Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu và kiểm tra định tính lipid của vi tảo Tetraselmis

cấu tạo của hạch tạo bột. Sinh sản vô tính bằng cách phân chia tế bào và giải phóng ra hai, bốn hoặc tám sản phẩm vận động. [2],[11] 2.3. Sơ lược về công nghệ sản xuất đại trà vi tảo 2.3.1. Lịch sử nghiên cứu Lịch sử nuôi trồng đại trà vi tảo khá ngắn, bắt đầu từ những thử nghiệm đầu những năm 1950, ngày nay, sản lượng tảo khô hàng năm trên thế giới sản xuất là khoảng hơn 9000 tấn. Sản xuất đại trà tảo Scenedesmus bắt đầu vào những năm 1960 ở Tiệp Khắc, Đức, Israel, Italia và một số nước Đông Âu. Trong khi đó, vi tảo lam Spirulina được nuôi trồng đại trà tại Mehico, Mỹ, Đài Loan, Israel, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ và Việt Nam. Sản xuất sinh khối Dunaliella – nguồn β – caroten bắt đầu sản xuất trên diện rộng tại Israel và triển khai mạnh ở Australia. Porphyridium – một loài tảo đỏ, giàu polysaccharid và acid arachidonic được nuôi trồng đại trà tại Pháp. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 25 2.3.2. Các kiểu bể nuôi trồng tảo Việc phát triển công nghệ nuôi trồng vi tảo, đòi hỏi phải giải quyết hàng loạt các vấn đề về sinh học của chủng tảo được chọn, các thông số hóa lý của môi trường, dinh dưỡng, thủy động lực học, các kỹ thuật khuấy, bổ sung CO2, tách, lọc, sấy sinh khối … Điều này liên quan mật thiết tới việc áp dụng các hệ thống nuôi trồng khác nhau. Có thể nuôi trồng công nghiệp vi tảo theo phương pháp quảng canh hoặc thâm canh, trong hệ thống kín hoặc hở, với tảo sạch vi khuẩn hoặc không. Rất khó đánh giá được phương pháp nào là ưu việt nhất vì việc chọn hệ thống sản xuất phụ thuộc phần lớn vào các loài tảo và sản phẩm cần khai thác. Người ta dùng phương pháp nuôi CO2 hoặc HCO3- Khoáng chất Nước Ánh sáng Nhiệt độ (20-40oC) Tảo giống Guồng Lọc Li tâm cô bớt nước Sấy Đóng gói tảo khô Chế biến hoặc sử dụng trực tiếp Thu hồi chất khoáng còn lại Môi trường Hình 2.7. Quy trình công nghệ sản xuất đại trà vi tảo [1] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 26 quảng canh để sản xuất sinh khối tảo Chlorella, Spirulina, và Scenedesmus với mục đích nhận protein đơn bào và thức ăn bổ dưỡng, sản xuất Dunaliella để nhận β – caroten. Phương pháp nuôi trồng này là đơn giản và rẻ nhất nhưng phải ứng dụng với môi trường nuôi có chọn lọc. Ví dụ Dunaliella salina sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối tới hơn 20% trong khi tảo Spirulina platensis chịu được pH cao hơn 9. Khi tiến hành thiết kế bể nuôi tảo, người ta phải cân nhắc tới một số yếu tố sau: - Độ sâu tối ưu của dịch tảo có tính tới mức độ ánh sáng mặt trời xuyên xuống - Tốc độ khuấy phù hợp với nhu cầu năng lượng. khuấy sục môi trường nhằm khử các không gian chết trong bể và giữ tế bào luôn ở dạng huyền phù mà không làm ảnh hưởng tới hoạt tính sinh lý của tảo. - Vật liệu xây dựng bể. Hệ thống nuôi trồng đại tà vi tảo được chia thành 5 loại (Borowitzka, 1991) [1] 2.3.2.1. Hệ thống bể nông (shallow ponds) Ưu điểm là vốn đầu tư xây dựng và kinh phí vận hành thấp. nhược điểm cơ bản của hệ thống là năng suất thấp và khả năng sản xuất không ổn định, độ tin cậy thấp. Hệ thống đòi hỏi diện tích đất lớn. Một số ao nông, diện tích rộng hiện nay đang được dùng như dạng ao ổn định để xử lý nước thải. Trong hệ thống này, sinh khối tảo chỉ được coi như sản phẩm thứ cấp [1] 2.3.2.2 Hệ thống bể dài (Rayceways) Là dạng bể thông dụng, ngoài trời và dùng cho nuôi quảng canh. Hệ thống được đưa vào sử dụng trong những năm 1960. Thông thường hai đầu bể được vuốt tròn để giản trở lực khi dòng huyền phù vận động tuần hoàn. Lúc đầu, nhiều dạng thiết kế sử dụng bơm đẩy tạo vận tốc của dòng chảy lên tới 30 cm/s. Trong những năm 1970, dạng guồng (paddlewheel) đã được đưa vào sử dụng khá hiệu quả vì tiêu tốn năng lượng ít hơn. Đôi khi người ta sử dụng phương pháp thổi khí nhờ máy nén khí để tạo dóng chảy. Các bể có thể có thành chung để giảm chi phí xây dựng. Hình 2.8. Hệ thống bể dài (rayceways) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 27 Điển hình của dạng bể nảy là dùng cho sản xuất tảo Spirulina tại nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tại Bình Thuận, dạng bể này được ứng dụng với hệ thống bơm khuấy trục vít Savonius chạy bằng năng lượng gió. Cần lưu ý thêm là hệ thống cần đầu tư tương đối cao và co chi phí vận hành lớn nếu muốn có sinh khối chất lượng cao. Ưu điểm là năng suất sinh khối chấp nhận được và hệ thống có tính ổn định cao. [1] 2.3.2.3. Hệ thống nghiêng (Cascade) Trong trường hợp này, dung dịch huyền phù được vận chuyển trên bề mặt bể nghiêng 30 và tuần hoàn nhờ bơm đặt ở phần thấp nhất. Kiểu bể này do Shetlik (Tiệp Khắc cũ) thiết kế và ứng dụng thành công tại Bungari với quy mô gần 5000 m2 để sản xuất tảo lục thuộc chi Chlorella và Scenedesmus. Dung dịch tảo vận hành trên bề mặt nghiêng và phải vượt qua nhiều thanh chắn nhỏ, nằm ngang để tối ưu hóa cho việc trao đổi khí và ánh sáng. Mật độ tảo có thể đạt tới 3gr/lít. Ưu điểm cơ bản của hệ thống là năng suất sinh khối cao và khá ổn định. Tuy vậy, hệ thống chỉ giới hạn cho việc nuôi trồng vi tảo lục và đòi hỏi chi phí đầu tư ban đầu cũng như vận hành cao. [1] 2.3.2.4. Hệ thống bể phản ứng quang sinh dạng ống (tubular photobioreactor) Các bể này được thiết kế thành công nhất tại Anh và Pháp. Đây là dạng hệ thống kín. Về cơ bản, hệ thống bể bao gồm: Một bể phản ứng dạng ống được thiết kế bằng vật liệu cho ánh sáng xuyên qua Hình 2.9. Mô hình bể nghiêng kiếu shetlik [1] Hình 2.10. Mô hình bể phản ứng quang sinh dạng ống Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 28 Một tháp bổ sung CO2 Thiết bị bơm tạo dòng tuần hoàn của dịch huyền phù tảo. Ưu điểm chính của hệ thống này là giảm bốc hơi nước và giảm khả năng bị lây nhiễm tảo khác. Nhược điểm của hệ thống là đầu tư cao, không tận dụng được triệt để ánh sáng tự nhiên và có nguy cơ bị đốt nóng vào mùa hè.Mặc dù có một số ưu điểm quan trọng, hệ thống này cần hoàn thiện một số khâu sau: Chọn loại bơm sao cho không làm thương tổn tới tế bào tảo Nồng độ O2 cao trong bể kín sẽ ức chế quang hợp của tảo. Chọn phương pháp để giảm chi phí vận hành tháp bổ sung CO2 Ví dụ điển hình của hệ thống này là cơ sở sản xuất porphyridium tại Caradache, Pháp [1] 2.3.2.5. Hệ thống bể lên men Đây cũng là bể kín cần đầu tư ban đầu và kinh phí vận hành lớn. Về nguyên tắc, hệ thống giống như các bể lên men vi sinh vật nhưng phải được trang bị thêm thiết bị chiếu sáng cho tảo quang hợp. Nhiều nước sử dụng hệ thống này kèm theo thiết bi điều chỉnh tự động các thông số môi trường thông qua một máy vi tính. Vi tảo nuôi trồng trong hệ thống này là sạch thuần khiết. [1] 2.3.3. Tách sinh khối Thu hoạch tảo là thao tác ảnh hưởng lớn đến giá thành sản xuất. cho đến nay, nhiều phương pháp thu sinh khối đã được ứng dụng như li tâm, kết lắng hóa học, kết lắng bằng điện trường, tự kết lắng, lọc trọng trường, lọc chân không … [1] 2.3.3.1. phương pháp ly tâm Có thể dùng để thu hoạch vi tảo dạng sợi hoặc đơn bào. Phương pháp ly tâm có ưu điểm chính là đơn giản và không phải sử dụng hóa chất bổ sung. Tuy vậy, chi phí Hình 2.11. Mô hình sản xuất tảo sạch vi khuẩn trong hệ thống kín [1] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 29 năng lượng của phương pháp thu hoạch này là khá lớn (khoảng 1kwh/m3) khiến việc sử dụng nó chỉ khả thi trong những cơ sở sản xuất cho ra các sản phẩm chất lượng cao. [1] 2.3.3.2. Phương pháp lọc Là phương pháp khả thi cho thu hoạch nhiều loài tảo khác nhau. Vật liệu dùng cho lọc cơ học là cát mịn, sợi cellulose … tốc độ lọc chậm và màng lọc hay bị bít tắc do chính sinh khối tảo và vi sinh vật khiến phương pháp này cần lượng nước khá lớn để rửa thường xuyên. Trong các phương pháp lọc khác nhau thì lọc nén áp suất có triển vọng hơn cả do tốc độ nhanh và khả thi cho sản xuất lớn vì giá thành không quá cao. Nhiều màng lọc đặc biệt vận hành theo kiểu màng rung, màng xoay, màng nghiêng và màng vi lỗ đã được thử nghiệm để tách sinh khối tảo khỏi môi trường. Phương pháp có ưu điểm là tốc độ nhanh và sinh khối rất sạch. Nhược điểm chính của phương pháp này là màng hay bị bít tắc và sơi tảo bị gãy sẽ có nguy cơ làm tăng thêm các chất hữu cơ trong môi trường. Những năm gần đây, một số cơ sở sản xuất tảo sử dụng thiết bị của hãng Waco (Canada) để tách Spirulina khỏi pha lỏng. Thiết bị kết hợp kỹ thuật chân không với màng lọc rung. Tuy vậy, một số tế bào tảo bị phá hủy khi qua thiết bị sẽ làm ảnh hưởng xấu tới chất lượng dịch hoàn lưu. Những tảo đơn bào (Dunaliella, Chlorella, Scenedesmus …) thường đòi hỏi thu hoạch bằng ly tâm, lọc hoặc bằng phương pháp tạo bông. [1] 2.3.3.3. Phương pháp tạo bông - Tự kết lắng : Hiện tượng tự kết lắng xảy ra khi pH tăng; khi tế bào lắng xuống cùng với Ca2+, Mg2+ và muối phosphate hoặc carbonat. Mặt khác, đây cũng là hậu quả của sự tương tác giữa tảo và vi khuẩn hoặc giữa tảo và các polyme hữu cơ trong môi trường. Ví dụ: tảo Scenedesmus sinh trưởng tối ưu trong pH trung tính sẽ dễ dàng bị kết lắng khi ta đưa pH lên 8.5 Kết lắng bằng các chất hóa học: Những chất được coi là gây hiệu ứng tạo bông tốt đối với vi tảo là sunphat nhôm, Ca(OH)2, sunphat sắt, clorua sắt và một số polyme khác. Yếu điểm của phương Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 30 pháp này là sinh khối tảo sau khi thu hoạch sẽ chứa một lượng hóa chất không mong muốn và bản thân phương pháp sẽ làm ô nhiễm môi trường nuôi trồng nếu sau thu hoạch môi trường được hoàn lưu. [1] 2.3.4. Sấy sinh khối Sau khi tách tảo khỏi môi trường và cô đặc sơ bộ, phải tiến hành ngay việc sấy để giữ sinh khối khỏi bị vi sinh vật hủy hoại. Trong sản xuất tảo hiện nay, người ta sử dụng nhiều phương pháp sấy. Bảng 2.2. Một số phương pháp sấy sinh khối tảo [1] Phương pháp Ưu và nhược điểm Đối tượng Ưu điểm Nhược điểm Sấy tiếp xúc (sấy hình trống) Nhanh, hiệu quả Giá thành cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Phơi nắng Đầu tư thấp Chậm, phụ thuộc thời tiết Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Sấy mặt trời sử dụng hiệu ứng lồng kính Hiệu quả hơn phương pháp 2 Phụ thuộc thời tiết Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Sấy phun khô Nhanh, hiệu quả Chi phí cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina, Dunaliella Cô chân không Hiệu quả Vốn đầu tư lớn Spirulina Sấy đông cô Đảm bảo chất lượng Chậm, chi phí cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Việc sấy sinh khối chiếm tỉ lệ chi phí khá cao của quá trình sản xuất tảo. Các phương pháp sấy được đề xuất phụ thuộc nguồn vốn đầu tư, nhu cầu năng lượng và có ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng sản phẩm, đặc biệt đối với tảo lục có thành tế bào rất chắc. [1] 2.3.4.1 Phương pháp sấy phun: Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 31 Cho sản phẩm bột rất đồng đều nhưng chi phí cao. Việc bổ sung một số chất chống ô xy hóa vào dịch tảo trước khi sấy phun có thể giữ nguyên chất lượng sắc tố và vitamin của sinh khối. Tuy vậy, khả năng tiêu hóa của tảo lục sấy phun khô chỉ đạt 50% so với 80% khi tảo này được sấy tiếp xúc. Tuy nhiên phương pháp sấy tiếp xúc làm biến tính protein so với sấy phun. [1] 2.3.4.2 Sấy mặt trời: Đây là phương pháp sấy rẻ nhất. Tính toán cho thấy để làm khô lớp sinh khối tảo dày 0.75 cm cần ít nhất 1 ngày. Vì tốc độ sấy khô rất chậm và phụ thuộc thời tiết nên phương pháp tỏ ra không hiệu quả khi áp dụng cho sản xuất lớn. [1] 2.3.4.3. Phương pháp sấy đông khô Phương pháp này tỏ ra hiệu quả trong việc ổn định thành phần sinh hóa của tảo nhưng không có triển vọng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất đại trà vi tảo.[1] 2.4. Sơ lược về nhiên liệu sinh học 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ nhiên liệu sinh học (biofuels) bao gồm các nguồn năng lượng được sản xuất từ nhiều loại sản phẩm nông nghiệp khác nhau như thân, cành, vỏ, quả, cây, các sản phẩm dư thừa khi chế biến nông, lâm sản, gỗ củi, phân gia súc, nước thải và bã phế thải hữu cơ công nghiệp, rác thải... 2.4.2. Phân loại nhiên liệu sinh học Hiện có 3 dạng năng lượng sinh học chủ yếu là ethanol sinh học, khí sinh học và diesel sinh học. - Cồn sinh học (bioethanol) là cồn được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose. Việc sản xuất cồn sinh học từ các nguồn tinh bột hoặc các cây thực phẩm được cho là không bền vững do ảnh hưởng tới an ninh lương thực. Việc sản xuất cồn sinh học từ sinh khối và sinh khối phế thải nông nghiệp không ảnh hưởng đến an ninh lương thực là hướng đi nhiều triển vọng. Tuy nhiên, tại thời điểm hiện tại (2010) công nghệ sản xuất cồn sinh học từ các nguồn lignocellulose chỉ đạt được hiệu suất thấp và giá thành còn cao. Theo ước tính, sau khoảng 7 – 10 năm, công nghệ này sẽ được hoàn thiện, đáp ứng được nhu cầu sản xuất và thương mại. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 32 - Khí sinh học (Biogas): được tạo ra sau quá trình ủ lên men các vật liệu hữu cơ. Sản phẩm tạo thành ở dạng khí (methane và đồng đẳng khác) có thể dùng làm nhiên liệu đốt cháy thay cho gas từ sản phẩm dầu mỏ. Sản xuất khí sinh học đã được phát triển từ khá lâu và có nhiều mô hình triển khai rộng rãi. - Diesel sinh học (Biodiesel): được dẫn xuất từ các loại dầu sinh học (thường được thực hiện thông qua quá trình tranester hóa bằng cách cho phản ứng với các loại rượu phổ biến nhất là methanol. Diesel sinh học có thể sử dụng thay thế cho diesel. 2.4.3. Biodiesel 2.4.3.1. Biodiesel là gì ? Biodiesel hay diesel sinh họ c là một loại nhiên liệu có tính chất giống với dầu diesel nhưng không phải được sản xuất từ dầu mỏ mà từ dầu thực vật hay mỡ động vật. Theo tiêu chuẩn ASTM thì Biodiesel được định nghĩa: “là các mono alkyl Ester của các acid mạch dài có nguồn gốc từ các lipit có thể tái tạo lại như:dầu thực vật, mỡ động vật, được sử dụng làm nhiên liệu cho động cơ diesel”. Bản chất của Biodiesel là sản phẩm ester hóa giữa methanol hoặc ethanol và acid béo tự do trong dầu thực vật hoặc mỡ động vật. Tùy thuộc vào loại dầu và loại rượu sử dụng mà alkyl ester có tên khác nhau: - Nếu đi từ dầu cây đậu nành (soybean) và Methanol thì ta thu được SME (soy methyl Esters). Đây là loại Esters thông dụng nhất được sử dụng tại Mỹ. - Nếu đi từ dầu cây cải dầu (rapeseed) và Methanol thì ta thu được RME (rapeseed methyl Esters). Đây là loại Esters thông dụng nhất được sử dụng ở châu Âu. 2.4.3.2. Lịch sử phát triển của Biodiesel Biodiesel bắt đầu được sản xuất khoảng giữa năm 1800, trong thời điểm đó người ta chuyển hóa dầu thực vật để thu Glycerol ứng dụng làm xà phòng và thu được các phụ phẩm là methyl hoặc ethyl Ester gọi chung là Biodiessel. Ngày 10/08/1893 lần đầu tiên Rudolf Diesel đã sử dụng Biodiesel do ông sáng chế để chạy máy. Năm 1912, ông đã dự báo: “Hiện nay, việc dùng dầu thực vật cho nhiên liệu động cơ có thể không quan trọng, nhưng trong tương lai, những loại dầu như thế chắc chắn sẽ có giá trị không thua gì các sản phẩm nhiên liệu từ dầu mỏ và than đá”. Trong bối cảnh nguồn tài nguyên dầu mỏ đang cạn kiệt và những tác động xấu lên môi trường của việc sử dụng nhiên liệu, nhiên liệu tái sinh sạch trong đó có Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 33 Biodiesel đang ngày càng khẳng định vị trí là nguồn nhiên liệu thay thế khả thi. Để tưởng nhớ nguời đã có công đầu tiên đoán được giá trị to lớn của Biodiesel, Nation Board Biodiesel đã quyết định lấy ngày 10 tháng 8 hằng năm bắt đầu từ năm 2002 làm ngày Diesel sinh học Quốc tế (International Biodiesel Day). - Năm 1900 tại Hội chợ thế giới tổ chức tại Pari, Diesel đã biểu diễn động cơ dùng dầu biodiesel chế biến từ dầu Phụng (lạc). - Trong những năm của thập kỷ 90, Pháp đã triển khai sản xuất Biodiesel từ dầu hạt cải. Và được dùng ở dạng B5 (5% Biodiesel với 95% Diesel) và B30 (30% Biodiesel trộn với 70% Diesel). 2.4.3.3. Ưu và nhược điểm của Biodiesel - Ưu điểm: + Về mặt môi trường Giảm lượng phát thải khí CO2, do đó giảm được lượng khí thải gây ra hiệu ứng nhà kính. Không có hoặc chứa rật ít các hợp chất của lưu huỳnh (nhỏ hơn 0.001% so với đến 0.2% trong dầu Diesel) Hàm lượng các hợp chất khác trong khói thải như: CO, SOx, HC chưa cháy, bồ hóng giảm đáng kể. Không chứa HC thơm nên không gây ung thư Có khả năng tự phân hủy và không độc (phân hủy nhanh hơn Diesel 4 lần, phân hủy từ 85% đến 88% trong nước sau 28 ngày) Giảm ô nhiễm môi trường nước và đất Giảm tiêu dùng các sản phẩm dầu mỏ + Về mặt kỹ thuật Có chỉ số cetan cao hơn diesel. Biodiesel rất linh động, có thể trộn với diesel theo bất kỳ tỉ lệ nào. Biodiesel có điểm chớp cháy cao hơn Diesel, đốt cháy hoàn toàn, an toàn trong tồn chứa và sử dụng. Có tính bôi trơn tốt. Ngày nay, để hạn chế lượng SOx thải ra không khí, người ta hạn chế tối đa lượng S trong dầu Diesel. Nhưng, chính những hợp chất lưu huỳnh lại Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 34 là những tác nhân giúp giảm ma sát của dầu Diesel. Do vậy, dầu Diesel có tính bôi trơn không tốt, đòi hỏi phải sử dụng thêm các chất phụ gia để tăng tính bôi trơn. Trong thành phần của biodiesel, có chứa Oxi, cũng có tác dụng giảm ma sát giống S. Do có tính năng tương tự dầu Diesel, nên nhìn chung, khi sử dụng Biodiesel không cần cải thiện bất kỳ chi tiết nào của động cơ (riêng đối với hệ thống ống dẫn, bồn chứa làm bằng nhựa, ta phải thay bằng vật liệu kim loại). + Về mặt kinh tế Sử dụng nhiên liệu Biodiesel ngoài vấn đề giải quyết ô nhiễm môi trường, nó còn thúc đẩy ngành nông nghiệp phát triển, tận dụng tiềm năng sẵn có của ngành nông nghiệp như dầu phế thải, mỡ động vật và các loại dầu khác ít có giá trị sử dụng trong thực phẩm. Đồng thời, đa dạng hóa nền nông nghiệp và tăng thu nhập ở vùng nông thôn. Hạn chế nhập khẩu nhiên liệu Diesel - Nhược điểm Bên cạnh lợi ích của phát triển nhiên liệu sinh học, còn có không ít nguy cơ về môi trường, kinh tế và xã hội. Đây là hai mặt của một quá trình phát triển. Vấn đề là thúc đẩy lợi ích của nhiên liệu sinh học và hạn chế những nguy cơ. + Vấn đề lương thực: Việc sử dụng đất để trồng cây nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học có thể ảnh hưởng đến nguồn cung cấp lương thực hoặc làm tăng giá lương thực, đặc biệt đối với các nước đang phát triển. Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ...) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm. + Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước: Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan vinhoto, một chất được dùng để bón và tưới khi trồng mía đường cũng có thể gây ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch và làm cho các loài thuỷ sinh không thể tồn tại. Năm 2003, người ta đã ghi nhận được một trường hợp bội nhiễm vihoto xảy ra tại Sao Paolo khiến cá chết hàng loạt trên suốt 95 dặm sông Rio Grande của Braxin. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 35 + Về mặt kỹ thuật Biodiesel cung cấp năng lượng thấp hơn Diesel thông thường, vì vậy, nếu tỉ lệ Biodiesel cao, thì động cơ sẽ yếu hơn hoặc phải dùng nhiều nhiên liệu hơn mới đạt được công suất như khi dùng Diesel thông thường. Biodiesel Oxi hóa nhanh hơn do đặc điểm thành phần hóa học, do đó khó có thể tích trữ loại nhiên liệu này lâu, đòi hỏi phải có thêm chất phụ gia. Nhược điểm lớn nhất về mặt kỹ thuật là Biodiesel nguyên chất dễ bị đóng băng hoặc đặc lại trong thời thiết lạnh. 2.4.3.4. Những nguồn nguyên liệu để sản xuất Biodiesel ở Việt Nam Ở nước ta, Biodiesel có thể được sản xuất từ một trong những nguồn sau: - Dầu mỡ thải đã qua sử dụng: gồm các phế phẩm dầu mỡ đi từ các nhà máy chế biến dầu mỡ, dầu mỡ đã qua sử dụng được thu hồi sau quá trình rán, nấu từ các cơ sở chế biến thức ăn. - Rỉ đường, ngũ cốc, vừng, lạc, dừa, mỡ cá Basa… - Cây Jatropha có nguồn gốc từ Trung M ỹ, di thực sang châu Phi, Ấn Độ và Nam Mỹ. Cây chịu được hạn, trồng ở đất khô cằn, có nhiều loại. Nước ta có thể tận dụng 9 triệu ha đất hoang hóa dọc ven các đường quốc lộ để trồng loại cây này. - Vi tảo: một nguồn nguyên liệu triển vọng do sự phát triển đơn giản, vòng đời ngắn, năng suất cao, hệ số sử dụng năng lượng ánh sáng cao, thành phần sinh hóa dễ được điều khiển tùy điều kiện nuôi cấy và nhờ kĩ thuật di truyền, nuôi trồng đơn giản, thích hợp với quy mô công nghiệp. [1] CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 36 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và môi trường 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Giống tảo Tetraselmis được phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, đại học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp. 3.1.2. Địa điểm thí nghiệm Phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh Kiểm tra định tính dầu tảo tại viện Sinh Học Nhiệt Đới tp. HCM 3.1.3. Hóa chất - Cồn 960, Cồn 700 - Thuốc nhuộm Nile Blue 1% - Acid Acetic 8% - Nước cất - Nước biển tự nhiên - NaNO3 - NaH2PO4 - Na2SiO3.9H2O - FeCl3.6H2O - Na2EDTA.2H2O - CuSO4.5H2O - Na2MoO4.2H2O - ZnSO4.7H2O - CoCl2.6H2O - MnCl2.4H2O - ZnCl2 - (NH4)6Mo7O24.4H2O - H3BO3 - NaCl - Vitamin B12 - Biotin - Vitamin B1 3.1.4. Thiết bị - Nồi hấp khử trùng - Tủ cấy vô trùng - que cấy - đèn cồn - tủ sấy - Kính hiển vi huỳnh quang - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích - chai nước biển 0.25l, 0.5L - Bình thủy tinh 1.5L - Bơm sục khí - Bình nhựa trong 10L Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 37 3.1.5. Môi trường 3.1.5.1. Môi trường F/2 (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975) [9] Để chuẩn bị môi trường F/2 để nuôi vi tảo biển, bắt đầu với 950 ml nước biển tự nhiên, bổ sung các thành phần theo bảng, bổ sung NaCl để đạt độ mặn theo yêu cầu. Định mức bằng nước biển đến 1000ml. Hấp khử trùng. Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) Hàm lượng NaNO3 75 g/L dH2O 1 mL NaH2PO4 .H2O 5 g/L dH2O 1 mL Na2SiO3 .9H2O 30 g/L dH2O 1 mL Dung dịch vi lượng (Bảng dưới) 1 mL Dung dịch vitamin (Bảng dưới) 0.5 mL - Dung dịch khoáng vi lượng môi trường F/2 Để chuẩn bị dung dịch khoáng vi lượng của môi trường F/2, bắt đầu với 950 ml nước cất, bổ sung các thành phần khoáng theo bảng, định mức đến 1000 ml bằng nước cất. Bảng 3.2. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng FeCl3.6H2O --- 3.15 g Na2EDTA.2H2O --- 4.36 g CuSO4 .5H2O 9.8 1 mL Na2MoO4 .2H2O 6.3 1 mL ZnSO4 .7H2O 22.0 1 mL Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 38 CoCl2 .6H2O 10.0 1 mL MnCl2 .4H2O 180.0 1 mL - Dung dịch vitamin của môi trường F/2 Chuẩn bị dung dịch vitamin cho môi trường F/2 , bắt đầu với 950ml nước cất vô trùng, bổ sung các loại vitamin theo hàm lượng của bảng, định mức đến 1000ml , bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đá. Bảng 3.3. Thành phần vitamin đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng Thiamine HCl (vit. B1) --- 200 mg Biotin (vit. H) 0.1 10 mL Cyanocobalamin (vit. B12) 1.0 1 mL 3.1.5.2. Môi trường Walne (Walne PR, 1970) [16] - Dung dịch stock khoáng vi lượng môi trường Walne Bảng 3.4. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (g/ 100ml) 1 ZnCl2 2.1 2 CoCl2.6H2O 2.0 3 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.9 4 CuSO4 .5H2O 2.0 Hòa tan lần lượt các muối vào 90ml nước cất, định mức đến 100ml. Do trong thành phần dung dịch có ZnCl2, làm đục môi trường, nên khi pha xong, ta nhỏ vào vài giọt acid HCl loãng để làm trong. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 39 - Dung dịch stock vitamin môi trường Walne. [16] Bảng 3.5. Thành phần vitamin đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (pha cho 100ml) 1 Vitamin B12 10.0 mg 2 Vitamin B1 10.0 mg 3 Vitamin H (Biotin) 200.0 µg Pha các vitamin vào 90ml nước cất vô trùng, sau đó định mức đến 100ml. Do Vitamin dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên dụng cụ phải được hấp khử trùng trước và thao tác trong môi trường vô trùng. - Dung dịch stock dinh dưỡng môi trường Walne [16] Bảng 3.6. Thành phần dinh dưỡng đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (Pha cho 1000ml) 1 FeCl3.6H2O 1.3 2 MnCl2 .4H2O 0.36 3 H3BO3 33.6 4 Na2EDTA.2H2O 45.0 5 NaH2PO4 .H2O 20.0 6 NaNO3 100.0 7 Khoáng Vi lượng 1ml Pha lần lượt các chất dinh dưỡng vào 950ml nước cất, sau đó định mức thành 1000ml. Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. - Môi trường Walne Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 40 Bảng 3.7. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne [16] STT Thành phần Hàm lượng (ml/L) 1 Dung dịch dinh dưỡng 1 ml 2 Dung dịch vitamin 0.1 ml Pha môi trường Walne trong 1000ml nước biển đã hấp khử trùng. 3.1.5.3. Môi trường Walne thương mại (Walne TM): Cải tiến từ môi trường Walne, do công ty TNHH Công nghệ Hải Dương, tp. HCM sản xuất, được pha chế sẵn ở dạng hợp chất tinh thể. Bảng 3.8. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne TM STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO3 9.366 2 NaH2PO4 .H2O 0.936 3 Na2SiO3 0.936 4 H3BO3 1.5735 5 Na2EDTA.2H2O 2.1075 6 FeCl3.6H2O 0.06 7 MnCl2 .4H2O 0.0165 8 ZnCl2 0.0048 9 CoCl2.6H2O 0.00465 10 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.00225 11 CoSO4.5H2O 0.0045 12 Vitamin B1 0.0375 13 Vitamin B12 0.00225 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 41 3.1.5.4. Môi trường TT3 Môi trường đang được sử dụng tại trung tâm thủy sản 3 – Nha Trang. Bảng 3.9. Thành phần môi trường TT3 STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO3 70 2 KH2PO4 6 3 Na2SiO3 5 4 EDTA 5 5 Acid citric C6H8O7.H2O 7 6 FeCl3.6H2O 2 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm - Nguồn nước Nguồn nước biển sử dụng cho nuôi cấy và giữ giống được lấy ở bãi sau biển Vũng Tàu. Nước biển được lọc qua giấy lọc, sau đó cho 200ml vào các bình nước biển thể tích 500ml. bổ sung khoáng và dinh dưỡng và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút. - Vệ sinh dụng cụ nuôi ống nghiệm, bình nuôi cấy, bình giữ giống, pipet, đầu típ, xilanh, môi trường (trừ vitamin) đều được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút. 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu. Thí nghiệm được tiến hành trong bình nước biển 500ml với 4 môi trường nuôi: F/2, Walne, Walne TM, TT3 với 3 lần lặp lại. Tổng cộng số bình thí nghiệm là 12. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 42 Điều kiện thí nghiệm Ban đầu, quy trình khảo sát được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ ổn định khoảng 280C, chiếu sáng bằng ánh sáng đèn neon). Tuy nhiên, đây là điều kiện áp dụng cho quá trình giữ giống, ức chế quá trình sinh trưởng của tảo. nên trong 2 tuần đầu, mật độ tảo không đủ để thực hiện quá trình nhân giống phục vụ thí nghiệm.Buộc phải chuyển toàn bộ thí nghiệm ra điều kiện tư nhiên. - Độ mặn: 10% - Mật độ ban đầu: 230.000 tb/ml - Cường độ sáng: khoảng 10.000 – 60.000 lux (có lưới che nắng). Chiếu sáng tự nhiên bằng ánh sáng mặt trời. - Chu kỳ chiếu sáng: tự nhiên - Nhiệt độ: ngoài trời, biên độ giao động nhiệt độ từ 280C – 350C, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm khoảng 70C – 100C. Mục đích: chọn được môi trường phù hợp cho tăng sinh của tảo Tetraselmis phục vụ cho công tác nghiên cứu và nuôi trồng đại trà. Tiến hành thí nghiệm: - Nhân giống: giống ban đầu được cung cấp bởi phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học (khoảng 10ml) được chuyển toàn bộ vào 100ml môi trường F/2 đã hấp khử trùng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên trong 5 ngày, mật độ đạt được khoảng 230.000 tb/ml. Chuyển 20ml dịch nuôi vào 180ml môi trường F/2, tiếp tục nuôi trong 5 ngày. Sau đó, chuyển toàn bộ 200ml dịch nuôi này vào bình chứa 800ml môi trường F/2. như vậy, lượng giống sau 15 ngày nuôi cấy đã đủ cho công tác lưu giữ giống và tiến hành thí nghiệm. - Làm thuần: Hình 3.1. Địa điểm thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 43 Từ bình giống 1L, hút ra 200 ml chia đều cho 4 bình có chứa 50ml các môi trường: F/2, TT3, Walne, Walne TM. Tiến hành nuôi trong thời gian 7 ngày, như vậy, ta có 4 bình môi trường khác nhau (mỗi bình 100ml) để tiến hành thí nghiệm khảo sát môi trường tối ưu. Mục đích của giai đoạn làm thuần này là giúp tảo thích nghi với điều kiện môi trường mới, tránh stress do thay đổi môi trường đột ngột. - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm, mỗi lô là một môi trường khác nhau gồm 3 bình, mỗi bình 200ml. Chuyển 20ml dịch nuôi đã làm thuần vào các môi trường tương ứng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên - Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tế bào, được theo dõi thông qua chỉ số độ hấp thu ánh sáng (OD) của dịch nuôi. Ghi nhận 2 ngày môt lần. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 44 Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Môi trường F/2 Môi trường TT3 Môi trường Walne Môi trường Walne TM Lưu giữ giống gốc Nhân giống cấp I Làm thuần 20ml Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 45 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Định tính lipid trong tảo Thí nghiệm này được thực hiện tại viện sinh học nhiệt đới tp. HCM Tiến hành thí nghiệm: Sau thí nghiệm 1, ta chọn được môi trường tăng trưởng tối ưu cho tảo Tetraselmis, lấy mẫu dịch nuôi trong môi trường này để kiểm tra định tính lipid. Lắc đều dịch nuôi cấy, dùng pipet vô trùng hút 1ml vào eppendort 1.5ml Thao tác trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy vòng chuyển vài giọt dịch nuôi cấy lên lam kính. Cố định mẫu bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa (chú ý không để quá nóng sẽ làm vỡ hoặc teo tế bào) Nhuộm bằng thuốc nhuộm Nile blue A Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Hình 3.3. Nhuộm mẫu tảo với Nile Blue A A. Nhuộm Nile Blue B. Sau khi rửa với acid acetic 3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 3.3.1. Xác định mật độ tế bào - Mẫu tảo được lấy 2 ngày một lần, một lần trong ngày vào lúc 10 giờ sáng - Lượng mẫu lấy mỗi lần: 4-6 ml A B Hình 3.4. Buồng đếm hồng cầu Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 46 - Mật độ tế bào được xác định bằng hai phương pháp: + Buồng đếm hồng cầu hiệu Hirschmann của Đức Diện tích 1mm2, độ sâu 0.1mm + Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tảo được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Spectrophotometer) CECIL – CE 1011. Trên cơ sở đo độ hấp thu ánh sáng (OD) của các dung dịch mẫu với mật độ tảo khác nhau, xác lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ tảo (với bước sóng 660 nm). Từ đó có thể xác định nhanh mật độ của tảo thông qua đo OD. 3.3.2. Xác định độ mặn. Độ mặn của nước biển được xác định bằng tỷ trong kế của Trung Quốc trước khi bố trí thí nghiệm nhằm xác định và bổ sung NaCl cho đạt theo yêu cầu. Hình 3.6. Tỷ trọng kế Hình 3.5. Máy đo OD A. nhìn ngang B. Nhìn từ trên xuống A B Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 47 3.3.3. Phương pháp định tính Lipid Định tính lipid bằng phương pháp phổ huỳnh quang nhờ thuốc nhuộm Nile blue. Công thức phân tử: C20H20C1N30 Hình 3.7. Công thức Nile Blue A A. Công thức hóa học B. Công thức không gian Nguyên tắc: Nile blue là thuốc nhuộm huỳnh quang dùng để phân biệt chất béo trung tính từ các acid béo. Thuốc nhuộm này sẽ kết hợp với giọt dầu trong tế bào và phát xạ huỳnh quang màu cam đậm khi được kích thích bằng phổ huỳnh quang màu lục. Thiết bị phân tích huỳnh quang Sơ đồ quang học Hình 3.8. Sơ đồ quang học của máy phân tích huỳnh quang Bộ đơn sắc Mẫu đo Bộ đơn sắc Ghi tín hiệu 1 Nguồn sáng 2 3 4 5 Detector A B Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 48 Phương pháp nhuộm Nile blue A - Mẫu tảo được cố định trên lam kính bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn - Nhuộm Nile blue 1%, để 5 phút. - Rửa nhẹ với dung dịch acid acetic 8% - Rửa lại với nước cất - Để trong tối 10 phút. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu Tảo Tetraselmis được nuôi tro ng 16 ngày, trên 4 môi trường: F/2, Walne, Walne TM, TT3. Giá trị độ hấp thu mật độ quang (OD) được ghi nhận sau 2 ngày nuôi và 2 ngày một lần, kết quả thu được như sau: 4.1.1. Phương trình đường tuyến tính giữa mật độ và độ hấp thu (OD) của môi trường F/2. OD Số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu Số tb trung bình trong buồng đếm Mật độ tb trong 1ml Lần 1 Lần 2 Lần 3 0.101 14 9 15 12.7 127.000 0.202 16 13 19 16 160.000 0.303 23 26 19 22.7 227.000 0.401 29 28 31 29.3 293.000 0.505 37 42 31 36.7 367.000 Biểu đồ 4.1. Đường tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ của tảo Tetraselmis y = 608793x + 50701 R2 = 0.9855 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD M ật đ ộ (tế b ào /m l) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 50 4.1.2.Tăng trưởng của tảo Tetraselmis trên các môi trường thử nghiệm. - Môi trường F/2 + Đường cong tăng trưởng Ngày OD 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 0.047 0.11 0.168 0.183 0.202 0.255 0.253 0.23 Mẫu 2 0.045 0.104 0.139 0.176 0.187 0.218 0.224 0.196 Mẫu 3 0.048 0.108 0.142 0.166 0.178 0.224 0.238 0.217 Ngày Tb/ml 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 79.314 117.668 152.978 162.110 173.677 205.943 204.726 190.723 Mẫu 2 78.097 114.015 135.323 157.849 164.545 183.418 187.071 170.024 Mẫu 3 79.923 116.451 137.150 151.761 159.066 187.071 195.594 182.809 Biểu đồ 4.2. Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường F/2 Trên môi trường F/2, tảo phát triển tăng đều, đạt mật độ cao nhất vào ngày thứ 12 và có xu hướng giảm dần từ ngày thứ 14. Cả 3 mẫu thí nghiệm trong nghiệm thức đều có giai đoạn tăng và giảm mật độ tương tự nhau. Điều này có thể được giải thích do thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện tự nhiên, ngoài ảnh hưởng do môi trường nuôi trồng, còn phải chịu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng, cường độ ánh sáng nhiệt độ,. . . 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ngày M ật đ ộ tế b ào (t b/ m l) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 51 - Môi trường TT3 Ngày OD 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 0.06 0.069 0.132 0.156 0.166 0.175 0.182 0.180 Mẫu 2 0.048 0.061 0.105 0.143 0.138 0.156 0.136 0.134 Mẫu 3 0.024 0.045 0.101 0.145 0.147 0.171 0.168 0.166 Ngày Tb/ml 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 87.229 92.708 131.062 145.673 151.761 157.240 161.501 160.284 Mẫu 2 79.923 87.837 114.624 137.758 134.714 145.673 133.497 132.279 Mẫu 3 65.312 78.097 112.189 138.976 140.194 154.805 152.978 151.761 Biểu đồ 4.3. Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường TT3 Trên môi trường TT3, mật độ tế bào tảo cũng đạt cao nhất vào ngày nuôi thứ 12. Tuy nhiên, cũng giống như nghiệm thức môi trường F/2, 3 bình nuôi cũng có mật độ không đều nhau và vào ngày nuôi thứ 10, mật độ tăng không đều mà có xu hướng giảm. Ở mẫu thứ 1 và thứ 2, ngày thứ 14, khuynh hướng giảm mật độ không rõ bằng mẫu thứ 3. 0 50,000 100,000 150,000 200,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ngày M ật đ ộ tế b ào (t b/ m l) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 52 - Môi trường Walne Ngày OD 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 0.029 0.047 0.053 0.036 0.038 0.034 0.039 0.032 Mẫu 2 0.029 0.035 0.046 0.04 0.042 0.041 0.042 0.038 Mẫu 3 0.020 0.025 0.044 0.036 0.036 0.032 0.042 0.036 Ngày Tb/ml 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 68.356 79.314 82.967 72.618 73.835 71.400 74.444 70.182 Mẫu 2 68.356 72.009 78.705 75.053 76.270 75.662 76.270 73.835 Mẫu 3 62.877 65.921 77.488 72.618 72.618 70.182 76.270 72.618 Biểu đồ 4.4. Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường Walne Môi trường Walne, hầu như mật độ tế bào không tăng, cả 3 mẫu trong nghiệm thức chỉ tăng mật độ không đáng kể vào ngày thứ 4 và thứ 6 của quá trình nuôi. Còn sau đó mật độ giảm và ổn định. Mật độ tế bào không tăng hoặc chỉ tăng nhẹ, tế bào tảo quan sát dưới kính hiển vi vẫn hoạt động bình thường, có thể nghiên cứu sử dụng môi trường Walne để phục vụ công tác giữ giống tảo Tetraselmis. 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ngày M ật đ ộ tế b ào (t b/ m l) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 53 - Môi trường Walne TM Ngày OD 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 0.028 0.05 0.057 0.06 0.06 0.062 0.061 0.06 Mẫu 2 0.023 0.036 0.055 0.066 0.062 0.06 0.066 0.064 Mẫu 3 0.037 0.051 0.062 0.06 0.056 0.059 0.069 0.066 Ngày Tb/ml 0 2 4 6 8 10 12 14 Mẫu 1 67.747 81.141 85.402 87.229 87.229 88.446 87.837 87.229 Mẫu 2 64.703 72.618 84.185 90.881 88.446 87.229 90.881 89.664 Mẫu 3 73.226 81.749 88.446 87.229 84.793 86.620 92.708 90.881 Biểu đồ 4.5. Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường Walne TM Môi trường Walne cải tiến (Walne TM), mật độ tế bào tăng cao nhất vào ngày nuôi thứ 8 và có xu hướng ổn định. Đến ngày thứ 16, mật độ có xu hướng giảm nhẹ ở mẫu 1. Cần tiến hành khảo sát trong thời gian dài hơn, để xác định pha suy vong. Có thể khảo sát để dùng môi trường này làm môi trường giữ giống. 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ngày M ật đ ộ tế b ào (t b/ m l) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 54 4.1.3. So sánh tăng trưởng của tảo Tetraselmis trên 4 môi trường. Ngày OD 0 2 4 6 8 10 12 14 F/2 0.047 0.107 0.15 0.175 0.189 0.232 0.238 0.214 Walne 0.026 0.036 0.048 0.037 0.039 0.036 0.041 0.035 Walne TM 0.029 0.046 0.058 0.062 0.059 0.06 0.065 0.063 TT3 0.044 0.058 0.113 0.148 0.15 0.167 0.162 0.16 Ngày Tb/ml 0 2 4 6 8 10 12 14 F/2 79.314 115.842 142.020 157.240 165.763 191.941 195.594 180.983 Walne 66.530 72.618 79.923 73.226 74.444 72.618 75.662 72.009 Walne TM 68.356 78.705 86.011 88.446 86.620 87.229 90.273 89.055 TT3 77.488 86.011 119.495 140.802 142.020 152.369 149.325 148.108 Biểu đồ 4.6. Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên 4 môi trường Khi bố trí 4 đường cong tăng trưởng của tảo Tetraselmis trên cùng một đồ thị, ta thấy rõ: môi trường F/2 là môi trường giúp tảo tăng sinh tốt nhất, mật độ tảo trung bình cực đại đạt 195.594 tb/ml. Như vậy, mật độ tảo tăng gấp 2.5 lần so với mật độ tảo ban đầu. Sau đó đến môi trường TT3, mật độ tảo trung bình cực đại đạt 152.369 tb/ml. mật độ tảo tăng gấp đôi so với ban đầu. Còn hai môi trường Walne và Walne TM, mật độ tảo chỉ tăng nhẹ và có xu hướng ổn định. 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Ngày M ật đ ộ tế b ào (t b/ m l) Môi trường F/2 Môi trường Walne Môi trường Walne TM Môi trường TT3 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 55 Hình 4.1. Tetraselmis sau 1 tuần nuôi 4.1.4. Thảo luận Trong cả 4 môi trường được khảo sát, thành phần dinh dưỡng chính là Nitơ (lấy từ muối NaNO3), Nitơ rất cần thiết cho quá trình tổng hợp protein ở tảo , Phốt Pho (từ muối NaH2PO4), cần thiết cho quá trình hình thành màng tế bào và các hợp chất năng lượng. Thành phần khoáng chủ yếu là Fe 3+ (từ Fecl3.6H2O), cần thiết cho quá trình quang tổ ng hợp của tảo . ở môi trường F/2, Walne và Walne TM còn có thêm các khoáng CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2.6H2O, MnCl2.4H2O, những khoáng này cần thiết cho hoạt động của các enzyme, hoặc tham gia trong thành phần của các enzyme. Thành phần thì tương đối giống nhau nhưng kết quả nuôi trồng không giống nhau. Ta xem xét về tỉ lệ giữa các thành phần trong môi trường: Xét về tỉ lệ giữa Nitơ/Phốt pho (N/P) trong 4 môi trường, ta có: Môi trường F/2: N/P = 15 Môi trường Walne: N/P = 5 Môi trường Walne TM: N/P = 10 Môi trường TT3: N/P = 12 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 56 Theo Schreurs (1992), tỉ lệ N/P tối ưu của nhóm tảo có nhân thật là 16 -23, của nhóm tảo tiền nhân là 10 -16. Còn theo Schindler (1977) và Smith (1983), tế bào tảo đòi hỏi khoảng 10 – 15 nguyên tử Ni tơ cho mỗi nguyên tử phốt pho, khi N/P cao thì tảo lục sẽ chiếm ưu thế so với các loài tảo khác. Điều này đã khẳng định, chính tỉ lệ của các thành phần dinh dưỡng trong môi trường quyết định đến tăng trưởng của tảo chứ không phải hàm lượng và thành phần. Xét môi trường Wal ne, Walne TM và môi trường F/2, ta thấy thành phần khoáng và vitamin trong 3 môi trường này tương đối giống nhau . Nhưng kết quả thu được cho thấy, những thành phần này không ảnh hưởng quyết định đến tăng trưởng của tảo. Điều này sẽ giúp cho việc pha chế môi trường nuôi trồng Tetraselmis trở nên đơn giản hơn, giảm chi phí khi nuôi trồng ở quy mô đại trà và đặc biệt trước mắt sẽ giúp công tác phân lập và thuần chủng giống này thuận lợi hơn, giảm thiểu các hiện tượng nhiễm tạp, do các vitamin là môi trường rất thuận lợi cho vi khuẩn và nấm phát triển. Xét giữa môi trường F/2 và môi trường TT3, kết quả cho thấy, tảo Tetraselmis phát triển thuận lợi hơn, mật độ cao hơn khi nuôi trên môi trường F/2. Như vậy, những thành phần khoáng và vitamin mà môi trường TT3 không có cũng đóng góp một vai trò nào đó trong quá trình tăng trưởng của tảo Tetraselmis. Vấn đề là cần tìm ra yếu tố nào góp vai trò quyết định: vitamin hay muối khoáng. Môi trường TT3 do viện nghiên cứu thủy sản III – Nha Trang nghiên cứu và sử dụng. Môi trường này được đặc chế để nuôi trồng tảo Silic. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm cho thấy, tảo lục Tetraselmis cũng có thể phát triển thuận lợi trên môi trường này, mở ra một khả năng tự nghiên cứu tìm ra môi trường tăng trưởng tối ưu cho giống tảo này dựa trên nền tảng cơ bản là tỉ lệ N/P trong môi trường. 4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm tra định tính lipid Kết quả định tính cho thấy, tảo Tetraselmis có kích thước giọt lipid khá lớn, có nhiều triển vọng trong việc áp dụng nuôi trồng đại trà để phục vụ cho sản xuất nhiên liệu sinh học. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn, còn phải tiến hành thí nghiệm kiểm tra định tính, xác định hàm lượng lipid trong tảo. Ngoài ra, còn phải nghiên cứu những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành lipid của tảo để chủ động tạo ra điều kiện thuận lợi nhằm thu được lượng lipid nhiều nhất. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 57 Hình 4.2. Định tính lipid trong Tetraselmis A. trước khi quét phổ B. Sau khi quét phổ Phổ phát xạ màu cam rất rõ. Chứng tỏ tảo tetraselmis có chứa lipid. Mẫu đối chứng Mẫu đối chứng là mẫu được phân lập tại phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, đại học Khoa Học Tự Nhiên tp.HCM. Những mẫu này nằm trong ngân hàng giống của đề tài cấp nhà nước về tảo dầu do cô ths. Lê Thị Mỹ Phước làm chủ nhiệm. Hình 4.3. Mẫu đối chứng A. không có dầu B. Có dầu A B A 1 A 2 B1 B2 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 58 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Nghiên cứu đã xác định được môi trường tối ưu trong 4 môi trường được khảo sát dùng để nuôi trồng tảo Tetraselmis. Bước đầu xác định được thành phần và tỉ lệ các thành phần trong môi trường cần thiết cho tăng trưởng của tảo Tetraselmis, là cơ sở để tự nghiên cứu và tìm ra môi trường thích hợp hơn đồng thời giảm chi phí và đơn giản hóa quá trình pha môi trường. Từ những kết quả thu được, chúng tôi đi đến kết luận sau: 1. Môi trường F/2 là môi trường tối ưu nhất trong 4 môi trường được khảo sát 2. thành phần môi trường không phải là yếu tố quyết định, ảnh hưởng đến mức độ tăng sinh của tảo, mà là tỉ lệ giữa các thành phần trong môi trường. 3. kết quả định tính lipid cho thấy trong tảo Tetrselmis có chứa lipid. Đề nghị 1. Môi trường nuôi chỉ là một trong số những yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng của tảo Tetraselmis. Để có thể đưa tảo này vào nuôi trồng đại trà, cần có những nghiên cứu tiếp theo về ảnh hưởng của nhiệt độ, cường độ chiếu sáng, thời gian chiếu sáng, pH môi trường, ảnh hưởng của sục khí và nồng độ bổ sung CO2… 2. Môi trường F/2 là môi trường tăng trưởng tối ưu trong 4 môi trường, nhưng trong thành phần có nhiều khoáng và vitamin, dễ gây nhiễm khuẩn và nấm mốc, ảnh hưởng lớn đến quá trình phân lập tảo này. Đề nghị dùng môi trường TT3 để phân lập tảo tetraselmis, hoặc dùng môi trường F/2 nhưng bỏ bớt một số thành phần khoáng và vitamin. 3. Hai môi trường Walne và Walne TM, không thích hợp cho tăng sinh sinh khối tảo, tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi, tảo vẫn hoạt động bình thường. như vậy, trên hai môi trường này, tảo chỉ lớn lên về kích thước chứ hầu như không phân chia, nên có thể dùng 2 môi trường này trong công tác nuôi giữ giống. 4. Hiện nay, việc định tính dầu tảo được tiến hành bằng phương pháp phổ huỳnh quang, nhờ thuốc nhuộm Nile Blue A, tuy nhiên, thí nghiệm này phải tiến hành ở viện sinh học nhiệt đới tp.HCM, gây ra một số khó khăn trong quá trình nghiên cứu. Đề nghị sử dụng phương pháp nhuộm Soudan III (R47) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 59 Phương pháp tiến hành như sau: - Làm tiêu bản có vết bôi của mẫu - Cố định tiêu bản bằng formalin 40% trong 5 phút - Thêm xanh methylene vào và giữ trong 10 phút - Nhỏ thêm một giọt dung dịch Soudan III, đậy lá kính lại và giữ yên từ 5-10 phút. - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Các hạt lipid sẽ có màu từ hồng đến cam, tế bào sẽ có màu xanh nước biển. TÀI LIỆU THAM KHẢO Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] GS.PTS. Đặng Đình Kim, PTS. Đặng Hoàng Phước Hiền. 1999. Công nghệ sinh học vi tảo, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [2] Đặng Thị Sy. 2005. Tảo học, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội. [3] Dương Đức Huyến. 2009. Phân loại thực vật bậc thấp, Nxb Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội. [4] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết.2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc Gia, tp. HCM [5] Đoàn Văn Bộ. Các phương pháp phân tích hóa học nước biển. 2001. Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội [6] Chu Chí Thiết, Martin S Kumar. 2008. Kỹ thuật sản xuất giống ngao Bến Tre (Meretrix lyrata Sowerby, 1851), Phân viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản Bắc Trung Bộ (ARSINC), Viện Nghiên cứu và Phát triển Nam Ausstralia (SARDI) Tài liệu tiếng Anh [7] Borowitzka M.A. 1988. Fats, oil and carbonhydrates, Microalgal biotechnology [8] O’Meley C & Daintith M. 1993. Algae cultures for marine hatcheries, turtle press, Australia [9] Guillard R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, Culture of marine invertebrate animals, pp. 29 – 60 [10] Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine Invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 61 Tài liệu Internet [11] [12] [13] [14] [15] [16] PHỤ LỤC Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 62 PHỤ LỤC : PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT BIODIESEL TỪ TẢO Quy trình sản xuất biodiesel - Đầu tiên tăng sinh khối tảo đến giai đoạn mật độ tế bào cao nhất. - Lọc thẩm thấu, thu sinh khối chuyển sang bể nuôi khác không bổ sung Nitơ, tảo sẽ phản ứng lại tình trạng thiếu dinh dưỡng bằng cách dự trữ chất béo. - Khi lượng chất béo sinh ra đủ mức cần thiết, ta sẽ tập trung các tế bào lại để phân tách chúng một cách hệ thống. - Lọc các cơ quan tế bào lớn và màng tế bào, sau đó dùng các loại dung môi như methanol để phân tách chất béo từ các loại protein và đường có thể hoà tan trong nước. - Tinh chế chất béo thu được và làm bay hơi dung môi. - Cuối cùng, đưa chất béo vào lò phản ứng hoá học để chuyển hoá chúng thành nhiên liệu sinh học. Hình 4.4. Quy trình sản xuất Biodiesel từ tảo