Đồ án Xác định hàm lượng axit amin thủy phân trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Từ các kết quả thu được chúng tôi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau. Chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng trong những đề tài khác, tiếp tục đánh giá các kết quả để có thể so sánh được hàm lượng axit amin trong những loài nấm khác nhau từ đó đánh giá được giá trị của các loài nấm và bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam.

doc90 trang | Chia sẻ: tienthan23 | Ngày: 18/02/2016 | Lượt xem: 1588 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đồ án Xác định hàm lượng axit amin thủy phân trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Axit amin không thiết yếu Loài Calvatia gigantean Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Threonin Tryptophan Valin 2,54 ± 0,21 28,74 ± 0,93 11,21 ± 0,19 2,53 ± 0,22 1,11 ± 0,01 15,45 ± 0,15 6,57 ± 0,10 30,06 ± 0,78 15,48 ± 0,18 Alanin Arginin aragin Axit Aspartic Cystein Axit Glutamic Glutamin Glycin Prolin Serin Tyrosin 4,38 ± 0,52 16,51 ± 1,08 1,23 ± 0,21 0,40 ± 0,08 <LOD 1,32 ± 0,05 3,46 ± 0,13 6,57 ± 0,23 10,03 ± 0,07 6,56 ± 0,11 17,95 ± 0,39 LOD: giới hạn phát hiện Từ kết quả nghiên cứu mẫu nấm C. gigantean ở bảng 2.5 cho thấy rằng có đầy đủ 20 axit amin tự do trong loài nấm này. Tổng hàm lượng axit amin thết yếu và axit amin không thiết yếu trong nấm này lần lượt là 113,69 mg/100 g và 85,96 mg/100 g, axit amin thiết yếu chiếm hơn 56% tổng axit amin. Như vậy, nấm là một nguồn lý tưởng của các axit amin thiết yếu, nấm C. gigantea có một lượng giá trị axit amin thiết yếu. Bảng 2.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [35] Loài Thr Val Met Ile Leu Phe His Lys EAA P. ostreatus (nấm sò tím) 0,42 0,44 0,09 0,33 0,53 0,29 0,18 0,28 2,56 F. velutipes (nấm kim châm) 0,22 0,35 0,06 0,24 0,38 0,27 0,13 0,15 1,79 Bảng 2.7: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [35] Loài Asp Glu Ser Gly Cys Arg Ala Pro Tyr NEAA P. ostreatus 0,56 1,04 0,54 0,44 - 0,35 0,8 0,37 0,20 4,30 F. velutipes 0,38 1,00 0,35 0,34 - 0,23 0,94 0,39 0,20 3,83 1.3. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 1.3.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển 1.3.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J, L. rất dễ thực hiện [8]. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axit amin. Tác giả Phạm Văn sổ và Bùi Thị Như Thuận (1978) đã dùng pyriđin làm dung môi triển khai chạy sắc ký bản mỏng, sau khi các axit amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axit amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác không cao. Ngày nay với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axit amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa. 1.3.1.2. Phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản đơn giản, nó là nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này. Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W, H. [46, 47, 48] và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axit amin ở nhiều đối tượng khác nhau. Nguyên lý cơ bản là axit amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM với hầu hết các axit amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho phân tích lượng lớn [54]. Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axit amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM. Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phản ứng được với các axit amin bậc 2. Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng tách đơn giản. 1.3.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách các axit amin ra khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axit amin sẽ được tách trên cột sắc ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dovvex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua cột là 0,5ml/phút, sau khi HC1 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH = 8,9 hỗn hợp của HCHO với HC1 IM (1:9) đã được trung hòa tới pH= 7 [7] . Từ lượng NaOH 0,1 M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mẫu trắng tính ra được hàm lượng các axit amin bằng bảng quy đổi. 1.3.2. Phương pháp sắc ký khí Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp. Tác giả Y. c. Fiamegos, c. D. Stalikas đã tách và xác định được 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS) và detector ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương pháp này, các axit amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclorometan rồi phân tích bằng phương pháp GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axit amin liên kết với protein sẽ được phân tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID [65]. Phương pháp sắc ký khí là một phương pháp tách rất phát triển và cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axit amin trong một số đối tượng khác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axit amin thông dụng là rất phức tạp và giá thành cao do axit amin là hợp chất không dễ bay hơi và không tan tốt trong các dung môi hữu cơ nên quá trình thực hiện khá phức tạp và tốn dung môi. Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn kém nên phương pháp sắc ký khí không được áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axit amin. 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nhỏ có chứa dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cưòng độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V (14-30 KV) đặt vào hai đầu mao quản. Phương pháp này tách các chất là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [3]. M. Umrnadi, B. C. Weimer đã phát triển phương pháp điện di mao quản huỳnh quang laze (CE-LIF) để phát hiện và định lượng 17 axit amin tại nồng độ mM, các axit amin được dẫn xuất với 3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolin-carboxaldehyd trước khi phân tích bằng CE-LIF. Môi trường tách là hệ đệm chứa: borat 6,25 mM, SDS 150 mM, và THF 10 mM (pH = 9,66) tại 25°C, điện thế 24 kV. Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 – 0,9% trong một ngày và từ 0,7 – 1,5% giữa các ngày. Các tác giả đã ứng dụng phương pháp này để theo dõi sự thay đổi nồng độ axit amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn [40]. 1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại và phát triển mạnh trong những năm 80, 90. Nó được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sinh hóa, hóa học, môi trường và đặc biệt với việc phân tích các vitamin và axit amin. Những nghiên cứu tách và xác định axit amin đã có số lượng lớn các bài báo công bố với các quy trình tách và xác định axit amin. Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin. Sau thủy phân các axit amin sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang. Các dẫn xuất này sẽ được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detector huỳnh quang (RF). Bằng phương pháp HPLC/RF, tác giả L. Bosch và cộng sự [39] đã tách và định lượng được 17 axit amin trong thức ăn trẻ em sử dụng tác nhân dẫn xuất 6- aminoquimolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamat (AQC). Tất cả các axit amin (trừ Cys và Met) được tách ra khỏi nền mẫu bằng sự thủy phân với HCl 6M trong môi trường khí trơ, ở 110°c trong 23 giờ. Quá trình dẫn xuất với AQC được thực hiện trong môi trường bazơ. Các dẫn xuất được tách trên cột Nova-Pak™, rửa giải bằng hỗn hợp đệm acetat-phosphat, acetonitril, nước theo chương trình gradient, phát hiện bằng detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm, em = 395 nm). Khoảng tuyến tính: 0,0025 – 0,2 mM; độ chính xác củạ phương pháp CV: 0,2 – 3,5% ; hiệu suất dẫn xuất: 86 - 106%, hiệu suất thu hồi của phương pháp: 88,3 – 118,2%. Giới hạn phát hiện: 0,016 – 0,367 mM; giới hạn định lượng: 0,044 – 1,073 mM. Sử dụng hai tác nhân dẫn xuất o-phthalaldehyd-3-mercaptopropionic axit (OPA) và 9-florenylmethyl cloroformat (FMOC) để dẫn xuất cho cả axit amin bậc 1 và bậc 2, tác giả D. Heems và cộng sự [22] đã tách và định lượng được 25 axit amin trong thức ăn, đồ uống. Các mẫu sau khi thủy phân axit với HCl 6M, được bay hơi tới khô dưới chân không, và hòa tan lại cặn bằng HC1 0,1M. Quá trình dẫn xuất trước cột của các mẫu lỏng được thực hiện tự động bởi thiết bị ASTED, sử dụng phản ứng kết hợp OPA/FMOC và được làm sạch bởi sự thẩm tích, rồi bơm vào hệ thống HPLC. Phổ huỳnh quang của các dẫn xuất OPA-3-MPA được ghi lại tại ex = 335 nm, em = 440 nm; còn các dẫn xuất FMOC tại ex =260 nm, em = 315 nm. Với hầu hết các axit amin, giới hạn phát hiện < 100 g/l, khoảng tuyến tính từ 0,5 - 100 mg/1. Bằng quá trình dẫn xuất trước cột tự động (SI) kết hợp với sắc ký lỏng (LC), C.K. Zacharis và cộng sự [21] đã xác định được 14 axit amin trong dược phẩm sử dụng chất dẫn xuất là o-phthaldialđehyd (OPA). Hệ thống SI có tác dụng lấy mẫu và hóa chất dẫn xuất, trộn và tự động đưa đến hệ thống bơm mẫu của LC. Bằng phương pháp sắc ký lỏng pha ngược cho phép tách và xác định 14 axit amin trong vòng 35 phút bằng phổ huỳnh quang với ex = 340 nm, em = 455 nm. Giới hạn phát hiện dưới 30g/1 cho tất cả các axit amin, khoảng tuyến tính 0,05 - 10 mg/l. Hiệu suất thu hồi của phương pháp nằm trong giới hạn xác định từ 93,8 - 108,6%. Phương pháp HPLC rất thích hợp để tách và xác định đồng thời nhiều chất trong các hỗn hợp khó như retinoit, carotenoit, axit amin mà trước đây các phương pháp khác gặp khó khăn. Ưu điểm nổi bật của HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất. Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn xuất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô cơ không tốn kém. Chính vì những ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin. Phương pháp cần được nghiên cứu và phát triển để ứng dụng phân tích trong mẫu thực phẩm và sinh học. Hình 1.1: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 series. Cân phân tích độ chính xác 0,0001g. Tủ sấy. Hệ thống hút chân không. Máy đo pH. Máy nghiền mẫu. Máy siêu âm. Dụng cụ Pipet: 1, 2, 5 ,10 ml; micropipet Ống ly tâm dung tích 10, 50ml Các bình định mức: 10, 20, 50, 100ml Cốc có dung tích 25, 50, 250, 500, 1000 ml Ống đong 50, 100, 200, 250 ml Màng lọc 0,45 2.1.2. Hóa chất Các loại hóa chất dùng trong phân tích đều thuộc loại tinh khiết phân tích. - Dung dịch chuẩn: hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol/, 25pmol/ và 100pmol/. Natri acetate trihydrate NaCH3COO.3H2O (NaAc) Dung dịch HCl đặc 37% Thuốc thử FMOC (9- fluorenylmethylchloroformate in acetonitrile) Trietylamin (TEA) C6H15N; tetrahidrofuran (THF) Natri tetraborat (Na2B4O7.10H2O) Acetonitril và methanol Ÿ Axit acetic 2%: Dùng pipet hút 2 ml axit acetic cho vào bình định mức 100 ml. Định mức đến vạch bằng nước cất đề ion thu được axit axetic 2%. Ÿ Natri tetraborat (Na2B4O7) 0,25M: Cân 47,75g Na2B4O7.10H2O hòa tan trong nước cất đề ion, định mức về 500 ml bằng nước cất đề ion. Ÿ Pha động A Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF). Ÿ Pha động B Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng axit acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitrin và 200 ml methanol. - Chất tạo dẫn xuất OPA (ortho-phthaladehyde) phản ứng với các axit amin trong sự có mặt của các hợp chất thiol hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho việc tạo các dẫn xuất trong phân tích các axit amin bằng sắc kí trao đổi ion. Trên cơ sở điều kiện phòng thí nghiệm, để xác định các axit amin trong nấm chúng tôi tiến hành dẫn xuất trước cột các axit amin bằng dẫn xuất OPA và FMOC. Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất tiền cột là tạo dẫn xuất của các axit amin với OPA, tiếp theo là tách HPLC pha ngược, sắc kí lỏng được trang bị một đầu dò fluorescence để phát hiện các dẫn xuất axit amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA-axit amin được theo dõi với bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Dẫn xuất này có độ nhạy rất cao. cơ chế phản ứng như sau. (Sản phẩm cuối cùng là Isoindole) Theo cơ chế trên thì OPA phản ứng bước 1 có thể với cả amin bậc 1 và bậc 2 nhưng chỉ có amin bậc 1 mới cho sản phẩm là isoindol có vòng kín 5 cạnh và phát huỳnh quang. Vì vậy với việc dẫn xuất bằng OPA không cho phép xác định axit amin bậc 2. Để xác định axit amin bậc 1 bằng OPA phải thực hiện khi có mặt của axit 3-mercapto proionic (3-MPA) ở pH=10, cơ chế: OPA axit amin bậc 1 axit 3-mecapto propionic dẫn xuất isoindol Không như những axit amin bậc 1 ban đầu, các dẫn xuất isoindol được tạo thành sẽ phát huỳnh quang. Bằng cách dẫn xuất các axit amin với OPA và đo ở bước sóng kích thích 340nm và bước sóng phát xạ 450nm. Để xác định được axit amin bậc 2 ta cần sử dụng thêm dẫn xuất FMOC: Dẫn xuất của FMOC 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Thu thập mẫu nấm. Mẫu nấm tự nhiên được thu thập từ các rừng Quốc Gia Phù Mát và rừng Phong Nha Kẻ Bàng, sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó bảo quản trong tủ lạnh. 2.2.2. Xử lí mẫu. Chuẩn bị mẫu nấm đã được đồng nhất, xay nhỏ cho vào lọ đựng. - Cân chính xác 1g nấm bằng cân phân tích chính xác 0,0001 cho vào ống chịu nhiệt. Cho 3 ml dung dịch HCl 6M vào ống đựng mẫu lắc đều và làm hòa tan mẫu bằng cách đặt ống vào máy siêu âm trong vòng 10 phút, loại bỏ không khí trong vòng 15 phút. Thủy phân mẫu bằng cách cho vào tủ sấy và đặt nhiệt độ tủ sấy ở 1250C trong 24h. Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy để nguội, điều chỉnh về pH = 5 6 bằng Na2B4O7 0,25M. Lọc qua giấy lọc thường và điều chỉnh về pH = 9 10 bằng Na2B4O7 0,25M. Sau đó định mức vào bình 50ml với nước cất đề ion. Lọc qua màng lọc 0,45, cho mẫu vào vial tiến hành chạy trên máy HPLC. Quá trình chẩn bị mẫu được tóm tắt bằng sơ đồ sau: LƯỢC ĐỒ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cân 1g mẫu 3ml HCl 6M Ống nghiệm Đánh siêu âm mẫu 10 phút Loại bỏ không khí bằng máy hút chân không Thủy phân mẫu ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Lấy mẫu ra khỏi tủ sấy Để nguội, mở ống nghiệm, điều chỉnh về PH = 5 – 6 bằng Na2B4O7 0,25M Lọc qua giấy lọc Điều chỉnh về PH =9 ÷10 bằng Na2B4O7 0,25M Định mức vào bình 50ml Lọc qua màng lọc 0,45µm Chạy mẫu trên hệ thống HPLC 2.2.3. Tiến hành phân tích trên máy Cột sắc ký: cột C18 150 4,6mm, kích thước hạt 5μm. Nhiệt độ cột: 450C. Tốc độ dòng: 0,5ml/phút. Pha động: Pha động A: Pha động B theo gradient : TT Time (min) A % B % Flow (ml/min) 1 0 100 0 0,5 2 18 0 100 0,5 3 18,1 0 100 0,5 4 18,5 0 100 0,8 5 23,9 0 100 0,8 6 24 0 100 0,5 7 25 100 0 0,5 - Chương trình bơm mẫu: TT Chương trình 1 Hút 5từ vial 10 – Đệm borate 2 Hút 1 từ vial 11 – Dẫn suất OPA 3 Hút 0 từ vial 12 – Nước 4 Hút 1 từ vial chứa mẫu 5 Hút 0 từ vial 11 – Nước 6 Trộn mẫu 7 Hút 1 từ vial 14 – FMOC 8 Hút 0 từ vial 12 – Nước 9 Trộn mẫu 10 Bơm mẫu - Đầu dò huỳnh quang bước sóng kích thích = 340nm, bước sóng phát xạ= 450 nm. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xây dựng đường chuẩn Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol để xác định khoảng tuyến tính của 17 axit amin. Kết quả đo được như sau: Hình 3.1: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10pmol Hình 3.2: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25pmol Hình 3.3: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100pmol Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/) của axit amin TT Axit amin Nồng độ Diện tích Nồng độ Diện tích Nồng độ Diện tích 1 Asp 10 918,90765 25 1710,64294 100 5496,87207 2 His 10 510,25375 25 1177,97742 100 4722,54395 3 Thr 10 948,26996 25 2164,69751 100 8251,57422 4 Tyr 10 878,52673 25 2247,63525 100 8347,11035 5 Ile 10 1316,59045 25 3005,27686 100 11251,700 6 Glu 10 570,48480 25 1088,09412 100 4358,87207 7 Ser 10 1021,77795 25 2183,39722 100 8127,51758 8 Gly 10 1089,90881 25 2269,00244 100 8475,58496 9 Ala 10 1964,74426 25 4545,54541 100 12645,000 10 Cys-ss-cys 10 278,71521 25 746,77118 100 2604,47350 11 Val 10 1036,72620 25 2218,25806 100 8452,68523 12 Met 10 1049,86084 25 2753,15942 100 10393,100 13 Phe 10 725,73773 25 1790,02100 100 6737,20166 14 Leu 10 1069,91785 25 2494,30664 100 9461,74219 15 Lys 10 348,24469 25 912,37457 100 3495,46118 16 pro 10 1648,60986 25 4539,64209 100 6955,32373 Từ kết quả xác định được ở bảng 3.1, vẽ đồ thị sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký vào nồng độ axit amin ta có đường chuẩn như sau: (x là nồng độ, y là diện tích pic) Hình 3.4: Đường chuẩn định lượng His Hình 3.5: Đường chuẩn định lượng Thr y = 47.06720x + 14.91559 y = 81,82352x + 83.06823 R2 = 0.99997 R2 = 0.99989 Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng Tyr Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng Ile y = 83.81909x + 55.27848 y = 111.54817x + 126.72174 R2 = 0,99983 R2 = 0,99982 Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Glu Hình 3.9: Đường chuẩn định lượng Ser y = 43.06935x + 50.69149 y = 79.99255x + 145.80702 R2 = 0.99947 R2 = 0.99965 Hình 3.10: Đường chuẩn định lượng Gly Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Ala y = 83.21861x + 168.42053 y = 123.43145x + 545.73923 R=0.99956 R2= 0.99388 Hình 3.12: Đường chuẩn định lượng Asp Hình 3.13: Đường chuẩn định lượng Leu y = 52.48837x + 287.51183 y = 93.90726x + 89.52055 R2 = 0.99692 R2 = 0.99989 Hình 3.14: Đường chuẩn định lượng Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Val Cys – SS – Cys y = 25.81115x + 37.63455 y = 83.32034x + 130.07620 R2 = 0.99936 R2 = 0.99973 Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng Met Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Phe Met: y = 103.81416x + 38.54980 Phe: y = 67.09587x + 45.26631 R2 = 0.99988 R2 = 0.99989 Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Lys Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Pro y = 34.94990x + 7.34645 y =53.82445x – 13.40806 R2 = 0.99993 R2 = 0.99931 3.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp Giới hạn phát hiện ( LOD) Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp định lượng). LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền. Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp. Chất nào nhạy hơn sẽ có giới hạn phát hiện nhỏ Giới hạn định lượng (LOQ) : LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy 95% . Theo lí thuyết thống kê trong hóa phân tích thì LOQ là nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường nền. Công thức tính giá trị LOD và LOQ : Trong đó: SD là độ lệch chuẩn n là số lần phân tích lặp lại của mẫu i k là số bậc tự do (k= n-1) xi là giá trị nồng độ mẫu tại lần đo thứ i là giá trị nồng độ trung bình của n lần đo a : Là hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính (y = ax +b) Tiến hành đo lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ chuẩn ta có bảng giá trị LOD và LOQ của Aspartic như sau: Bảng 3.2: Giá trị LOD và LOQ của axit Aspartic Nồng độ chuẩn (pmol) Nồng độ đo được SD SD(tb) LOD pmol LOQ Pmol Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 12,29757 12,20815 12,21738 0,04015 0,03274 0,0019 0,0063 25 24,08097 24,10468 24,06121 0,01777 100 99,04614 99,11618 99,14143 0,04030 Tương tự, khi tiến hành đo lặp lại 3 lần dãy các nồng độ chuẩn (10, 25, 100 pmol) của 16 axit amin còn lại ta có kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được chỉ ra ở bảng 3.3. Bảng 3.3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp TT Axit amin LOD (pmol) LOQ (pmol) 1 Asp 0,0019 0,0063 2 Glu 0,0027 0,0090 3 Ser 0,0021 0,0070 4 His 0,0060 0,0200 5 Gly 0,0037 0,0125 6 Thr 0,0025 0,0084 7 Ala 0,0006 0,0020 8 Try 0,0046 0,0153 9 Cys-ss-cys 0,0029 0,0097 10 Val 0,0036 0,0120 11 Met 0,0010 0,0033 12 Phe 0,0022 0,0073 13 Ile 0,0013 0,0043 14 Leu 0,0014 0,0047 15 Lys 0,0015 0,005 16 Pro 0,0029 0,0097 Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy khoảng giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là rất nhỏ chứng tỏ thiết bị phân tích có độ nhạy cao. Như vậy phương pháp này hoàn toàn phù hợp để xác định hàm lượng axit amin dạng vết trong mẫu phân tích. 3.3. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu 3.3.1. Khảo sát nồng độ axit HCl Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm Thượng hoàng) cùng với chuẩn axit amin 25pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ : 4M; 6M; 7M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C trong thời gian 24h. Kết quả thực nghiệm cho thấy nồng độ HCl ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu suất thủy phân. Khi nồng độ HCl thấp, mẫu thủy phân không hoàn toàn, hiệu suất thấp, còn khi nồng độ HCl đủ lớn mẫu thủy phân hoàn toàn. Hình 3.20: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 4M Hình 3.21: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 6M Hình 3.22: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 7M Bảng3.4: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi TT Nồng độ HCl (M) Axit amin Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cos (pmol) H% Cs+mẫu Cmẫu 1 4 Val 78,20105 58,60855 19,5925 25 78,37 6 Val 77,12652 53,83017 23,29635 25 93,19 7 Val 94,67967 82,07970 12,59997 25 50,40 2 4 Ser 70,0778 51,12522 18,95251 25 75,81 6 Ser 46,55488 37,16798 9,38690 25 93,87 7 Ser 80,16694 60,07444 20,09250 25 80,37 3 4 Gly 56,85719 43,16463 15,69256 25 62,77 6 Gly 57,20037 35,11787 22,0825 25 88,33 7 Gly 71,83441 59,46321 12,3712 25 49,48 4 4 Leu 60,70277 46,69294 14,00983 25 56,04 6 Leu 57,87564 38,27814 19,5975 25 78,39 7 Leu 75,05681 61,20772 14,74909 25 59,00 Trong đó: Cos là nồng độ chuẩn thêm vào (pmol) Cs+mẫu là nồng độ mẫu thêm chuẩn (pmol) Cmẫu là nồng độ mẫu phân tích (pmol) Hình 3.23: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl Từ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào nồng độ HCl thủy phân cho thấy khi nồng độ axit HCl chưa đủ để thủy phân mẫu thì hiệu suất thu hồi của một số axit amin nhỏ hơn 100%, có thể do lẫn tạp chất hoặc chưa tách được hoàn toàn. Từ nồng độ 5,5-6M thì hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định và các hiệu suất thu được đều lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị mẫu nấm Thượng hoàng và mẫu nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 25pmol tiến hành thủy phân trong môi trường HCl 6M, nhiệt độ 1250C và thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau : 20h, 22h, 24h, 26h. Hình 3.24: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 20h Hình 3.24: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 22h Hình 3.26 : Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng tại thời gian thủy phân 24h Hình 3.27: Sắc đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng thủy phân 26h Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi TT Thời gian (h) Axit amin Nồng độ (pmol) Cs+mẫu - Cmẫu Cos (pmol) H% Cs+mẫu Cmẫu 1 20 Met 13,89374 3,74293 10,15081 25 101,51 22 Met 46,39152 32,79879 11,59273 25 115,93 24 Met 31.81972 7,07722 24,74251 25 98,97 26 Met 53.60454 30,87333 22,73 25 90,92 2 20 Ser 173,41949 164,48299 8,93650 25 89,36 22 Ser 136.45201 113,74197 22.71003 25 90,84 24 Ser 46.55488 37,16798 9,38690 25 93,87 26 Ser 115,10768 104,07405 11,03318 25 110,33 3 20 Thr 190.99758 169,27693 21.72065 25 86.88 22 Thr 140.40317 119,86729 20.53586 25 82.14 24 Thr 24.48210 0,627899 23.85420 25 95.42 26 Thr 134.14618 109,49253 24.65365 25 98.61 4 20 Ala 157.45626 130,81709 26.63917 25 106,56 22 Ala 136.99577 114,66710 22.32867 25 89.31 24 Ala 87.02606 62,92079 24.10527 25 96.42 26 Ala 121,07270 111,74550 9,32720 25 93,21 Hình 3.28: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân Kết quả ở bảng 3.5 và hình 3.28 cho thấy dưới 20h mẫu chưa được thủy phân hoàn toàn, các axit amin chưa tách hết khỏi tạp chất nên cho hiệu suất thu hồi không ổn định. Khi thời gian thủy phân lớn hơn 20h đủ để tách được các axit amin ra khỏi nền mẫu nên hiệu suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 24h-26h cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, đều lớn hơn 90%, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%) và ổn định. Vậy nên chúng tôi chọn 24h là thời gian thủy phân mẫu phân tích. Từ các kết quả thu được khi khảo sát nồng độ axit HCl và thời gian thủy phân đã trình bày ở trên chúng tôi đề xuất lược đồ quy trình phân tích ở mục 2.4.3 cho axit amin thủy phân. 3.5. Độ thu hồi của phương pháp Đây là thông số không thể thiếu khi đánh giá một phương pháp phân tích. Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực cùng với làm mẫu thực không thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau : Hiệu suất thu hồi: Trong đó: H%: hiệu suất thu hồi Cs+m: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cm : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thực Cso: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên một mẫu nấm đã xác định được hàm lượng các axit amin ở phần xác định độ lặp lại của phương pháp, đó là mẫu nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen. Tiến hành thí nghiệm trên nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen và nấm Thượng hoàng, nấm Linh chi đen thêm chuẩn 25pmol, dựa vào phương trình đường chuẩn thu được kết quả của mẫu thêm chuẩn và đem so sánh với nồng độ chuẩn thêm vào, thực hiện phân tích 5 lần lặp lại và lấy kết quả trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6 và bảng 3.7. Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Thượng Hoàng Axit amin Cso+mẫu Cmẫu () Cso () H (%) Asp 20,4077 16,1328 3,2028 133,47 Glu KPH KPH 3,5528 KPH Ser 6,4624 3,9026 2,5776 99,31 His 16,1418 12,5187 3,8410 94,32 Gly 4,2489 2,6338 1,8349 88,02 Thr KPH 0,2749 2,9451 KPH Ala 7,8525 5,5600 2,2060 103,92 Arg - - - - Tyr 4,9700 0,6301 4,5359 95,68 Cys – ss – Cys 8,3112 5,4216 3,0462 94,86 Val 9,0238 6,2981 2,9727 94,88 Met 4,4149 1,0545 3,7433 89,77 Phe 13,4033 8,8533 4,1191 110,46 Ile 3,4496 0,4465 3,2420 92,63 Leu 7,9043 5,0144 3,2500 88,92 Lys 7,0297 3,4539 3,6675 97,50 Pro 8,4506 5,6383 2,9027 96,88 Bảng 3.7: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Linh chi đen Axit amin Cso + mẫu () Cmẫu () Cso () H(%) Asp 45,3615 42,0659 3,2028 102,89 Glu KPH KPH 3,5528 KPH Ser 12,5491 10,1270 2,5776 93,97 His 52,5135 48,8215 3,8410 96,12 Gly 12,0672 10,3712 1,8349 92,43 Thr 3,5380 0,6982 2,9451 96,43 Ala 6,9751 4,9373 2,2060 92,37 Arg - - - - Tyr 8,9565 4,6159 4,5359 95,69 Cys – ss – Cys 41,0087 38,1906 3,0462 92,51 Val 29,8559 28,2817 2,8727 89,61 Met 4,9564 1,4930 3,7433 92,52 Phe 13,1158 8,9175 4,1191 101,92 Ile 16,1063 12,9941 3,2420 96,00 Leu 26,6805 22,8014 3,2500 88,58 Lys 7,9765 4,5554 3,6675 93,28 Pro 29,1281 26,4860 2,9027 91,02 Các kết quả về hiệu suất thu hồi giao động từ khoảng 88% đến 105%. Theo AOCA, ở khoảng nồng độ của các axit amin đang xét thì độ thu hồi chấp nhận được là từ 80 - 110%, như vậy phương pháp áp dụng cho mẫu nấm Thượng hoàng và nấm Linh chi đen có độ thu hồi tốt. Hình 3.29: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Thượng hoàng Hình 3.30: Sắc đồ tách axit amin trong dịch nấm Thượng hoàng thêm chuẩn 3.6. Xác định hàm lượng các axit amin trong các mẫu nấm Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích axit amin trong mẫu nấm. Đánh giá thống kê quy trình phân tích axit amin đều đạt trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm 7 mẫu nấm tự nhiên: nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, nấm PL4, nấm Linh chi, nấm Linh chi đen. Hàm lượng axit amin (μg/g) có trong mẫu được tính theo công thức sau : Trong đó : -  C là hàm lượng axit amin có trong mẫu, tính theo μg/g -  Co: Hàm lượng axit amin có trong dịch chiết tính thông qua đường chuẩn () -   m: lượng mẫu nấm phân tích (g) - V: Thể tích định mức mẫu (ml) (bảng quy đổi đơn vị pmol/sang ở phần phụ lục 2) 3.6. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin thủy phân Mẫu nghiên cứu gồm 7 loại nấm được tiến hành phân tích theo lược đồ quy trình phân tích. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các axit amin trong 1g mẫu nấm Thượng hoàng được chỉ ra ở bảng 3.9 và các sắc đồ từ hình 3.31 đến hình 3.38. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các axit amin trong 1g mẫu nấm Thượng hoàng được chỉ ra ở bảng 3.8. Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin trong nấm Thượng hoàng TT Axit amin Diện tích Hàm lượng () 1 Thr 134,44516 23,0217 2 Val 4615,22412 527,4791 3 Met 773,26526 88,3166 4 Ile 506.93848 37,3953 5 Leu 3684,11597 419,9665 6 Phe 3645,38525 741,4824 7 Lys 834,16046 289,2747 8 His 3816,34302 1048,4690 Tổng axit amin thiết yếu 3175,4053 9 Asp 6654,29736 1351,1558 10 Glu KPH KPH 11 Ser 3118,96802 326,8509 12 Gly 3090,88110 220,5863 13 Cys – ss – Cys 1194,14832 454,0703 14 Ala 8312,14355 469,0075 15 Arg - - 16 Tyr 344,86682 52,7696 17 Pro 4175,47900 472,2161 Tổng axit amin không thiết yếu 3346,6565 Tổng 6522,0618 EAA/TAA 48,68% Hàm lượng các mẫu nấm PL1, PL2, PL3, PL4, Linh chi , Linh chi đen được tính toán tương tự, kết quả được chỉ ra ở bảng 3.9 và các sắc đồ từ hình 3.31 đến 3.38. Hình 3.31: Sắc đồ tách axit amin trong dịch mẫu nấm Linh Chi Đen Hình 3.32: Sắc đồ tách axit amin trong dịch nấm Linh Chi Đen thêm chuẩn Hình 3.33: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL1 Hình 3.34: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL2 Hình 3.35: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL3 Hình 3.36: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL4 Hình 3.37: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh Chi Hình 3.38: Sắc đồ tách axit amin trong dịch thủy phân nấm Linh Chi Đen Bảng 3.9: Hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm TT Axit amin Nấm PL1 Nấm PL2 Nấm PL4 Nấm PL3 Nấm Linh Chi Linh Chi Đen 1 Thr KPH 7.32 7.62 KPH 27,96 69.56 2 Val 2039.50 KPH 1195.31 1197.4 1498,76 2717.84 3 Met 149.43 51.90 15.11 9.36 321,18 148.73 4 Ile 729.08 108.66 219.41 251.45 396,45 1294.49 5 Leu 1785.60 537.61 1052.79 1062.11 952,02 2271.51 6 Phe 3175.21 747.98 1624.62 1737.25 2258.77 888.37 7 Lys 493.46 207.77 690.36 483.99 672.97 453.82 8 His 4348.93 1037.40 2488.49 2510,92 2421.66 4863.67 Tổng axit amin thiết yếu 12721.1 2698,64 7365.71 7252.48 8549.77 12707.9 9 Asp 3876.80 882.97 1812.52 1797.90 1558.60 4190.67 10 Glu KPH KPH KPH KPH KPH KPH 11 Ser 1286.11 0 771.86 762.50 277.79 1008.87 12 Gly 1052.69 KPH 560.67 609.05 313.02 1033.28 13 Cys – ss – Cys 3082.47 1980.87 1410.38 1955.63 1018.8 3804.60 14 Ala 1192.51 270.37 723.62 685.38 935.96 491.86 15 Arg _ _ _ _ _ _ 16 Tyr 266.17 83.64 102.65 108.27 130.41 459.84 17 Pro 1511.82 556.47 825.85 973.07 1251.27 2638.57 Tổng axit amin không thiết yếu 12268.7 3774.32 6207.55 6891.8 5485.85 13627.9 Tổng 24989.8 6472.96 13573.26 14144.8 14035.62 26335.8 EAA/TAA 50.91% 41.69% 54.27 % 51.28% 60.91% 48.25% Bảng 3.8 và bảng 3.9 cho thấy trong 7 loại nấm thì nấm Linh Chi Đen có tổng hàm lượng các axit amin cao nhất (26335.8 μg/g), nấm PL2 thấp nhất (6472.96 μg/g). Nếu so sánh với một số loài nấm trên thế giới đã được nghiên cứu về hàm lượng như nấm sò tím 6,86 g/100g = 68600 μg/g và nấm kim châm Hàn Quốc 5,62 g/100g = 56200 μg/g (Lee, K, J et at., 2011), hay loài Dictyophora indusiata (nấm lưới trắng) là loài có hàm lượng axit amin (8000mgkg-1) thấp nhất trong 41 loài nấm Vân Nam (mục 1.2.5) thì có thể nhận xét các mẫu nấm hàm lượng trung bình còn thấp. Như vậy, tùy thuộc từng loài nấm, môi trường sốngmà nấm có hàm lượng protein khác nhau. Trong thành phần của cả 7 loại nấm này đều chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu cho cơ thể. Tỉ lệ EAA/TAA từ 41.69% (nấm Pl2) đến 60,91% (nấm Thượng Hoàng) suy ra tỉ lệ EAA/NEAA từ 0,78 – 1.56. Như vậy tỉ lệ EAA/NEAA của 7 loại đáp ứng tốt với giá trị tham khảo là 0,6 đề nghị bởi PAO/WHO (1973), tuy nhiên axit amin Arg không được định lượng trong các mẫu do đó ảnh hưởng khách quan đến kết quả. Cả 7 loại nấm này là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng có chứa đầy đủ các axit amin thiết yếu. Hàm lượng Glu và một số acid amin khác quá nhỏ trong một vài loại nấm nên không thể định lượng được. Chúng tôi cũng tiến hành xác định axit amin thủy phân ở các loại nấm PL1, Pl2, Pl3, Pl4, Thượng Hoàng được xử lí mẫu nguyên liệu theo các phương pháp khác nhau. Kết quả ở bảng 3.10. Bảng 3.10.Hàm lượng các axit amin trong mẫu nấm theo các phương pháp xử lí mẫu khác nhau TT Axit amin Nấm PL1 HL- ĐK Nấm PL1 HL- CK Nấm PL1 HL- T Nấm PL2 HL- T Nấm PL2 HL-CK Thượng Hoàng HL- T Nấm PL3 HL- T Nấm PL4 HL-CK 1 Thr 114,34 KPH 24,04 KPH 0 0 0 0 2 Val 0 1647,34 0 2019,58 2582,3 0 1997,9 2401,8 3 Met 300,80 217,27 107,05 369,65 418,02 128,03 106,10 234,19 4 Ile 160,42 198,67 0 232,34 286,23 0 KPH 0 5 Leu 1219,18 1433,88 464,26 2318,08 3120,5 462,75 2544,2 1251,18 6 Phe 135,11 1555,73 481,56 2389,19 2987,1 498,79 2543,5 1233,3 7 Lys 667,68 627,64 201,09 861,04 1091,0 319,69 751,48 1011,4 8 His 1817,90 1688,69 783,28 2587,22 3407,9 1246,9 2770,8 2055,3 Tổng axit amin thiết yếu 4415,43 7369,22 2061,28 10777,1 13893,1 2656,16 10713,9 8187,2 9 Asp 1386,88 1203,08 296,17 2285,56 2818,5 749,18 2860,2 1202,9 10 Glu KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 11 Ser KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 12 Gly KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH KPH 13 Cys – ss – Cys 4951,88 3601,55 2701,1 4531,36 5943,4 3059,7 1439,6 5905,8 14 Ala KPH 0 KPH 0 0 0 0 0 15 Arg _ _ _ _ _ _ _ _ 16 Tyr 614,84 608,27 294,29 364,36 921,29 279,65 272,96 1033,8 17 Pro 4988,89 3460,9 1536,1 5020,9 4633,5 3519,9 3852,8 5634,6 Tổng axit amin không thiết yếu 11942,49 8873,8 4827,66 12202,18 14316,7 7608,43 8425,56 13777,1 Tổng 16357,92 8947,50 6888,94 22979,28 28209,8 10264,6 19139,5 21964,3 EAA/TAA 27,00% 82,36% 29,92% 46,90% 49,25% 25,88% 55,98% 37,28% Từ bảng 3.10 ta thấy ở các điều kiện xử lí mẫu khác nhau làm ảnh hưởng đến hàm lượng các acid amin ở các mức độ khác nhau. Thr bị mất đi khi sử dụng phương pháp chiết hồi lưu, sấy đông khô để xử lí mẫu. KẾT LUẬN Trên cơ sở các nhiệm vụ được đặt ra và các kết quả đã đạt được chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Khảo sát tối ưu hóa một số điều kiện trong quy trình thủy phân xử lý mẫu xác định hàm lượng axit amin trong nấm : + Thời gian thủy phân mẫu tối ưu là 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ưu là 6M 2. Đã xây dựng được các phương trình đường chuẩn của các axit amin và xác định được khoảng nồng độ nghiên cứu nằm trong khoảng tuyến tính. 3. Xác định được giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp là rất nhỏ: LOD từ 0,0006 – 0,0060 pmol, LOQ từ 0,0020 – 0,0153 pmol. 4. Quy trình phân tích đưa ra đã được đánh giá bằng đường chuẩn, độ thu hồi. Độ thu hồi với các loại axit amin nằm trong khoảng 85,6 – 133,8% trong vùng đường chuẩn tuyến tính. 5. Xác định được hàm lượng axit amin thủy phân trong 7 mẫu nấm tự nhiên, cụ thể: TT Mẫu nấm Hàm lượng axit amin thủy phân(μg/g) 1. Nấm PL1 24989.8 2. Nấm PL2 6472.96 3. Nấm PL3 13573.26 4. Nấm PL4 14144.8 5. Nấm Thượng hoàng 6522.06 6. Nấm Linh chi 14035.62 7. Nấm Linh chi đen 26335.8 Từ các kết quả thu được chúng tôi thấy phương pháp phân tích hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm với độ tin cậy cao và đề nghị được áp dụng phương pháp phân tích axit amin này cho nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau. Chúng tôi mong muốn được tiếp tục nghiên cứu để hoàn chỉnh và mở rộng trong những đề tài khác, tiếp tục đánh giá các kết quả để có thể so sánh được hàm lượng axit amin trong những loài nấm khác nhau từ đó đánh giá được giá trị của các loài nấm và bổ sung số liệu vào bảng thành phần thực phẩm Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Trung thuần, Phạm Thị Thu, (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất bản Phụ Nữ- Hà Nội, trang 28-52. 2. Phạm Luận (1987), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khoa Hóa học - Trường Đại học Tổng Hợp Hà Nội 3. Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký điện di mao quản hiệu suất cao, Khoa Hóa học - Trường ĐHKHTN Hà Nội. 4. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận (1978), Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật – Hà Nội, trang 128-183. 5. Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn ở Việt Nam tập I, Nhà xuất bản khoa học tự nhiên và công nghệ. 6. Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2008), Thành phần loài nấm dược liệu của Việt Nam, Tạp chí di truyền học và ứng dụng – chuyên san công nghệ sinh học, 4, 39-42. Tiếng Anh 7. AOAC Official Method (2000), Monosodium Glutamate in food, Potentiometric Titration Method, C. 970.37. 8. Bailey, J.L. (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin, Techniques in Protein Chemistry, Elsevier, Amsterdam, pp 73-81. 9. Bano Z., Rajarathnam, S. (1988), Pleurotus mushroom, CRC Crit Rev Food Sci Nutr, 27, 87–158. 10. Bano, Z., Rajathnam, S. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 363-380, 1982. 11. Barros L, Cruz T, Baptista P, Estevinho LM, Ferreira ICFR. (2008), Food Chem Toxicol, 46:2742–7. 12. Barros, L., Baptista, P., Correira, D. M., Casa, S., Oliveira, B., & Ferreira, I. C. F. R. (2007a), Fatty acid and sugar compositions, and nutritional value of five wild edible mushrooms from Northeast Portugal, Food Chemistry, 105, 140–145. 13. Barros, L., Venturini, B. A., Baptista, P., Estevinho, L. M., & Ferreira, I. C. F. R. (2008), Chemical composition and biological properties of Portuguese wild mushrooms: A comprehensive study, Journal of Agricultural and Food Chemistry. doi:10.1021/jf8003114. 14. Bauer-Petrovska, B. (2001). Protein fractions in edible Macedonian mushrooms. European Food Research and Technology, 212, 469–472. 15. Belitz, H.-D., & Grosch, W. (1999), Food chemistry, Berlin: Springer. 16. Cavalieri, C., Bolzoni, L., & Bandini,M. (2010), Nicotine determination in mushrooms by LC-MS/MS with preliminary studies on the impact of drying on nicotine formation. Learning, Media and Technology, 27, 473. 17. Chang, S, T. (1980), Mushroom as human food, Bioscience, 30, 399-401. 18. Chen, S.-Y., Ho, K.-J., Hsieh, Y.-J., Wang, L.-T., & Mau, J.-L. (2012), Contents of lovastatin, c-aminobutyric acid and ergothioneine in mushroom fruiting bodies and mycelia, LWT-Food Science and Technology, 47, 274–278. 19. Colak, A., Faiz, Z., & Sesli, E. (2009), Nutritional composition of some wild edible mushrooms, Turkish Journal of Biochemistry, 34, 25–31. 20. Colak, A., Kolcuoglu, Y., Sesli, E., & Dalman, O. (2007), Biochemical composition of some Turkish fungi, Asian Journal of Chemistry, 19, 2193–2199. 21. Constantinos K. Zacharis, Georgios A. Theodoridis, Anastasios N. Voulgaropoulos (2005), Coupling of sequential injection with liquid chromatography for the automated derivatization and on-line determination of amino acids, Talanta, 68, p.448-458. 22. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1988), Full automated precolumn derivatization, on-line dialysis and highperformance liquid chromatographic analysis of amino acids in food, beverages and feedstuff, Journal of chromatography A, 798, p.9-17. 23. Díez, A. A., & Alvarez, A. (2001), Compositional and nutritional studies on two wild edible mushrooms from northwest Spain, Food Chemistry, 75, 417–422. 24. Diplock AT, Aggett PJ, AshwellM, Bornet F, Fern EB, RoberfroidMB (1999), Br J Nutr, 81:S1–S27. 25. Eva Guillamón, Ana García-Lafuente, Miguel Lozano, Matilde D´Arrigo, Mauricio A. Rostagno, Ana Villares, José Alfredo Martínez (2010), Edible mushrooms: Role in the prevention of cardiovascular diseases, Fitoterapia, Volume 81 , Pages 715-723. 26. Falandysz J. (2008). J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev; 26:256–99. 27. FAO (Food and Agriculture Organization) (1991), Protein Quality Evaluation, Rome:Food and Agricultural Organization of the United Nations. 28. Gross, B., & Asther, M. (1989). Flavour of Basidiomycetes: Characteristics, analysis and production, Sciences des Aliments, 9, 427–454. 29. Guo, Y. J., Deng, G. F., Xu, X. R., Wu, S., Li, S., Xia, E. Q., et al. (2012), Antioxidant capacities, phenolic compounds and polysaccharide contents of 49 edible macro-fungi, Food & Function, 3, 1195–1205. 30. Hawksworth, D.L., (1991), The fungal dimension of biodiversity. Magnitude, significance and conservasion, Mycol, Res. 95, 640-655. 31. Hawksworth, D.L., (2001), The magnitude of fungal diversity: the 1.5 million species estimate revisited, Mycol, Res. 105, 1422-1432. 32. Hayes, W, A., Haddad, N. (1976). The foof value of the cultivated mushroom and its importance to the mushroom industry, Mushroom J., 40, 104-110. 33. Ibrahim Kıvrak, Seyda Kıvrak, Mansur Harmandar (2014), Free amino acid profiling in the giant puffball mushroom (Calvatia gigantea) using UPLC–MS/MS, Food Chemistry, 158, 88–92 34. Kim, M. Y., Chung, L. M., Lee, S. J., Ahn, J. K., Kim, E. H., Kim, M. J., et al. (2009), Comparison of free amino acid, carbohydrates concentrations in Korean edible and medicinal mushrooms, Food Chemistry, 113, 386–393. 35. Kwang Jae Lee, In Jue Yun, Kyung Hee Kim, Sang Hyun Lim, Hun Ju Ham, Won Sik Eum, Jin Ho Joo (2011), Amino acid and fatty acid compositions of Agrocybe chaxingu, an edible mushroom, Journal of Food Composition and Analysis, 24, 175–178 36. Li, G. S. F., Chang, S.T. (1982), Tropical Mushroom Biological Nature and Cultivation Methods, Chinese University Press, Hong Kong, 199-219. 37. Liu, P., Li, H. M., & Tang, Y. J. (2012), Comparison of free amino acids and 5’ -nucleotides between Tuber fermentation mycelia and natural fruiting bodies, Food Chemistry, 132, 1413–1419. 38. Liu, Y. T., Sun, J., Luo, Z. Y., Rao, S. Q., Su, Y. J., Xu, R., et al. (2012), Chemical composition of five wild edible mushrooms collected fromsouthwest China and their antihyperglycemic and antioxidant activity, Food and Chemical Toxicology, 50, 1238–1244. 39. Lourdes Bosch, Amparo Alegria, Rosaura Farre (2006), Application of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods, Journal of chromatography B, 831, P. 176-183. 40. M. Ummadi, B. C.Weiner (2002), Use of capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence for attomole detection of amino acids, Journal of chromatography A, 964, p.243-253. 41. Mantovani MS, Bellini MF, Angeli JPF, Oliveira RJ, Silva AF, Ribeiro LR.(2008), Mutat Res;658:154–61. 42. Manzi P, Grambelli L, Marconi S, Vivanti V, Pizzoferrato L. (1999), Food Chem, 65, 477–82. 43. Manzi, P., Marconi, P., Aguzzi, A., & Pizzoferrato, L. (2004), Commercial mushrooms: Nutritional quality and effect of cooking, Food Chemistry, 84, 201–206. 44. Marekov, L., Momchilova, S., Grung, B., Nikolova-Damyanova, B. (2012), Fatty acid composition of wild mushroom species of order Agaricales—Examination by gas chromatography–mass, Journal of Chromatography B, Volume 910,   54-60. 45. Mattilda P, Könkö K, Eurola M, Pihlava JM, Astola J, Vahteristo L, et al.( 2001), J Agric Food Chem , 49, 2343–8. 46. Moore, S., Stein, W.H., (1948), Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids, Journal of Biological Chemistry, 176, p.367-388. 47. Moore, S., Stein, W.H., (1951), Determination amino acid by post-columm derivatization, J.Biol. Chem. 192,663. 48. Moore, S., Stein, W.H., (1954), A modified ninhydrin reagent for the photometric determination of amino acids and related compounds, Journal of Biological Chemistry, 211, p.907-913. 49. Nathalie Le Floc'h, Bernard Seve (2007), Biological roles of tryptophan and its metabolism: Potential implications for pig feeding, Livestock Science, Volume 112, Issues 1-2 23–32. 50. Nedelcheva, D., Antonova, D., Tsvetkova, S., Marekov, I., Momchilova, S., Nikolova-Damyanova, B., et al. (2007). TLC and GC–MS probes into the fatty acid composition of some Lycoperdaceae mushrooms. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 30, 2717–2727. 51. Pavel Kalač (2009), Chemical composition and nutritional value of European species of wild growing mushrooms, Food Chemistry, Volume 113, Pages 9-16. 52. Rai, M., Tidke, G., & Wasser, S. P. (2005), Therapeutic potential of mushrooms, Natural Products Radiance, 246–257. 53. Satoshi Mitsuhashi (2014), Current topics in the biotechnological production of essential amino acids, functional amino acids, and dipeptides, Current Opinion in Biotechnology, 26:38–44. 54. Shih-Wen Sun, Yi-Cheng Lin, Yih-Ming Weng, Min-Jane Chen (2006), Effciency improvement on ninhydrin method for amino acids quantification, Journal of food and analysis, 19, p.112-117. 55. Shu-ting Chang and Philip G.Miles, (1930), Mushroom culvation, nutritional value, medicinal effect, and environmental impact, 2nd ed. 56. Sun, C., Lin, J.,Wan, Y. P., Liu, Y., & Xu, H. K. (2012), Amino acids contents of common wild edible mushrooms in Yunnan province, Plant Diversity and Resources, 34,89–92. 57. U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, USDA Nutrient Data Laboratory (2009), USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 22. www.ars.usda.gov/nutrientdata. 58. University of Maryland Medical Center (2009).  "Lysine", Retrieved 59. Vaz, J. A., Barros, L., Martins, A., Santos-Buelga, C., Vasconcelos, M. H., & Vasconcelos I. C. F. R. (2011), Chemical composition of wild edible mushrooms and antioxidant properties of their water soluble polysaccharidic and ethanolic fractions, Food Chemistry, 126, 610–616. 60. Vetter, J. (2000), Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms, European Food Research and Technology, 211, 346–348. 61. Wang, X, M., Zhang, Z., Wu, L, H., Zhao, Y, L., Li, T., Li, Z, Q., Wang, Y, Z., Liu, H, G. (2014), A mini-review of chemical composition and nutritional value of edible wild-grown mushroom from China, Food Chemistry, 151, 279–285. 62. Whittaker, R. H. (1969), “New concepts of kingdoms of organisms”, Science, 163, 150–160 63. Wu G. (2009), Amino acids: metabolism, functions, and nutrition, Amino Acids, 37, 1-17. 64. Yaru Song, Ming Shenwu, Shulin Zhao, Dongyan Hou, Yi-Ming Liu (2005), Enantiomeric separation of amino acids derivatized with 7-fluoro-4-nitrobenzoxadiazole by capillary liquid chromatographyltandem mass spectrometry, Journal of chromatography A, 1091, 102-109. 65. Yiannis C. Fiamegos, Constantine D. Stalikas (2006), Gas chromatographic determination of amino acids via one-step phase-transfer catalytic pentafluorobenzylation-preconcentration, Journal of chromatography A. 66. Yin, J. Z., & Zhou, L. X. (2008). Analysis of nutritional components of 4 kinds of wild edible fungi in Yunnan. Food Research and Development, 29, 133–136.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docxac_dinh_ham_luong_axit_amin_thu_y_phan_trong_mot_so_loai_nam_bang_phuong_phap_sac_ki_long_hieu_nang.doc
Luận văn liên quan