Đề tài Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen

MỞ ĐẦU Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thu nhập của người dân ở các nước này. Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quan trọng và hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm [11]. Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và gia súc. Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệu liều vaccine được dùng. Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới). Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có tiềm ẩn bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất [33]. Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải. Theo số lượng thống kê của Viện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phố có 82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế. Nhưng hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine là phương pháp tối ưu nhất. Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổ biến là loại vaccine bất hoạt. Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao, không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh. Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccine hoàn toàn mới. Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơn giản có thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so với vaccine cổ điển. Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng khác nhau như E. coli, nấm men người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế hệ mới. Nhưng đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong các tế bào vi sinh vật lại gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trên các đối tượng cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá ) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì tính hiệu quả của nó. Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đối tượng cây trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất trên tế bào động vật. Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuật đơn giản phù hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển. Hơn thế nữa, vì là vaccine ăn hoặc uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng và bảo quản [1, 13]. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật, nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uống được. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về vaccine. 3 1.1.1. Vaccine và hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm 3 1.1.2. Vaccine tái tổ hợp. 4 1.2. Bệnh dại ( Rabies disease). 5 1.2.1. Gen mã hoá cho kháng nguyên glycoprotein của virus dại 7 1.2.2. Phân tử glycoprotein của virus dại và cơ chế gây miễn dịch . 9 1.3. Vi khuẩn Agrobacterium timefaciens và hiện tượng biến nạp gen vào thực vật. 10 1.4. Giới thiệu chung về vectơ sử dụng trong chuyển gen. 11 1.4.1. Vectơ nhị thể (binary vector). 11 1.4.2. Vectơ pBI121. 12 1.4.3. Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới 155 Chương 2. VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP. 177 2.1.Vật liệu nghiên cứu. 177 2.1.1. Các chủng vi sinh vật và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. 177 2.1.2. Hoá chất, thiết bị 177 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 18 2.2.1. PCR nhân gen đặc hiệu. 19 2.2.2. Phương pháp điện di 20 2.2.3. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 20 2.2.4. Cắt bằng enzym giới hạn. 22 2.2.5. Phản ứng ghép nối 22 2.2.6. Phương pháp tạo tế bào E. coli khả biến. 23 2.2.7. Biến nạp vectơ pBI121 đã gắn gen GlyP vào tế bào khả biến E. coli DH5a theo phương pháp sốc nhiệt 23 2.2.8. Tách plasmid bằng phương pháp Sambrook. 24 2.2.9. Phương pháp tạo tế bào khả biến A. tumefaciens. 25 2.2.10. Biến nạp Ti-plasmid vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện (Electroporation method). 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Chuẩn bị vectơ pBI121 và gen glyP 28 3.1.1. Tách vectơ pBI121 từ chủng E. Coli Top 10. 28 3.1.2. Khuyếch đại gen GlyP bằng kỹ thuật PCR 28 3.2. Thiết kế ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 Mang gen GlyP dưới sự điều khiển của đoạn khởi động 35S và đoạn kết thúc NOS. 30 3.2.1. Cắt enzym hạn chế tạo đầu dính và ghép nối tạo vectơ tái tổ hợp. 30 3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α. 32 3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen GlyP trong các dòng khuẩn lạc bằng kỹ thuật colony-PCR 33 3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen GlyP trong Ti-plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế 36 3.4. Kết quả biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen glyP vào tế bào A. tumefaciens. 36 3.3.1. Biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens. 36 3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của vectơ Ti-plasmid tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR và cắt enzym hạn chế. 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

doc47 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 05/06/2013 | Lượt xem: 1577 | Lượt tải: 4download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Thiết kế Ti-Plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
tÝnh tr¹ng ph¸t sinh khèi u ®­îc gäi lµ Ti-plasmid (Tumor inducing). Cho ®Õn nay tr×nh tù nuclªotit cña Ti-plasmid ®· ®­îc x¸c ®Þnh. Ti plasmid lµ mét ph©n tö ADN vßng t­¬ng ®èi lín gåm 150.000 - 200.000 cÆp nuclªotit. Tuy nhiªn, chØ cã mét ®o¹n gåm 2000 - 3000 cÆp nuclªotit cã kh¶ n¨ng g¾n vµo hÑ gen cña tÕ bµo chñ ®­îc gäi lµ T-ADN. Nh÷ng enzym cã tr¸ch nhiÖm chuyÓn n¹p ®o¹n T-ADN tõ plasmid vµo hÖ gen cña tÕ bµo chñ ®­îc mµ ho¸ bëi c¸c ®o¹n gen vir [17]. Bªn c¹nh nh÷ng gen chøc n¨ng võa kÓ trªn Ti-plasmid cã mang gen tæng hîp indolyl acetic axit, mét lo¹i auxin tù nhiªn, v× thÕ mµ khi nu«i cÊy in vitro nh÷ng tÕ bµo thùc vËt c¶m biÕn cã thÓ sèng trong m«i tr­êng thiÕu auxin vµ cytokinin. Ngoµi ra, Ti-plasmid cßn mang gen tæng hîp nh÷ng axit amin hiÕm, vÝ dô: mét lo¹i u t¹o octopin vµ lo¹i kh¸c t¹o nopalin v× vËy ng­êi ta ph©n biÖt 2 lo¹i plasmid lµ lo¹i nopalin vµ octopin cã trong c¸c chñng a. tumefaciens kh¸c nhau. VÒ tr×nh tù nuclªotit chóng chØ kh¸c nhau ë ®o¹n gen m· ho¸ cho c¸c enzym tham gia vµo qu¸ tr×nh sinh tæng hîp nopalin vµ octopin [1]. HiÖn nay, ng­êi ta ®· thµnh c«ng trong viÖc c¶i biÕn Ti-plasmid b»ng c¸ch c¾t bá hÇu hÕt c¸c ®o¹n gen g©y ph¸t triÓn khèi u chØ ®Ó l¹i ®o¹n gen vir vµ phÇn T-ADN tèi thiÓu mang ®iÓm ghÐp gen. Lo¹i vect¬ nµy ®­îc sö dông rÊt cã hiÖu qu¶ cho viÖc ®­a ADN l¹ vµo tÕ bµo thùc vËt kh«ng nh÷ng ®èi víi lo¹i c©y hai lµ mÇm mµ c¶ ë lóa lµ ®¹i diÖn cña lo¹i c©y mét l¸ mÇm. 1.4. Giíi thiÖu chung vÒ vect¬ sö dông trong chuyÓn gen §Ó cã thÓ chuyÓn gen vµo thùc vËt th«ng qua a. tumefaciens ng­êi ta ph¶i sö dông mét hÖ thèng vect¬ chuyÓn gen. Cã hai lo¹i vect¬ chuyÓn gen ®ã lµ vect¬ liªn hîp vµ vect¬ nhÞ thÓ. 1.4.1. Vect¬ nhÞ thÓ (binary vector) Vect¬ nhÞ thÓ ra ®êi ®· kh¾c phôc ®­îc t×nh tr¹ng khã nh©n b¶n trong a. tumefaciens cña vect¬ liªn hîp. Mét vect¬ nhÞ thÓ bao gåm nh÷ng thµnh phÇn sau: 1) VÞ trÝ ghÐp nèi ®a ®iÓm; 2) §o¹n khëi ®Çu t¸i b¶n ho¹t ®éng c¶ trong E. coli vµ a. tumefaciens, vÝ dô RK2; 3) gen chän läc ho¹t ®éng c¶ ë vi khuÈn vµ thùc vËt nh­ gen kh¸ng kh¸ng sinh, gen b- glucuronidase…; 4) cã kh¶ n¨ng vËn chuyÓn nh­ oriV, oriT, trfA, chØ cÇn khi chuyÓn th«ng qua a. tumefaciens, kh«ng cÇn khi chuyÓn gen trùc tiÕp; 5) §o¹n T-ADN ngo¹i biªn (border), ®Æc biÖt lµ ®o¹n ngo¹i biªn b¾t buéc ph¶i cã. Ngoµi ra cßn cã mét sè thµnh phÇn phô trî kh¸c nh­ gen kÝch thÝch vËn chuyÓn T-ADN (T-DNA transfer stimulator sequence = TSS). HÖ vect¬ nhÞ thÓ ®­îc thiÕt kÕ bao gåm hai plasmid tù t¸i b¶n. Lo¹i vect¬ vËn t¶i mang GOI gi÷a ®o¹n biªn cña T-ADN vµ mét plasmid bæ trî cã gen vir ®¶m nhËn chøc n¨ng vËn chuyÓn gen ngo¹i lai vµo tÕ bµo thùc vËt. Plasmid bæ trî ®­îc c¶i biÕn tõ Ti-plasmid tù nhiªn b»ng c¸ch lo¹i bá gen kÝch thÝch tÕ bµo thùc vËt ph¸t triÓn thµnh khèi u, nh­ng vÉn duy tr× kh¶ n¨ng th©m nhËp vµo tÕ bµo thùc vËt [1]. HÖ thèng vect¬ nhÞ thÓ lu«n ®­îc c¶i tiÕn ®Ó cã thÓ n©ng cao hiÖu suÊt chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciens. Mét trong nh÷ng h­íng c¶i biÕn lµ ®­a vµo vect¬ mét chuçi COS ®Ó ph©n lËp c¸c ®o¹n g¾n lín hoÆc th­ viªn gen thùc vËt, trong ®ã ®iÓn h×nh lµ vect¬ pBI121. 1.4.2. Vect¬ pBI121 C¸c vect¬ chØ thùc hiÖn ®­îc chøc n¨ng cña m×nh khi chóng cã mét sè ®Æc tÝnh nh­: cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp ®éc lËp vµ tÝch cùc trong tÕ bµo vËt chñ; cã kÝch th­íc nhá, dÔ nhËn gen quan t©m, dÔ x©m nhËp vµ ®­îc sao chÐp; mang mét sè dÊu hiÖu chän läc gióp ph©n biÖt c¸c tÕ bµo mang plasmid t¸i tæ hîp víi c¸c tÕ bµo kh«ng cã plasmid t¸i tæ hîp; tån t¹i bÒn v÷ng trong tÕ bµo vËt chñ. C¸c ®Æc tÝnh nµy lµ c¬ së quyÕt ®Þnh c¸c thµnh phÇn chÝnh cña plasmid víi: Gen quan t©m ®­îc g¾n thªm ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc; gen chØ thÞ chän läc; c¸c thµnh phÇn kh¸c nh­ vïng khëi ®Çu sao chÐp vµ vïng tr×nh tù nh©n dßng ®a ®iÓm c¾t (MCS) [5]. Vect¬ pBI121 cã kÝch th­íc kho¶ng 13Kb víi c¸c thµnh phÇn chÝnh nh­ sau: * §o¹n khëi ®éng gen (promoter) C¸c gen ngo¹i lai cã thÓ ®­îc biÓu hiÖn thµnh protein cÇn ph¶i cã mÆt c¸c tÝn hiÖu ®iÒu khiÓn thÝch hîp ë nh÷ng vÞ trÝ thÝch hîp. Nh÷ng tÝn hiÖu kh«ng thÓ thiÕu trong qu¸ tr×nh ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen bao gåm ®o¹n khëi ®éng gen vµ ®o¹n kÕt thóc gen. §o¹n khëi ®éng bao gåm tr×nh tù nuclªotit phÝa ®Çu 5’ cña c¸c gen cÊu tróc. Nã ®ãng vai trß ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh phiªn m· nhê kh¶ n¨ng ®¶m b¶o c¸c vÞ trÝ nhËn biÕt cho enzym ARN polymeraza, cho c¸c yÕu tè ho¹t ho¸ vµ khëi ®éng. Cho ®Õn nay mét sè promoter ®­îc sö dông trong chuyÓn gen nh­: Chuçi khëi ®éng x©y dùng, chuçi khëi ®éng c¶m øng, chuçi khëi ®éng trong c¸c m« ®Æc thï. Promoter 35S lµ mét d¹ng chuçi khëi ®éng x©y dùng ®­îc t¸ch tõ virus kh¶m sóp l¬ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter CaMV35S-P), lo¹i promoter nos [7]. Trong c¸c nghiªn cøu chuyÓn gen thùc vËt, CaMV35S-P ®­îc sö dông réng r·i nhê kh¶ n¨ng ho¹t ®éng m¹nh ë nhiÒu lo¹i m« cña c©y hai l¸ mÇm, tuy nhiªn nã l¹i Ýt ho¹t ®éng ë c©y mét lµ mÇm. §Ó kh¾c phôc nh­îc ®iÓm nµy, CaMV35S-P ®­îc sö dông kÕt hîp víi c¸c thµnh phÇn khëi ®éng kh¸c, ch¼ng h¹n vect¬ pEmu chøa nhiÒu b¶n sao cña c¸c tiÓu phÇn ph¶n øng kÞ khÝ cña gen Adh1 tõ ng« vµ c¸c tiÓu phÇn cña gen tæng hîp octopin tõ A. tumefaciens ®· lµm gia t¨ng sù biÓu hiÖn cña gen trong c©y mét lµ mÇm lªn hµng chôc lÇn [12]. Promoter 35S dµi 350bp, gåm 3 thµnh phÇn: - Hép TATA ( ë vÞ trÝ tõ- 46 ®Õn + 8). - Vïng t¨ng c­êng A (enhancer) tõ vÞ trÝ - 90 ®Õn - 46, lµm t¨ng biÓu hiÖn gen ngo¹i lai ë rÔ. -Vïng t¨ng c­êng B (enhancer) tõ vÞ trÝ -343 ®Õn -90, lµm t¨ng biÓu hiÖn gen chuyÓn ë l¸. Trong vïng B gåm 5 phÇn nhá tõ B1 - B5 ph©n chia theo møc ®é ph¶n øng cña mçi vïng ®èi víi c¸c yÕu tè dÞch m· kh¸c nhau [17]. NÕu x¶y ra sù thay ®æi trong vïng t¨ng c­êng tõ vÞ trÝ -207 ®Õn -56 cã thÓ dÉn ®Õn mÊt kh¶ n¨ng g©y nhiÔm cña virus. Lîi dông tÝnh chÊt nµy, cã thÓ g¾n gen ngo¹i l¹i vµo vïng enhancer sÏ lµm mÊt kh¶ n¨ng g©y nhiÔm cña virus kh¶m sóp l¬ [17]. *§o¹n kÕt thóc. C¸c ®o¹n kÕt thóc th­êng chøa ®u«i polyA nh­ AATTAA, hoÆc AACCAA gióp b¶o vÖ c¸c ph©n tö ARN th«ng tin ®­îc bÒn v÷ng h¬n vµ tr¸nh ®­îc sù ph©n huû. Hai ®o¹n kÕt thóc ®­îc sö dông nhiÒu trong c«ng nghÖ gen thùc vËt lµ ®o¹n kÕt thóc cña CaMV35S (cã mÆt trong 7 s¶n phÈm chuyÓn gen hiÖn nay) vµ ®o¹n kÕt thóc NOS cã mÆt trong Ýt nhÊt 16 - 28 s¶n phÈm) [7]. *Gen chØ thÞ C¸c chØ thÞ chän läc di truyÒn sö dông trong biÕn n¹p thùc vËt th­êng cã nguån gèc tõ vi khuÈn hoÆc thùc vËt, gåm 2 lo¹i chÝnh: - ChØ thÞ chän läc (selectable marker): kÕt cÊu gen mang ®o¹n khëi ®éng NOS (nopaline synthase promoter-terminater) ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen kh¸ng npt2 (neomycin phospho transferase gene), chØ cã nh÷ng thÓ biÕn n¹p sèng ®­îc trªn m«i tr­êng cã kh¸ng sinh kanamycin. ViÖc sö dông gen chØ thÞ cÇn ®¹t mét sè yªu cÇu sau: chÊt chän läc øc chÕ sinh tr­ëng c¸c tÕ bµo kh«ng ®­îc biÕn n¹p, sù thÓ hiÖn cña gen chän läc kh«ng lµm ¶nh h­ëng tíi trao ®æi chÊt cña c¸c tÕ bµo chuyÓn n¹p, sù biÓu hiÖn cña gen chän läc b¶o vÖ tÕ bµo khái t¸c dông cña chÊt chän läc, kh«ng ¶nh h­ëng tíi c©y chuyÓn gen [4]. - ChØ thÞ sµng läc (screenable marker) kh«ng chØ gióp nhËn biÕt c¸c thÓ biÕn n¹p mµ cßn dù ®o¸n ®­îc møc ®é biÓu hiÖn gen quan t©m trong m« thùc vËt ®­îc chuyÓn gen. Ch¼ng h¹n, chØ thÞ b-glucuronidaza (GUS) cho phÐp sµng läc ho¹t tÝnh cña enzym dÔ dµng trªn c¬ së kÜ thuËt nhuém ho¸ tÕ bµo. Gen chØ thÞ sµng läc cÇn cã mét sè ®Æc ®iÓm sau: s¶n phÈm cña nã lµ ®éc nhÊt vµ kh«ng ®éc ®èi víi tÕ bµo thùc vËt, c¸c enzym chØ thÞ ph¶i cã kh¶ n¨ng dÞch m· æn ®Þnh cao, ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch thuËn tiÖn, rÎ tiÒn, ®é nh¹y cao vµ cã kh¶ n¨ng ph¶n øng víi c¸c polypeptit ngoµi mµ kh«ng ¶nh h­ëng ho¹t tÝnh enzym [7] . * Vïng khëi ®éng sao chÐp vµ MCS - Vïng pUC ori: vïng khëi ®éng sao chÐp trong E. coli, cã nguån gèc tõ vect¬ pUC9. - RK 2 ori V: vïng khëi ®éng sao chÐp trong A. tumefaciens, cã nguån gèc tõ plasmid RK2. - Vïng MCS cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña rÊt nhiÒu lo¹i enzym nh­ HindIII, SphI, PstI, EcoRV…Trong ®ã chóng ta quan t©m ®Õn hai lo¹i enzym lµ BamHI vµ SacI, tr×nh tù ®iÓm c¾t cña chóng ë hai ®Çu cña gen GUS. V× vËy khi c¾t pBI121 b»ng hai lo¹i enzym trªn sau ®ã ®iÖn di chóng ta sÏ thu ®­îc hai b¨ng t­¬ng øng víi kÝch th­íc kho¶ng 11,2Kb (vect¬) vµ 1,8Kb (gen gus). NÕu g¾n vµo ®o¹n gen ngo¹i lai mµ ta mong muèn th× gen GUS kh«ng ®­îc biÓu hiÖn. §iÒu nµy rÊt cã ý nghÜa trong viÖc chän läc thÓ biÕn n¹p [5]. Trong t­¬ng lai, viÖc tèi ­u ho¸ hÖ thèng chñ/vect¬ vµ c¶i tiÕn c¸c vect¬ trªn c¬ së nghiªn cøu tØ mØ c¸c yÕu tè tham gia vµo qu¸ tr×nh chuyÓn n¹p æn ®Þnh, c¸c yÕu tè ®­a gen chuyÓn n¹p vµo vÞ trÝ nhÊt ®Þnh trong genome thùc vËt vµ c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy t¸i sinh c©y chuyÓn gen vÉn lµ nh÷ng vÊn ®Ò cÇn thiÕt trong nghiªn cøu chuyÓn gen ë thùc vËt. H×nh 4. S¬ ®å cÊu tróc vect¬ pBI121 1.4.3. T×nh h×nh nghiªn cøu vaccine thùc vËt trªn thÕ giíi Cho dï hiÖn nay phÇn lín thuèc ch÷a bÖnh ®­îc tæng hîp b»ng ph­¬ng ph¸p ho¸ häc, tuy nhiªn 1/3 tæng sè thuèc trªn thÞ tr­êng ®Òu cã nguån gèc tõ thùc vËt. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña c«ng nghÖ gen, thùc vËt l¹i ®­îc biÕt ®Õn víi mét vai trß lµ mét nguån nguyªn liÖu míi trong viÖc s¶n xuÊt thuèc phßng bÖnh. Thùc vËt chuyÓn gen s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn phßng bÖnh dÞch t¶, bÖnh viªm gan B vµ bÖnh d¹i ®ang ®­îc ph¸t triÓn ë rÊt nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn toµn thÕ giíi (Boyce Thompson Plant Research institute, Thomas Jeferson institute, North Carolina State University…) [27]. Vaccine ¨n ®­îc (edible vaccine) s¶n xuÊt ë trong thùc vËt ( Dr. Charles Arntzen, Boyce Thompson institute for Plant Research, USA) ®· xo¸ bá nh÷ng rµo c¶n trong viÖc s¶n xuÊt vaccine b»ng ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy tÕ bµo. §Æc biÖt ®èi víi c¸c n­íc ®ang ph¸t triÓn, nh÷ng rµo c¶n nµy trë nªn khã kh¨n h¬n rÊt nhiÒu, chóng bao gåm: nh÷ng yÕu tè cÇn thiÕt cho c«ng nghÖ lªn men, quy tr×nh tinh s¹ch nghiªm ngÆt, ®ßi hái b¶o qu¶n ë nhiÖt ®é thÊp trong suèt qu¶ tr×nh vËn chuyÓn, gi¸ thµnh cao… ViÖc s¶n xuÊt vaccine b»ng thùc vËt c¶i biÕn di truyÒn cã thÓ cung cÊp s¶n phÈm víi gi¸ rÎ hiÖn ®ang ®­îc thùc hiÖn víi c¸c bÖnh d¹i, bÖnh dÞch t¶, bÖnh viªm gan B, bÖnh sèt rÐt, bÖnh AIDS… vµ chØ ®¬n thuÇn, khi ¨n c¸c lo¹i thùc vËt nµy, c¬ thÓ cña chóng ta sÏ sinh kh¸ng thÓ chèng l¹i bÖnh tËt [27]. Dr. arntzen cïng c¸c céng sù ®· thµnh c«ng trong viÖc t¹o ra c©y thuèc l¸ s¶n xuÊt vaccine phßng bÖnh viªm gan B vµ chøng minh ®­îc r»ng vaccine ®­îc s¶n xuÊt trong thùc vËt cã cÊu tróc vµ chøc n¨ng t­¬ng tù nh­ nh÷ng vaccine ®­îc s¶n xuÊt tõ huyÕt thanh ng­êi hoÆc tõ tÕ bµo nÊm men. Chóng còng g©y ®¸p øng miÔn dÞch rÊt m¹nh khi ®­îc tiªm vµo chuét. Khandelwal vµ céng sù còng c«ng bè ®· thµnh c«ng trong viÖc chuyÓn gen m· ho¸ cho protein ng­ng kÕt tè hång cÇu cña virus dÞch h¹ch ë bß vµo c©y l¹c, c©y thuèc l¸ [23, 24]. Mét lo¹i vaccine kh¸c còng ®­îc t¹o thµnh theo c¸ch nµy, ®ã lµ vaccine phßng bÖnh tiªu ch¶y. Dr. arntzen cïng c¸c céng sù còng ®· t¹o ra ®­îc c©y thuèc l¸ vµ c©y khoai t©y chuyÓn gen cã chøa mét l­îng lín c¸c chÊt kh¸ng nguyªn ho¹t ®éng lµ c¸c ®éc tè trong ruét kh«ng bÒn víi nhiÖt cña E. coli (E. coli heat labile enterotoxin = LT-B). §éc tè nµy cã cÊu tróc t­¬ng tù nh­ ®éc tè cña virus t¶. Nh÷ng con chuét ®­îc ¨n c¸c lo¹i thùc vËt nµy ®· béc lé ph¶n øng miÔn dÞch rÊt m¹nh. C¸c cuéc thö nghiÖm biÓu hiÖn l©m sµng trªn nh÷ng ng­êi t×nh nguyÖn b»ng viÖc sö dông khoai t©y t­¬i chøa vaccine phßng bÖnh tiªu ch¶y sÏ sím kiÓm chøng hiÖu qu¶ cña vaccine cã nguån gèc tõ thùc vËt [27]. Nh÷ng nhµ nghiªn cøu ë tr­êng ®¹i häc Thomas Jefferson bang Philadelphia, USA ®· t¹o ra c©y cµ chua cã biÓu hiÖn kh¸ng nguyªn cña virus d¹i. Dr. Karaser vµ c¸c céng sù t¹i phßng thÝ nghiÖm Biotechnology Foundation cña Thomas Jefferson University còng ®· biÓu hiÖn ®­îc vaccine d¹i trong c©y rau bina (spinach). Dr. Karaser th«ng b¸o r»ng, ®Ò tµi nghiªn cøu nµy ®· ®­îc kiÓm chøng b»ng mét cuéc thö nghiÖm gåm 16 ng­êi chia thµnh hai nhãm: mét nhãm ®èi chøng vµ mét nhãm thÝ nghiÖm. Nhãm thÝ nghiÖm ®­îc ¨n kho¶ng 150g l¸ rau bina. KÕt qu¶ khi kiÓm tra th× nh÷ng ng­êi nµy cã sè l­îng kh¸ng thÓ t¨ng h¬n so víi nhãm cßn l¹i. Vaccine d¹i tõ thùc vËt sÏ ®­îc ph¸t triÓn mét c¸ch ®Çy ®ñ trong vßng tõ 2 - 4 n¨m tiÕp theo [13]. XuÊt ph¸t tõ nhu cÇu vÒ vaccine ë n­íc ta hiÖn nay, ®ång thêi ®Ó nhanh chãng n¾m b¾t vµ tiÕp cËn víi c«ng nghÖ míi trong viÖc s¶n xuÊt vaccine vµ c¸c d­îc chÊt ch÷a bÖnh cho ng­êi, ®éng vËt trªn ®èi t­îng c©y trång. Phßng c«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt thuéc ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc ®ang thùc hiÖn mét sè ®Ò ¸n chuyÓn gen m· ho¸ cho kh¸ng nguyªn cña mét sè virus nh­ virus d¹i vµ virus viªm n·o NhËt B¶n vµo c©y trång. Ch­¬ng 2. VËt liÖu v µ ph­¬ng ph¸p 2.1.VËt liÖu nghiªn cøu 2.1.1. C¸c chñng vi sinh vËt vµ cÆp måi sö dông trong nghiªn cøu - Vi khuÈn A. tumefaciens chñng Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101 vµ vi khuÈn E.coli chñng DH5a cña h·ng Gibco BRL, life Technologies, Mü. - Chñng E. Coli Top 10 mang vect¬ pBI121. - CÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI h·ng invitrogen tæng hîp. - Plasmid (vect¬ pCRâ2.1+ gen GlyP) mang toµn bé gen m· hãa cho ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i chñng Vnucovo-32. C¸c vËt liÖu trªn ®­îc ViÖn C«ng nghÖ sinh häc cung cÊp. 2.1.2. Ho¸ chÊt, thiÕt bÞ * Hãa chÊt Ho¸ chÊt dïng trong nghiªn cøu lµ cña h·ng: Invitrogen, Amersham Parmacia Biotech, New England Biolabs… Bao gåm mét sè ho¸ chÊt sau: - Bé hãa chÊt sö dông cho ph¶n øng PCR cña h·ng Applied Biosystem (Mü) - Bé kÝt th«i gel cña h·ng QIAGEN ( QIAquick Gel Extraction Kit) - Bé kit tinh s¹ch ADN cña h·ng QIAGEN (QIAquick DNA Purification Kit) - Thang ADN 1Kb cña h·ng MBI Fermantas, hai enzym BamHIvµ SacI, dung dÞch ®Öm, BSA - Dung dÞch ®Öm 10X, rATP, T4 ligase - Pepton 10g/l, trypton 10g/l, Yeast extract - NaCl, MgSO4.7H2O, 1mM HEPES - Agarose, sucrose, 50mM glucose - Glycerol , 0,1 M CaCl2, 5M acetat potassium, acetic acid, NaOH, SDS 1% - C¸c lo¹i kh¸ng sinh kanamycin, ampecilin vµ rifamycin - Cån 70%, dung dÞch chloroform : isopropanol (24 : 1), n­íc khö ion, RNase - 25mM Tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH 8 (Ethylene Diamine tetraacetic) * ThiÕt bÞ - M¸y PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mü), m¸y ®iÖn di Powerpac300 (Bio-Rad, Mü), m¸y soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mü), m¸y chôp ¶nh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuþ §iÓn), m¸y Vortex (Mimishaker, IKA, §øc), m¸y hót ch©n kh«ng Speed-Vac 110A (Savant, Mü), m¸y ly t©m, m¸y xung ®iÖn Gene Plulser, cïng víi c¸c trang thiÕt bÞ kh¸c cña Phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. S¶n phÈm PCR-GlyP gus NOST GlyP Sac BamH I I Bam HI & Sac I BamHI SacI T4 - ligase 35S gus NOST 35S GlyP NOST BamHI SacI 35S pBI121 ... … pBI121 pBI121 ... … pBI121 pBI121 ... … pBI121 2.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu H×nh 5. S¬ ®å thiÕt kÕ Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP 2.2.1. PCR nh©n gen ®Æc hiÖu PCR viÕt t¾t tõ ch÷ Polymerase Chain Reaction lµ ph­¬ng ph¸p nh©n nhanh mét ®o¹n ADN mong muèn trong èng nghiÖm. Theo lý thuyÕt sÏ cã 3 ®o¹n ADN ®ã lµ: ®o¹n ADN khu«n cÇn nh©n b¶n, måi xu«i vµ måi ng­îc. Thªm vµo ®ã lµ c¸c thµnh phÇn: Taq polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP vµ GTP) vµ mét dung dÞch muèi MgCl2. Mét ph¶n øng PCR ®­îc thùc hiÖn nh­ sau: Bæ sung lÇn l­ît nh÷ng chÊt sau ®©y vµo èng PCR 0,5 ml B¶ng 1. Thµnh phÇn cña ph¶n øng PCR Thµnh phÇn ThÓ tÝch N­íc cÊt 14,7ml Dung dÞch ®Öm PCR 10X 2,5ml MgCl225mM 2,5ml dNTPs 2,0ml Måi RabG-start-BamHI 1,0ml Måi RabG-stop-SacI 1,0ml ADN khu«n 1,0ml Taq polymerase 0,2ml Tæng thÓ tÝch 25ml Thùc hiÖn ph¶n øng PCR theo chu kú nhiÖt nh­ sau: - B­íc 1 biÕn tÝnh: 940C, 2 phót - B­íc 2 biÕn tÝnh: 930C, 30 gi©y - B­íc 3 g¾n måi: 600C, 30 gi©y - B­íc 4 kÐo dµi chuçi: 720C, 1phót 30 gi©y - B­íc 5 hoµn thiÖn viÖc kÐo dµi: 720C, 10 phót - B­íc 6: 40C, l­u gi÷ Tõ b­íc 2 ®Õn b­íc 4 lÆp l¹i 32 chu kú. 2.2.2. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di §iÖn di trªn gel agarose 0,8% dïng ®Ó ph©n t¸ch axÝt nucleic cã kÝch th­íc lín (tõ 0,2 - 70Kb). Khi n»m trong ®iÖn tr­êng ADN sÏ ®i tõ cùc ©m sang cùc d­¬ng, träng l­îng ph©n tö ADN nµo nhÑ nhÊt sÏ ®i xuèng tr­íc, nÆng di chuyÓn chËm sÏ ®i xuèng sau t¹o thµnh mét d·y ADN cã kÝch th­íc kh¸c nhau. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông gel agarose 0,8% ®Ó t¸ch nh÷ng axÝt nucleic cã khèi l­îng tõ 0,4 - 20Kb. 1. ChuÈn bÞ gel agarose 0,8% C©n 0,8g agarose cho vµo 100ml dung dÞch ®Öm TAE 1X (Tris-base, glacial acetic acid, EDTA), ®un cho agarose tan hoµn toµn, ®Ó nguéi xuèng kho¶ng 50 - 60oC, ®æ dung dÞch agarose vµo khay ®iÖn di cã cµi s½n r¨ng l­îc. Sau 30 - 60 phót, khi gel ®· ®«ng cøng, ®Æt vµo bÓ ®iÖn di, ®æ ®Öm TAE 1X ngËp c¸ch mÆt gel 1 - 2mm, gì l­îc ra. 2. ChuÈn bÞ mÉu MÉu ADN ®­îc trén víi 3ml ®Öm tra mÉu (loading buffer - 0,1ml bromophenol blue 10%; 0,3ml glycerol 100% vµ dÉn b»ng n­íc ®Õn 1ml) vµ ®­îc tra vµo c¸c giÕng nhá trªn gel, giÕng ®Çu tiªn th­êng dïng ®Ó tra thang ADN chuÈn, ch¹y ®iÖn di víi hiÖu ®iÖn thÕ 100V trong thêi gian 30 phót. 3. Nhuém mÉu vµ soi gel §Ó quan s¸t ®­îc ADN d­íi ¸nh s¸ng tö ngo¹i ng­êi ta ph¶i tiÕn hµnh nhuém mÉu trong dung dÞch ethidium bromide nång ®é 0,5mg/ml trong 30 - 40 phót, l¾c nhÑ, sau ®ã röa b»ng n­íc cÊt vµ ®em soi d­íi tia tö ngo¹i 234nm trªn m¸y soi ADN vµ chôp ¶nh. 2.2.3. Th«i gel vµ tinh s¹ch s¶n phÈm PCR 2.2.3.1. Ph­¬ng ph¸p th«i gel Sau khi nh©n b¶n b»ng kü thuËt PCR hoÆc c¾t enzym giíi h¹n muèn cã ®­îc ®­îc ®o¹n gen cã kÝch th­íc mong muèn, tinh s¹ch th× ph¶i tiÕn hµnh th«i gel theo quy tr×nh sau: - §iÖn di s¶n phÈm PCR hoÆc s¶n phÈm c¾t enzym, mçi mét mÉu th× ®iÖn di thµnh hai giÕng, mét giÕng ®èi chøng ®iÖn di víi 5ml mÉu, sau khi ®iÖn di xong chØ c¾t, nhuém vµ soi gel ë giÕng ®èi chøng, sau ®ã ®¸nh dÊu vµo kÝch th­íc cÇn t×m, ghÐp hai mÉu gel l¹i vµ c¾t lÊy ®o¹n gel mang gen cÇn quan t©m ë giÕng cßn l¹i. - C©n gel theo quy ­íc 1mg gel t­¬ng ®­¬ng 1ml - Bæ sung dung dÞch QG theo tØ lÖ: V mÉu : VQG = 1 : 3 (ml) - ñ ë 50oC trong 15 phót, 3 phót trén nhÑ mét lÇn, sau khi gel tan hÕt ñ thªm 5 phót cho gel tan hoµn toµn - ChuyÓn hçn hîp dung dÞch lªn cét th«i gel, ly t©m cùc ®¹i trong 1 phót - Lo¹i bá dÞch ch¶y qua cét - Bæ sung 500ml QG, ly t©m 1 phót - Thªm 750ml ®Öm PE vµo cét, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong 5 phót - Ly t©m cùc ®¹i 13000 vßng/phót, ®æ dÞch ch¶y qua cét, ly t©m bæ sung 1 phót ®Ó lo¹i bá hÕt ®Öm PE - ChuyÓn sang èng eppendorf 1,5ml míi - Hoµ tan ADN trong 30 - 50ml n­íc cÊt khö trïng hoÆc dung dÞch EB, ®· ®­îc lµm Êm ®Õn 500C, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng trong vßng 1 phót, sau ®ã ly t©m cùc ®¹i 13000 vßng/phót trong 1 phót. 2.2.3.2. Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR nh»m lo¹i bá c¸c thµnh phÇn trong ph¶n øng cßn d­ thõa (Taq polymerase, c¸c ion…). *C¸c b­íc tiÕn hµnh - Bæ sung dung dÞch PB theo tû lÖ: VmÉu : VPB= 1 : 5, trén nhÑ - Cho hçn hîp dung dÞch vµo cét tinh s¹ch, ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót - Bæ sung 0,75ml dung dÞch NW vµo cét tinh s¹ch, ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót. - Lo¹i bá dÞch næi ch¶y qua cét, ly t©m bæ sung 1 phót, ®Ó lo¹i s¹ch NW. - Cho cét tinh s¹ch vµo èng eppendorf 1,5ml. - Bæ sung thÓ tÝch EB t­¬ng ®­¬ng thÓ tÝch mÉu, ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 1 - 2 phót. Ly t©m 13000 vßng/phót, trong 1 phót. 2.2.4. C¾t b»ng enzym giíi h¹n V× trong måi RabG-start-BamHI cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña enzym BamHI vµ RabG-stop-SacI cã chøa tr×nh tù ®iÓm c¾t cña SacI. V× vËy, chóng t«i dïng hai enzym nµy ®Ó c¾t s¶n phÈm PCR vµ vect¬ pBI121. B¶ng 2. Thµnh phÇn ph¶n øng c¾t b»ng enzym Thµnh phÇn ThÓ tÝch S¶n phÈm PCR hoÆc vect¬ pBI121 25ml Dung dÞch ®Öm 3ml Enzym BamHI 1ml Enzym SacI 1ml BSA 1ml Tæng thÓ tÝch V= 30ml Bæ sung lÇn l­ît theo thµnh phÇn trªn vµo èng eppendorf 1,5ml, ñ ë 37oC 5 giê. 2.2.5. Ph¶n øng ghÐp nèi S¶n phÈm PCR vµ vect¬ pBI121 sau khi ®­îc xö lý b»ng enzym giíi h¹n sÏ t¹o ra nh÷ng ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ph©n tö ADN. Khi ta trén lÉn chóng víi nhau d­íi sù xóc t¸c cña enzym T4 ligase, c¸c ®Çu dÝnh nµy sÏ ghÐp cÆp bæ sung víi nhau. V× vËy, s¶n phÈm PCR ®· qua xö lý enzym sÏ ®­îc g¾n vµo vect¬ pBI121. B¶ng 3. Thµnh phÇn ph¶n øng ghÐp nèi Thµnh phÇn ThÓ tÝch ADN tõ s¶n phÈm PCR ®· xö lý enzym 2,0ml Dung dÞch ®Öm 10X 1,5ml pBI121 ®· xö lý enzym 10ml rATP 0,5ml T4 ligase 1,0ml Tæng thÓ tÝch V = 15ml Hçn hîp ph¶n øng ®­îc ñ ë 4oC qua ®ªm. 2.2.6. Ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo E. coli kh¶ biÕn B¶ng 4. Thµnh phÇn m«i tr­êng LB Thµnh phÇn Hµm l­îng (g/l) bacto peptone 10g/l yeast extract 5g/l NaCl 10g/l C¸ch pha: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, sau ®ã bæ sung n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy ®Òu, chØnh pH 7,0. NÕu lµ LB ®Æc th× bæ sung 16g/l bacto agar. Sau ®ã ®em ®i khö trïng ë 117oC trong 25 phót. * Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh 1. §æ ®Üa th¹ch, mçi mét ®Üa kho¶ng 25ml LB ®Æc 2. Chñng vi khuÈn E. coli DH5a ®­îc cÊy tr¶i trªn m«i tr­êng LB ®Æc vµ nu«i qua ®ªm ë 370C. 3. CÊy mét khuÈn l¹c vµo trong 2ml m«i tr­êng LB láng, l¾c qua ®ªm ë 370C, 200 vßng/phót 4. ChuyÓn 0,5ml dÞch nu«i trªn sang 50ml m«i tr­êng LB láng, l¾c trong 3 giê, ®o OD600nm ®¹t 0,6 - 0,8 th× chuyÓn dÞch nu«i cÊy sang èng ly t©m 50ml ®Ó ë trong ®¸. 5. Ly t©m thu khuÈn ë tèc ®é 4000 vßng/phót, 00C, trong 10 phót, thu cÆn tÕ bµo 6. Hoµ tan tÕ bµo nhÑ nhµng trong 20 - 30ml 0,1M CaCl2, gi÷ trong ®¸ 45 phót, ly t©m 4000 vßng/phót, 00C, trong 10 phót, thu cÆn vµ hoµ tan trong 1,5ml 0,1M CaCl2 vµ 0,5ml glycerol. 7. Chia 50ml dÞch khuÈn vµo mçi èng eppendorf 1,5ml, lµm ®«ng l¹nh nhanh b»ng nit¬ láng vµ gi÷ chñng ë -85oC. 8. CÊy tr¶i trªn m«i tr­êng cã vµ kh«ng cã kh¸ng sinh ®Ó kiÓm tra. 2.2.7. BiÕn n¹p vect¬ pBI121 ®· g¾n gen GlyP vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a theo ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt * Ph­¬ng ph¸p tiÕn hµnh - Bæ sung 5ml vect¬ (s¶n phÈm ghÐp nèi) vµo 50ml tÕ bµo kh¶ biÕn vµ trén nhÑ. Hçn hîp ®­îc ®Æt trong ®¸ 30 phót. Sau ®ã ñ ë 420C chÝnh x¸c 1,5 phót vµ ®Æt ngay vµo ®¸ 5 phót. Bæ sung 450ml m«i tr­êng LB láng, hçn hîp ®­îc ñ ë 37oC, l¾c 200 vßng/ phót trong 1 giê - Sö dông que cÊy tr¶i, tr¶i tö 50 - 100ml dÞch vi khuÈn lªn ®Üa m«i tr­êng LB ®Æc cã chøa 50mg/l kanamycin - ñ ®Üa ë 370C trong 16 giê. 2.2.8. T¸ch plasmid b»ng ph­¬ng ph¸p Sambrook B¶ng 5. Thµnh phÇn Sol STT Thµnh phÇn Sol I 50mM glucose, 25mM tris HCl pH 8, 10mM EDTA pH8 Sol II 0,2 NaOH, SDS 1% Sol III 60ml acetat potassium 5M, 11,5ml acid acetic, 28,5ml H2O Chó ý: Sol I ph¶i khö trïng ë 1170C vµ gi÷ ë – 40C SDS ( Sodium dodecyl sulfate) pha míi tr­íc khi dïng * C¸c b­íc tiÕn hµnh - LÊy 2ml dung dÞch vi khuÈn nu«i trong LB láng 12 giê. - Ly t©m 13000 vßng/phót thu tÕ bµo - Bæ sung 150ml Sol I hoµ tan tÕ bµo hoµn toµn - Bæ sung 150ml Sol II trén nhÑ trong 30 gi©y - Bæ sung tiÕp 150ml Sol III trén nhÑ trong 30 gi©y - Bæ sung 450ml chloroform : isopropanol (24 : 1) trén ®Òu trong 3 phót - Ly t©m 13.000 vßng/ phót, hót nhÑ nhµng kh«ng cÆn 400ml pha trªn sang èng eppendorf míi - Cho 800ml cån tuyÖt ®èi ®Ó ë nhiÖt ®é phßng 5 - 10 phót, ly t©m 10.000 vßng/ phót, lo¹i bá pha trªn. - Cho 500ml cån 80% vµo, ly t©m 2 phót, sau ®ã lo¹i bá cån vµ lµm ®«ng kh« trong 5 phót. - Hoµ tan s¶n phÈm trong 50ml n­íc khö ion - Bæ sung RNase - ñ ë 370C trong 10 phót - KiÓm tra ®é tinh s¹ch b»ng c¸ch lÊy 5ml ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% 2.2.9. Ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens B¶ng 6. Thµnh phÇn cña m«i tr­êng YEP Thµnh phÇn Hµm l­îng( g/l) peptone 10g/l sucrose 1g/l yeast extract 5g/l MgSO4.7 H2O 0,5g/l C¸ch pha: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, sau ®ã bæ sung n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy ®Òu cho tan hÕt, sau ®ã chØnh ®Õn pH 7,0. NÕu lµ m«i tr­êng ®Æc th× cã bæ sung thªm 16g/l bacto agar. Khö trïng m«i tr­êng ë 1170C trong 25 phót. * C¸c b­íc tiÕn hµnh - Lµm míi gièng trªn m«i tr­êng YEP ®Æc 3 chñng A. tumefaciens Cv58C1, pGV 2206 vµ pGV3101. - Nu«i cÊy l¾c vi khuÈn trong 2ml m«i tr­êng YEP láng ë 28oC trong 6 giê. - LÊy 100ml dung dÞch vi khuÈn nu«i cÊy tiÕp ë 280C qua ®ªm trong 100ml YEP láng ®Õn khi OD660nm= 1 - 1,5. - Lµm l¹nh mÉu trong ®¸ 15 phót, ly t©m 5.000 vßng/phót trong 20 phót ®Ó thu cÆn tÕ bµo. - Röa cÆn hai lÇn trong 10ml 1mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0. - CÆn tÕ bµo hoµ tan trong 500-700ml 10% glycerol. - Chia 45ml dÞch tÕ bµo vµo mçi èng eppendorf, lµm l¹nh trong nit¬ láng vµ gi÷ chñng ë -85%. 2.2.10. BiÕn n¹p Ti-plasmid vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn (Electroporation method) BiÕn n¹p vµo 3 chñng tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens lµ Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101. B¶ng 7. Thµnh phÇn cña m«i tr­êng SOC Thµnh phÇn Hµm l­îng (1lÝt) yeast extract 5g/l trypton 20g/l NaCl 10mM KCl 2,5mM MgSO4 10mM MgCl2 10mM glucose 20mM C¸ch lµm: C©n lÇn l­ît c¸c thµnh phÇn trªn, thªm n­íc cÊt ®Õn thÓ tÝch ®Þnh møc, dïng m¸y khuÊy tõ khuÊy tan hÕt c¸c chÊt vµ khö trïng ë 1170C. * C¸c b­íc tiÕn hµnh - Lµm tan tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens trong ®¸ 30 phót. - Thªm 5ml ADN plasmid t¸i tæ hîp vµo mçi èng eppendorf chøa tÕ bµo kh¶ biÕn, trén ®Òu vµ ®Æt trong ®¸ 15 phót. - Dïng pipet chuyÓn dung dÞch sang cuvet dïng trong xung ®iÖn ®· ®­îc lµm l¹nh tõ tr­íc. - B¾n xung ®iÖn ë 25mF, 400W, 2,5kV. - Bæ sung ngay 1ml m«i tr­êng SOC vµo cuvet vµ chuyÓn sang èng eppendorf l¾c ë 28oC tõ 1 - 1,5 giê. - CÊy tr¶i 50ml trªn m«i tr­êng chän läc YEP ®Æc cã bæ sung thªm rifamycin 100mg/l, ampicilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l. - Chän mét sè khuÈn l¹c mäc trªn m«i tr­êng nµy ®Ó tiÕn hµnh kiÓm tra khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh cã chøa gen GlyP b»ng c¸c c¸ch: + Colony-PCR: Ph­¬ng ph¸p nµy còng t­¬ng tù nh­ ph¶n øng PCR nh­ng thay c¸c mÉu ADN hoÆc plasmid b»ng c¸c tÕ bµo vi khuÈn ®­îc lÊy trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c. + T¸ch plasmid vµ PCR kiÓm tra víi hai cÆp måi pUC18-F1/R1 vµ RabG-start-BamHI/RabG-stop-SacI + C¾t b»ng enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. ChuÈn bÞ vect¬ pBI121 vµ gen glyP 3.1.1. T¸ch vect¬ pBI121 tõ chñng E. Coli Top 10 HÖ thèng chuyÓn gen vµo thùc vËt th«ng qua Agrobacterium tumefaciens ®ßi hái ph¶i cã mét vect¬ chuyÓn gen thÝch hîp. Vect¬ chuyÓn gen ®­îc sö dông trong thÝ nghiÖm nµy lµ mét lo¹i vect¬ nhÞ thÓ cã nguån gèc tõ Ti-plasmid cña vi khuÈn Agrobacterium §Ó g¾n ®­îc g¾n gen quan t©m vµo hÖ gen cña thùc vËt th× gen ®ã ph¶i n»m trong vïng T-AND ®­îc h¹n chÕ bëi c¸c ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i ®­îc gäi lµ ®o¹n ®Çu biªn ( left border and right border) trªn plssmid. H¬n n÷a, muèn biÓu hiÖn ®­îc trong tÕ bµo thùc vËt th× ®o¹n gen ph¶i n»m trong kÕt cÊu hoµn chØnh víi ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc. Vect¬ pBI121 ®­îc thiÕt kÕ víi promoter 35S ho¹t ®éng rÊt m¹nh ë c©y hai l¸ nÇm vµ ®o¹n kÕt thóc NOS. Gen GUS n»m trªn vect¬ pBI121 ®­îc kÕt nèi víi vïng khëi ®éng b»ng enzym h¹n chÕ BamHI vµ víi vïng kÕt thóc b»ng enzym SacI, tr×nh tù nhËn biÕt cña hai enzym nµy còng cã ë hai ®Çu ®o¹n gen GlyP ®­îc nh©n b¶n b»ng PCR, nh­ vËy vÒ mÆt lý thuyÕt gen GUS cã thÓ bÞ lo¹i bá vµ ®­îc thay thÕ b»ng gen GlyP. §ång thêi vect¬ nµy ®­îc thiÕt kÕ dùa trªn vect¬ pBIN19 cã kÝch th­íc t­¬ng ®èi nhá kho¶ng 13kb phï hîp víi yªu cÇu cña mét vect¬ chuyÓn gen. Víi tÊt c¶ nh÷ng ­u ®iÓm trªn vect¬ pBI121 ®· vµ ®ang ®­îc sö dông lµm nguyªn liÖu cho rÊt nhiÒu nghiªn cøu chuyÓn gen. §Ó thu ®­îc vect¬ pBI121 tinh s¹ch, chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmid tõ chñng E. coli Top 10 theo ph­¬ng ph¸p cña Sambrook theo môc 2.2.8. KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy plasmid t¸ch ®­îc cã hµm l­îng cao vµ t­¬ng ®èi s¹ch protein. B­íc tiÕp theo c¾t vect¬ b»ng enzym h¹n chÕ, th«i gel vµ tinh s¹ch ®Ó thu ®­îc vect¬ më vßng cã 2 ®Çu dÝnh ®óng nh­ mong muèn nh»m phôc vô cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.1.2. KhuyÕch ®¹i gen GlyP b»ng kü thuËt PCR Kü thuËt PCR (polymerase chain Reaction) ®­îc sö dông rÊt hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c ®Þnh sù cã mÆt vµ nh©n b¶n gen GlyP víi ADN khu«n lµ ADN plasmid (vector pCR®2.1 + GlyP) mang toµn bé gen GlyP ®· dïng ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù (Chu Hoµng Hµ vµ cs). Ngoµi nh÷ng yÕu tè cÇn thiÕt kh¸c nh­ Taq polymerase, MgCl2 , buffer… th× cÆp måi ®Æc hiÖu lµ thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu ®Ó ph¶n øng PCR thùc hiÖn ®­îc. Dùa vµo tr×nh tù ®· ®­îc c«ng bè trªn ng©n hµng gen thÕ giíi vµ tr×nh tù gen GlyP chñng Vnucovo-32 do viªn C«ng nghÖ Sinh häc x¸c ®Þnh ®­îc, chóng t«i thiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI sö dông cho viÖc nh©n b¶n mét ®o¹n gen GlyP cã kÝch th­íc 1,5Kb b»ng kü thuËt PCR. B¶ng 8 . C¸c th«ng sè cÇn thiÕt cña cÆp måi nµy nh­ sau: Tªn måi Tr×nh tù måi Tm %GC RabG-start-BamHI 5’-GAGGATCCCTTATGGTTCCTCAGGCTCTCCT-3’ BamHI 96 54,84 RabG-stop-SacI 5’-GCGAGCTCTCACAGTCTGGTCTCAC-3’ SacI 80 60,00 PUC18-F1 5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’ 62 55,00 PUC18-R1 5’-GCGGATAACAATTTCACACA-3’ 56 40,00 §Æc biÖt, ®Ó phôc vô cho viÖc thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen sau nµy, chóng t«i ®· thiÕt kÕ thªm trªn cÆp måi tr×nh tù ®iÓm c¾t cña hai enzym h¹n chÕ lµ BamHI vµ SacI. Tr×nh tù nhËn biÕt cña hai enzym nµy bao gåm 6 nuclªotit, trong ®ã tr×nh tù cña BamHI lµ 5’-G GATCC-3’ vµ cña SacI lµ 5’-GAGCT C-3’. Ph¶n øng PCR ®­îc tiÕn hµnh t­¬ng tù nh­ môc 2.1. MÆc dï nhiÖt ®é b¾t mèi theo tÝnh to¸n lý thuyÕt cña måi RabG-start-BamHI lµ 960C vµ cña RabG-stop-SacI lµ 800C, nh­ng khi trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm, chóng t«i thÊy hiÖu qu¶ cao nhÊt thu ®­îc khi thùc hiÖn ph¶n ph¶n øng víi nhiÖt ®é g¾n måi lµ 600C, trong kho¶ng 32 chu k×. S¶n phÈm PCR ®o¹n gen GlyP ®­îc gi÷ ë 40C vµ lÊy 5ml s¶n phÈm ®Ó diÖn di kiÓm tra trªn gel agarose 0,8%. Sau khi tiÕn hµnh nhuém vµ soi gel chóng t«i thu ®­îc mét b¨ng rÊt ®Æc hiÖu cã kÝch th­íc 1,5Kb (h×nh 6), ®iÒu nµy phï hîp víi yªu cÇu vÒ kÝch th­íc cña ®o¹n gen mµ chóng t«i cÇn nh©n b¶n, ®o¹n gen kh«ng bÞ lÉn víi ADN t¹p nhiÔm kh¸c. VËy cã thÓ kÕt luËn ®­îc r»ng chóng t«i ®· khuÕch ®¹i thµnh c«ng ®o¹n gen GlyP cña virus d¹i. 1,5Kb H×nh 6. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n gen GlyP Ghi chó: M. Thang ADN chuÈn 1Kb; 1 vµ 2 lµ s¶n phÈm PCR 1 2 M Trong s¶n phÈm PCR gen GlyP thu ®­îc sÏ cã chøa nh÷ng ®o¹n gen ®· ®­îc nh©n b¶n, ®o¹n måi, sîi khu«n vµ nh÷ng ®o¹n gen ch­a hoµn thiÖn. V× vËy, c«ng viÖc tiÕp theo chóng t«i lµ tiÕn hµnh th«i gel vµ tinh s¹ch s¶n phÈm PCR ®Ó thu ®­îc ®o¹n gen GlyP cã ®é tinh s¹ch cÇn thiÕt cho ph¶n øng c¾t enzym h¹n chÕ. Quy tr×nh nµy ®­îc thùc hiÖn t­¬ng tù nh­ môc 2.2.3. S¶n phÈm ADN thu ®­îc ®­îc b¶o qu¶n ë -20oC ®Ó sö dông cho b­íc thÝ nghiÖm tiÕp theo. 3.2. ThiÕt kÕ ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 Mang gen GlyP d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng 35S vµ ®o¹n kÕt thóc NOS 3.2.1. C¾t enzym h¹n chÕ t¹o ®Çu dÝnh vµ ghÐp nèi t¹o vect¬ t¸i tæ hîp Trªn vïng MCS (multi cloning site) cña vect¬ pBI121 cã chøa hai vÞ trÝ c¾t cña enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI. Do ®ã vect¬ pBI121®­îc xö lý b»ng hai enzym h¹n chÕ trªn ®Ó t¹o hai ®Çu dÝnh kh¸c nhau, tr¸nh viÖc ®ãng vßng trë l¹i. ViÖc xö lý c¾t b»ng hai enzym kh¸c nhau còng gi÷ vai trß gióp gen GlyP g¾n vµo vect¬ ®óng chiÒu (môc 2.2.4). Theo dù ®o¸n vÒ mÆt lý thuyÕt, s¶n phÈm c¾t cña pBI121 sÏ cã hai b¨ng t­¬ng øng víi kÝch th­íc cña vect¬ kho¶ng 11,2Kb vµ kÝch th­íc cña gen gus 1,8Kb. Dùa vµo ¶nh ®iÖn di kiÓm tra (H×nh 7) cho thÊy, kÕt qu¶ viÖc më vßng vect¬ b»ng enzym h¹n chÕ hoµn toµn phï hîp víi ph©n tÝch lý thuyÕt. Sau khi ®iÖn di chóng t«i tiÕn hµnh th«i gel vµ tinh s¹ch ®Ó thu ®­îc ®o¹n vect¬ cã kÝch th­íc lµ 11,2Kb. 1 M 11,2Kb 1,8Kb H×nh 7. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t vect¬ pBI121 b»ng enzym BamHI vµ SacI Ghi chó. 1: Vect¬ pBI121 sau khi c¾t b»ng enzym h¹n chÕ; 2: Thang ADN chuÈn 1Kb M 1 1,5Kb Nh»m t¹o ®­îc nh÷ng ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ®o¹n gen GlyP cã kh¶ n¨ng liªn kÕt bæ sung víi hai ®Çu dÝnh trªn vect¬ ®· c¾t, chóng t«i tiÕp tôc xö lý c¾t s¶n phÈm PCR ®o¹n gen GlyP b»ng hai enzym BamHI vµ SacI. Ngoµi nh÷ng thµnh phÇn cÇn thiÕt cho ph¶n øng c¾t b»ng enzym h¹n chÕ, chóng t«i cã bæ sung thªm 1ml BSA ®Ó n©ng cao hiÖu suÊt cña ph¶n øng. S¶n phÈm c¾t cã ®Çu dÝnh ë hai ®Çu ®o¹n gen vµ mét sè nucleotid riªng lÎ nªn tr­íc khi thùc hiÖn ph¶n øng ghÐp nèi (ligation), chóng t«i tiÕn hµnh tinh s¹ch theo bé kÝt tinh s¹ch cña h·ng QIAGEN (môc 2.2.3.2), h×nh 8 d­íi ®©y lµ ¶nh ®iÖn di kÕt qu¶ sau khi tinh s¹ch. Sau ®ã thùc hiÖn ph¶n øng ghÐp nèi b»ng enzym T4 ligase (môc 2.2.5). H×nh 8: ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t ADN b»ng enzym giíi h¹n sau tinh s¹ch Ghi chó: M. Thanh ADN chuÈn 1kb ; 1. s¶n phÈm PCR sau khi ®· c¾t b»ng enzym giíi h¹n Enzym ghÐp nèi (ligase) lµ enzym xóc t¸c cho viÖc liªn kÕt nèi hai ®o¹n ADN cã vai trß hÕt søc quan träng trong c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp. Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông enzym T4-ligase cã nguån gèc tõ phage T4 x©m nhiÔm E. coli . Ngoµi kh¶ n¨ng liªn kÕt c¸c ®o¹n ADN cã ®Çu dÝnh gièng nh­ Ligase ®­îc t¸ch tõ E.coli, enzym nµy cßn cã kh¶ n¨ng liªn kÕt c¸c ®o¹n ADN ®Çu b»ng. Do gi÷a ADN vect¬ vµ ®o¹n ADN gen GlyP cã c¸c ®Çu dÝnh phï hîp, bæ sung víi nhau nªn trong m«i tr­êng cã T4-ligase th× ADN vect¬ vµ ADN ®o¹n gen GlyP (®o¹n xen) sÏ kÕt nèi víi nhau t¹o thµnh mét vect¬ t¸i tæ hîp. §Ó gia t¨ng hiÖu qu¶ xóc t¸c, rATP ®­îc bæ sung thªm víi môc ®Ých trî gióp ho¹t ®éng cho enzym T4-ligase. Ph¶n øng nµy, ®­îc thùc hiÖn ë 4oC trong kho¶ng thêi gian tõ 12 - 16h. T4- Ligase GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121 GAGCT G Gen GlyP GATCC C NOS TCGAG C CCTAG 35S G pBI121 pBI121 H×nh 9. S¬ ®å ghÐp nèi vect¬ pBI121 vµ gen GlyP 3.2.2. BiÕn n¹p vect¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo E. coli DH5α S¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n gen GlyP sau khi ®· xö lý b»ng BamHI vµ SacI, tinh s¹ch, ®­îc g¾n trùc tiÕp vµo vect¬ chuyÓn gen pBI121 ®· ®­îc më vßng s½n vµ sÏ ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli DH5a ®Ó chän läc, nh©n nhanh plasmid víi sè l­îng lín. * ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a E. coli lµ mét vi khuÈn Gram ©m khi nu«i trong m«i tr­êng cã chøa CaCl2, mµng tÕ bµo sÏ bÞ lµm cho máng ®i vµ cã nh÷ng lç nhá t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho c¸c ph©n tö ADN ®i vµo. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn nh­ ph­¬ng ph¸p ho¸ häc, ph­¬ng ph¸p vËt lý, ph­¬ng ph¸p sö dông sãng siªu ©m… nh­ng th«ng th­êng ng­êi ta hay sö dông ph­¬ng ph¸p ho¸ häc h¬n v× ph­¬ng ph¸p nµy rÊt ®¬n gi¶n vµ tiÕt kiÖm chi phÝ. TÕ bµo E. coli kh¶ biÕn ®­îc t¹o ra theo quy tr×nh ë môc 2.2.6. * BiÕn n¹p vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang cÊu tróc 35S/GlyP/NOS vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli DH5a. Vect¬ t¸i tæ hîp ®­îc ®­a vµo tÕ bµo E. coli kh¶ biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt ( môc2.2.7). Khi biÕn n¹p cã c¸c tr­êng hîp sau x¶y ra: - C¸c tÕ bµo kh«ng chøa vect¬ t¸i tæ hîp, chóng sÏ kh«ng mäc ®­îc trªn m«i tr­êng cã chøa kh¸ng sinh kanamycin v× kh«ng cã gen npt2 m· ho¸ cho enzym ph©n gi¶i kh¸ng sinh. - C¸c tÕ bµo mang plasmid b×nh th­êng kh«ng cã gen GlyP g¾n vµo, chóng vÉn mäc trªn m«i tr­êng chän läc. - c¸c tÕ bµo cã chøa vect¬ mang gen GlyP nh­ng gen nµy kh«ng cßn nguyªn vÑn do bÞ ®øt g·y trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm, nh÷ng tÕ bµo nµy vÉn mäc ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc. - C¸c tÕ bµo mang vect¬ cã chøa gen ®Ých nguyªn vÑn vµ cã thÓ ®­îc biÓu hiÖn trong m«i tr­êng tÕ bµo. TÊt nhiªn, nh÷ng tÕ bµo nµy còng mäc ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc kh¸ng sinh. KÕt qu¶ thu ®­îc trªn ®Üa th¹ch cã rÊt nhiÒu khuÈn l¹c mäc. §iÒu nµy cho thÊy hiÖu qu¶ biÕn n¹p b»ng ph­¬ng ph¸p sèc nhiÖt cao. Chóng t«i cã thÓ kÕt luËn s¬ bé r»ng ®· biÕn n¹p ®­îc vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP vµo chñng tÕ bµo E.coli DH5a. VÊn ®Ò ®Æt ra lµ liÖu trong nh÷ng khuÈn l¹c thu ®­îc, khuÈn l¹c nµo mang vect¬ cã chøa ®o¹n gen GlyP cßn nguyªn vÑn, chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra sù cã mÆt cña ®o¹n gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng ph­¬ng ph¸p colony-PCR (PCR trùc tiÕp tõ khuÈn l¹c). 3.2.3. KiÓm tra sù cã mÆt cña ®o¹n gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng kü thuËt colony-PCR Ti-plasmid t¸i tæ hîp khi ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli nhê bé m¸y sao chÐp cña tÕ bµo sÏ ®­îc nh©n lªn, kÕt qu¶ t¹o ra rÊt nhiÒu b¶o sao. §ång thêi gen npt2 m· ho¸ cho enzym ph©n huû kh¸ng sinh kanamycin ho¹t ®éng nªn tÕ bµo cã thÓ sèng ®­îc trªn m«i tr­êng chän läc LB + 50mg/l kanamycin. Khi cã khuÈn l¹c mäc trªn m«i tr­êng chän läc cã thÓ nãi b­íc ®Çu cña qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®· thµnh c«ng. §Ó ch¾c ch¾n r»ng gen GlyP cã mÆt trong c¸c dßng khuÈn l¹c thu ®­îc chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng colony-PCR. Ph­¬ng ph¸p nµy gióp chóng ta ph¸t hiÖn nhanh nh÷ng dßng khuÈn l¹c nµo mang gen ®Ých, gi¶m chi phÝ trong nghiªn cøu vµ ®ì mÊt thêi gian, c¸c b­íc ph¶n øng còng t­¬ng tù nh­ ph¶n øng PCR th«ng th­êng nh­ng ADN ®­îc thay b»ng c¸c tÕ bµo vi khuÈn. TiÕn hµnh ph¶n øng víi 12 dßng khuÈn l¹c kh¸c nhau sö dông cÆp måi trªn vect¬ (pUC18F1,R1). Së dÜ trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i kh«ng dïng cÆp måi RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI lµ do khi thùc hiÖn ph¶n øng nèi kÕt gen GlyP ®­îc sö dông víi mét l­îng lín. Ngoµi nh÷ng gen ®· ®­îc g¾n vµo vect¬ cßn cã rÊt nhiÒu gen cßn d­ thõa, chóng sÏ tån t¹i bªn trong hoÆc xung quanh nh÷ng khuÈn l¹c mäc trªn ®Üa th¹ch khi biÕn n¹p. V× vËy nÕu thùc hiÖn ph¶n øng colony- PCR víi cÆp måi RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI, chóng ta vÉn thu ®­îc b¨ng ®Æc hiÖu 1,5Kb nh­ng trªn thùc tÕ gen GlyP vÉn ch­a ®­îc g¾n vµo vect¬. §ã chÝnh lµ lý do mµ chóng t«i sö dông cÆp måi trªn vect¬ (pUC18F1,R1) cho ph¶n øng nµy. Dù ®o¸n khi ®iÖn di sÏ thu ®­îc b¨ng ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 2,75Kb. KÕt qu¶ chóng t«i thu ®­îc nh­ sau: M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2,75Kb H×nh 10. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm colony-PCR trùc tiÕp tõ c¸c khuÈn l¹c Ghi chó: M: Thang ADN chuÈn 1Kb; 1-12 s¶n phÈm colony-PCR tõ khuÈn l¹c t­¬ng øng víi c¸c dßng khuÈn l¹c 1-12. Tõ ¶nh chôp ®iÖn di, cho thÊy cã 10 dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh xuÊt hiÖn b¨ng ADN cã kÝch th­íc kho¶ng 2,75Kb ®óng víi kÝch th­íc cña ®o¹n gen GlyP 1,5Kb céng víi mét ®o¹n 1,25Kb cña vect¬. Tõ kÕt qu¶ thu ®­îc, chóng t«i tiÕn hµnh nu«i khuÈn trªn m«i tr­êng LB láng vµ t¸ch plasmid (môc 2.2.8 ) 3 dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh vµ 1 dßng ©m tÝnh lµm ®èi chøng theo ph­¬ng ph¸p Sambrook, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n nh­ng thu ®­îc plasmid cã ®é tinh s¹ch cao. Sau khi t¸ch, kÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 11 xuÊt hiÖn hai b¨ng, mét b¨ng lµ d¹ng siªu xo¾n vµ mét b¨ng lµ d¹ng duçi th¼ng. Ta thÊy dßng sè 1 cã b¨ng thÊp h¬n c¸c b¨ng cña 3 dßng cßn l¹i, lµ do plasmid kh«ng cã ®o¹n gen GlyP ®­îc g¾n vµo. B¨ng ®iÖn di plasmid cho thÊy cã ®ñ hµm l­îng vµ chÊt l­îng cho c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. 1 2 3 4 H×nh 11. ¶nh ®iÖn di plasmid t¸i tæ hîp t¸ch tõ tÕ bµo E.coli DH5µ Ghi chó: 1. S¶n phÈm t¸ch plasmid t¸i tæ hîp dßng khuÈn l¹c ©m tÝnh 2,3,4. Plasmid cña c¸c dßng khuÈn l¹c d­¬ng tÝnh. 3.3.3. KiÓm tra sù cã mÆt cña gen GlyP trong Ti-plasmid t¸i tæ hîp b»ng enzym h¹n chÕ 1 M 11,2 Kb 1,5 Kb LÊy plasmid võa t¸ch ®­îc c¾t b»ng 2 enzym h¹n chÕ (BamHI + SacI), kÕt qu¶ thu ®­îc nh­ trªn h×nh 12. H×nh 12. ¶nh ®iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid t¸i tæ hîp b»ng 2 enzym BamHI + SacI Ghi chó: 1: S¶n phÈm c¾t plasmid t¸i tæ hîp; M: Thang ADN chuÈn 1Kb KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy s¶n phÈm c¾t ph©n thµnh hai b¨ng t­¬ng øng víi phÇn vect¬ pBI121 kho¶ng 11,2Kb vµ ®o¹n gen GlyP kho¶ng 1,5Kb. Nh­ vËy cã thÓ kÕt luËn chóng t«i ®· thiÕt kÕ vµ biÕn n¹p thµnh c«ng Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP vµo trong tÕ bµo E. coli DH5a. TÕ bµo vi khuÈn ®­îc gi÷ chñng trong glycerol ë -85oC. 3.4. KÕt qu¶ biÕn n¹p Ti-plasmid t¸i tæ hîp pbi121 mang gen glyP vµo tÕ bµo A. tumefaciens. 3.3.1. BiÕn n¹p Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo thùc vËt nh­ chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciens, chuyÓn gen trùc tiÕp vµo c¸c tÕ bµo trÇn vµ thÓ transient, chuyÓn gen trùc tiÕp qua tÕ bµo trÇn vµ chuyÓn n¹p gen b»ng thiÕt bÞ b¾n gen…Ph­¬ng ph¸p chuyÓn gen th«ng qua vi khuÈn A. tumefaciens võa cho hiÖu qu¶ cao, ®¬n gi¶n l¹i Ýt tèn kÐm rÊt phï hîp víi n­íc ta nªn ®­îc lùa chän ®Ó chuyÓn c¸c kÕt cÊu gen thiÕt kÕ ®­îc vµo mét sè c©y trång. Chóng ta ®· biÕt, Ti-plasmid t¸i tæ hîp cã thÓ ®­îc chuyÓn vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p trùc tiÕp nhê sèc nhiÖt sö dông CaCl2, tuy nhiªn hiÖu qu¶ biÕn n¹p vµo tÕ bµo A. tumefaciens theo c¸ch nµy t­¬ng ®èi thÊp so víi tÕ bµo E. coli. v× vËy, trong nghiªn cøu nµy chóng t«i thùc hiÖn biÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn. Ti-plasmid t¸i tæ hîp sau khi thiÕt kÕ thµnh c«ng chóng t«i tiÕn hµnh chuyÓn vµo A. tumefaciens b»ng ph­¬ng ph¸p xung ®iÖn, ®©y lµ ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p rÊt cã hiÖu qu¶, cã thêi gian thÝ nghiÖm ng¾n. Ba chñng tÕ bµo A. tumefaciens Cv58C1, pGV2206, pGV3101 ®­îc sö dông cã mang gen m· ho¸ cho enzym kh¸ng hai lo¹i kh¸ng sinh ampecilin vµ rifamycin. Tr­íc tiªn, ®Ó ph©n tö ADN ®i vµo tÕ bµo ®­îc rÔ rµng chóng t«i tiÕn hµnh t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens (môc 2.2.2.10). TÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens ®­îc bæ sung thªm plasmid t¸i tæ hîp vµ ®­îc xö lý ë ®iÒu kiÖn 25mF, 400W, 2,5 kV tõ 8 - 10 gi©y. Sau khi xung ®iÖn, mÉu ®­îc bæ sung ngay 1ml m«i tr­êng SOC, l¾c ë 28oC trong hai giê vµ cÊy tr¶i trªn ®Üa petri chøa m«i tr­êng chän läc thÝch hîp YEP + ampecilin 50mg/l, kanamycin 50mg/l, rifamycin 100mg/l, nu«i ë 28oC qua ®ªm. T­¬ng tù mÉu ®èi chøng (kh«ng ®­îc bæ sung thªm vect¬ t¸i tæ hîp) còng ®­îc xö lý b»ng xung ®iÖn vµ còng ®­îc nu«i cÊy trªn m«i tr­êng chän läc nh­ trªn. KÕt qu¶ biÕn n¹p b»ng xung ®iÖn ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng d­íi ®©y: B¶ng 9. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm biÕn n¹p b»ng xung ®iÖn chuyÓn Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens. M«i tr­êng Sè l­îng khuÈn l¹c trung b×nh/1 ®Üa petri §èi chøng Chñng Cv58c1 Chñng pGV 2206 Chñng pGV 3101 YEP+Amp+Rif +++ +++ +++ +++ YEP+Km+Amp+Rif - +++ +++ ++ Chó thÝch: (+++): xuÊt hiÖn rÊt nhiÒu khuÈn l¹c; (++): xuÊt hiÖn khuÈn l¹c; (-): kh«ng xuÊt hiÖn khuÈn l¹c Tõ b¶ng 9 cho thÊy, tÕ bµo A. tumefaciens trong mÉu ®èi chøng (chñng vi khuÈn kh«ng mang vect¬ t¸i tæ), mäc rÊt tèt trªn m«i tr­êng YEP chøa kh¸ng sinh chän läc A. tumefaciens, cßn trªn m«i tr­êng chøa thªm kh¸ng sinh kanamycin chän läc khuÈn mang vect¬ t¸i tæ hîp kh«ng mäc ®­îc. §èi víi c¸c mÉu thÝ nghiÖm, khuÈn mäc rÊt nhiÒu trªn m«i tr­êng chøa c¶ 3 lo¹i kh¸ng sinh chän läc. §iÒu nµy cho thÊy ®· biÕn n¹p thµnh c«ng vect¬ t¸i tæ hîp vµo 3 chñng vi khuÈn A. tumefaciens. Trong ®ã, ë nh÷ng ®Üa chøa hai chñng Cv58c1 vµ pGV 2206 sè l­îng khuÈn l¹c mäc nhiÒu h¬n so víi chñng pGV3101. H×nh 13. ¶nh chôp ®Üa th¹ch sau khi biÕn n¹p vect¬ Ti-plasmid vµo tÕ bµo A. tumefaciens chñng Cv58C1 3.3.2. KiÓm tra sù cã mÆt cña vect¬ Ti-plasmid t¸i tæ hîp trong c¸c dßng khuÈn l¹c b»ng colony-PCR vµ c¾t enzym h¹n chÕ C¸c dßng khuÈn l¹c A. tumefaciens ®­îc t¹o ra nhê xung ®iÖn chøa Ti-plasmid t¸i tæ hîp ®· ®­îc ph¸t hiÖn b»ng ph­¬ng ph¸p chän läc trªn m«i tr­êng ®Æc hiÖu. §Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña gen GlyP trong c¸c dßng khuÈn l¹c chóng t«i lÊy ngÉu nhiªn mçi chñng kho¶ng 6 khuÈn l¹c tiÕn hµnh kiÓm tra b»ng ph­¬ng ph¸p colony-PCR (môc 2.2.11) víi cÆp måi (RabG-sart-BamHI+RabG-stop-SacI), ®©y lµ ph­¬ng ph¸p ®¬n gi¶n cho phÐp kh¼ng ®Þnh vµ x¸c ®Þnh chÝnh x¸c cÊu tróc cña plasmid t¸i tæ hîp ®­îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo A. tumefaciens. KÕt qu¶ thu ®­îc tÊt c¶ c¸c dßng ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng 1,5Kb, ®iÒu nµy chøng tá chóng t«i ®· ®­a ®­îc Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo trong 3 chñng vi khuÈn A. tumefaciens Cv58c1, pGV 2206 vµ pGV 3101. 11,2 kb 1,5 kb M 1 2 §Ó mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n sù cã mÆt cña gen GlyP trong Ti-plasmid t¸i tæ hîp chóng t«i tiÕn hµnh t¸ch plasmid tõ tÕ bµo vi khuÈn A. tumefaciens. V× sè l­îng b¶n sao cña plasmid cã trong tÕ bµo A. tumefaciens rÊt thÊp (kho¶ng vµi chôc b¶n sao) nªn khi t¸ch plasmid th× ph¶i t¸ch víi khèi l­îng lín. Ph­¬ng ph¸p Sambrook ®­îc sö dông rÊt cã hiÖu qu¶ trong tr­êng hîp t¸ch plasmid tõ A. tumefaciens. Tr­íc tiªn ph¶i nu«i l¾c tÕ bµo vi khuÈn trong 100ml m«i tr­êng YEP láng ë 28oC qua ®ªm. Sau ®ã cho vµo èng li t©m 50ml li t©m ë 5000 vßng/phót trong 10 phót ®Ó thu c¨n tÕ bµo, tiÕn hµnh t¸ch plasmid (môc 2.2.8). Sau khi t¸ch ®­îc plasmid tiÕn hµnh c¾t b»ng 2 enzym h¹n chÕ BamHI vµ SacI. §iÖn di kiÓm tra chóng t«i thu ®­îc kÕt qu¶ sau: H×nh 14. KÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm PCR vµ s¶n phÈm c¾t Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP sau khi t¸ch tõ tÕ bµo A. tumeffaciens. Ghi chó: GiÕng 1: Thang AND chuÈn 1Kb; giÕng 2: s¶n phÈm colony-PCR tõ tÕ bµo A. tumefaciens; giÕng 3:s¶n phÈm c¾t Ti-plasmid t¸i tæ. Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy chóng t«i ®· thu ®­îc mét b¨ng ®Æc hiÖu 1,5Kb s¶n phÈm PCR vµ s¶n phÈm c¾t b»ng enzym h¹n chÕ thu ®­îc hai b¨ng bao gåm : b¨ng vect¬ lµ 11,2Kb, b¨ng ®o¹n gen GlyP 1,5Kb. §iÒu nµy hoµn toµn thèng nhÊt víi gi¶ thiÕt ®Æt ra vµ chøng tá chóng t«i ®· chuyÓn thµnh c«ng Ti-plasmid t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo vi khuÈn A. tumefaciens. Nh­ vËy, chóng t«i ®· hoµn thµnh nghiªn cøu t¹o chñng vi khuÈn A. Tumefaciens mang T-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 chøa ®o¹n gen GlyP m· ho¸ cho ph©n tö glycoprotein cña virus d¹i. §©y lµ nguån nguyªn liÖu ®Çu tiªn phôc vô cho nghiªn cøu chuyÓn gen nh»m t¹o c©y trång chuyÓn gen cã thÓ s¶n xuÊt vaccine d¹i ¨n ®­îc. H×nh 15. Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP cña vir KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ KÕt kuËn 1. chóng t«i ®· nh©n b¶n thµnh c«ng ®o¹n gen GlyP cã chiÒu dµi 1500 nuclªotit m· ho¸ cho ph©n tö glycoprotein vá cña chñng virus d¹i Vnucovo-32 b»ng kü thuËt PCR sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu RabG-start-BamHI, RabG-stop-SacI. 2. §· thµnh c«ng trong viÖc thiÕt kÕ Ti-plasmid t¸i tæ hîp pBI121 mang gen GlyP d­íi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng 35S vµ ®o¹n kÕt thóc NOS. 3. §· t¹o ®­îc ba chñng a. tumeffaciens Cv58C1, pGV2206 vµ pGV3101 chøa Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP phôc vô cho viÖc chuyÓn gen s¶n xuÊt vaccine d¹i ¨n ®­îc trªn ®èi t­îng thùc vËt. §Ò NGHÞ Nghiªn cøu chuyÓn Ti-plasmid t¸i tæ hîp mang gen GlyP vµo c©y l¹c b»ng hÖ thèng chuyÓn gen th«ng qua a. tumeffaciens. §ång thêi biÓu hiÖn gen GlyP trong vi khuÈn E. coli thu protein ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®a dßng phôc vô nghiªn cøu c©y chuyÓn gen sau nµy. Tµi liÖu tham kh¶o Tµi liÖu TiÕng ViÖt 1. Lª TrÇn B×nh, Hå H÷u NhÞ, Lª ThÞ Muéi (1997), C«ng nghÖ sinh häc thùc vËt trong c¶i tiÕn gièng c©y trång, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi. 2. NguyÔn ThÞ ChÝnh, Ng« TiÕn HiÓn (2001), Virut häc, Nxb §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi 3. NguyÔn L©n Dòng, NguyÔn §×nh QuyÒn, Ph¹m V¨n Ty (2002), Vi sinh vËt häc, Nxb Gi¸o Dôc. 4. Lª Thanh Hoµ, §¸i Duy Ban (2002), C«ng nghÖ sinh häc ®èi víi c©y trång vËt nu«i vµ b¶o vÖ m«i tr­êng, TËp II, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ néi. 5. Lª Thanh Hoµ (2003), Sinh häc ph©n tö virus Gumboro, nghiªn cøu øng dông t¹i ViÖt Nam, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi. 6. Lª Hång Hinh (2003), Vi sinh y häc, Nxb Y häc Hµ Néi. 7. Lª ThÞ Thu HiÒn (2003), T¹o chñng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens mang gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång, LuËn ¸n tiÕn sÜ, ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖt Nam. 8. NguyÔn ThÞ Lang (2002), Ph­¬ng ph¸p c¬ b¶n trong nghiªn cøu c«ng nghÖ sinh häc, Nxb N«ng nghiÖp, Tp Hå ChÝ Minh. 9. §ç Ngäc Liªn (2004), MiÔn dÞch häc c¬ së, Nxb §¹i häc Quèc gia, Hµ Néi. 10. §oµn ThÞ Nguyªn, TrÇn Quang C¶nh (2004), Gi¸o tr×nh vi sinh vËt, Nxb Y häc Hµ Néi. 11. TrÇn V¨n TiÕn, §inh Kim XuyÕn (2003), Gi¸m s¸t vµ kiÓm so¸t bÖnh truyÒn nhiÔm ë ng­êi, Nxb Khoa häc vµ kü thuËt, Hµ Néi. 12. NguyÔn §øc Thµnh (2003), ChuyÓn gen ë thùc vËt, Nxb Khoa häc vµ kü thuËt, Hµ Néi. Tµi liÖu TiÕng Anh 13. American Medical Association (2002), “Plant-based vaccine show promise against infectious diseases”, 4 Oct, pp. 4197-5329. 14. Byrnes M. (2001), “Plant vaccine promises safe genetic modification” Daily News, 9 Jun, 15. Charlton K.M., Rupprecht C.E., Dietzschold B., Koprowski H. (1994), “in Lyssaviruses”, spingler-Verlag press, Berlin, pp. 95-119. 16. Centers for Disease Control and Prevention (2003), “ The virus”, National center for infevtious Diseases, 6 Feb, 17. Chilton M.D. (1993), “Agrbacterium gene transfer: Progress on a poor nam’s vector”, Vol., 90, pp. 3119-3210. 18. Coll J.M. (1995), “The glycoprotein G of rhabdoviruses” Archives of virology, 140(5), pp. 827-851. 19. Conzelmann K.K. (1998), “Nonsegmented Negative- Strand RNA virus: Genetics and Manipulation of viral genome”, Ann. Rev. Genet., 32, pp. 123-162. 20. Goldbeg K.B., Morell B., Hillman B.I., Heaton L.A., Chol T.J., Jackson A. O (1991), “Structure of the glycoprotein gene of sonchus yellow net virus, a pinal rhabdovirus”, Virology, 185, pp. 32-38. 21. Jond W., Krebs M.S., Charles E., James E. (2000), “Rabies surveillance in the United States during 1999”, Public veterinary medicine, 217 (12), pp. 1799-1811. 22. Khattak S., Darai G., Sle S., Rosen-Wolff A. (2002), “Characterization of expression of Puumala virus nucleocapsid protein in transgenic plant”, National library of Medicine, 45(4-6). 23. Khandelwal A., Sita G.l., Shaila M.S. (2003), “Expression of hemagglutini protein of virus in transgenic tobaco and immunogenicity of plant-derived protein a mouse model”, Viriology, 308(2), pp. 207-215. 24. Khandelwal A., Sita G.l., Shaila M.S. (2003), “ oral immunization of cattle with hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed in transgenic peanut induces specific immune responses”, Vaccine, 21, pp. 3282-3289. 25. Langevin C., Jaaro H., Bressanalli S., Fainziber M. (2002) “Rabies virus glycoprotein (RVG) is a trimeric ligand for the N-terminal cystein-rish domain of the mammalian p75 neurotrophin receptor”, The Journal of biological chemistry, 4 Oct, p No. 40, pp. 37655-37662. 26. National library of medicine (1999), “A plethora of hitech vaccine-genetic, edible, sugar glass, an more”, Pubmed, 4 July, 21, pp. 3282-3289. 27. Prakash C.S. (1996), “Edible vaccines and antibody producing plants”, biotechnology and Developmant monitor, No.27, pp. 10-13. 28. Smith M.L., Mason H.S., Shuler M.L. ( 2002), “Hepatitis B surface antigen expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form”, Biotachnol Bioeng, 30 Dec, 80(7), pp. 812-222. 29. University of South carolina (2004), “Rabies”, Microbiology and Immunology On-line, 2 Nov. 30. Vaccineation Liberation-Imformation (2005) “Rabies, vaccine and health principles” Vaccination Liberation, 26 Der, 31. Wantto M., Ryan A., Cummins J. (2004), "Cauliflower mosaic viral promoter – arecipe for disaster?", 32. World Health Organization (2003), “Rabies vaccine”, Immunization, vaccines and biologicals, April 2003, 33. Wetz G.W., Davis N.L., Palton J. (1987) , “The role of proteins in vesicular stomatits virus RNA replication”, Plenum Press, New York, pp. 271-298. Môc lôc Trang Më ®Çu.....................................................................................................................................1

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • doc16.doc
Luận văn liên quan