Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1

LOGO Luận văn thạc sĩ khoa học Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 1.05.10 Đại học Quốc gia Hà Nội Trường Đại học Khoa học Tự nhiên LOGO Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Vân Trang Học viên: Nguyễn Hoà Bình Đại học Quốc gia Hà Nội Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Nội dung Tổng quan tài liệu1 Vật liệu và phương pháp2 Kết quả và bàn luận3 Kết luận và kiến nghị4 Lời cảm ơn5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trên thế giới 11/2007 2005 2003 1997 2004 2006 - 60 quốc gia đã có dịch bùng phát - 207/337 người chết/người nhiễm virus -200 triệu gia cầm bị chết và tiêu huỷ - 10 tỷ USD thiệt hại về kinh tế Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam 11/2007 2005 2004 2006 - 61/64 tỉnh đã có dịch bùng phát - 46/100 người chết/người nhiễm virus - 50 triệu gia cầm bị chết và tiêu huỷ 2003 Virus cúm gia cầm H5N1 Lớp lipit kép NA (Neuraminidase) HA (Hemaglutinin) M2 (Kênh ion) M1 (protein nền) NS1 (protein không cấu trúc, xâm nhiễm tế bào) NP (protein nucleocapsit) PB1, PB2, PA (phức hợp polymeraza) NS2 Phân loại: - Thuộc họ Orthomyxoviridae, chi cúm A; Lây truyền: - Gia cầmÆGia cầm; - Gia cầmÆĐộng vật có vú; - Gia cầmÆNgười; (NgườiÆNgười) Sự xâm nhập và sao chép của virus Lắp ghép và phóng thích Tổng hợp các thành phần Xâm nhập và “cởi áo” Hấp phụ Chu kì xâm nhập và sao chép Cơ chế hình thành chủng mới Thay đổi lớn KN (Antigenic Shift): Khi hai (nhiều) chủng virus với các đoạn RNA khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, chúng có thể trao đổi các đoạn gen với nhau, tạo ra chủng virus mới có kháng nguyên thay đổi. Thay đổi nhỏ KN (Antigenic Drift): Sự thay đổi kháng nguyên do đột biến ngẫu nhiên như thêm, mất, chèn điểm hoặc đoạn xảy ra ở gen mã hoá cho protein của virut đặc biệt là HA và NA. Các phương pháp chẩn đoán virus 1 Chẩn đoán trực tiếp: -Phản ứng HA -Phản ứng HI -Kính hiển vi điện tử -RT-PCR -Multiplex RT-PCR -Real-time PCR 2 Chẩn đoán gián tiếp: -Phân lập từ trứng -Phân lập từ tế bào 3 PP huyết thanh học: - NA và NAI - Phản ứng HI - Western Blot - Serial radial hemalysis - Trung hoà virus (Trung hoà vi lượng) Trung hoà virus Trung hoà vi lượng VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Dòng tế bào: Tế bào thận chó (MDCK) KN & KT: - KN virus A/Vietnam/Ck/6/03 H5N1; - KT chuột kháng NP virus cúm A và cộng hợp Phiếu điều tra thông tin cá nhân Hoàn thiện kỹ thuật trung hòa vi lượng Chủng virus: NIBRG-14 Huyết thanh: - Người tiếp xúc với bệnh nhân - Người tiếp xúc với gia cầm Điều tra huyết thanh học Huyết thanh: - Chứng âm của người - Chứng dương của gà và cừu Hoàn thiện kỹ thuật MN - Chuẩn bị virus + Xác định % trypsin + Xác định tỉ lệ pha loãng virus gốc ÆMOI -Hoàn thiện kĩ thuật MN + Xác định mật độ tế bào + Xác định thời gian gây nhiễm + Xác định TCID50 + Xác định ảnh hưởng của trypsin + Xác định tính ổn định, độ đặc hiệu và độ nhạy (so sánh với HI) Virus đối chứng (VC) Tế bào đối chứng (CC) Mẫu huyết thanh Pha loãng Bỏ 50 μl Bắt đầu 1/10 10µl mẫu + 90µl DMEM + 1% BSA Số mẫu Virus đối chứng (VC) Tế bào đối chứng (CC) Huyết thanh Pha loãng Bỏ 50 μl Thêm 100µl virus Bỏ 50 μl Tính ngưỡng hiệu giá (X) X = - OD ≤ X Æ có KT trung hòa - OD > X Æ không có KT trung hòa Điều tra huyết thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1 ¾ Thu nhận, xử lý, bảo quản mẫu huyết thanh ¾ Thực hiện phản ứng trung hoà vi lượng ¾ Xử lý thông tin về người tiếp xúc (thu thập từ phiếu điều tra bằng phần mềm Epi Info 6.0 và được xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 15.0.) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định nồng độ trypsin-TPCK và MOI sử dụng trong gây nhiễm Nồng độ trypsin Hiệu giá HA Pha loãng virus 10-3 Pha loãng virus 10-4 1μg/ml 20-40 < 10 2μg/ml 20 40 5μg/ml 160 - 320 10 - 320 Nồng độ trypsin-TPCK cho hiệu quả cao nhất là: 5μg/ml Virus gốc được pha loãng với các tỉ lệ 10-3; 10-4. Như vậy, MOI của virus sử dụng cho phản ứng MN là từ 2x10-3 tới 4x10-3 Xác định mật độ tế bào MDCK thích hợp Thí nghiệm với tế bào MDCK ở các mật độ khác nhau: 1,5 x 105; 2,0 x 105 và 2,5 x 105 tế bào/ml. Mật độ 1,5x105 tế bào/ml Mật độ 2,0x105 tế bào/ml Mật độ 2,5x105 tế bào/ml Mật độ tế bào thích hợp nhất cho phản ứng MN 2,0x105 tế bào/ml Hiệu ứng huỷ hoại tế bào do virus CPE 30% độ khuếch đại 10x CPE 60%; độ khuếch đại 10x TB không nhiễm virus; độ khuếch đại 10x CPE 90%; độ khuếch đại 10x Xác định thời gian gây nhiễm virus vào tế bào Tiến hành thí nghiệm với các khoảng thời gian: 18 tiếng; 20 tiếng và 22 tiếng trong điều kiện không có và có trypsin-TPCK (0,5 µg/ml). Kết quả thu được: + Ở điều kiện không có mặt của trypsin, thời gian gây nhiễm virus vào tế bào thích hợp nhất là 22 tiếng, + Trong điều kiện có mặt của trypsin-TPCK, ở nồng độ 0,5 µg/ml với thời gian gây nhiễm 18 tiếng sẽ cho kết quả tốt nhất. Xác định TCID50 của virus dùng cho phản ứng MN Ngưỡng dương tính = AvgCC(OD) + 3SD(OD). Khoảng cách = TCID50 = 10-5,5 + 0,25 TCID50 của chủng virus sử dụng cho phản ứng MN là 10-5,75 /100ml 10-2 10- 2,5 10- 3,5 10-4 10- 4,5 10-5 10- 5,5 10-6 10- 6,5 10-3 Đối chứng Thêm 146µl virus pha loãng ban đầu (1/100) Chỉ có môi trường (không có virus) Bỏ đi 46µl So sánh kết quả phản ứng MN ở điều kiện có và không có mặt của trypsin-TPCK Mã huyết thanh Hiệu giá HI Hiệu giá MN không cótrypsin Hiệu giá MN có trypsin Mẫu 1 <10 14* 80 Mẫu 2 <10 10 80 Mẫu 3 10 10 40 Mẫu 4 20 20 160 Mẫu 5 20 160 320 Mẫu 6 20 20 80 Mẫu 7 20 <10 40 Mẫu 8 20 28* 40 Mẫu 9 28* <10 40 Mẫu 10 28* <10 80 Mẫu 11 28* <10 80 HT người (-) <10 <10 Không ổn định** HT gà (+) 640 1280 1280 HT cừu (+) 640 2560 2560 Đánh giá độ ổn định của phản ứng MN Lần TN HT Gà (+) HT Cừu (+) HT Người (-) Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá Log(hiệu giá) Hiệu giá I 640 2.806 1280 3.107 < 10 II 640 2.806 640/1280 2.957 < 10 III 640/1280 2.957 1280/2560 3.258 < 10 IV 1280 3.107 2560 3.408 < 10 V 1280 3.107 2560 3.408 < 10 VI 1280 3.107 2560 3.408 < 10 Độ lệch chuẩn 0, 147 (5%) 0,190 (5%) Phản ứng MN thiết lập được có độ ổn định trong giới hạn cho phép Đánh giá độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng MN HI (-) HI (+) MN (-) MN(+) 287 8 20 40 x x x 28 57 57 80 80 160 28x3 x x x 160 Æ Phản ứng MN thiết lập được có độ đặc hiệu cao Æ Phản ứng MN có độ nhạy không cao hơn phản ứng HI Thông tin dịch tễ các mẫu MN dương tính Ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học Phát hiện được 16/311 mẫu dương tính, có 3 mẫu của người tiếp xúc với bệnh nhân. Mẫu số 3 của một người nhà bệnh nhân có hiệu giá cao cả HI và MN, hai trường hợp còn lại là của nhân viên y tế tham gia chăm sóc bệnh nhân. 13/16 mẫu dương tính là của người tiếp xúc với gia cầm, chủ yếu ở nhóm chăn nuôi gia cầm, hiệu giá MN của nhóm này không cao với 8/13 mẫu có hiệu giá MN bằng 20. 4/8 mẫu huyết thanh dương tính với HI, âm tính với MN là của người trên 60 tuổi, kết quả của các mẫu này có thể không chính xác, cần được khẳng định lại bằng các kĩ thuật khác. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN A. Hoàn thiện kĩ thuật MN 1. Nồng độ trypsin-TPCK thích hợp cho gây nhiễm là 5μg/ml. 2. Tỉ lệ pha loãng từ virus gốc là 10-3 tới 10-4. MOI trong gây nhiễm virus vaccine H5N1 vào tế bào: 2x10-3 tới 4x10-3. 3. Mật độ tế bào thích hợp cho phản ứng MN: 2,0x105 tế bào/ml. 4. Thời gian gây nhiễm virus ở điều kiện không có trypsin là 22 tiếng. 5. Virus H5N1 sử dụng có TCID50: 10-5,75/100ml. 6. Đã thiết lập và hoàn thiện kĩ thuật MN với độ ổn định và độ đặc hiệu cao sử dụng trong nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1. 7. Có 98% số mẫu (đã loại bỏ những người trên 60 tuổi) cho kết quả tương đồng với kết quả của HI. KẾT LUẬN B. Bước đầu ứng dụng kĩ thuật MN trong điều tra huyết thanh học trên người tiếp xúc với virus cúm gia cầm H5N1 8. Có 16/311 (5,14%) mẫu dương tính. Có 3 trường hợp tiếp xúc với bệnh nhân, 13 người tiếp xúc với gia cầm. Phần lớn các trường hợp có hiệu giá KT trung hòa thấp (20-80). Các mẫu huyết thanh của người trên 60 tuổi có thể cho kết quảMN và HI không chính xác. Nếu loại bỏ các trường hợp này thì tỉ lệ tương đồng giữa hai kĩ thuật này đạt 98%. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu, xác định những điều kiện tốt nhất nhằm làm tăng độ nhạy, giúp hoàn thiện hơn nữa phản ứng MN. 2. Tiến hành phản ứng MN với các chủng virus cúm khác như H1N1, H3N2, chủng H5N1 có độc lực. 3. Thực hiện phản ứng trên một số lượng mẫu lớn hơn để khẳng định chắc chắn hơn nữa hiệu quả và độ tin cậy của phản ứng MN. 4. Xác định các dòng tế bào khác có khả năng thay thế cho tế bào MDCK sử dụng trong phản ứng MN. 5. Tiến hành phản ứng MN với toàn bộ số mẫu thu được và phân tích hiệu giá MN trên người tiếp xúc với gia cầm và người tiếp xúc với bệnh nhân. Lời cảm ơn 1. TS. Nguyễn Vân Trang - người trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. 2. PGS. TS. Nguyễn Văn Mùi, PGS. TS. Vũ Tân Trào, đã có định hướng quan trọng và những lời khuyên bổ ích 3. Chị Đỗ Quỳnh Nga đã giúp đỡ tôi về kĩ thuật trong nghiên cứu. 4. Các thầy cô trong Bộ môn Hoá sinh và Khoa Sinh học, ĐHKHTN đã cho tôi niềm đam mê khoa học cùng những kiến thức cơ bản. 5. PGS. TS. Đinh Duy Kháng, TS. Nguyễn Tiến Dũng, TS. Mason (AFRIMS) đã cung cấp virus và hướng dẫn kĩ thuật 6. Lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại công ty Ageless. 7. Các tổ chức SIDA, AFRIMS và NIH đã cấp kinh phí và hoá chất cho nghiên cứu. LOGO