Luận văn Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sö (penaeus monodon) bằng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch

TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “BưỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHưƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH”. Giáo viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm hiện nay rất ít. Do đó việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phương thức kiểm soát bệnh. Kết hợp mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch trên tôm sú không mang các virus thông thường nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tôm. Tiến trình thí nghiệm được thực hiện như sau: tôm không mang các virus thông thường được gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (101,5 SID50/ml) và liều cao (104,0 SID50/ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm. Sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú. Các kết quả thu được: Các biểu hiện lâm sàng của tôm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thường, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, được phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cường độ nhiễm là (+) Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dương tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hóa mô miễn dịch. Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngoài gan tụy với cường độ nhiễm thấp (+). Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng. Cường độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp có sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trước, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dưới vỏ và mô liên kết của màng bao gan tụy. MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ . .iv TÓM TẮT . v MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT . x DANH SÁCH CÁC HÌNH .xi DANH SÁCH CÁC BẢNG xii PHẦN I: GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 2 1.3. Yêu cầu 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tôm sú .3 2.1.1. Miễn dịch không đặc hiệu của giáp xác .3 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác 3 2.1.3. Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase .3 2.1.4. Hệ thống đông máu 6 2.1.5. Các chất ức chế proteinase .7 2.1.6. Hệ thống nhận diện không chuyên biệt 7 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn .8 2.1.8. Peroxynectin .9 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 9 2.2.1. Bệnh đốm trắng 9 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố 10 2.2.1.2. Triệu chứng, bệnh tích 11 2.2.2. Virus đốm trắng 11 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi .11 2.2.2.2. Hình thái 12 2.2.2.3. Cấu trúc .13 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng .15 2.3.1. Vật liệu gây bệnh 15 2.3.2. Cơ chế gây bệnh .16 2.3.3. Cơ chế lây lan .17 2.4. Mô hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tôm .18 2.5. Phương pháp hóa mô miễn dịch .19 2.5.1. Nguyên lý 19 2.5.2. Kháng nguyên .20 2.5.3. Kháng thể 20 2.5.4. Phương pháp nhuộm .21 2.5.4.1. Phương pháp trực tiếp .21 2.5.4.2. Phương pháp gián tiếp 22 2.5.4.3. Phương pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) 23 2.5.4.4. Phương pháp avidin – biotin complex (ABC method) .23 2.5.4.5. Phương pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHưƠNG PHÁP .25 3.1. Thời gian và địa điểm .25 3.1.1. Thời gian 25 3.1.2. Địa điểm 25 3.2. Vật liệu .25 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm 25 3.2.1.1. Vật liệu .25 3.2.1.2. Dụng cụ .25 3.2.2. Các hóa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC .26 3.2.2.1. Hóa chất 26 3.2.2.2. Vật tư 26 3.2.2.3. Thiết bị 26 3.3. Bố trí thí nghiệm .27 3.3.1. Tôm và điều kiện thí nghiệm 27 3.3.2. Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) .27 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tôm sú 27 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh .28 3.4. Phương pháp nghiên cứu .28 3.4.1. Phương pháp pha loãng dịch virus 28 3.4.2. Phương pháp thu mẫu tôm .29 3.4.3. Phương pháp nhuộm IHC 30 3.4.4. Xử lý thống kê .34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Độc lực của virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) .35 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết 35 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tôm thí nghiệm theo từng thời điểm .36 4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú 37 4.2.1. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) 38 4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) 42 4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh .46 4.3. Thảo luận 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1. Kết luận .50 5.2. Đề nghị .50 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC .57

pdf81 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 04/06/2013 | Lượt xem: 1715 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sö (penaeus monodon) bằng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hóa mô miễn dịch, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ều thấp theo từng thời điểm Nhận xét Ở liều cao, tôm bị nhiễm WSSV đƣợc phát hiện vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ nhiễm là 50 % (3/6 con) còn ở liều thấp thì tôm bị nhiễm WSSV cũng đƣợc phát hiện đầu tiên vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm với tỷ lệ là 33,3 % (2/6 con) (Bảng 4.2). Kết quả này chứng minh ở liều cao nồng độ virus đốm trắng cao hơn hẳn liều thấp nên khả năng tấn công vào tôm với cƣờng độ lớn hơn nên làm số lƣợng tôm thí nghiệm nhiễm nhiều hơn (Hình 4.2) Từ thời điểm 18 giờ đến khi kết thúc thí nghiệm 60 giờ (sau khi gây nhiễm) tỷ lệ tôm bị nhiễm WSSV tăng dần, nhƣng ở liều cao tôm bị nhiễm 100 % vào thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm, trong khi ở liều thấp tôm bị nhiễm 100 % vào thời điểm cuối thí nghiệm (60 giờ). Kết quả này chứng tỏ rằng với dòng virus đƣợc sử dụng trong thí nghiệm có độc lực nhƣ nhau thì liều cao (104,0 SID50/ml) có nồng độ virus cao hơn có khả năng lan truyền virus đốm trắng trong cơ thể tôm sú sẽ nhanh hơn liều thấp (101.5 SID50/ml ), do đó tỷ lệ nhiễm của tôm với liều cao cho kết quả cao hơn liều thấp. 37 4.2. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA DÕNG WSSV-VN Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dòng Việt Nam trên tôm sú ở 10 cơ quan chính: hệ tiêu hoá (ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa), gan tụy (mô liên kết, khe sinuse), hệ hô hấp (mang), cơ quan lymphoid, tim, tuyến anten, mô tạo máu và biểu mô dƣới vỏ (Marks, 2005). Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN Đây là các cơ quan đích của virus đốm trắng. Vì thế chúng tôi khảo sát sự xâm nhiễm của virus đốm trắng trên các cơ quan này cho nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên tôm sú. 4.2.1 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều gây nhiễm thấp (10 1,5 SID50/ml) Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp (%) Thời gian (giờ) Cơ quan 0 6 12 18 24 36 48 60 Lympho 0 0 0 0 0 66.7 75 100 Ruột giữa 0 0 0 0 0 66.7 50 100 Mô liên kết gan 0 0 0 0 0 16.7 0 0 Tim 0 0 50 0 33.3 66.7 66.7 100 Mang 0 0 0 16.7 16.7 66.7 83.3 100 Mô tạo máu 0 0 0 0 0 66.7 83.3 100 Tim Gan tụy Biểu mô dƣới vỏ Mang Mô tạo máu Ruột trƣớc Tuyến anten Ruột giữa Dạ dày Lymphoid 38 Ruột trƣớc 0 0 0 16.7 33.3 66.7 60 100 Tuyến anten 0 0 0 0 0 66.7 60 100 Dạ dày 0 0 0 16.7 50 66.7 66.7 100 Biểu mô dƣới vỏ 0 0 0 0 50 66.7 83.3 100 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp. A: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên tim, mô tạo máu, lymphoid B: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên mang và tuyến anten C: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên biểu mô dƣới vỏ, ruột trƣớc, dạ dày và ruột giữa Các tế bào bị nhiễm WSSV đầu tiên xuất hiện vào giờ thứ 12 sau khi tiêm, tại thời điểm này có 2/6 con tôm thí nghiệm bị nhiễm WSSV. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú là tim với cƣờng độ nhiễm thấp (+) (chỉ có một nhân A B 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Lympho Mô tạo máu Tim 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) T. anten Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Ty r lệ nh iễm (% ) Ruột trước Ruột giữa Dạ dày Biểu mô dưới vỏ C 39 tế bào bị nhiễm). Nhƣ vậy, tim là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của WSSV-VN trên tôm sú (Hình 4.4.A) Ở thời điểm 18 giờ, 2/6 con tôm bị nhiễm và vị trí tấn công tiếp theo của WSSV trên mang, ruột trƣớc và dạ dày với cƣờng độ nhiễm (+) (Hình 4.4.B, C) Ở thời điểm 24 giờ, 4/6 con tôm bị nhiễm WSSV. Ở hệ tiêu hóa, WSSV tấn công vào các tế bào biểu mô của ruột trƣớc và dạ dày cũng với cƣờng độ (+), tuy nhiên ruột giữa chƣa bị nhiễm. Một số cơ quan khác cũng bị nhiễm WSSV trong thời điểm này là mang, tim và biểu mô dƣới vỏ với cƣờng độ chƣa cao. Các cơ quan khác: lymphoid, gan tụy, mô tạo máu và tuyến anten chƣa bị nhiễm tại thời điểm này. Ở thời điểm 36 giờ, cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm khá nặng và nhiễm trên hầu hết các cơ quan. Đặc biệt, 2 con tôm đã bị nhiễm với cƣờng độ nặng (++) trên tất cả các cơ quan, điều này phù hợp với các biểu hiện lâm sàng (đỏ thân, thân mềm và phản xạ kém). Tuy nhiên, trong lô thí nghiệm này có 2 con hoàn toàn không có những dấu hiệu lâm sàng đặc trƣng và kết quả phân tích không bị nhiễm WSSV (phụ lục 3) . Thời điểm 48 giờ, có 5/6 con tôm bị nhiễm WSSV, hầu hết các cơ quan đều dƣơng tính với WSSV: ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa, tim, mang, mô tạo máu, tuyến anten và biểu mô dƣới vỏ bị nhiễm nặng nhất với cƣờng độ nhiễm là (++), còn cơ quan lymphoid bị nhiễm nhẹ hơn với cƣờng độ (+), ngoại trừ tế bào mô liên kết của màng bao gan không bị nhiễm (phụ lục 3) Thời điểm kết thúc thí nghiệm (60 giờ) 100 % tôm thí nghiệm đều bị nhiễm WSSV. Các tế bào bị nhiễm nặng nhất đƣợc tìm thấy ở mang, mô tạo máu, các tế bào của ruột trƣớc, dạ dày và ruột giữa, các tế bào của lympho, tuyến anten và lớp biểu mô dƣới vỏ với cƣờng độ nhiễm (++). Các cơ quan khác nhƣ tim bị nhiễm ít hơn, chỉ một số ít tế bào với cƣờng độ xâm nhiễm là (+). Các tế bào mô liên kết của màng bao bên ngoài gan tụy không bị nhiễm WSSV. 40 1 2 A B A B A B B A B B A A 5 6 3 4 41 Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tôm thí nghiệm liều thấp 1: Biểu mô dưới vỏ, X40 2: Ruột trước, 40X 3: Dạ dày, 40X 4: Ruột giữa, 40X 5: Mang, 40X 6: Tuyến anten, 40X 7: Mô tạo máu, 40X 8: Tim, 40X A: Tế bào bị nhiễm WSSV B: Tế bào bình thường 4.2.2 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tôm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều cao (%) Thời gian (giờ) Cơ quan 0 6 12 18 24 36 48 60 Lympho 0 0 0 0 100 100 100 100 Ruột giữa 0 0 0 0 50 100 100 100 Mô liên kết gan 0 0 16.7 0 50 16.7 60 100 Tim 0 0 16.7 16.7 83.3 66.7 100 100 Mang 0 0 16.7 66.7 100 100 100 100 Mô tạo máu 0 0 16.7 0 83.3 100 100 100 Ruột trƣớc 0 0 0 60 100 100 100 100 Tuyến anten 0 0 16.7 40 100 100 100 100 Dạ dày 0 0 0 66.7 100 100 100 100 Biểu mô dƣới vỏ 0 0 0 66.7 100 100 100 100 B A A B 7 8 42 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao. A: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên tim, mô tạo máu, lymphoid B: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên mang, tuyến anten và mô liên kết gan C: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên biểu mô dưới vỏ, ruột trước, dạ dày và ruột giữa Các tế bào bị nhiễm WSSV xuất hiện đầu tiên vào thời điểm 12 giờ. Ở thời điểm này có 3/6 con tôm bị nhiễm trên các cơ quan: tim, mô tạo máu, tuyến anten, mang và các tế bào nằm trên màng bao bên ngoài của gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+) (1 – 2 tế bào ). Nhƣ vậy, ở liều cao tim vẫn là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng trên tôm sú. Ở thời điểm 18 giờ, có 5/6 con tôm dƣơng tính với WSSV. Các tế bào trên tim bị nhiễm khá ít với cƣờng độ (+). Các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa: biểu mô ruột trƣớc và dạ dày tuy bị nhiễm nặng hơn ở tim nhƣng cƣờng độ nhiễm vẫn là (+), nhƣng ruột 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Lympho Tim Mô tạo máu 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ nh iễm (% ) Mô liên kết gan Tuyến anten Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ nh iễm (% ) Ruột trước Ruột giữa Dạ dày Biểu mô dưới vỏ A B C 43 giữa vẫn chƣa bị nhiễm. Các tế bào ở mang, biểu mô dƣới lớp vỏ carapace và tuyến anten cũng bị nhiễm với cƣờng độ (+). Từ 24 giờ đến khi kết thúc thí nghiệm (60 giờ) mức độ nhiễm WSSV của các tế bào trên các cơ quan tăng lên rất nhiều: ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa, mang, tuyến anten, biểu mô dƣới vỏ, tim, mô tạo máu, lympho. Số lƣợng tế bào bị nhiễm WSSV đƣợc tìm thấy nhiều nhất trên biểu mô của ruột trƣớc, mô tạo máu, dạ dày, mang và biểu mô dƣới vỏ với cƣờng độ (++). Trên cơ quan gan tụy chỉ tìm thấy sự xâm nhập của virus đốm trắng trên màng bao bên ngoài và khe sinuse, không tìm thấy sự xâm nhập của virus đốm trắng vào các tế bào gan. 2 3 4 A A B B B 1 B A A 44 Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC 1: Biểu mô dưới vỏ carapace, 40X 2: Ruột trước, 40X 3: Dạ dày, 40X 4: Ruột giữa, 40X 5: Mang, 40X 6: Tuyến anten, 40X 7: Tim, 40X 8: Mô tạo máu, 40X 9: Mô liên kết của màng bao gan, 40X 10: Cơ quan lymphoid, 40X A: Tế bào bị nhiễm WSSV B: Tế bào bình thường 5 6 7 8 9 10 A A B B A A B A A A B B 45 4.2.3 So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh Lymphoid 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m (% ) Thấp Cao Ruột giữa 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Mô liên kết gan 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Tim 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Mô tạo máu 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Ruột trước 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Tuyến anten 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Dạ dày 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Biểu mô dưới vỏ 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp và liều cao 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 46 1: Cơ quan lymphoid 2: Ruột giữa 3: Mô liên kết màng bao gan 4: Tim 5:Mang 6: Mô tạo máu 7: Ruột trước 8: Tuyến anten 9: Dạ dày 10: Biểu mô dưới vỏ Vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm, tôm ở cả 2 liều đều nhiễm WSSV với tỷ lệ tôm bị nhiễm của liều thấp thấp hơn liều cao, ở liều thấp tôm bị nhiễm WSSV chỉ phát hiện đƣợc trên tim tỷ lệ nhiễm 33,3 % (2/6 con). Trong khi đó ở liều cao thì các cơ quan bị nhiễm WSSV đƣợc phát hiện: tim, mô tạo máu, mang, mô liên kết màng bao gan với tỷ lệ nhiễm ở mỗi cơ quan là 16,7 % (1/6 con) (Hình 4.8). Điều này chứng tỏ virus liều cao có nồng độ virus cao hơn liều thấp nên khả năng xâm nhiễm và lan truyền rộng hơn liều thấp, tấn công vào nhiều cơ quan hơn. Thời gian thí nghiệm càng kéo dài thì mức độ xâm nhiễm của virus ở liều cao càng tăng lên so với liều thấp (24 giờ sau khi gây nhiễm thì hầy hết các cơ quan có tỷ lệ nhiễm là 100 %), trong khi đến khi kết thúc thí nghiệm thì ở liều thấp tỷ lệ nhiễm ở các cơ quan mới đạt 100 % (Hình 4.8). Điều này chứng tỏ ở liều cao có nồng độ virus cao hơn liều thấp nên khả năng xâm nhiễm trên các cơ quan khảo sát sẽ mạnh hơn. Bảng 4.5: Kết quả so sánh thống kê giữa liều cao và liều thấp trên các cơ quan khảo sát (với độ tin cậy 95 %) Vị trí xâm nhiễm của WSSV Yếu tố Giá trị P Cơ quan lymphoid Tiêm liều cao 0.0286 Ruột giữa Tiêm liều cao 0.1766 Mô liên kết màng bao gan Tiêm liều cao 0.0001 Tim Tiêm liều cao 0.2596 Mang Tiêm liều cao 0.0139 Mô tạo máu Tiêm liều cao 0.1248 Ruột trƣớc Tiêm liều cao 0.0153 Tuyến anten Tiêm liều cao 0.0070 Dạ dày Tiêm liều cao 0.0471 Biểu mô dƣới vỏ Tiêm liều cao 0.0415 47 Dựa vào bảng thống kê so sánh giữa liều cao và liều thấp trên các cơ quan khảo sát cho thấy: Việc tiêm virus với liều cao hay liều thấp trong quá trình gây nhiễm thì khả năng nhiễm WSSV ở các cơ quan: ruột giữa, tim, mô tạo máu không khác biệt nhau về mặt thống kê học (P>0.05) (Hình 4.8). Trong khi đó, các cơ quan khác: lymphoid, mô liên kết của màng bao gan, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mô dƣới vỏ lại có sự khác biệt với nhau khá rõ ràng (P<0.05) (Hình 4.8) trong đó sự nhiễm WSSV ở mô liên kết của màng bao gan là có khác biệt rõ ràng nhất giữa hai liều tiêm thấp và cao (P=0) (Hình 4.8.3). Còn các cơ quan khác cũng có sự khác biệt nhƣng không rõ ràng lắm, đó là cơ quan lymphoid, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mang. Từ kết quả trên, chỉ có nồng độ virus liều cao mới đủ để xâm nhập vào mô liên kết màng bao gan, và gây nhiễm ở các cơ quan: lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mô dƣới vỏ nặng hơn so với liều thấp. Các cơ quan còn lại bị nhiễm nhƣ nhau ở cả hai liều tiêm. 4.3 Thảo luận Trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm và theo dõi thí nghiệm, ở liều thấp các biểu hiện lâm sàng nhƣ hoạt động kém, bỏ ăn xuất hiện vào thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và dấu hiệu đặc trƣng của tôm nhiễm bệnh đốm trắng là đỏ thân xuất hiện vào thời điểm 48 giờ sau khi cảm nhiễm. Trong khi đó, ở liều cao các biểu hiện hoạt động kém, bỏ ăn xuất hiện vào thời điểm 24 giờ sau khi cảm nhiễm và các dấu hiệu đặc trƣng xuất hiện vào thời điểm 48 giờ. Cuối thí nghiệm, chỉ có 16,7 % xuất hiện đốm trắng ở liều thấp trong khi đó ở liều cao 100 % tôm xuất hiện đốm trắng (Bảng 4.1). Kết quả này chứng minh đƣợc với nồng độ virus cao hơn nên khả năng tấn công của virus đốm trắng ở liều cao mạnh hơn liều thấp nên các dấu hiệu đặc trƣng xuất hiện nhanh hơn và với mức độ nhiều hơn Trong nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng, chúng tôi bố trí thí nghiệm trên 2 liều thấp (101,5 SID50/ml) và cao (10 4,0 SID50/ml), sử dụng virus đốm trắng dòng Việt Nam gây nhiễm trên tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả đạt đƣợc là tôm bị nhiễm đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm ở cả 2 liều, trong đó ở liều thấp tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng là 33,3 % và liều cao là 50 %. Thời điểm 18 giờ, ở liều thấp tỷ lệ tôm nhiễm 33,3 % (2/6 con) và tăng dần theo từng thời điểm và bị 48 nhiễm 100 % vào cuối thí nghiệm. Ở liều cao, thời điểm 18 giờ tỷ lệ tôm nhiễm là 83,3 % (5/6 con) và tỷ lệ tôm bị nhiễm đạt 100 % từ 24 giờ đến cuối thí nghiệm. Với thí nghiệm tƣơng tự của Escobedo-Bonilla, sử dụng virus đốm trắng dòng Thái Lan gây nhiễm trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở 2 liều thấp (101,5 SID50/ml) và cao (104,0 SID50/ml), kết quả là tôm bị nhiễm đốm trắng vào thời điểm 18 giờ sau khi tiêm ở liều thấp với tỷ lệ 16,7 % (1/6 con) và 12 giờ ở liều cao với tỷ lệ nhiễm 80 % (4/5 con). Ở liều thấp, thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm tỷ lệ nhiễm 83,3 % (5/6 con) và đạt 100 % vào thời điểm 36 giờ. Còn ở liều cao, thời điểm 18 giờ đến cuối thí nghiệm, tỷ lệ nhiễm đạt 100 %. Từ 2 kết quả trên chứng minh rằng, cả tôm sú lẫn tôm thẻ chân trắng đều bị nhiễm virus đốm trắng vào những thời điểm sớm của quá trình gây nhiễm. Trong nghiên cứu này chúng tôi gây nhiễm thực nghiệm bằng phƣơng pháp tiêm vào phần cơ trên thân, cơ quan xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng là tim ở liều thấp và trên các cơ quan tim, mang, mô tạo máu, tuyến anten và mô liên kết màng bao gan khi gây nhiễm ở liều cao. Khi tiến hành gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ, virus đốm trắng theo đƣờng máu lan truyền trong cơ thể tôm và xâm nhập vào tim đầu tiên, sau đó, máu từ tim đƣợc vận chuyển đến các cơ quan. Tuy nhiên, chỉ có mô tạo máu, tuyến anten, mang, mô liên kết màng bao gan ở liều cao bị nhiễm. Điều này có thể là do sự lan truyền của máu từ tim đến các cơ quan nhanh hay chậm và truyền máu đến cơ quan nào trƣớc. Khi đó, cơ quan nào đƣợc truyền máu đến đầu tiên sẽ bị nhiễm WSSV mà cụ thể đó là mô tạo máu, mang, tuyến anten và mô liên kết màng bao gan. Ở các thời điểm sau đó thì lần lƣợt các cơ quan đều bị nhiễm ở cử 2 liều. Đến cuối thí nghiệm, số lƣợng các cơ quan bị nhiễm đốm trắng tƣơng tự nhau ở cả 2 liều tiêm. Trong nghiên cứu của Escobedo-Bonilla, với phƣơng pháp gây nhiễm bằng cách tiêm virus qua đƣờng miệng nên vị trí tấn công đầu tiên của virus đốm trắng trên ruột trƣớc. Điều này khá dễ hiểu vì khi gây nhiễm qua đƣờng miệng, cơ quan đầu tiên virus đốm trắng tiếp xúc là ruột trƣớc nên ruột trƣớc là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng khi gây nhiễm bằng phƣơng pháp này. Với 2 liều gây nhiễm thấp và cao trên tôm sú, tỷ lệ nhiễm ở liều thấp vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm thấp hơn liều cao (33,3 % so với 50 %) và từ thời điểm 18 giờ cho đến khi kết thúc thí nghiệm, tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng ở liều thấp thấp hơn nhiều so với liều cao (bảng 4.2). Điều này do nồng độ virus ở liều cao cao hơn 49 liều thấp nên sự tấn công vào tôm sẽ mạnh hơn dẫn đến tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng nặng hơn. Bên cạnh đó, cƣờng độ nhiễm đốm trắng trên các cơ quan lymphoid, mô liên kết màng bao gan, mang, tuyến anten, ruột trƣớc, dạ dày và biểu mô dƣới vỏ ở liều cao nặng hơn các cơ quan này ở liều thấp vì theo Marks (2005) các cơ quan này là cơ quan đích của virus đốm trắng và với nồng độ virus cao hơn nên mức độ xâm nhiễm vào các cơ quan này nặng hơn so với liều thấp. Các cơ quan còn lại mức độ nhiễm tƣơng tự nhau ở cả 2 liều. (bảng 4.5) (Hình 4.8) 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN  Theo dõi thực nghiệm và các biểu hiện lâm sàng Các biểu hiện lâm sàng của tôm bị nhiễm: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao.  Gây nhiễm thực nghiệm với liều thấp (101,5 SID50/ml) Bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch phát hiện tôm bị nhiễm WSSV vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm, vị trí xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng là các tế bào trên tim với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Và các cơ quan bị nhiễm tiếp theo là mang, ruột trƣớc, dạ dày ở thời điểm 18 giờ sau khi gây nhiễm. Tỷ lệ nhiễm của hầu hết các cơ quan tăng dần theo thời gian sau khi gây nhiễm và chỉ bị nhiễm 100 % vào thời điểm cuối thí nghiệm  Gây nhiễm thực nghiệm với liều cao (104,0 SID50/ml) Bằng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch phát hiện cơ quan bị nhiễm WSSV vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm trên các tế bào của tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten và mô liên kết của màng bao bên ngoài của gan tụy với cƣờng độ thấp (+). Ở thời điểm 18 giờ sau khi gây nhiễm, các cơ quan còn lại đều bị nhiễm ngoại trừ cơ quan lymphoid và ruột giữa chƣa bị nhiễm ở thời điểm này. Từ 24 giờ đến cuối thí nghiệm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm WSSV.  Tại thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm, tất cả các cơ quan đều bị nhiễm WSSV  So sánh mức độ nhiễm WSSV ở liều tiêm thấp và cao Các cơ quan lymphoid, ruột trƣớc, tuyến anten, mang, dạ dày, biểu mô dƣới vỏ và mô liên kết màng bao gan bị nhiễm nặng hơn khi gây nhiễm với liều cao, trong đó mô liên kết màng bao gan bị nhiễm khác biệt nhiều nhất giữa liều tiêm thấp và liều tiêm cao (P=0). Các cơ quan còn lại nhƣ tim, mô tạo máu, ruột giữa không có sự khác biệt về cƣờng độ nhiễm giữa 2 liều tiêm (P>0.05) 51 5.2. ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục thực hiện quá trình gây nhiễm thực nghiệm trên tôm sú ở liều thấp và liều cao vào các thời điểm 3, 9, 15, 21, 30, 42, 54 giờ sau khi tiêm để xem thời điểm trƣớc 12 giờ sau khi gây nhiễm, virus đốm trắng đã xâm nhiễm vào các cơ quan của tôm chƣa. - Bên cạnh phân tích sự xâm nhiễm của virus đốm trắng trên các cơ quan bằng phƣơng pháp IHC, ta nên tiến hành phân tích mẫu máu (hemolymph) bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (IIF-indirect immuno fluorescent) và mẫu PCR bằng PCR định lƣợng để khảo sát sự xâm nhiễm của WSSV vào tế bào máu và biến thiên lƣợng virus trong cơ thể vật chủ sau khi gây nhiễm. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp, NXB Nông Nghiệp. 2. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muôi, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản, Trƣờng Đại Học Thủy Sản, Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản 3. Lý Thị Thanh Loan, 2003. Nghiên cứu một số vi khuẩn và virus gây bệnh trên tôm sú nuôi thƣơng phẩm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận án tiến sỹ. 4. Trần Ngọc Ánh Mai, 2005. Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp 5. Bùi Quang Tề, 1998. Giáo trình bệnh của Động Vật Thủy Sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 6. Phạm Văn Tình, 2001. Kỹ thuật nuôi tôm sú. NXB Nông Nghiệp. Tp.HCM 7. Vũ Thế Trụ, 1994. Cải tiến kỹ thuật nuôi tôm tại Việt Nam, NXB Nông Nghiệp. Tài liệu Tiếng Anh 1. Boigegrain R. A., Helene Mattras, Michel Brehelin and Maria-Antonia Coletti-Previero, 1994. Invertebrate proteinase inhibitors. Pure & Appi. Chem., Vol. 66, No. 1, pp. 1 – 7. 2. Boenisch T., Farmilo A.J., Stead R.H., Key M., Welcher R., Harvey R., and Atwood K.N., 2002. Handbook of Immunochemical Staining Methods. 3 rd edition, Carpinteria, California, USA. 65p 3. Chen L. L., Wang H. C., Huang C. J., Peng S. E., Chen Y. G., Lin S. J., Chen W. Y., Dai C. F., Yu H. T., Wang C. H., Lo C. F. and Kou G. H., 2002. Transcriptional Analysis of the DNA Polymerase Gene of Shrimp White Spot Syndrome Virus. Virology 301, p 136 – 147. 4. Chou H.Y., Huang C.Y., Wang C.H., Chiang H.C., Lo C.F., 1995. Pathogenecity of a baculovirus infection causing white spot syndrome virus in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms 23, p 165 – 173. 53 5. Crockford M., 2001. White Spot Disease. Australia and New Zealand Standard Diagnostic Procedures 6. Dieu B.T.M., H. Marks, J.J. Siebenga, R.W. Goldbach, D. Zoudema, Duong. T.P, J.M. Vlak, 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus in Vietnam. Journal of General Virology , p 3607 – 3618. 7. Destoumieux .D, Marcello Muñoz, Céline Cosseau, Jenny Rodriguez, Philippe Bulet, Michel Comps and Evelyne Bachère, 2000. Penaeidin, antimicrobial peptides with chitin-binding activity are produced and stored in shrimp granulocytes and released after microbial challenge. Journal of Cell Science, p 461 – 469. 8. Donald V. Lightner, Carlos R. Pantoja. Biosecurity in shrimp farming. Department Veterrinary Science and Microbiology. University of Arizona, Tucson, USA. 9. Escobedo-Bonilla C.M., M. Wille, V. Alday Sanz, P. Sorgeloos, M.B. Pensaert, H.J. Nauwynck, 2005. In vivo titration of white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopenaeus vannamei by intramuscular and oral routes. Diseases of Aquatic Organisms 66, p 163 – 170. 10. Escobedo-Bonilla C.M., M. Wille, V. Alday Sanz, P. Sorgeloos, M.B. Pensaert, H.J. Nauwynck. Pathogenesis of a Thai strain of white spot syndrome virus (WSSV) in juvenile specific pathogen-free Litopenaeus vannamei. 11. Flegel T.W., 1998. Advances in Shimp Biotechnology. Multimedia Asia Co. Ltd. Thailand, p 129 – 167. 12. Jirapanichpaisal P., 2005. Whire Spot Syndrome Virus Interaction With a Freshwater Crayfish. Acta Univertitatis Upsaliensis. Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 47. 56 pp. Uppsala. ISBN 91 – 554 – 6235 – 9. 13. Khadijah .S, Neo S.Y., M.S. Hossain, L.D. miller, S. Mathavan and J. Kwang, 2003. Identification of White Spot Syndrome Virus Latency-Related Genes in Specific-Pathogen-Free Shrimp by Use of a Microarray. Journal of Virology, p 10162 – 10167. 14. Lee S.Y., 2001. Initiation of Innate Immune Responses in the Freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus. Acta Univertitatis Upsaliensis. Comprehensive 54 Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science and Technology 613. 42 pp. Uppsala. ISBN 91 – 554 – 4973 – 5. 15. Leu J.H., Tsai J.M., Wang H.C., Wang Andrew H. J., Wang C.H., Kou G.H., Lo C.F., 2004. The Unique Stacked Rings in the Nucleocapsid of the White Spot Syndrome Virus Virion Are Formed by the Major Structural Protein VP664, the Largest Viral Structural Protein Ever Found. Journal of Virology, p 140 – 149. 16. Marks H., 2005. Genomics and transcriptomics of White Spot Syndrome Virus. PhD thesis Wageningen University 17. Melba G. Bondad-Reantaso, Sharon E. McGladdery, Iain East, Rohana P. Subasinghe, 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fisheries Technical Paper. 18. Nelda Lo´peza, Gerard Cuzonb, Gabriela Gaxiolac, Gabriel Taboadac, Manuel Valenzuelac, Cristina Pascualc, Ariadna Sa´nchezc, Carlos Rosasc, 2003. Physiological, nutritional and immunological role of dietary -1,3-glucan ascorbic acid 2-monophosphate in Litopenaeus vannamei juveniles. Aquaculture 224, 223 – 243. 19. Poulos B.T., C.R. Pantoja, D. Bradley-Dunlop, J. Aguilar, D.V Lightner, 2001. Development and application pf monoclonal antibodies for the detection of white syndrome virus of penaeid shrimps. Diseases of Aquatic Organisms 47, p 13 – 23. 20. Rajeev Kumar Jha and Zi-rong Xu, 2005. Production of recombinant enveloped structural protein the Chinese WSSV isolate. Indian Journal oj Clinical Biochemistry, p 136 – 141. 21. Scholnick D. A., Karen G. Burnett, Louis E. Burnett, 2006. Impact of Exposure to Bacteria on Metabolism in the Penaeid Shrimp Litopenaeus vannamei 22. Sritunyalucksana K., 2001. Characterisation of Some Immune Gene in the Black Tiger Shimp, Penaeus monodon. Acta Universitis Upsaliensis, p 7 – 20. 23. Standardized immunohistochemistry protocol, 2005. Brigham and women’s Hospital, Pathology Department. 24. Tookwinas S., 1998. Disease diagnosis of P. monodon broostock. Workshop on development of Penaeus monodon broodstock disease-free in asian country, 1998. Indonesia. 55 25. Tsai J.M., Hang H.C., Leu J.H., Hsiao H.H., Wang Andrew H.J., Kou G.H. and Lo C.F., 2004. Genomic and Proteomic Analysis of Thirty-Nine Structural Proteins of Shrimp White Spot Syndrome Virus. Journal of Virology, p 11360 – 11370. 26. Van der Braak K., 2002. Haemocytic defense in black tiger shrimp (Penaeus monodon), Wageningen. 27. Van Hulten, Martin Reijns, Angela M. G. Vermeesch, Fokko Zanbergen and Just M.Vlak, 2002. Identification of VP19 and VP15 of white spot syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structure proteins. Journal of General Virololy (2002), 82, 257 – 265. 28. Vlak J.M., Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu Fang Lo, Philip C. Loh and Peter J. Walker, 2002. Nimaviridae, A new virus family infecting aquatic invertebrates. XIIth InternationalCongress oj Virology. 29. Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X.B. and Xu X., 2001. Complete Genome Sequence of Shrimp White Spot Bacilliform Virus. Journal of Virology, p 11811 – 11820. 30. Yi G., W Z., Qi Y.P., Yao L.G., Qian J., Hu L.B., 2004. VP28 of Shrimp White Spot Syndrome Virus Is Involved in the Attachment and Penetration into Shrimp Cell. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, p 726 – 734. 31. Wang R., Liang Z., M. Hall, K. Soderhall, 2001. A transglutaminase involved in the coagulation system of the freshwater, Pacifastacus leniusculus. Tissue localisation and cDNA cloning. Fish and Shellfish immunology, p 623 – 637. 32. Wittevelt J., 2004. On the vaccination of shrimp against white spot syndrome virus. Ph.D thesis Wageningen University. 33. Zhang Xiaobo, Canhua Huang, Xun xu and Choy L. Hew, 2002. Identification and localization of a prawn white spot syndrome virus gene that encodes an envelope protein. Journal of General Virology (2002), 83, 1069 – 1074. 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Trọng lƣợng cơ thể tôm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm Liều Thời gian thu mẫu (giờ) Con 1 (g) Con 2 (g) Con 3 (g) Con 4 (g) Con 5 (g) Con 6 (g) Thấp 0 7 6 6 7 6 6 6 7 8 8 7 8 8 12 8 6 9 8 10 9 18 7 7 10 7 7 10 24 6 9 7 7 7 6 36 8 11 7 6 7 7 48 9 9 7 9 6 8 60 6 6 9 7 8 7 Cao 0 6 8 7 7 7 9 6 7 7 9 8 6 7 12 6 6 10 8 7 10 18 6 9 8 6 6 8 24 6 8 11 7 9 9 36 7 7 9 7 6 9 48 7 6 8 7 12 10 60 8 9 8 10 6 7 57 PHỤ LỤC 2: Thành phần một số hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 1. Dung dịch Davidson Cồn 95% : 330 ml Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nƣớc cất : 335 ml 2. Hóa chất làm lame dƣơng Aceton : 250 ml (3-aminopropyl) triethoxysaline : 5 ml PHỤ LỤC 3: Kết quả theo dõi quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng WSS- VN ở liều tiêm thấp Thời gian (giờ) Con Lympho Ruột giữa Mô liên kết gan Tim Mang Mô tạo máu Ruột trước Tuyến anten Dạ dày Biểu mô dưới vỏ 0 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 6 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 12 1 - - - + - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - 6 - - - + - - - - - 18 1 - - - - + - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - + - + - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - 58 24 1 - - - + - - - - + - 2 - - - + - - + + - + 3 - - - - + - + - + + 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - + + 6 - - - - - - - - - 36 1 + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ 2 - - - - - - - - - - 3 + + - + + + + + + + 4 + + - + + + + + + + 5 + + - + + + + + + + 6 - - - - - - - - - - 48 1 - - + + + ++ + ++ ++ 2 - - + + ++ - - - + 3 + + - + + ++ + + ++ ++ 4 + + - ++ ++ + ++ ++ ++ ++ 5 + ++ - + ++ + ++ ++ 6 - - - - - - - - - - 60 1 + + - + + ++ + + + ++ 2 - + + + + + + 3 - + + + + 4 + + - + + + + + ++ ++ 5 + + - + + + + + + + 6 + + - + + + + + + ++ PHỤ LỤC 4: Kết quả theo dõi quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng WSSV-VN ở liều tiêm cao Thời gian (giờ) Con Lympho Ruột giữa Gan Tim Mang Mô tạo máu Ruột trƣớc Tuyến anten Dạ dày Biểu mô dƣới vỏ 0 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - 6 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 59 12 1 - - - - - - - - - 2 - - - - - + - - - - 3 - - - - - - - + - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - + + + - - - - - 18 1 - - - + + - + + + + 2 - - - - - - + + + + 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - + - + - + + 5 - - - - + - - - 6 - - - - + - - - + + 24 1 + - + + ++ ++ ++ + ++ + 2 + - - + + + + + + + 3 + - - + + - + + + + 4 + - - + + + + + + 5 + + + + + + + + + + 6 + + + + + + + + + + 36 1 + + - + + + + + + + 2 + - + + + + + + + 3 + + + + + + + + 4 + - + + 5 + + - - + + + + + + 6 + + - + + + + + + + 48 1 + + + + + 2 + + - + ++ + + + + ++ 3 + + + + + + + + + + 4 + + + ++ ++ ++ + + + + 5 + + - + + + + + + ++ 6 + + + + + + + + + + 60 1 + + + + + + ++ ++ ++ 2 + + + + + + + + + ++ 3 + + + + + + + + + ++ 4 + + + + + + + + + + 5 + + + + + + + + ++ ++ 6 ++ ++ + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ 60 PHỤ LUC 5: Kết quả xử lý thống kê One-Way Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Lymphoid Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ----------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ----------------------------------------------------------------------- Between groups 1.139455 1 1.1394548 4.965 .0286 Within groups 19.048780 83 .2295034 ----------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 20.188235 84 11 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Lymphoid by KETQUA.Lieu_tiem ----------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ----------------------------------------------------------------------- 1 41 .2682927 .0700556 .0748174 .1630453 .3735401 2 44 .5000000 .0762493 .0722218 .3984039 .6015961 ----------------------------------------------------------------------- Total 85 .3882353 .0519619 .0519619 .3151393 .4613313 Multiple range analysis for KETQUA.Lymphoid by KETQUA.Lieu_tiem ----------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 41 .2682927 X 2 44 .5000000 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.23171 0.20688 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 61 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Ruot_giua Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .392912 1 .3929119 1.856 .1766 Within groups 18.416077 87 .2116790 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 18.808989 88 7 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Ruot_giua by KETQUA.Lieu_tiem -------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .2391304 .0635867 .0678360 .1437689 .3344920 2 43 .3720930 .0745845 .0701624 .2734610 .4707251 --------------------------------------------------------------------------- Total 89 .3033708 .0487690 .0487690 .2348129 .3719287 Multiple range analysis for KETQUA.Ruot_giua by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .2391304 X 2 43 .3720930 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.13296 0.19402 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 62 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Mo_lien_ket Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.822625 1 1.8226250 15.682 .0001 Within groups 10.808954 93 .1162253 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 12.631579 94 1 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Mo_lien_ke by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .0208333 .0208333 .0492073 .0482778 .0899445 2 47 .2978723 .0674286 .0497280 .2280298 .3677148 --------------------------------------------------------------------------- Total 95 .1578947 .0349775 .0349775 .1087692 .2070202 Multiple range analysis for KETQUA.Mo_lien_ke by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .0208333 X 2 47 .2978723 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.27704 0.13896 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 63 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Tim Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .315837 1 .3158366 1.287 .2596 Within groups 22.329325 91 .2453772 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.645161 92 3 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Tim by KETQUA.Lieu_tiem -------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 47 .3617021 .0708449 .0722550 .2601913 .463213 2 46 .4782609 .0744651 .0730362 .3756526 .5808692 --------------------------------------------------------------------------- Total 93 .4193548 .0513660 .0513660 .3471910 .4915187 Multiple range analysis for KETQUA.Tim by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 47 .3617021 X 2 46 .4782609 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.11656 0.20412 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 64 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Mang Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.500000 1 1.5000000 6.278 .0139 Within groups 22.458333 94 .2389184 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 23.958333 95 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Mang by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3541667 .0697614 .0705512 .2550922 .4532411 2 48 .6041667 .0713322 .0705512 .5050922 .7032411 --------------------------------------------------------------------------- Total 96 .4791667 .0498872 .0498872 .4091104 .5492229 Multiple range analysis for KETQUA.Mang by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3541667 X 2 48 .6041667 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.25000 0.19815 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 65 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Mo_tao_mau Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- --- Between groups .578126 1 .5781262 2.399 .1248 Within groups 22.411348 93 .2409822 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.989474 94 1 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Mo_tao_mau by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3333333 .0687614 .0708552 .2338179 .4328487 2 47 .4893617 .0737043 .0716050 .3887932 .5899302 --------------------------------------------------------------------------- Total 95 .4105263 .0503652 .0503652 .3397889 .4812637 Multiple range analysis for KETQUA.Mo_tao_mau by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3333333 X 2 47 .4893617 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.15603 0.20009 --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 66 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Ruot_truoc Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.431499 1 1.4314993 6.122 .0153 Within groups 20.343782 87 .2338366 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 21.775281 88 7 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Ruot_truoc by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .3043478 .0685922 .0712980 .2041194 .4045762 2 43 .5581395 .0766283 .0737432 .4544738 .6618053 --------------------------------------------------------------------------- Total 89 .4269663 .0512579 .0512579 .3549095 .4990230 Multiple range analysis for KETQUA.Ruot_truoc by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .3043478 X 2 43 .5581395 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.25379 0.20392 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference 67 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Tuyen_anten Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.757709 1 1.7577089 7.620 .0070 Within groups 21.221014 92 .2306632 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.978723 93 2 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Tuyen_anten by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .2916667 .0663000 .0693216 .1942913 .3890420 2 46 .5652174 .0738988 .0708126 .4657477 .6646871 --------------------------------------------------------------------------- Total 94 .4255319 .0495365 .0495365 .3559485 .4951153 Multiple range analysis for KETQUA.Tuyen_anten by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .2916667 X 2 46 .5652174 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.27355 0.19686 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 68 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Da_day Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups .981579 1 .9815788 4.055 .0471 Within groups 21.545894 89 .2420887 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 22.527473 90 5 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Da_day by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .3478261 .0709997 .0725451 .2458768 .4497754 2 45 .5555556 .0749111 .0733468 .4524797 .6586314 --------------------------------------------------------------------------- Total 91 .4505495 .0515782 .0515782 .3780654 .5230335 Multiple range analysis for KETQUA.Da_day by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 46 .3478261 X 2 45 .5555556 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.20773 0.20503 * --------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 69 One-Way Analysis of Variance --------------------------------------------------------------------------- Data: KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance --------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- Between groups 1.041667 1 1.0416667 4.273 .0415 Within groups 22.916667 94 .2437943 --------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 23.958333 95 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3750000 .0706166 .0712674 .2749197 .4750803 2 48 .5833333 .0719124 .0712674 .4832530 .6834136 --------------------------------------------------------------------------- Total 96 .4791667 .0503937 .0503937 .4083992 .5499341 Multiple range analysis for KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo by KETQUA.Lieu_tiem --------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups --------------------------------------------------------------------------- 1 48 .3750000 X 2 48 .5833333 X --------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.20833 0.20016 * --------------------------------------------------------------------------- 1. * denotes a statistically significant difference

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfPHAM MINH NHUT - 02126077.pdf
Luận văn liên quan