Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học rễ cây chùm ruột (Phyllanthus acidus (L).) Skeels, họ Euphorbiaceae

Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất còn lại trên cao ethyl acetate ở các phân đoạn khác và cao butanol. Đồng thời chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được.

pdf32 trang | Chia sẻ: builinh123 | Ngày: 30/07/2018 | Lượt xem: 336 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học rễ cây chùm ruột (Phyllanthus acidus (L).) Skeels, họ Euphorbiaceae, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS (L).) SKEELS, HỌ EUPHORBIACEAE GVHD: TS. Bùi Xuân Hào ThS. Lê Thị Thu Hương SVTH : Nguyễn Thị Hoài Khanh MSSV: K38.201.049 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS (L).) SKEELS, HỌ EUPHORBIACEAE GVHD: TS. Bùi Xuân Hào ThS. Lê Thị Thu Hương SVTH : Nguyễn Thị Hoài Khanh MSSV: K38.201.049 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016 Ý KIẾN HỘI ĐỒNG ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ ............................................................................................................................................ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Thầy Bùi Xuân Hào, Cô Lê Thị Thu Hương và Thầy Dương Thúc Huy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đã giúp đỡ tận tình, định hướng cũng như truyền đạt những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm cần thiết trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận này. Quý Thầy Cô bộ môn Hóa, khoa Hóa – Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh, các thầy cô đã hết lòng hướng dẫn, giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức khoa học quý báu trong suốt thời gian em học tại trường, tạo nền tảng cho em bước vào sự nghiệp sau này trong tương lai cũng như trong thời gian em thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Gia đình đã luôn đồng hành và hỗ trợ em trong suốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Đặc biệt con xin cảm ơn mẹ đã luôn chia sẻ, động viên, tin tưởng và là chỗ dựa tinh thần để con hoàn thành tốt khóa luận. Cuối cùng em cũng xin cảm ơn tất cả các bạn trong phòng thí nghiệm Hợp chất thiên nhiên trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình trao đổi những kinh nghiệm, đoàn kết, gắn bó và tạo mọi điều kiện giúp đỡ nhau trong suốt quá trình thực hiện đề tài. -i- MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU iv LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) 2 1.1.1 Tên gọi 2 1.1.2 Phân bố 2 1.1.3 Mô tả thực vật 2 1.1.4 Công dụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền 3 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 3 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 4 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS TRONG NƯỚC 5 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 8 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 8 2.1.1 Hóa chất 8 2.1.2 Thiết bị 2.2 LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 8 2.2.1 Khảo sát nguyên liệu 8 2.2.2 Điều chế các loại cao 9 2.2.3 Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane 9 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1 13 -ii- 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T3 14 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 16 4.1 KẾT LUẬN 16 4.2 KIẾN NGHỊ 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 PHỤ LỤC 20 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ac Acetone AcOH Acetic Acid C Chloroform d Doublet dd Doublet of doublets DMSO Dimethyl sulfoxide EA Ethyl acetate H n-Hexane m multiplet M Methanol NMR Nuclear magnetic resonance P Petroleum ether ppm Parts per million q Quartet t Triplet UV Ultraviolet -iii- DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây chùm ruột 1 Hình 1.2. Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus 5 Hình 3.1. Khung sườn lupane 13 Hình 3.2. Cấu trúc hợp chất T1 13 Hình 3.3. Cấu trúc hợp chất T3 14 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất cao 10 Sơ đồ 2.2. Quá trình cô lập các hợp chất trên phân đoạn H1 11 BẢNG BIỂU Bảng 1. Sắc kí cột trên dịch methanol 8 Bảng 2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất T3 và hợp chất T1 14 -iv- LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa, được thiên nhiên ưu đãi cho các loài thực vật rất đa dạng. Từ xưa, người Việt Nam đã biết tận dụng nguồn tài nguyên này vào để làm thuốc chữa bệnh (gọi là thảo dược). Nhưng có thể do ngẫu nhiên hoặc phải mất rất nhiều thời gian thì người ta mới nhận biết được một loại cây có thể dùng làm thuốc. Ngày nay, sự phát triển nhanh chóng của khoa học kĩ thuật, ngành tổng hợp hoá dược rất phát triển. Tuy vậy, không phải hợp chất nào cũng có thể dễ dàng được tổng hợp. Để đáp ứng yêu cầu đó, đồng thời cũng tận dụng những ưu đãi của thiên nhiên, ngành Hoá học các hợp chất thiên nhiên ra đời và phát triển rất mạnh mẽ. Nhiều hợp chất tự nhiên được cô lập từ cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất các loại thuốc chữa bệnh bảo vệ sức khoẻ con người. Các nguồn tài liệu cho thấy cây chùm ruột là một loài cây được phân bố khá phổ biến ở các nước nhiệt đới gió mùa như Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Malaysia... Các chất được cô lập từ lá cây chùm ruột đều có đa dạng các loại hoạt tính sinh học như chống lại những thương tổn ở gan, làm giảm huyết áp, có tính kháng viêm, giảm đau, chống oxi hoá. Từ những điều trên, cần thiết phải nghiên cứu và khảo sát thành phần hoá học rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) ở Việt Nam để tìm ra những chất hi vọng có hoạt tính mới và tương tự như lá cây chùm ruột, và đó là lý do chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát thành phần hoá học của rễ cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels, thuộc họ Thầu dầu Euphorbiaceae” để thực hiện. -1- CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) 1.1.1. Tên gọi Tên thông thường: cây chùm ruột, cây tầm ruột. Tên gọi khác: cây tầm ruột hay cây tầm giuộc. Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Tên khoa học: Phyllanthus acidus (L.) Skeels. Hình 1.1 Cây chùm ruột 1.1.2. Phân bố Cây chùm ruột có nguồn gốc từ Madagasca, sau đó di nhập vào nhiều nước vùng châu Á, châu Phi. Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây chùm ruột được trồng phổ biến ở miền Nam. Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu là cây chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels (Euphorbiaceae) được thu hái ở huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận. 1.1.3. Mô tả thực vật Theo Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, cây chùm ruột là loại cây nhỏ, cao 3 – 5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt, nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo do lá rụng để lại. Lá chùm ruột thuộc loại lá kép, mọc -2- so le, cuống dài, lá chét mỏng, mềm, dài 4 – 5 cm, rộng 18 – 20 mm. Gốc lá bầu, tròn, phần đầu phiến lá nhọn, mặt dưới màu xám nhạt, gân lá rõ ở cả hai mặt. Cụm hoa mọc ở kẽ những lá đã rụng thành xim, dài 6 – 15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu đỏ, hoa cái và hoa đực ở cùng một cây; hoa đực có đài 4 răng, 4 nhị, rời; hoa cái có 4 lá đài, bầu 4 ô và hoa mọc thành cụm từ 4 – 7 hoa ở mỗi mấu tròn. Quả chùm ruột mọng, có khía, 4 mảnh, đường kính khoảng 5 mm và cuống quả dài khoảng 7 mm. Khi quả chín có màu vàng nhạt, vị chua, hơi ngọt và ăn được.[24-26] 1.1.4. Công dụng của cây chùm ruột trong y học cổ truyền Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích và cộng sự, trong y học cổ truyền các nước, những bộ phận khác nhau của cây chùm ruột được dùng làm thuốc chữa các bệnh ngoài da, như lá được dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa và mề đay. Vỏ thân cây chùm ruột được dùng để chữa các bệnh ngoài da: tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm, trừ tích ở phổi, dùng bôi ngoài, chữa ghẻ, loét, vết thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng và đau họng. Bột vỏ thân ngâm giấm, uống chữa bệnh trĩ. Rễ và vỏ cây chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sôi, xông hít chữa ho và nhức đầu; hay được người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng rất nhỏ). Vỏ rễ sắc đặc hoặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (psoriasis). Tuy nhiên, không được sử dụng rễ và vỏ rễ để uống. [24,25] 1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS Các nghiên cứu về cây chùm ruột Phyllanthus acidus cho thấy có nhiều nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, lactone, steroid, terpenoid, lignan và tannin, trong đó lignan, triterpene, alkaloid và tannin là các loại hợp chất phổ biến được phát hiện trong cây này. Một số nghiên cứu hoá thực vật trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus được thực hiện khá sớm và chỉ công bố sự cô lập của các triterpene và phytosterol (Dekker, 1908; Ultee, 1933; Sengupta và Mukhopadhyay, 1966; Pettit và cộng sự, 1982).[2,22,18,16] Các hợp chất triterpene đã được cô lập thuộc khung oleane như β-amyrin (22), khung lupane như lupeol (23) và khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid như phyllanthol (24). Trong khi đó, các hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol và các glycoside của chúng. -3- Những nghiên cứu trong khoảng 15 năm gần đây trên cây chùm ruột Phyllanthus acidus đã công bố sự cô lập của một nhóm các hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học của chúng khá đa dạng (Lv J.-J và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[10,23] Năm 2000, hai hợp chất phyllanthusol A (2) và B (3) đã được cô lập, có khung sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn các phân tử đường glucosyl và mannosamine-N-acetate (Vongvanich và cộng sự, 2000).[23] Tuy nhiên, đến năm 2014, cùng với sự cô lập 19 hợp chất cũng thuộc khung sườn norbisabolane, các hợp chất phyllanthusol A và B được xác nhận cấu trúc, trong đó hai đơn vị đường là glucopyranosyl và glucosamine-N-acetate. Như vậy, cho đến nay đã có 21 hợp chất norbisabolane được cô lập, với tên gọi tương ứng là phyllanthacidoid A-T (1-21). Trong đó, hai hợp chất phyllantacidoid S (20) và T (21) chứa khung sườn rất lạ so với các hợp chất được cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có trong cấu trúc của chúng. Ngoài ra, các hợp chất phyllanthacidoid cũng được xác định là thành phần chính có trong rễ cây chùm ruột, với hàm lượng khoảng 1 mg/g, tính trên khối lượng rễ chưa khô (Vongvanich và cộng sự, 2000).[23] Quá trình chiết xuất và phân tích hàm lượng của phyllanthacidoid A và B cũng được xác nhận bằng phương pháp điện di (capillary electrophoresis) (Durham D. G. và cộng sự, 2002).[3] Năm 2010, các hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic acid (30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột (Leeya và cộng sự, 2010).[9] 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học trên cao chiết các bộ phận của cây chùm ruột Phyllanthus acidus cũng khá phổ biến, như hoạt tính kháng khuẩn (Menlendez và cộng sự, 2006),[13] kháng nấm (Satish và cộng sự, 2009),[17] kháng ký sinh trùng giun đũa trên thực vật (Mackeen và cộng sự, 1997),[11] bệnh sơ nang (Sousa và cộng sự, 2007; Santhosh và cộng sự, 2011),[20,8] chữa trị tổn thương gan (Nilesh và cộng sự, 2011),[6] giảm nhẹ mỡ ở các mô, tạng, giảm lipid trong huyết thanh và trong gan của chuột lang trong 6 tuần (Chongsa và cộng sự, 2014).[1] Ngoài ra, các hợp chất thuộc khung sườn -4- norbisabolane đã được thử nghiệm độc tính tế bào và hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV), với giá trị IC50 trong khoảng 0.8-36.0 µM (Lv và cộng sự, 2014; Vongvanich và cộng sự, 2000).[10,23] Các hợp chất được cô lập từ cao n-butanol của lá cây chùm ruột Phyllanthus acidus đều có khả năng làm giảm huyết áp và giãn cơ vòng ở động mạch chủ (Leeya và cộng sự, 2010).[9] 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS TRONG NƢỚC Năm 2014, Nguyễn Thái Thế đã cô lập được các hợp chất phenylbutanoid và diphenylheptanoid, trong đó có một hợp chất diphenylpentanoid mới (Nguyen T. T. và cộng sự, 2014).[15] Cho đến nay, các hợp chất có khung sườn phenylbutanoid và phenylheptanoid chưa được công bố trong chi Phyllanthus. Các hợp chất cô lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone (26), 1-[4’-(O-β-D- glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3-pentanone (27). Năm 2015, trong tóm tắt kết quả nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ của Võ Thị Như Thảo,[27] với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết và xác định thành phần hóa học của vỏ thân cây chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam trong một số dịch chiết”, tác giả công bố đã thu được một số kết quả như: xác định độ ẩm của nguyên liệu bột khô là 8.87%; hàm lượng tro trung bình là 5.00%; định tính được dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu cơ thuộc các nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có 9 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester của acid béo; dịch chiết ethyl acetate có 14 cấu tử hữu cơ thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpen... Ngoài ra, tóm tắt luận án cũng công bố thông tin về thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của bột vỏ cây chùm ruột trên hai dòng chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis và Klebsiella. Tuy nhiên, công bố của tác giả không cho thấy bất kỳ sự xác định cấu trúc của hợp chất nào cô lập được từ vỏ thân cây chùm ruột ở Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam và cho đến nay, các kết quả này vẫn chưa được tìm thấy trong các báo cáo khoa học tại Việt Nam. -5- Hình 1.2 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus -6- Hình 1.2 Một số hợp chất cô lập từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus (tiếp). -7- CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Hoá chất  Silica gel: silica gel 60, 0.04-0.06 mm, Merck dùng cho cột sắc kí.  Sắc kí bản mỏng loại 25DC - Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F 254 , Merck.  Dung môi dùng cho quá trình sắc kí cột và sắc kí điều chế: n-hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.  Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng vanillin/H2SO4. 2.1.2. Thiết bị  Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.  Các cột sắc kí.  Máy cô quay chân không.  Bếp cách thuỷ.  Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.  Cân điện tử.  Các thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR (500 MHz), phổ 13C-NMR (125 MHz), ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker.  Tất cả phổ NMR được ghi tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. LY TRÍCH VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT 2.2.1. Khảo sát nguyên liệu Rễ chùm ruột được thu hái ở tỉnh Bình Thuận vào tháng 4 năm 2014. Rễ cây được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, chặt nhỏ, phơi khô trong bóng râm và nghiền nhỏ thành bột. Sau đó tiến hành đun chiết và phân lập các hợp chất. -8- 2.2.2. Điều chế các loại cao Sau khi xử lý mẫu nguyên liệu thu được 20.0 kg nguyên liệu dạng bột. Nguyên liệu bột được đun hồi lưu trong ethanol ở 80oC trong 30 phút đối với mỗi bình cầu dung tích 1000 ml. Tiến hành lọc bỏ phần bã rắn, cô quay phần dịch dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (1.0 kg). Một nửa cao ethanol thô tiếp tục được hòa tan bằng methanol nóng thu được phần dịch methanol (300.0 g). Tiến hành sắc ký cột pha thuận nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: methanol với độ phân cực tăng dần thu được các cao tương ứng (Bảng 2.1). Bảng 1 Sắc kí cột trên dịch methanol. Hệ dung môi Cao H:EA 95:5 H1 (2.0 g) H:EA 9:1 H2 H:EA 8:2 H3 H:EA 5:5 H4 (3.4 g) EA EA1 (67.0 g) EA:Me 5:5 EA2 (85.0 g) Me Me 2.2.3. Cô lập các hợp chất hữu cơ trong cao hexane Trên cao H1 (2.0 g) thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel và giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (9:1) thu được 4 phân đoạn H1.1 (125.0 mg), H1.2 (250.0 mg), H1.3 (152.0 mg) và H1.4 (150.0 mg). Từ phân đoạn H1.2 tiếp tục SKC silica gel và giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được 3 phân đoạn H1.2.1 (60.0 mg), H1.2.2 (55.0 mg) và H1.2.3 (75.0 mg). Trên phân đoạn H1.2.1 thực hiện SKC và giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được hợp chất T3 (30.0 mg) (Sơ đồ 2.2). -9- Trên phân đoạn H1.2.2 thực hiện SKC silica gel và giải ly nhiều lần bằng hệ dung môi n-hexane: methanol (100:0.2) thu được hợp chất T1 (22.0 mg) (Sơ đồ 2.2). -10- Làm sạch, để khô, nghiền nhỏ Rễ chùm ruột Đun hồi lưu trong ethanol ở 80 o C trong 30 phút Lọc Cô quay thu hồi dung môi Hòa tan một nửa trong cao tổng bằng methanol nóng Sắc ký cột pha thuận nhiều lần bằng các hệ dung môi với độ phân cực tăng dần. Methanol H:EA 8:2 EA:Me 5:5 H:EA 9:1 H:EA 95:5 H:EA 5:5 EA Bột khô (20.0 kg) Dịch ethanol Bã khô Cao ethanol thô (1.0 kg) Phần còn lại Dịch methanol (300.0 g) Phần bã không tan (200.0 g) MeOH EA2 (85.0 g) EA1 (67.0 g) H4 (3.4 g) H3 H2 H1 (2.0 g) Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất cao -11- H:Me 100:0.2 H:Me 100:0.2 H:Me 100:0.2 H:EA 9:1 H1 (2.0 g) H1.1 (125.0 mg) H1.2 (250.0 mg) H1.3 (152.0 mg) )mg) H1.4 (150.0 mg) H1.2.1 H1.2.2 H1.2.3 T1 (22.0 mg) T3 (30.0 mg) Sơ đồ 2.2 Quá trình cô lập các hợp chất trên phân đoạn H1 -12- CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T1 Hợp chất T1 (22.0 mg) thu được được từ phân đoạn H1.2.2 với các đặc điểm như sau:  Chất bột vô định hình màu trắng.  Không bắt UV tại bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4 đun nóng cho vết màu tím.  Phổ 1H–NMR (CDCl3): Phụ lục 1.  Phổ 13C–NMR (CDCl3): Phụ lục 2.  Phổ 13C–NMR giãn rộng (CDCl3): Phụ lục 3. Trên phổ 13C–NMR của T1 có 30 tín hiệu cộng hưởng ứng với 30 cacbon giúp xác định hợp chất có khung sườn triterpene. Trên phổ 1H–NMR lại thấy xuất hiện 7 tín hiệu cộng hưởng của 7 nhóm methyl với H 0.76 (3H, s), H 0.79 (3H, s), H 0.83 (3H, s), H 0.94 (3H, s), H 0.97 (3H, s), H 1,03 (3H, s), H 1.68 (3H, s) lần lượt là H3-24, H3-28, H3-25, H3-27, H3-23, H3-26, H3- 30, trong đó nhóm methyl (H3-30) cộng hưởng ở vùng từ trường thấp có thể là nhóm methyl gắn với carbon sp2. Trên phổ 1H–NMR xuất hiện 2 tín hiệu ở vùng từ trường thấp của 2 proton có δH 4.69 ppm và δH 4.57 ppm ghép gem với nhau bởi hằng số ghép nhỏ J=1.5 Hz. Bên cạnh đó phổ 13C–NMR có 2 tín hiệu carbon ở vùng alkene, trong đó có 1 tín hiệu carbon tứ cấp tại δC 151.0 ppm và 1 tín hiệu carbon ở δC 109,4 ppm, vậy khẳng định trong hợp chất T1 có chứa 1 nhóm isopropenyl –C(CH3)=CH2. Ngoài ra, trên phổ 1 H–NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm oxymethine ở H-3 tại 3.19 ppm (dd, J1=5.0 Hz, J2=11.5Hz). Kết hợp với tài liệu tham khảo (Ayer 1984, Mahato, 1994), [12] dự đoán hợp chất T1 có khung sườn lupane. Phân tích sự chẻ mũi của H-3 chứng tỏ H-3 ghép cặp với H-2a với Jaa=11,5Hz, từ đó suy ra proton H-3 phải ở vị trí trục hay nhóm –OH phải ở vị trí xích đạo. -13- Kết hợp so sánh dữ kiện phổ của lupeol[14] cho thấy có sự tương đồng, cấu trúc của T1 là lupeol hình vẽ sau: 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT T3 Hợp chất T3 (30.0 mg) thu được được từ phân đoạn H1.2.1 với các đặc điểm như sau:  Chất lỏng màu vàng.  Bắt UV tại bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4 đun nóng cho vết màu tím.  Phổ 1H–NMR (CDCl3): Phụ lục 4. Trên phổ 1H–NMR ta thấy xuất hiện các tín hiệu của proton các nhóm methyl và proton olefin. So sánh dữ liệu phổ 1H–NMR của T3 và T1 (Bảng 2) thì chúng tương đồng nhau và chỉ khác biệt ở sự thay đổi các nhóm thế trên vòng A của T3. Trên phổ 1H–NMR xuất hiện 2 proton olefin tại 5.78 ppm (1H, d, 10.0 Hz) và 7.09 ppm (1H, d, 10.0 Hz) chứng tỏ 2 proton này ghép cis với nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của proton H-1 cho thấy nối đôi giữa C-1 và C-2 phải liên hợp với 1 nối đôi C=O. So sánh với tài liệu tham khảo,[19] hợp chất T3 được xác định là glochidone. Hợp Hình 3.1 Khung sườn lupane Hình 3.2 Cấu trúc hợp chất T1 -14- chất này đã được cô lập từ cao methanol của vỏ thân cây chùm ruột bởi Nguyễn Thái Thế và cộng sự.[15] Bảng 2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất T3, T1 và Glochidone No T3 a T1 a Glochidone H (ppm) H (ppm) C (ppm) H (ppm) C (ppm) 1 7.09 (1H, d, 10.0) 38.2 7.11 (1H, d, 10.0) 159.9 2 5.78 (1H, d, 10.0) 25.4 5.81 (1H, d, 10.0) 125.2 3 3.17 (1H, dd, 11.5, 5.0) 79.2 205.6 4 38.9 44.7 5 55.6 53.5 6 18.5 19.0 7 34.5 33.8 8 41.1 43.0 9 50.7 44.5 10 37.5 39.6 11 21.2 21.3 12 27.5 25.1 13 39.1 38.3 14 43.1 43.1 15 27.6 35.5 16 35.9 40.0 17 43.2 41.8 18 48.7 47.9 19 2.40 (1H, ddd, 11.0, 6.0, 6.0) 2.37 (1H, ddd, 11.0, 5.5, 5.5) 48.1 2.52 (1H, ddd, 11.0, 6.0, 6.0) 48.2 20 151.0 150.8 21 30.1 29.8 22 40.2 29.7 23 1.06 (3H,s) 0.97 (3H,s) 28.2 1.1 (3H,s) 27.8 24 0.96 (3H,s) 0.76 (3H,s) 15.5 1.05 (3H,s) 21.4 25 1.08 (3H,s) 0.83 (3H,s) 16.2 1.03 (3H,s) 19.2 26 1.13 (3H,s) 1.03 (3H,s) 16.1 1.14 (3H,s) 16.5 27 1.11 (3H,s) 0.94 (3H,s) 14.7 0.95 (3H,s) 14.5 28 0.81 (3H,s) 0.79 (3H,s) 18.2 0.83 (3H,s) 18.1 29 4.71 (1H, d, 2) 4.59 (1H,s) 4.69 (1H, d, 2.0) 4.57 (1H, dd, 2.5, 1.5) 109.4 4.62 (1H, d, 2) 4.59 (1H,s) 109.5 30 1.69 (3H,s) 1.68 (3H, s) 19.5 1.70 (3H,s) 19.3 a Các hợp chất được ghi phổ trong dung môi CDCl3. Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất T3 -15- CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Trong nội dung đề tài, từ cây chùm ruột Phyllanthus acidus, 3 hợp chất được cô lập và xác định cấu trúc. Dựa vào các kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và kết hợp với so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất T1, T3 và T2A được xác định như sau: Hợp chất T1: Hợp chất T3: 4.2. KIẾN NGHỊ Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát các hợp chất còn lại trên cao ethyl acetate ở các phân đoạn khác và cao butanol. Đồng thời chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được. -16- TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng anh [1] Chongsa W., Radenahmad N., Jansakul C., “Six weeks oral gavage of a Phyllanthus acidus leaf water extract decreased visceral fat, the serum lipid profile and liver lipid accumulation in middle-aged male rats”, Journal of Ethnophramacology, 396 – 404, 2014. [2] Dekker S., Pharm. Weekbe, 95, 1156, 1908. [3] Durham D. G., Reid R. G., Wangboonskul J., Daodee S., “Extraction of Phyllanthusols A and B from Phyllanthus acidus and analysis by capillary electrophoresis”, Phytochem. Ana, 13, 358-362, 2002. [4] Eldeen I. M. S., Seow E. M., Abdullah R., Sulaiman S. F., “In vitro antibacterial, antioxidant, total phenolic contents and anti-HIV-1 reverse transcriptase of extract of seven Phyllanthus sp”, South African journal of botany, 77: 75 – 79, 2011. [5] Jahan A., Jangde C. R., Khatoon S., Umap S. A., “In vitro antihelmintic activity of Phyllanthus niruri Linn. against Paramphistomes”. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 5(3), 836-838, 2013. [6] Jain N. K., Singhai A. K., “Protective effects of Phyllanthus acidus (L.) Skeels leaf extracts on acetaminophen and thioacetamide induced hepatic injuries in Wistar rats”, Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 470 – 474, 2011. [7] Kotloff K. L., Winickoff J. P., B. Ivanoff J. D., Clemens D. L., Swerdlow P. J., Sansonetti G. K., Adak M. M. L., “Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and implementation of control strategies”, Bull World Health Organ, 77, 651-666, 1999. [8] Kumar S. C., Bhattacharjee C., Debnath S., Chandu A. N., Kanna K. K., “Remedial effect of Phyllanthus acidus against bleomycin provoked pneumopathy”, Journal of Advanced Pharmceutial Research, 2(1), 317–325, 2011. [9] Leeya Y., Mulvany M. J., Queiroz E. F., Marston A., Hostettmann K., Jansakul C., “Hypotensive activity of an n-butanol extract and their purified compounds -17- from leaves of Phyllanthus acidus (L.) Skeel in rats”, European Journal of Pharmacology, 649, 301-313, 2010. [10] Lv J.-J., Yu S., Wang Y.-F., Wang D., Zhu H.-T., Cheng R.-R., Yang C.-R., Xu M., Zhang Y.-J., “Anti-hepatitus B virus norbisabolane sesquiterpenoids from Phyllanthus acidus and the establishment of their absolute configurations using theoretical calculations”, The Journal of Organic Chemistry, 79(12), 5432- 5447, 2014. [11] Mackeen M. M., Ali A. M., Abdullah M. A., Nasir R. M., Mat N. B., Razak A. R., Kawazu K., “Antinematodal activity of some Malaysian plant extracts against the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus”, Pesticide Science, 51(2), 165-170, 1997. [12] Ayer W. A., Flanagan R. J., Reffstrup T., “Metabolites of bird’s nest fungi – New triterpenenoid carboxylic acids from Cyathus striatus and Cyathus pygmaeus”, Tetrahedron, 40(11), 2069-2082, 1984. [13] Menlendez P. A., Capriles V. A., “Antibacterial properties of tropical plants from Puerto Rico”, Phytomedicine: international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 13, 272 – 276, 2006. [14] Mohammad Saleem, Farrukh Afaq, Vaqar Mustafa Adhami, Hasan Mukhtar, “Lupeol modulates NF-B and PI3K/Akt pathways and inhibits skin cancer in CD-1 mice”, Oncogene, 23, 5203-5214, 2004. [15] Nguyen T. T., Duong T. H., Nguyen T. A. T., Bui X. H., “Study on the chemical constituents of Phyllanthus acidus (Euphorbiaceae)”, Journal of Science and Technology, 52(5A), 156-161, 2014. [16] Pettit G. R., Cragg G. M., Gust D., Brown P., Can J. Chem., 60, 939, 1982. [17] Satish S., Raghavendra M. P., Raveesha K. A., “Antifungal potentiality of some plant extracts against Fusarium sp.”, Archives of Phytopathology and Plant Protection , 42(7), 618-625, 2009. [18] Sengupta P., Mukhopadhyay J., “Terpenoids and related compds. VII. Triterpenoids of Phyllanthus acidus”, Phytochemistry, 5(3), 531-534, 1966. [19] Ganguly A. K., Govindachari T. R., Mohamed P. A., Rahimtulla A. D., Viswsnathan N., “Chemical constituents of glochidion hohen ackeri”, -18- Tetrahedron, 42, 1513-1519, 1966. [20] Marisa S., Jiraporn O., Roswitha S., Supaporn P., Ana R., Andre S., Tiago G., Chaweewan J., Margarida D. A., Rainer S., et al, “An extract from the medicinal plant Phyllanthus acidus and its isolated compounds induce airway chloride secretion:A potential treatment for cystic fibrosis.”, Molecular pharmacology, 71(1), 366-376, 2007. [21] Tang Y.-Q., Sekaran S. D. (2011), “Evaluation of Phyllanthus, for Its Anti- Cancer Properties, Prostate Cancer - From Bench to Bedside”, Dr. Philippe E. Spiess (Ed.), ISBN: 978-953-307-331-6, InTech. [22] Ultee A. J., “The phytosterol of Phyllanthus acidus Skeels”, Pharmaceutisch Weekblad, 70, 1173-1175, 1933. [23] Vongvanich N., Kittakoop P., Kramyu J., Tanticharoen M., Thebtaranonth Y., “Phyllanthusols A and B, cytotoxic norbisabolane glycosides from Phyllanthus acidus skeel”, Journal of Organic Chemistry, 65(17), 5420-5423, 2000. Tài liệu tham khảo tiếng việt [24] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đảm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Như, Nguyễn Tập, Trần Toàn, “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, NXB. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, 460 – 461, 2004. [25] Đỗ Tất Lợi, “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 515 – 516, 2004. [26] Phạm Hoàng Hộ, “Cây cỏ Việt Nam”, quyển II, NXB trẻ, 190, 2003. [27] Võ Thị Như Thảo, “Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài luận văn thạc sĩ”, Đại học Đà Nẵng, Trường Đại học Sư phạm, 2015. -19- PHỤ LỤC -20- Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của hợp chất T1 19 24 28 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của hợp chất T1 Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR của hợp chất T1 giãn rộng 27 Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR của hợp chất T3 28

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfkhao_sat_thanh_phan_hoa_hoc_re_cay_chum_ruot_phyllanthus_acidus_l_skeels_ho_euphorbiaceae_8202.pdf