Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2 Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4 Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin

i ĐIỀU CHẾ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC DẪN XUẤT 2-HYDRAZINOBENZOTHIAZOLCURCUMIN VÀ 2,4-DIFLUOROPHENYLHYDRAZINOCURCUMIN TỪ CURCUMIN Tác giả ĐẶNG THỊ MỸ LỆ ĐỖ THỊ XUÂN VUI Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu Cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học Giáo viên hướng dẫn Th.S PHAN THỊ HOÀNG ANH Th.S LÊ XUÂN TIẾN Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN Tháng 08/2009 ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT Đề tài “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin” được thực hiện tại phòng Thí nghiệm tổng hợp hữu cơ trường Đại Học Bách Khoa TP. HCM, thời gian từ 02/2009 đến 08/2009. Nội dung chính của đề tài là tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin nhằm tìm kiếm một hoạt chất có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Tiến trình thực hiện đề tài như sau: 1/ Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin từ bột curcuminoid - Phân lập curcumin từ bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội). - Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR. Kết quả: Đã tổng hợp và phân lập thành công curcumin có độ tinh khiết >95% và có thể dùng curcumin tinh khiết này cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất tiếp theo. 2/ Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất imine – Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC), 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC). – Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột. – Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bảng mỏng TLC, đo điểm chảy. – Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổIR, MS, NMR. Kết quả: Đã tổng hợp và tìm được hệ dung môi thích hợp để phân lập thành công 2 dẫn xuất imine DFPHC, HBTC có độ tinh khiết > 95% để tiến hành khảo sát các hoạt tính sinh học. iv 3/ Khảo sát hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin – Hoạt tính kháng ung thư. – Hoat tính kháng oxy hóa. – Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. – So sánh các hoạt tính sinh học của dẫn xuất đã tổng hợp được với hoạt tính sinh học của curcumin. Kết quả: Trong luận văn này, hai dẫn xuất DFPHC và HBTC đều thể hiện hoạt tính kháng oxi hoá trong thử nghiệm DPPH và MDA tuy nhiên hoạt tính thấp hơn Cur. DFPHC và Cur đều thể hiện hoạt tính kháng ung thư đối với dòng tế bào Hep – G2. Ngoài ra DFPHC và HBTC đều có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhưng hoạt tính này không đáng kể với các chủng vi khuẩn, vi nấm đã khảo sát. v MỤC LỤC Trang tựa ......................................................................................................................... i Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii Tóm tắt ............................................................................................................................ ii Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách các từ viết tắt .............................................................................................. viii Danh sách các hình ........................................................................................................ ix Danh sách các bảng ....................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ ..................................................................................................... xii Chương 1: MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2 1.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 2 1.4. Yêu cầu ..................................................................................................................... 3 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 4 2.1. Tổng quan về curcumin ............................................................................................ 4 2.1.1. Curcuminoid .......................................................................................................... 4 2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid .............................................................. 4 2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid .......................................................... 5 2.1.2. Curcumin ............................................................................................................... 6 2.1.2.1. Lý tính ................................................................................................................. 6 2.1.2.2. Hóa tính .............................................................................................................. 7 2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. ................................................... 14 2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư ...................................................................................... 15 2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa ...................................................................................... 16 2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur .................................................... 17 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 23 3.1. Sơ đồ thực nghiệm .................................................................................................. 23 3.2. Phương pháp thực hiện ........................................................................................... 24 3.2.1. Phân lập curcumin ................................................................................................ 24 vi 3.2.1.1. Kết tinh lại ........................................................................................................ 25 3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ................................................................................... 26 3.2.1.3. Sắc ký cột ......................................................................................................... 27 3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất imne – curcumin. ........................................................... 29 3.2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2 hydrazinobenzothiazolcurcumin .................................... 29 3.2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất 2,4 diflorophenylhydrazinocurcumin ................................ 32 3.2.3. Phân tích cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp .............................................. 35 3.2.3.1. Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). ...................................................................... 35 3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR) ......................................................................................... 35 3.2.3.3. Khối phổ .......................................................................................................... 35 3.2.3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................................................ 35 3.2.4. Khảo sát hoạt tính sinh học ................................................................................ 35 3.2.4.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá in vitro – phương pháp DPPH ................... 35 3.2.4.2. Đánh giá hoạt tính chống peroxide hóa lipid - phương pháp MDA ................ 37 3.2.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn- phương pháp MIC ................... 38 3.2.4.4. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư .................................................................... 39 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 41 4.1. Phân lập curcumin .................................................................................................. 41 4.1.1. Kết tinh lại curcuminoid ...................................................................................... 41 4.1.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 42 4.1.3. Nhận danh cấu trúc hóa học ................................................................................ 43 4.1.3.1 Tính chất vật lý đặc trưng của curcumin ........................................................... 43 4.1.3.2. Biện luận cấu trúc của curcumin ...................................................................... 44 4.2. Tổng hợp dẫn xuất 2-hydrazinobenzothiazolecurcumin ........................................ 46 4.2.1. Theo dõi phản ứng ............................................................................................... 46 4.2.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 47 4.2.3. Nhận danh cấu trúc .............................................................................................. 48 4.2.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 48 4.2.3.2. Biện luận cấu trúc của HBTC ........................................................................... 48 4.3.2. Sắc ký cột ............................................................................................................. 52 4.3.3. Biện luận cấu trúc ................................................................................................ 53 vii 4.3.3.1. Tính chất vật lý đặc trưng ................................................................................. 53 4.3.3.2. Biện luận cấu trúc của DFPHC ........................................................................ 53 4.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học ........................................................................ 56 4.4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa ....................................................................................... 56 4.4.1.1. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro- phương pháp DPPH .................... 56 4.4.1.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá tiền in vitro phương pháp MDA ................ 58 4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................................... 60 4.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm ..................................................................... 61 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 62 5.1. Kết luận ................................................................................................................... 62 5.2. Kiến nghị. ............................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 64 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 67 viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur : Curcumin DMC : Demethoxycurcumin BDMC : Bisdemethoxycurcumin HC : Hydrazinocurcumin IOZ : Isoxazolcurcumin HBTC : 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin DFPHC : 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin OD : Mật độ quang HTCO : Hoạt tính kháng oxi hoá CS : là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của hoạt chất được thử tính theo % so với chất đối chứng IC50 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 50% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc gốc tự do (half maximal (50%) inhibitory concentration) IC70 : Nồng độ hoạt chất để ức chế 70% vi khuẩn, vi nấm, tế bào ung thư hoặc gốc tự do MIC : Nồng độ thấp nhất của chất thử nghiệm có khả năng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn, vi nấm (minimum inhibitory concentration) HPLC : Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MS : Khối phổ (Mass spectrometry) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) TLC : Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography). ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid .................................................... 4 Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur ........................................ 6 Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH .............................................................................. 8 Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm ...................................................... 9 Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur ................................................................................... 10 Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá ................................................................................ 11 Hình 2.7: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng (kobsd) giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường. ................................................................................................................ 12 Hình 2.8: Cấu trúc của dẫn xuất isoxazole và pyrazolecurcumin .................................... 12 Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch ................................................................... 13 Hình 2.10: Phức Cur với kim loại ........................................................................................ 13 Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do ....................................................................... 14 Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u ....................... 16 Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur ...................................................... 17 Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC ....................................................................................... 18 Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC .................................................................................... 18 Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ hydrazinoCur với các chủng tế bào ung thư khác nhau (theo phương pháp MTT) ............................................................................................ 18 Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN ............ 19 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................ 20 Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ Curcuminoid ........................ 20 Hình 2.19: 3-nitrophenylpyprazolecurcumin ................................................................ 21 Hình 2.20: Hydrazinocurcumin ..................................................................................... 21 Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC ............................................................................... 21 Hình 3.1: Phương pháp tính Rf ............................................................................................. 27 Hình 3.2 : Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá ............................... 36 Hình 3.3: Cơ chế tạo màu của MDA ................................................................................... 37 Hình 4.1: Bản mỏng kiểm tra hỗn hợp curcuminoid sau các lần kết tinh ....................... 41 x Hình 4.2: TLC phân đoạn tinh thu được từ sắc ký cột ...................................................... 42 Hình 4.3: (A) Sắc ký cột phân lập Cur (B) Cur: cur thu được qua sắc ký cột. ........ 42 Hình 4.4: Tinh thể Cur ........................................................................................................... 43 Hình 4.5: Phổ UV-vis (trong ethanol) của Cur ................................................................... 43 Hình 4.6: Curcumin, C21H20O6 (M=368). .......................................................................... 45 Hình 4.7: TLC theo dõi phản ứng ........................................................................................ 46 Hình 4.8: Sắc ký cột thô ........................................................................................................ 47 Hình 4.9: Sắc ký cột tinh ....................................................................................................... 47 Hình 4.10: (A) TLC của HBTC so với Cur (silica gel ,CH2Cl2:CH3OH: 97:3 v/v) ...... 48 Hình 4.11: Cấu trúc của HBTC, C28H23SN3O4 (M=497) .................................................. 49 Hình 4.12: TLC theo dõi điểm dừng phản ứng ...................................................................... Hình 4.13: Sắc ký cột thô ...................................................................................................... 52 Hình 4.14: Sắc ký cột tinh .................................................................................................... 52 Hình 4.15: (A) Dạng tinh thể của DFPHC và ..................................................................... 53 (B) TLC của DFPHC (silica gel, CH2Cl2:CH3OH: 98:2 v/v) ....................... 53 Hình 4.16: Cấu trúc của DFPHC, C27H22N2F2O4 (M=476) .............................................. 54 Hình 4.17: Hoạt tính kháng oxy hoá của HBTC, DFHTC, Cur theo phương pháp DPPH ....................................................................................................................................... 57 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid .......................................................... 4 Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất Curcuminoid .......................................... 5 Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur ......................................... 7 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất Curcuminoid đối với tế bào BAEC ................ 20 Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại ...................................................................................... 25 Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi ......................................................................... 26 Bảng 3.3: Bảng nồng độ các dung dịch thử DPPH ............................................................ 36 Bảng 4.1: Kết quả định lượng của quá trình kết tinh ......................................................... 41 Bảng 4.2: Tính chất vật lý đặc trưng của Cur ..................................................................... 44 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của curcumin ........................................................................ 45 Bảng 4.4: Tính chất vật lí đặc trưng của HBTC ................................................................. 48 Bảng 4.5: Dữ liệu phổ NMR của HBTC ............................................................................. 49 Bảng 4.6: Tính chất vật lý đặc trưng của DFPHC ............................................................. 53 Bảng 4.7: Dữ liệu phổ NMR của DFPHC .......................................................................... 54 Bảng 4.8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của HBTC, DFPHC, Cur theo phương pháp DPPH ............................................................................................................... 56 Bảng 4.9: Hoạt tính kháng oxy hoá của vitamin C theo phương pháp DPPH ............... 56 Bảng 4.10: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá DPPH .................... 57 Bảng 4.12: Hoạt tính kháng oxy hoá của Trolox theo phương pháp MDA ................... 58 Bảng 4.13: Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá MDA ..................... 59 Bảng 4.14: Kết quả xác định giá trị IC50 trong khảo sát hoạt tính kháng ung thư của DFPHC, Cur với 3 dòng tế bào Hep-G2, Lu và RD ...................................................... 60 Bảng 4.15: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của HBTC, DFPHC, Cur đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm ......................................................................................................... 61 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu. ........................................................ 23 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin ............................................................................. 24 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) ................. 29 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 2,4-Diflorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC) .......... 32 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Từ lâu curcumin đã được biết đến như là một hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật đóng vai trò quan trọng trong nền công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng tỏ curcumin có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như: kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng nhiều chủng tế bào ung thư, chống đột biến, giảm cholesterol, chống đông máu, chữa được một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS... Mặt khác curcumin lại là hoạt chất không gây độc cho người và động vật ngay cả khi dùng với liều lượng lớn (10g/ngày). Chính vì những đặc tính trên mà hiện nay curcumin đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm. Hiện nay có nhiều phương pháp để nâng cao hoạt tính sinh học cho curcumin. Tuy nhiên một trong những phương pháp cho nhiều kết quả khả quan là tạo dẫn xuất imine cho curcumin. Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất imine này làm tăng đáng kể hoạt tính sinh học của curcumin và thể hiện tiềm năng được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược. Nhận thấy được những ưu điểm và tiềm năng của nhóm dẫn xuất này chúng tôi thực hiện đề tài: “Điều chế và khảo sát hoạt tính sinh học của các dẫn xuất imine 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin”. 2 1.2. Mục tiêu đề tài - Tổng hợp các dẫn xuất imine: 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin và 2,4-Difluorophenylhydrazinocurcumin từ curcumin. - Khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất vừa tổng hợp. • Hoạt tính kháng ung thư. • Hoạt tính kháng oxy hóa. • Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 1.3. Nội dung đề tài Từ các mục đích đã đưa ra đề tài sẽ được triển khai theo các nội dung cơ bản sau: a. Tinh chế và xác định cấu trúc của curcumin. – Phân lập curcumin từ bột curcuminoid. – Kiểm tra độ tinh khiết của curcumin bằng sắc ký bản mỏng và đo điểm chảy, xác định cấu trúc bằng phổ MS, IR và NMR. b. Tổng hợp và xác định cấu trúc của các dẫn xuất – Tổng hợp dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin (HBTC) 2,4 - Difluorophenylhydrazinocurcumin (DFPHC). – Phân lập các sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột. – Kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc ký bản mỏng (TLC). – Xác định cấu trúc của dẫn xuất tổng hợp được bằng phổ MS, IR và NMR. c. Khảo sát các hoạt tính sinh học của curcumin và các dẫn xuất imine - curcumin – Hoạt tính kháng ung thư. – Hoat tính kháng oxy hóa. ƒ Theo phương pháp DPPH. ƒ Theo phương pháp MDA. – Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. – So sánh các hoạt tính của dẫn xuất tổng hợp được với hoạt tính sinh học của curcumin. 3 1.4. Yêu cầu – Tách và tinh chế được curcumin tinh khiết. – Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin. – Tổng hợp và tinh chế dẫn xuất 2,4 – Difluorophenylhydrazinocurcumin. – Xác định cấu trúc của các dẫn xuất bằng phổ MS, IR và NMR. – Khảo sát hoạt tính sinh học của: • Curcumin. • 2-Hydrazinobenzothiazolcurcumin. • 2,4–Difluorophenylhydrazinocurcumin. 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về curcumin 2.1.1. Curcuminoid 2.1.1.1. Cấu trúc của các dẫn xuất curcuminoid Hỗn hợp curcuminoid là một trong những thành phần quan trọng mang nhiều hoạt tính đáng quý được chiết từ củ nghệ vàng (Curcuma longa L.). Hỗn hợp curcuminoid có dạng bột màu vàng và là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng cam của nghệ [6]. Lượng curcuminoid trong bột nghệ khoảng từ 3 – 6%. Hỗn hợp curcuminoid có chứa khoảng 77% curcumin (Cur), 17% demethoxycurcumin (DMC), 3% bisdemethoxycurcumin (BDMC) [7]. O O OH R1 OH R2 Hình 2.1: Công thức hóa học chung của curcuminoid [7] Bảng 2.1: Cấu trúc các thành phần của curcuminoid [7] Hợp chất R1 R2 CTPT M (đvc) Cur OCH3 OCH3 C21H20O6 368 DMC OCH3 H C20H18O5 338 BDMC H H C19H16O4 308 5 2.1.1.2. Phân lập các dẫn xuất curcuminoid Để tìm hiểu, nghiên cứu sâu hơn về curcuminoid cũng như các dẫn xuất của nó thì các dẫn xuất này cần phải được phân lập ra vì mỗi thành phần này có cấu trúc hoá học khác nhau nên màu sắc và tính chất hoá học cũng khác nhau. Vì vậy việc phân lập các thành phần của curcuminoid ra là vấn đề cần thiết và mang ý nghĩa thiết thực. Hiện nay đã có nhiều tác giả dùng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các thành phần của curcuminoid. Opa vajragupta và cộng sự [8] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel 60G, 0.063-0.200mm với hệ dung môi CHCl3:MeOH:AcOH (98:5:2 v/v/v). Theo phương pháp này, Cur được rửa giải đầu tiên, kế tiếp là hỗn hợp của Cur và DMC, cuối cùng là BDMC tinh. DMC được tách ra khỏi hỗn hợp giữa DMC và Cur bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (95:5 v/v ). G. K. Jayaprakasha và cộng sự [9] đã phân lập 3 thành phần curcuminoid bằng sắc ký cột silica gel. Thu được Cur, DMC, BDMC lần lượt với hệ dung môi benzene : EtOAc (82:18 v/v), benzene : EtOAc (70:30 v/v), benzene : EtOAc (58:42 v/v). Nhiệt độ nóng chảy đo được của Cur, DMC, BDMC tương ứng là 186 - 187, 175 - 176, 231 - 232oC. W. Chearwae và cộng sự [10] đã cô lập các dẫn xuất curcuminoid từ cao ethanol trích từ củ nghệ vàng cũng bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CHCl3, sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi bằng CH3OH. Thu được các phân đoạn Cur, DMC, BDMC có độ tinh khiết khoảng 95-99% (HPLC). L. Péret-Almeida và cộng sự [11] đã cô lập, xác định cấu trúc và một số tính chất hoá lý của từng dẫn xuất curcuminoid riêng biệt. Hỗn hợp curcuminoid (Merck) được kết tinh lại 3 lần bằng hệ dung môi CH2Cl2:CH3OH (5:1 v/v), hiệu suất quá trình kết tinh ~ 40%. Cắn thu được từ nước cái của quá trình kết tinh được sắc ký với chất hấp phụ silica gel tẩm sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4), dung môi rửa giải là CH2Cl2. Các phân đoạn tinh khiết được xác định cấu trúc và một số tính chất vật lý. 6 Bảng 2.2: Các thông số hoá lý của các dẫn xuất curcuminoid [11] Điểm chảy (oC) Cur DMC BDMC 184 172 222 Hình 2.2: Kết quả HPLC tương ứng của BDMC, DMC và Cur [11] Điều kiện HPLC: cột spherical Shi-pack CLC NH2 (5 µm, 4.6 x 150 mm, Shimadzu), pha động ethanol: nước (85/15 v/v), tốc độ dòng 1ml/phút, 22oC, detector DAD 425nm. Ngoài ra các thành phần này còn được định tính bằng phổ tử ngoại khả kiến, hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và bằng phương pháp so màu. Các kết quả đều cho thấy các thành phần phân lập được chính là Cur, DMC, BDMC. 2.1.2 Curcumin 2.1.2.1. Lý tính Có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi [6]. Tỉ trọng: 0.93 g/ml [5]. Điểm chảy: 179- 1830C [5]. Bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng. Khi ở dạng dung dịch Cur dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ [6]. 7 Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở 250C) [6,12]. Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong môi trường acid có màu đỏ tươi [4]. Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng từ 420 - 430 nm [6]. 2.1.2.2. Hóa tính a. Quá trình điện ly theo pH Cur không tan trong môi trường nước ở pH acid và trung tính nhưng tan tốt ở pH kiềm [12]. Nghiên cứu bằng kỹ thuật HPLC cho kết quả điện ly theo pH của Cur như sau: Bảng 2.3: Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Cur [12]. pH Màu của dung dịch Dạng ion tồn tại < 1 Đỏ H4A+ 1 – 7 Huyền phù màu vàng H3A > 7.5 Đỏ H2A- , HA2- , A3- H4A+ OH+HO OCH3H3CO OHOH 8 H3A OHHO OCH3H3CO OHO H2A- OHHO OCH3H3CO O-O HA2- O-HO OCH3H3CO O-O A3- O--O OCH3H3CO O-O Hình 2.3: Các dạng ion của Cur theo pH [12] b. Phản ứng phân hủy ™ Phân hủy trong môi trường kiềm Cur tương đối bền trong môi trường acid nhưng lại bị phân hủy nhanh chóng trong môi trường kiềm [12]. Ở pH = 8.5, chỉ sau 5 phút Cur đã bắt đầu phân hủy thành ferulic acid và feruloylmethane. Sau đó, feruloylmethane còn bị phân hủy thành vanillin và acetone. 9 OCH3OCH3 OHHO O O OCH3 HO O OCH3 OH O HO OH- OH- OCH3 HO CHO O as radical feruloyl methane ferulic acidcondensation product vaniline actone Hình 2.4: Sự phân huỷ của Cur trong môi trường kiềm [12, 14] Nghiên cứu của Ying Jan Wang và cộng sự [13] cũng cho thấy 90% Cur bị phân huỷ sau 30 phút trong môi trường đệm phosphate pH = 7.2, 37oC. ™ Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng [12] Cur không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch. Khi tiếp xúc với ánh sáng, Cur bị phân huỷ ngay cả ở dạng rắn và bị phân huỷ nhanh hơn khi ở trạng thái dung dịch. Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillic acid, ferulic aldehyde, ferulic acid. Cur có thể bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng ngay cả khi có mặt oxi và không oxi. - Không có oxi, Cur có thể bị vòng hóa. - Khi có mặt oxi và ánh sáng, Cur phân huỷ tạo thành 4-vinylguaialcol và anilin. 10 c. Phản ứng cộng H2 Trong phân tử Cur có nối đôi trong mạch cacbon nên có thể phản ứng với 1, 2 hoặc 3 phân tử H2 tạo thành các dẫn xuất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin và hexahydrocurcumin, khi có mặt xúc tác kim loại hay oxit kim loại (Ni, PtO2) tương ứng (hình 2.5), các sản phẩm này cũng là các chất kháng oxy hoá [15]. + H2 Ni (PtO2) OHHO OCH3H3CO OHO n = 1: dihydrocurcumin OHHO OCH3H3CO OHO . . n = 2: tetrahydrocurcumin OHHO OCH3H3CO OHO n = 3: hexahydrocurcumin OHHO OCH3H3CO OHO Hình 2.5: Phản ứng cộng H2 của Cur [5] d. Phản ứng imine hóa Cur là hợp chất diketone nên có thể cho phản ứng với các amin bậc nhất (RNH2), hydroxylamine (NH2OH), hydrazine (NH2-NH2), semicarbazide 11 (NH2NHCONH2) … tạo các dẫn xuất imine (base Schiff) hoặc dẫn xuất imine tương ứng [2,3,16,17]. Cơ chế phản ứng imine hoá R C O Y R'NH2 R C O- Y +NH2R' ± H+ R C OH Y NHR' carbinolamin R C OH2 Y NHR' R C Y NH R' H2O R C NR' Y H3O+ H+ H3O+ Hình 2.6: Cơ chế phản ứng imine hoá [16] Giai đoạn đầu của phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên tử nitrogen của amine vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm carbonyl. Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường, hình thành hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxide và cation ammonium. Hợp chất trung gian này chuyển hoá nhanh thành sản phẩm trung gian bền hơn là carbinolamin. Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác, giúp cho cân bằng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamine, sinh ra dạng proton hoá của imine hoặc các dẫn xuất của imine. Cuối cùng là giai đoạn tách proton, hình thành sản phẩm là imine hoặc các dẫn xuất của imine [2,16]. Trong cơ chế của phản ứng imine hoá, pH của môi trường đóng vai trò quan trọng. Nếu môi trường phản ứng quá acid, toàn bộ amine bị proton hoá. Các amine bị proton hoá không có tính ái nhân nên chúng không phản ứng với các nhóm ketone. Ngược lại, giảm môi trường acid sẽ làm giảm quá trình tách nước tạo imine. Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng imine hoá là khoảng pH~4.5 [17]. Hình 2.7 mô tả sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng giữa acetone và hydroxylamine vào pH môi trường phản ứng. Hìn hyd xuất i nghiên Cur. C h 2.7: S roxylamine Cur cũng mine, Cur cứu tổng ơ chế của H3C H3C Hìn ự phụ thu vào pH m là hợp ch còn có thể hợp các h các phản ứ HO O HO O h 2.8: Cấu ộc của t ôi trường [ ất β-diketo tạo các hợ ợp chất dị ng này tươ Isoxa Pyra trúc của dẫ ốc độ phả 17]. ne nên ng p chất dị v vòng của C ng tự như p NO zole curcum NHN zole curcum n xuất isox n ứng (k oài khả nă òng khác ur như dị hản ứng im in in azole và py obsd) giữ ng tạo các nhau. Hiện vòng pyra ine thông OH OCH OH OCH razole Cur a acetone imine và nay có mộ zole, isoxa thường [4] 3 3 [18]. và dẫn t số zole . 13 e . Phản ứng tạo phức Cur với cấu trúc diketon trong môi trường acid hay trung tính nằm dưới dạng hỗ biến keto-enol đối xứng và ổn định, làm cho Cur có khả năng tạo phức mạnh với nhiều ion kim loại khác nhau như : Zn2+, Sn2+, Al3+, Cu2+, Ni2+, Fe3+...[4]. CHR R O O H H CR R O O H Hình 2.9: Sự hỗ biến của Cur trong dung dịch [5] Các ion kim loại này hấp thu các cặp electron trong nguyên tử oxy của phân tử Cur để tạo phức. Phức ion-kim loại không bền ở nhiệt độ cao và khi tiếp xúc với ánh sáng trong thời gian dài. Một ion kim loại có thể tạo phức với một hay nhiều phân tử Cur. O O H3CO HO OCH3 OH M OO OCH3 OH H3CO HO OO OCH3 OH H3CO HO M HOH OCOCH3 Hình 2.10: Phức Cur với kim loại [5]. 14 g. Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzene Do sự liên hợp cặp electron tự do của nhóm OH với vòng benzene làm cho nhóm phenoxyl của Cur dễ nhường nguyên tử H tạo thành gốc tự do phenoxy bền vững. Ngoài ra nhóm methylene ở giữa nhóm β – diketone có thể nhường nguyên tử H tạo gốc tự do carbon ổn định. Hai hướng phản ứng này (hình 2.11) góp phần giải thích hoạt tính kháng oxy hóa mạnh của Cur và các dẫn xuất của chúng [19]. OHHO OCH3H3CO OO -H+ R* OHO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO OHO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO OO OCH3H3CO OO OHHO OCH3H3CO OO Hình 2.11: Phản ứng của Cur với gốc tự do [19] 2.2. Hoạt tính sinh học của Cur và dẫn xuất của Cur. Từ xa xưa, Cur đã được dùng làm màu thực phẩm và dùng trong các bài thuốc dân gian. Cur đã được sử dụng như một vị thuốc dân gian để chữa một số bệnh như bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh ngoài da, viêm loét dạ dày, phòng và chữa một số loại ung thư…Cur không gây độc đối với người ở liều lượng lên đến 10g/ngày. Chính vì tính an toàn nên Cur có nhiều tiềm năng sử dụng trong dược phẩm [20]. 15 Cur còn là chất chống viêm và chống oxy hóa điển hình, có thể sử dụng trong điều trị bệnh mà không sợ gây loãng xương, không gây loét dạ dày. Ngoài ra, Cur cũng đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan siêu vi B, C và cả HIV với giá rẻ [4,5]. Như vậy ta thấy hoạt tính của Cur rất phong phú và đa dạng, nội dung luận văn này xin trình bày hoạt tính kháng ung thư, kháng oxy hóa của Cur. 2.2.1. Hoạt tính kháng ung thư Hiện nay, ung thư đang được xem là bệnh nan y và được điều trị dựa trên sự kết hợp của ba phương pháp: xạ trị, phẫu trị và hóa trị. Riêng thuốc trị ung thư trong hoá trị là loại thuốc khó sử dụng hơn cả vì độc tính cao. Thuốc trị ung thư có tác dụng ức chế sự phát triển và biệt hóa các tế bào ung thư nhằm chặn đứng sự phát triển và di căn của ung thư. Tuy nhiên đại đa số các thuốc trị ung thư hiện nay đều dễ bị nhờn thuốc và hệ số an toàn giảm dần theo thời gian sử dụng, ngoài ra chúng có thể gây độc cho các tế bào lành và gây ra các tác dụng phụ như: rụng tóc, buồn nôn... Vì vậy việc tìm ra một hoạt chất có tác dụng chống ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên và tăng hoạt tính của các hoạt chất đó đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Cur là được xem một hoạt chất điều trị ung thư vào loại mạnh theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính [4]. Nó vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới mà không ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh, nó loại bỏ các gốc tự do và các loại men gây ung thư có trong thức ăn, nước uống hằng ngày. Vì vậy, Cur được xem là hoạt chất hỗ trợ, phòng chống và chữa trị ung thư một cách có hiệu quả. Ngoài ra, Cur còn có khả năng ức chế sự hình thành khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển của khối u như: biến đổi, phát triển, lan rộng của tế bào ung thư . 16 Hình 2.12: Tác động của Cur đến quá trình hình thành và di căn khối u [7]. 2.2.2. Hoạt tính kháng oxy hóa Các dạng oxygen hoạt động (ROS-Reactive oxygen species) là thành phần tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [7]. Cur có khả năng ức chế hiệu quả các ROS trong cơ thể như: anion superoxide, H2O2, gốc nitrite ở mức độ in vitro và in vivo [14]. Cur có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, các hoạt tính đó đều xuất phát từ tính kháng oxy hóa mạnh của Cur, tính kháng oxy hóa của nó mạnh hơn vitamin E [15]. Do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa, Cur có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật và các tác nhân gây hại khác nhau. Cur thể hiện khả năng ức chế mạnh với những thương tổn do H2O2 gây ra ở tế bào sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG108 [16]. Cur ngăn chặn sự peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột nhờ vậy mà nó duy trì hoạt động của những enzyme kháng oxy hóa như SOD, catalase và glutathione peroxidase [17]. Trong cấu trúc của Cur có hydrogen của nhóm phenolic và hydrogen của nhóm methylene (giữa liên kết β-diketone) đều có thể tạo nên khả năng kháng oxy hoá. Tuy nhiên, hoạt tính của Cur thực chất là do hydrogen ở vị trí nào gây ra vẫn còn nhiều tranh cãi. W.F.Chen và cộng sự [18] nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH), Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và các chất tương tự như curcumin nhưng không có nhóm phenolic:1,7-bis(3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1), 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2) và 1,7- diphenyl-1,6- heptadiene-3,5-dione (3). Hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu Khối u di căn Lan rộng Biến đổi Phát triển Cur Tế bào bình thường Tế bào ung thư Khối u tăng trưởng 17 hơn các dẫn xuất Cur nhiều lần. Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid. L. Chen và cộng sự [19] cho rằng nhóm enolic có tính acid cao hơn nhóm phenolic nên hydrogen của enolic đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng oxy hoá của Cur. Do đó trong quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do hydrogen của enolic tách ra đầu tiên (hình 2.13). O O H3CO OCH3 O O H H H C H O O H3CO OCH3 O H H C O O2- HO2- Hình 2.13: Cơ chế quét gốc tự do superoxide của Cur [19] Tuy nhiên, J.S. Wright và cộng sự [42] lại cho rằng vai trò kháng oxy hoá của nhóm phenolic hay methylene trên Cur tuỳ thuộc vào loại gốc tự do tấn công và môi trường phản ứng. K. I. Priyadarsini và cộng sự [20] lại cho rằng hoạt tính kháng oxy hoá của Cur chủ yếu l à do quá trình tách hydrogen trên nhóm phenolic và một phần trên nhóm methylene. Ngoài ra, Cur có khả năng tạo phức mạnh với các ion kim loại như chì, cadmium, sắt… mà các ion kim loại này là nhân tố xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá, đầu độc tế bào thần kinh và là nguyên nhân gây ra các căn bệnh như Alzheimer, Parkinson, … Do vậy, Cur là một trong các hợp chất thiên nhiên tiềm năng có thể sử dụng để loại trừ các ion kim loại độc trong cơ thể người [21]. 2.3. Các nghiên cứu về imine và dẫn xuất imine Cur Một trong các hướng nghiên cứu về Cur hiện nay là nâng cao khả năng ứng dụng và nâng cao hoạt tính của Cur dựa trên các nguyên tắc sau: z Tạo phức với các kim loại chuyển tiếp. z Tổng hợp các hợp chất imine. z Encapsule hoá Cur. z Tạo các dẫn xuất Cur với glucose, glycine, alanine, acid acetic… 18 Trong các hướng nghiên cứu trên thì các nghiên cứu về các dẫn xuất imine ngày càng thể hiện nhiều tiềm năng cho ngành dược phẩm. J.S.Shim và cộng sự [22] đã tổng hợp được một số dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC) và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC). OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 OH H3CO OH N NH NH2NH2.HCl Triethylamine AcOH, MeOH Hình 2.14: Phản ứng tổng hợp HC [22]. OCH3 OH H3CO OH O O OCH3 OH H3CO OH N N Triethylamine AcOH, MeOH NH.NH2 HO O HO O Hình 2.15: Phản ứng tổng hợp HBC [22]. Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BAEC (bovine aortic endothelial cell), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần so với Cur. Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào: HT29, NH3T3, Chang. Hình 2.16: Ảnh hưởng của nồng độ HC với các chủng tế bào ung thư khác nhau (theo phương pháp MTT) [22] 19 Riêng HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAEC mạnh hơn Cur nhưng kém hơn HC. HBC có hoạt tính ức chế mạnh lên tế bào HCT15, ở nồng độ 40µM HBC thì hầu như toàn bộ lượng tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48 giờ. Tuy nhiên, cũng như HC, HBC không thể hiện hoạt tính ức chế đối với APN (amino peptidase N). Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy HBC có khả năng cản trở quá trình phát triển của tế bào ung thư ruột kết (ruột già – HCT15 colon cancer cells) bằng cách kết hợp với nhóm chức năng trung gian khác là Ca2+/CaM [46]. Ca2+/CaM là một protein đa chức năng, bản thân nó không có hoạt tính nào đặc biệt nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy nó có liên quan và thường có những biểu hiện bất thường đối với một vài loại tế bào ung thư. Vì vậy, nó được xem như một chất mang lý tưởng cho các chất khác trong đó Ca2+ đóng vai trò là cầu nối gắn kết những chất có hoạt tính sinh học với CaM. Kết quả nghiên cứu cho thấy HBC có thể gắn trực tiếp lên protein Ca2+/CaM với độ tương thích cao. Hình 2.17: Ảnh hưởng của HBC đến sự phát triển của tế bào HCT15 và APN [22] 20 Bảng 2.4 : Giá trị IC50 của các dẫn xuất curcuminoid đối với tế bào BAEC [22] R1 R2 IC50 Curcuminoid, 1 1a 1b 1c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 1.5 ± 0.3 x 10-5 2.2 ± 0.5 x 10-5 5.3 ± 0.6 x 10-5 Hydrazino curcuminoid, 2 2a 2b 2c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 5.2 ± 0.4 x 10-7 1.8 ± 0.3 x 10-6 5.8 ± 0.2 x 10-6 Hydrazinobenzoyl curcuminoid, 3 3a 3b 3c OCH3 OCH3 H OCH3 H H 9.3 ± 0.4 x 10-7 2.4 ± 0.1 x 10-6 8.7 ± 0.2 x 10-6 C. Selvam và cộng sự [23] đã tổng hợp một số dẫn xuất imine–curcumin và qua khảo sát các hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này cho thấy dẫn xuất HC và isoxazolcurcumin (dẫn xuất 4 và dẫn xuất 7 của hình 2.18) có hoạt tính kháng oxy hóa ở mức độ in vitro (quét gốc DPPH), ở mức độ tiền invivo (trên động vật), ức chế cyclooxygenase (COX1/COX2), kháng viêm cao hơn Cur tương ứng. O O OH R1 OH R2 OHHO R2R1 NHN OHHO R2R1 NO 1. R1=R2=OCH3 2. R1=OCH3; R2=H 3. R1=R2=H 4. R1=R2 =OCH3 5. R1=OCH3; R2= H 6. R1=R2=H 7. R1=R2=OCH3 8. R1 = R2= H NH2-NH2. H2O CH3COOH NH2-OH. H2O CH3COOH Hình 2.18: Phản ứng tổng hợp một số dẫn xuất imine từ curcuminoid [23] 21 S. Mishra cùng các cộng sự [24] đã tổng hợp và tiến hành khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum (ký sinh trùng gây bệnh sốt rét) của một số dẫn xuất của Cur. Qua đó đã tìm ra được 2 dẫn xuất: Hydrazinocurcumin và 3-nitrophenylpyprazole curcumin có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium falciparum cao hơn so với Cur. N N HO OH H3CO OCH3 NO2 HO H3CO N NH OH OCH3 Hình 2.19: 3-nitrophenylpyrazolecurcumin Hình 2.20: Hydrazinocurcumin Curcuminsemicarbazone (CSC) được tổng hợp từ phản ứng thế một nguyên tử oxy của nhóm diketo trong Cur bằng nhóm semicarbazone [25]. Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất này thể hiện hoạt tính chống peroxy hóa lipid của microsome gây ra bởi bức xạ γ trong thử nghiệm TBARS tương tự như Cur. Cả hai chất đều thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa này ở mọi liều sử dụng, điều này chứng tỏ rằng cấu trúc diketon khi liên kết với các nhóm chức khác vẫn không mất đi hoạt tính sinh học của Cur. H3CO OCH3 O NNHCONH2 HO OH Hình 2.21: Công thức cấu tạo của CSC [24] Cur thể hiện hoạt tính bắt gốc DPPH nhanh hơn nhiều so với CSC. Điều này được lý giải là do có nhóm thế hút điện tử semicarbazone nên làm giá trị thế oxy hóa của nhóm phenolic trong CSC hơn trong Cur. Nhóm tác giả Đào Hùng Cường, Lê Hải Lợi (Đại học Đà Nẵng) [1] đã tổng hợp thành công dẫn xuất pyrazole giữa phenylhydrazin và Cur, dẫn xuất isoxazole giữa hydroxylamine và Cur. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế 22 gốc tự do DPPH của chúng kết quả cho thấy hai dẫn xuất này đều có khả năng kháng oxy hóa, có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn E.Coli, P.aeruginosa, B.subtillis, S.aureus. Tuy nhiên các hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất này đều kém hơn so với Cur. Tác giả Lê Xuân Tiến (Đại Học Bách Khoa TPHCM) [4] đã tổng hợp thành công isoxazolcurcumin (IOZ) và hydrazinocurcumin (HC) từ Cur. Qua khảo sát các hoạt tính sinh học của 2 dẫn xuất này cho thấy IOZ và HC có tính kháng oxy hóa tương tự như Cur. Trong đó IOZ và HC có khả năng gây độc cho dòng tế bào ung thư Hep-G2 cao hơn Cur riêng HC cho hoạt tính cao gấp 2 lần so với Cur. 23 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Sơ đồ thực nghiệm Quy trình thực hiện để đạt được những mục tiêu của đề tài đã đề ra sẽ được tiến hành theo sơ đồ thực nghiệm 3.1 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ thực nghiệm tiến hành nghiên cứu. Bột curcuminoid >=95% >=95% <9 5% Tổng hợp dẫn xuất Kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc Tinh chế sản phẩm Xác định các hoạt tính sinh học Kiểm tra độ tinh khiết, cấu trúc Phân lập curcumin 95 <9 5% 24 Từ nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid (Viện Dược Liệu Hà Nội) gồm ba thành phần là Cur, DMC và BMDC. Tiến hành tinh chế lần lượt qua hai bước: kết tinh lại và sắc k í cột để phân lập Cur có độ tinh khiết cao (≥ 95%). Sản phẩm thu được sẽ được kiểm tra độ tinh khiết bằng TLC và đo điểm nóng chảy. Sau đó, tổng hợp 2 dẫn xuất DFPHC và HBTC từ Cur tinh đã tách ở trên với 2,4-Difluorophenylhydrazine hydrochlorode, 2-Hydrazinobenzothiazole. Tinh chế sản phẩm và tiến hành kiểm tra cấu trúc và độ tinh khiết bằng TLC, IR, MS, NMR, … Xác định hoạt tính sinh học của hai dẫn xuất vừa tổng hợp được rồi so sánh các hoạt tính trên với Cur tinh. 3.2. Phương pháp thực hiện 3.2.1. Phân lập curcumin Nguyên liệu : Nguyên liệu ban đầu là bột curcuminoid thương phẩm của Viện Dược Liệu Hà Nội được chiết xuất từ nghệ vàng (Curcuma Longa L.). Quy trình phân lập Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập curcumin Hệ dung môi methanol - nước Thời gian 24 giờ, 50C Bột curcuminoid Kết tinh lại Tinh thể Curcumin Sắc ký cột Silicagel 60G 63-200µm Dung môi : 100% CH2Cl2 Cur tinh <9 5% >=95% 25 3.2.1.1. Kết tinh lại ™ Mục đích - Loại bỏ bớt một số tạp chất, chất nhựa trong nguyên liệu. - Thu phần tinh thể có hàm lượng Cur cao giúp cho quá trình sắc ký cột phân lập Cur được dễ dàng và cho hiệu suất cao. ™ Nguyên tắc. Dựa trên tính tan khác nhau của các chất trong dung môi theo nhiệt độ và độ tinh khiết của hỗn hợp đem kết tinh. ™ Phương pháp thực hiện Hóa chất, nguyên liệu Bảng 3.1: Nguyên liệu kết tinh lại STT Nguyên liệu Khối lượng 1 Bột curcuminoid 2g 2 Methanol 500ml 3 Nước cất 100ml Tiến hành Kết tinh lần 1 ƒ Hoà tan hoàn toàn 500mg bột curcuminoid trong methanol ở 50oC. ƒ Thêm từ từ nước cất (ở 50oC) vào cho đến khi dung dịch vừa đục. ƒ Bổ sung thêm methanol vào cho đến khi dung dịch trong trở lại. ƒ Để cho dung dịch trên từ từ hạ về nhiệt độ phòng rồi cho vào tủ đá kết tinh trong 24 giờ ở 5oC. ƒ Lọc hút chân không thu tinh thể chuẩn bị cho giai đoạn tiếp theo. Kết tinh lần 2, 3 ƒ Lấy phần tinh thể đã làm khô sau lần kết tinh trước đó, tiến hành lại các thao tác kết tinh như đã trình bày. ƒ Tinh thể thu được sau khi lọc cũng được làm khô chân không. Cân, ghi kết quả, chuẩn bị cho sắc ký cột. 26 3.2.1.2. Sắc ký bản mỏng (TLC) ™ Mục đích ƒ Xác định hệ dung môi chạy sắc ký cột. ƒ Kiểm tra thành phần, độ tinh khiết các phân đoạn trong sắc ký cột. ™ Nguyên tắc Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau. ™ Phương pháp thực hiện Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất Bảng 3.2 : Nguyên liệu khảo sát dung môi STT Nguyên liệu Khối lượng 1 2 3 4 5 6 Bột curcuminoid sau 3 lần kết tinh. Methanol Dicloromethane Cloroform Acetone Bản mỏng silica gel 60G, Merck 3-5mg 1chai (500 ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 1chai (500ml) 20x20cm2 ™ Tiến hành Chuẩn bị - Hoạt hóa bản mỏng silica gel bằng cách sấy 1giờ ở 110oC sau đó để cân bằng trong bình hút ẩm 30 phút. - Vuốt ống vi quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa mao quản 2 lần bằng acetone. Chấm mẫu lên bản mỏng - Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng methanol. - Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng. Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 1cm, hai bờ hai bên 1.5cm, và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 1cm. Kích thước của vết chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt. - Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. 27 Triển khai bản mỏng Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô. Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định. Bão hòa khí quyển trong bình triển khai từ 15-20 phút. Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại. Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 1cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai. Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. Phát hiện vết và tính trị số Rf Phát hiện vết qua mà