 99, pp. 626-633. Marechal D.L., Guillemaut P. (1995), “A powerful but simple technique to prepare polysaccharide-free DNA quickly and without phenol extraction”, Plant Mol. Biol. Rep., 13, pp. 26-30. Marilyn Warburton and JosÐ Crossa (2002), “data analysis in the CIMMYT Applied Biotechnology Center for fingerprinting and Genetic” Murray M.G., Thompson W.F. (1980), "Rapid isolation of high molecular weight DNA", Nucleic Acids Res., 8, pp. 4321-4325. Nei M., Li W.H. (1979), “Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction and nucleases”, Proc. Natl. Sci., 76, pp. 5269-5273. Orozco C.C., Chalmers K.J., Waugh R., Powell W. (1994), “Detection of diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers”, Theor. Appl. Genet., 87, pp. 934-940. Pandey R.N., Adams R.P., Flournoy L.E. (1996), "Inhibition of random amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides", Plant Mol. Biol. Rep., 14, pp. 17-22. Paterson A.H., Brubaker C.L., Wendel J.F. (1993), "A rapid method for extraction of Cotton (Gossypium spp) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis", Plant Mol. Biol. Rep., 11, pp. 122-127. Porebski S., Bailey L.G. and Baum B.R. (1997), “Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components”, Plant Mol. Biol. Rep., 15, pp. 8-15. Rether B., Delmas G., Laouedj A. (1993), “Isolation of polysaccharide-free DNA from plants”, Plant Mol. Biol. Rep., 11, pp. 333-337. Rohlf F.J. (2001), NTSYS Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.0, Exeter Software Publ., Setauket, New York. Rom¸n B., Alfaro C., Torres A.M., Moreno M.T., Satovic Z., Pujadas A., Rubiales D. (2003), "Genetic relationships among Orobanche species as revealed by RAPD analysis", Annals of Botany, 91, pp. 637-642. Rose E.A. (1991), “Applications of PCR to genome analysis”, The Faser J., pp. 46-54. Samec P., Našinec V. (1995), “Detection of DNA polymorphism among pea cultivars using RAPD technique”, Biol. Planta., 37, pp. 321-327. Sandhu S.S., Bastos C.R., Azini L.E., Neto A.T., Colombo C. (2002), “RAPD analysis of herbicide resistant Brasilian rice lines produced via mutagenesis”, Genet. Mol. Res., 1(4), pp. 359-370. Song B.K., Clyde M.M., Wickneswari R., Normah M.N. (2000), "Genetic relatedness among Lansium domesticum accessions using RAPD makers", Annals of Botany, 86, pp. 299-307. Stange C., Prehn D., Patricio A.J. (1998), “Isolation of Pinus radiata genomic DNA suitable for RAPD analysis”, Plant Mol. Biol. Rep., 16, pp. 1-8. Steiner J.J., Poklemba C.J., Fjellstrom R.G., and Elliott L.F. (1995), "A rapid one-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analysis", Nucleic Acids Res., 23, pp. 2569-2570. Sun G., bond M., Nass H., Martin R., Dong Z. (2003), “RAPD polymorphism in spring wheat cultivars and line with different level of Fusarium resistance”. Theor. Appl. Genet., 106, pp. 1059-1067. V. Subranmanian, S. Gurtu, R. C. N. Rao, S. N. Nigam (2000), Genome, 43, pp. 656 -660. Weir B.S. (1990), Genetic data analysis - Methods for discrete genetic data, Sinauer Associates, Inc., Sunderland. Wilkie S.E., Issac P.G., Slater R.J., (1993), "Random amplification polymorphic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium", Theor. Appl. Genet., 86, pp. 497-504. Williams J. K. G., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A., and Tirgey S. V. (1990), “DNA polymorphicsms amplified by arbitrary primer and useful as genetic markers”. Nucleic Acids Research, 18, pp. 6531 – 6535. Yang X., Quiros C. (1993), "Identification and classification of celery cultivars with RAPD marker", Theor. Appl. Genet., 86, pp. 205-212. Yu K., Pauls K.P. (1993), "Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneuos populations of alfalfa by random applification of bulked genomic DNA sample”, Theor. Appl. Genet., 87, pp. 788-794 Zhang D.P., Ghislain M., Huam¸n Z., Golmirzaie A., Hijmans R. (1998), “RAPD variation in Sweetpotato cultivars from South America and Paua New Guinea”, Renetic Resources and Crop Evolution, 45, pp. 271-277. Zhang J., Stewart J.McD. (2000), “Molecular Biology: Economical and Rapid Method for Extracting Cotton Genomic DNA”, The J. of Cotton Science, 4, pp. 193-201.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • doc14.doc
Luận văn liên quan