Luận văn Bước đầu sản xuất nghiên cứu nước tương lên men

Mục đích của luận văn “Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men” nhằm khảo sát các thông số công nghệ để thủy phân một cách có hiệu quả và triệt để hàm lượng protein thô còn tồn tại khá lớn trong nguyên liệu khô lạc của các nhà máy ép dầu, nâng cao hàm lượng Nitơ amin tự do trong nước tương lên men. Đồng thời đưa người sản xuất và người tiêu dùng trở về với một sản phẩm lên men truyền thống thân thiện với môi trường và tốt cho sức khoẻ con người. Sau khi tham khảo các nguồn tài liệu thu thập được về các nội dung: o Quy trình sản xuất nước tương lên men ở một số nước trên thế giới. o Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc Aspergillus oryzae. o Đặc tính của một số chế phẩm enzym protease trên thị trường. Chúng tôi đã đề ra hướng nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp này như sau: o Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi nấm mốc để sinh tổng hợp enzym protease có hoạt tính cao nhất. o Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân để nâng cao hàm lượng Nitơ amin tự do trong nước tương. o Bước đầu sử dụng kết hợp enzym protease của nấm mốc và các chế phẩm protease thương mại nhằm nâng cao hơn nữa hàm lượng Nitơ amin tự do trong nước tương. Sản phẩm mà chúng tôi thu được trong nghiên cứu này là dịch nước tương sau thủy phân với hàm lượng Nitơ amin và Nitơ tổng cao nhất là 8.93 (g/l) và 14.41 (g/l). MỤC lục Lời cảm ơn ii Tóm tắt luận văn iii danh mục hình vii danh mục bảng viii các từ viết tắt ix CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Giới thiệu 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Tổng quan về cây lạc 4 2.1.1. Lịch sử phát hiện và đặc điểm thực vật của cây lạc 4 2.1.2. Thành phần hóa học của hạt lạc 5 2.2. Tổng quan về khô lạc 7 2.3. Tổng quan về nước tương 9 2.3.1. Định nghĩa nước tương 9 2.3.2. Giới thiệu một số phương pháp sản xuất nước tương 10 2.3.3. Tiêu chuẩn chất lượng nước tương 16 2.3.4. Vi sinh vật dùng trong sản xuất nước tương lên men 17 2.3.5. Hệ enzyme trong sản xuất nước tương lên men 21 CHƯƠNG 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1. Nguyên liệu 30 3.1.1. Khô lạc 30 3.1.2. Bột mì 31 3.1.3. Muối 31 3.1.4. Nước 31 3.1.5. Vi sinh vật 31 3.2. Hóa chất sử dụng 31 3.3. Dụng cụ và thiết bị 31 3.3.1. Dụng cụ 31 3.3.2. Thiết bị 32 3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 32 3.4.1. Nội dung nghiên cứu 32 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 33 3.5. Các phương pháp phân tích 36 3.5.1. Định lượng N tổng 36 3.5.2. Định lượng N amin 37 3.5.3. Định lượng N ammoniac 38 3.5.4. Định lượng lipid thô bằng bộ Soxhlet 38 3.5.5. Định lượng tinh bột 38 3.5.6. Định lượng cellulose 38 3.5.7. Định lượng độ tro 39 3.5.8. Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến 39 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40 4.1. Khảo sát thành phần nguyên liệu 40 4.1.1. Khảo sát thành phần khô lạc 40 4.1.2. Khảo sát thành phần bột mì 42 4.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình nuôi mốc 42 4.2.1. Anh hưởng của thành phần môi trường tới hoạt tính protease. 43 4.2.2. Anh hưởng của độ ẩm tới hoạt tính protease 47 4.2.3. Anh hưởng của tỉ lệ mốc cấy tới hoạt tính protease 50 4.2.4. Anh hưởng của thời gian nuôi mốc tới hoạt tính protease 53 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 5.1. Kết luận 60 5.2. Kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 Phụ lục 64

doc87 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 25/01/2013 | Lượt xem: 2450 | Lượt tải: 16download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Bước đầu sản xuất nghiên cứu nước tương lên men, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
laø cao nhaát. Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng:nöôùc muoái, noàng ñoä muoái, nhieät ñoä, pH vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình thuûy phaân. Xaùc ñònh tæ leä boå sung cheá phaåm protease ñeå thuùc ñaåy quaù trình thuûy phaân protein. Phöông phaùp nghieân cöùu Khaûo saùt thaønh phaàn cuûa khoâ laïc Xöû lyù maãu tröôùc phaân tích Baùnh daàu laïc tröôùc khi söû duïng caàn phaûi ñöôïc ñaäp nhoû vaø ñem nghieàn nhoû tôùi kích thöôùc khoaûng 1mm. Khaûo saùt caùc thaønh phaàn cuûa khoâ laïc bao goàm: Ñoä aåm. Haøm löôïng N toång. Lipid thoâ. Tinh boät Xô thoâ. Tro. Xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng, tyû leä moác caáy, ñoä aåm vaø thôøi gian thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác ñeå hoaït tính protease laø maïnh nhaát Xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa thaønh phaàn moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Thaønh phaàn nguyeân lieäu - Tæ leä khoâ laïc: boät mì = (50:50), (70:30), (90:10); (100:0) Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu. Xaùc ñònh aûnh höôûng tyû leä moác caáy ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Tyû leä moác caáy thay ñoåi laàn löôït laø 1; 3; 5; 7; 9% (v/w) Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu. Xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease Yeáu toá thay ñoåi: Ñoä aåm ban ñaàu cuûa moâi tröôøng ñöôïc thay ñoåi laàn löôït laø 45%, 50%, 55%, 60%, 65% Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu Xaùc ñònh thôøi gian thích hôïp cho quaù trình nuoâi moác Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian nuoâi moác thay ñoåi töø 24 giôø, 36 giôø, 38 giôø; 40 giôø; 42 giôø, 46 giôø; 48 giôø; 50 giôø; 52 giôø; 60giôø Giaù trò caàn ño: Hoaït tính protease cuûa maãu Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng:dung moâi, noàng ñoä muoái, nhieät ñoä vaø thôøi gian thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Xaùc ñònh tæ leä canh tröôøng : dung moâi thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä canh tröôøng : dung moâi thay ñoåi laàn löôït laø 1:2; 1:3; 1:4 Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh noàng ñoä muoái thích hôïp cho quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Noàng ñoä muoái trong dung dòch nöôùc muoái thay ñoåi laàn löôït laø 0%, 4%, 10%, 16%, 22% (w/v) Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh nhieät ñoä thích hôïp cuûa quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Nhieät ñoä thuûy phaân thay ñoåi laàn löôït laø 450C, 500C, 550C, 600C Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh thôøi gian thuûy phaân thích hôïp Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian thuûy phaân thay ñoåi laàn löôït laø: 0; 12; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120 giôø Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Xaùc ñònh tæ leä boå sung cheá phaåm protease trong quaù trình thuûy phaân Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä boå sung Neutrase thay ñoåi laàn löôït laø 0.5; 1; 1.5; 2% (khoái löôïng dòch ennzym/khoái löôïng canh tröôøng) Tæ leä boå sung Flavourzyme thay ñoåi laàn löôït laø 0.25; 0.5; 0.75; 1% (khoái löôïng dòch ennzym/khoái löôïng canh tröôøng) Giaù trò caàn ño: Haøm löôïng N amin cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N ammoniac cuûa caùc maãu. Haøm löôïng N toång cuûa caùc maãu. Caùc phöông phaùp phaân tích [5, 11] Ñònh löôïng N toång Xaùc ñònh haøm löôïng N toång baèng phöông phaùp Micro Kieldahl. Nguyeân taéc: Khi ñoát noùng vaät phaåm ñem phaân tích vôùi H2SO4 ñaäm ñaëc, caùc hôïp chaát höõu cô bò oxy hoùa. Cacbon vaø hydro taïo thaønh CO2 vaø H2O. Coøn nitô sau khi ñöôïc giaûi phoùng ra döôùi daïng NH3 seõ keát hôïp vôùi H2SO4 taïo thaønh (NH4)2SO4 tan trong dung dòch. Ñuoåi NH3 ra khoûi dung dòch baèng NaOH ñoàng thôøi caát vaø thu NH3 baèng moät löôïng dö H2SO4 0,1N. Ñònh phaân löôïng H2SO4 coøn laïi baèng dung dòch NaOH 0,1N chuaån. Qua ñoù, tính ñöôïc deã daøng löôïng nitô coù trong maãu nguyeân lieäu thí nghieäm. Ñònh löôïng N amin Nguyeân taéc. Caùc nhoùm amin cuûa acid amin, coù theå cho phaûn öùng vôùi thuoác thöû ninhydrin, taïo ra phöùc chaát coù maøu xanh tím. Töø ñoù xaùc ñònh haøm löôïng nitô ñoàng hoùa thoâng qua vieäc so saùnh cöôøng ñoä maøu cuûa dung dòch vôùi cöôøng ñoä maøu cuûa chaát chuaån laø glycine vôùi noàng ñoä bieát tröôùc. Axit amin ñaõ phaûn öùng vôùi ninhydrin theo phöông trình: Ñònh löôïng N ammoniac Nguyeân taéc: Baèng phöông phaùp chöng loâi cuoán hôi nöôùc coù theå ñaåy ammoniac ra khoûi muoái cuûa chuùng baèng NaOH 40%, sau ñoù duøng hôi nöôùc ñeå loâi keùo löôïng ammoniac naøy ra khoûi dung dòch ñeå taùc duïng vôùi löôïng H2SO4 xaùc ñònh ôû bình höùng. Sau quaù trình chöng, ta seõ ñem ñònh löôïng haøm löôïng H2SO4 dö, töø ñoù seõ xaùc ñònh ñöôïc löôïng nitô ammoniac coù trong dung dòch. Ñònh löôïng lipid thoâ baèng boä Soxhlet Nguyeân taéc: Duøng dung moâi kò nöôùc trích ly hoaøn toaøn lipid töø nguyeân lieäu ñaõ ñöôïc nghieàn nhoû. Moät soá thaønh phaàn hoøa tan trong chaát beùo cuõng ñöôïc trích ly bao goàm saéc toá, caùc vitamin tan trong chaát beùo, caùc chaát muøi… Tuy nhieân, haøm löôïng cuûa chuùng thaáp. Do coù laãn taïp chaát, phaàn trích ly ñöôïc goïi laø lipid toång hay daàu thoâ. Haøm löôïng lipid toång coù theå tính baèng caùch caân tröïc tieáp löôïng daàu sau khi chöng caát loaïi saïch dung moâi hoaëc tính giaùn tieáp töø khoái löôïng baõ coøn laïi. Öu ñieåm cuûa caùch tính giaùn tieáp laø coù theå ñoàng thôøi trích ly nhieàu maãu trong cuøng moät truï chieát. Ñònh löôïng tinh boät Nguyeân taéc: Duøng enzym amilase thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät thaønh glucose. Chuaån ñoä vaø ñònh löôïng tinh boät döïa vaøo haøm löôïng glucose tröôùc vaø sau thuûy phaân. Ñònh löôïng cellulose Nguyeân taéc: Cellulose laø chaát xô baõ coøn laïi sau khi caùc glucide khaùc nhö tinh boät, lignin vaø caùc saéc toá, caùc taïp chaát bò thuûy phaân bôûi acid vaø kieàm. Sau khi loïc, röûa saïch xô baõ naøy, saáy khoâ ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi vaø nung thaønh tro, tröø haøm löôïng tro, tính ñöôïc löôïng cellulose trong maãu. Ñònh löôïng ñoä tro Tro laø thaønh phaàn coøn laïi cuûa thöïc phaåm sau khi nung chaùy heát caùc chaát höõu cô. Nguyeân taéc: Duøng söùc noùng 6000C nung chaùy hoaøn toaøn caùc chaát höõu cô. Phaàn coøn laïi ñem caân vaø tính ra phaàn traêm tro trong maãu. Ñònh löôïng hoaït tính protease theo phöông phaùp Anson caûi tieán Nguyeân taéc Phöông phaùp naøy döïa vaøo söï thuûy phaân cô chaát (casein) bôûi protease. Ñònh löôïng saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh baèng phaûn öùng taïo maøu vôùi thuoác thöû Folin-Cio-Calteau roài so maøu ôû böôùc soùng 750nm. Keát quaû ñöôïc tính toaùn döïa vaøo ñoà thò tyrosine chuaån vaø tính theo ñôn vò hoaït ñoä. Moät ñôn vò hoaït ñoä protease laø löôïng enzym caàn duøng trong 1 phuùt, ôû 300C ñeå thuûy phaân ñöôïc moät löôïng cô chaát taïo ra saûn phaåm töông ñöông vôùi 1 mol tyrosine baèng 18,12mg. CHÖÔNG 4-KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Trong khuoân khoå luaän vaên naøy, chuùng toâi xin trình baøy phaàn keát quaû lieân quan ñeán vieäc khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng tôùi quaù trình nuoâi naám moác ñeå sinh toång hôïp enzym protease trong quy trình saûn xuaát nöôùc töông leân men. Khaûo saùt thaønh phaàn nguyeân lieäu Khaûo saùt thaønh phaàn khoâ laïc BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 1: Keát quaû khaûo saùt thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc Thaønh phaàn hoùa hoïcHaøm löôïng (% toång khoái löôïng)Ñoä aåm13.81Protein thoâ30.78Lipid4.51Tinh boät10.50Cellulose23.76Tro8.54So saùnh thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ laïc vôùi khoâ ñaäu naønh: BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 2: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa khoâ ñaäu naønh [14] Thaønh phaàn hoùa hoïcHaøm löôïng (% toång khoái löôïng)Ñoä aåm11-13 %Protein thoâ47-51 %Chaát beùo thoâ0.1-1.5 %Hydratcarbon19-22 %Xô thoâ3-5 %Tro 4-6 %Ta so saùnh thaønh phaàn nguyeân lieäu khoâ laïc ñöôïc söû duïng trong luaän vaên vôùi thaønh phaàn cuûa khoâ ñaäu naønh thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát nöôùc töông taïi Nhaät Baûn ( REF _Ref186610570 \h BAÛNG 4.2) vaø nhaän thaáy nhö sau: Khoâ laïc ñöôïc thu nhaän töø caùc nhaø maùy saûn xuaát chaát beùo baèng phöông phaùp eùp taïi AÁn Ñoä coù haøm löôïng chaát beùo 13%) neân khoâ laïc deã bò hö hoûng neáu khoâng ñöôïc baûo quaûn trong ñieàu kieän thích hôïp. Haøm löôïng protein thoâ trong khoâ laïc khaûo saùt laø 30.78%. Trong khi ñoù, haøm löôïng protein thoâ trong haït ñaäu naønh thöôøng söû duïng ñeå saûn xuaát nöôùc töông laø khoaûng 40% vaø trong khoâ ñaäu naønh laø 47-51% [14]. Nhö vaäy, haøm löôïng protein thoâ cuûa khoâ laïc so vôùi khoâ ñaäu naønh laø töông ñoái thaáp. Haøm löôïng protein thoâ trong khoâ laïc chuû yeáu phuï thuoäc vaøo gioáng laïc vaø tæ leä voû laãn trong baõ. Khoâ laïc neáu bò laãn voû coù haøm löôïng protein thoâ khoaûng 27.7% vaø haøm löôïng naøy trong khoâ laïc nhaân laø khoaûng 45.5% [2]. Khoâ laïc ñöôïc söû duïng trong luaän vaên naøy coøn laãn voû neân coù haøm löôïng cellulose lôùn (23.76%) vaø haøm löôïng protein khoâng cao. Nhö vaäy, so vôùi haït ñaäu naønh vaø khoâ ñaäu naønh thì khoâ laïc laø nguoàn nguyeân lieäu coù theå thu nhaän töø caùc nhaø maùy eùp daàu trong nöôùc hay nhaäp khaåu töø nöôùc ngoaøi vôùi giaù reû. Hôn nöõa, ñaây cuõng laø moät nguoàn nguyeân lieäu coù giaù trò dinh döôõng cao, caàn phaûi ñöôïc taän duïng khai thaùc. Haàu heát, caùc cô sôû, nhaø maùy trong nöôùc hieän nay ñeàu ñang söû duïng khoâ laïc ñeå saûn xuaát nöôùc töông vôùi quy moâ lôùn. Vì vaäy, chuùng toâi choïn khoâ laïc laøm nguyeân lieäu chính ñeå saûn xuaát nöôùc töông leân men. Khaûo saùt thaønh phaàn boät mì BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 3: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa boät mì töø coâng ty Bình Ñoâng Thaønh phaànHaøm löôïng (% toång khoái löôïng)Ñoä aåm14Protein thoâ8Tinh boät70Lipid thoâ1.2Xô thoâ2.5Tro1.4Boät mì coù chöùa protein thoâ vôùi moät löôïng nhoû, chuû yeáu laø tinh boät vôùi haøm löôïng cao. Ñaây seõ laø nguoàn cung caáp C chuû yeáu (tinh boät) cho söï phaùt trieån cuûa naám moác trong quaù trình nuoâi caáy. Ngoaøi ra, boät mì coøn tham gia vaøo vieäc hình thaønh maøu saéc cho nöôùc töông thaønh phaåm. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá tôùi quaù trình nuoâi moác Muïc ñích cuûa quaù trình nuoâi moác laø taïo ñieàu kieän thích hôïp cho naám moác sinh ra enzym coù hoaït tính cao, quan troïng nhaát laø protease. Vì vaäy, quaù trình nuoâi moác laø moät quaù trình ñoùng vai troø quan troïng, caàn phaûi ñöôïc nghieân cöùu ñeå löïa choïn caùc thoâng soá coâng ngheä thích hôïp. Nhieäm vuï cuûa luaän vaên trong giai ñoaïn naøy laø khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá tôùi quaù trình nuoâi moác ñeå tìm ra ñieàu kieän phuø hôïp cho naám moác sinh protease hoaït tính cao treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì. Hoaït tính protease caøng cao thì khaû naêng thuûy phaân nguyeân lieäu taïo N amin töï do caøng cao. Ñaây laø thaønh phaàn deã tieâu hoùa, deã haáp thu coù trong nöôùc töông. Haøm löôïng N amin töï do trong nöôùc töông caøng cao thì dinh döôõng cuûa nöôùc töông thaønh phaåm seõ caøng cao. Aûnh höôûng cuûa thaønh phaàn moâi tröôøng tôùi hoaït tính protease. Löïa choïn tæ leä khoâ laïc vaø boät mì seõ aûnh höôûng tôùi haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy (nguoàn C, nguoàn N, chaát caûm öùng, chaát khoaùng). Do vaäy, tæ leä nguyeân lieäu coù aûnh höôûng tôùi hoaït tính cuûa protease ñöôïc taïo ra bôûi naám moác. Theo caùc taøi lieäu veà saûn xuaát nöôùc töông ôû nöôùc ngoaøi, ngöôøi ta thöôøng söû duïng tæ leä phoái troän khoâ ñaäu naønh:boät mì dao ñoäng trong khoaûng (50-90%) : (10-50%) [17]. Do ñi töø nguoàn nguyeân lieäu laø khoâ laïc vaø boät mì neân chuùng toâi caàn khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa tæ leä nguyeân lieäu tôùi hoaït tính protease. Caùc thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Tæ leä moác caáy: 3% v/w Ñoä aåm cuûa maãu: 50% Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = (50:50), (70:30), (90:10), (100:0) (w/w). Caùch tieán haønh: Troän nguyeân lieäu khoâ laïc vaø boät mì theo caùc tæ leä treân, boå sung aåm cho hoãn hôïp moâi tröôøng nuoâi caáy (coâng thöùc xem phaàn phuï luïc). Moâi tröôøng sau khi haáp tieät truøng 121oC, 1atm, 20 phuùt seõ ñöôïc laøm nguoäi, kieåm tra vaø hieäu chænh tôùi ñoä aåm 50%, sau ñoù, tieán haønh gieo caáy naám moác. Duøng pipet voâ khuaån laáy 10ml nöôùc voâ khuaån cho vaøo oáng nghieäm chöùa gioáng. Duøng que caáy ñaùnh nheï cho caùc baøo töû naám phaân taùn trong nöôùc. Sau ñoù huùt 3ml huyeàn phuø baøo töû vaø phaân phoái ñeàu treân khay nuoâi. Troän ñeàu moâi tröôøng vôùi gioáng naám moác. Naám moác ñöôïc nuoâi caáy treân khay nuoâi, ôû nhieät ñoä phoøng. Trong suoát thôøi gian nuoâi caáy, beà maët khay nuoâi ñöôïc che phuû baèng khaên vaûi ñaõ ñöôïc thaám öôùt ñeå haïn cheá söï maát aåm cuûa moâi tröôøng vaø söï nhieãm vi sinh vaät khaùc töø moâi tröôøng beân ngoaøi. Sau khi keát thuùc thôøi gian nuoâi moác, ta thu laáy canh tröôøng, ñem xaùc ñònh aåm vaø ño hoaït tính protease. BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 4: Aûnh höôûng cuûa tæ leä khoái löôïng khoâ laïc:boät mì ñeán hoaït tính protease trong canh tröôøng beà maët Asp. oryzae Tæ leä khoâ laïc:boät mì (w/w)Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)50:501.11a70:302.00b90:102.72c100:02.35dChuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 1: Quan heä giöõa tæ leä nguyeân lieäu vaø hoaït tính protease Ta nhaän thaáy, khi haøm löôïng khoâ laïc trong hoãn hôïp nguyeân lieäu taêng thì hoaït tính protease taêng. Töùc laø khi taêng haøm löôïng cô chaát caûm öùng (protein) thì naám moác Asp. oryzae seõ sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao hôn. Coù theå giaûi thích quy luaät naøy döïa vaøo sô ñoà sau cuûa Monod vaø Jacob: Gen ñieàu khieån Gen toång hôïp 1. 2. 3. 4. Enzym E2 Chaát kìm haõm (I) Cô chaát Saûn phaåm (S) (P) Bình thöôøng, khi khoâng coù cô chaát caûm öùng, chaát kìm haõm coù trong teá baøo seõ töông taùc vôùi gen ñieàu khieån, toaøn boä quaù trình sinh toång hôïp enzym bò phong toûa vaø khoâng hoaït ñoäng. Khi ta cho cô chaát caûm öùng vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, cô chaát seõ töông taùc vôùi chaát kìm haõm, gen ñieàu khieån thoaùt ra khoûi söï phong toûa cuûa chaát kìm haõm, khi ñoù, quaù trình sinh toång hôïp protease seõ xaûy ra. Nhö vaäy, löôïng cô chaát caûm öùng trong moâi tröôøng caøng nhieàu thì seõ kích thích toång hôïp ra nhieàu enzym caûm öùng. Keát quaû thí nghieäm ñaït ñöôïc laø phuø hôïp vôùi lyù thuyeát ñieàu khieån sinh toång hôïp enzym caûm öùng maø Monod vaø Jacob ñaõ ñöa ra. Tuy nhieân, taùc ñoäng caûm öùng ñaït hieäu quaû cao chæ ôû moät lieàu löôïng nhaát ñònh naøo ñoù cuûa cô chaát caûm öùng. Khi naøo haøm löôïng cô chaát caûm öùng quaù cao, khaû naêng sinh toång hôïp enzym caûm öùng seõ giaûm [6]. Töø keát quaû thí nghieäm, ta nhaän thaáy: hoaït tính protease taêng daàn khi haøm löôïng khoâ laïc trong nguyeân lieäu taêng, nhöng noù khoâng taêng maõi maõi. Hoaït tính protease ñaït cöïc ñaïi khi nuoâi caáy naám moác trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn 90% (khoâ laïc):10% (boät mì). Vaø sau ñoù, khi taêng haøm löôïng khoâ laïc leân thì hoaït tính protease laïi giaûm do hieän töôïng öùc cheá dò hoùa. Töùc laø, khi haøm löôïng protein trong moâi tröôøng taêng cao thì sau moät thôøi gian nuoâi caáy, löôïng acid amin töï do ñöôïc tích luõy trong canh tröôøng seõ taêng leân. Chuùng seõ ñoùng vai troø kìm haõm quaù trình sinh toång hôïp protease cuûa naám moác. Do vaäy, khoâng phaûi caøng cho nhieàu cô chaát thì khaû naêng sinh toång hôïp enzym caøng cao. So saùnh vôùi tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu trong saûn xuaát nöôùc töông ôû moät soá nöôùc: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu khoâ ñaäu naønh vaø boät mì cuûa caùc loaïi nöôùc töông ôû caùc quoác gia khaùc nhau raát ña daïng vaø taïo neân neùt ñaëc tröng rieâng cho saûn phaåm nöôùc töông cuûa töøng nöôùc. Si yau (Trung Quoác): Khoâ ñaäu naønh vaø boät mì ñöôïc troän vôùi tæ leä 6:4 Kecap asin (Indonesia): Khoâ ñaäu naønh vaø boät mì ñöôïc troän vôùi tæ leä 1:2. Toyo (Philipine): Haøm löôïng khoâ ñaäu naønh khoaûng 66-90%, boät mì khoaûng 10-34%. Nhaät Baûn: Tæ leä phoái troän giöõa khoâ ñaäu naønh vaø boät mì cuûa caùc loaïi nöôùc töông khaùc nhau cuõng khaùc nhau ( REF _Ref186687170 \h BAÛNG 4.5). BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 5: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong saûn xuaát nöôùc töông ôû Nhaät Baûn Loaïi nöôùc töôngKoikuchi-shoyuUsukuchi-shoyuTamari-shoyuSaishikomi-shoyuShiro-shoyuTæ leä khoâ ñaäu naønh:boät mì1:11:1Khoâng duøng boät mì10:11:5Ñoái vôùi nguyeân lieäu laø khoâ laïc ñaõ khaûo saùt ôû treân, do haøm löôïng protein thoâ khoâng cao nhö trong haït ñaäu naønh hay khoâ ñaäu naønh neân, neáu söû duïng tæ leä khoâ laïc thaáp coù theå seõ khoâng coù ñuû nguoàn N thích hôïp cho naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao. Vieäc söû duïng boät mì vôùi tæ leä 10% chuû yeáu cung caáp nguoàn C (tinh boät) cho moác sinh tröôûng vaø phaùt trieån. Thaønh coâng hay thaát baïi trong saûn xuaát enzym caûm öùng phuï thuoäc raát nhieàu vaøo vieäc xaùc ñònh cô chaát caûm öùng vaø lieàu löôïng caàn thieát cuûa chaát caûm öùng ñöa vaøo moâi tröôøng. Vôùi thaønh phaàn moâi tröôøng thích hôïp laø 90% (khoâlaïc):10% (boät mì), chuùng toâi tieáp tuïc tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá khaùc tôùi hoaït tính protease. Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng tôùi hoaït tính protease Quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñeàu coù lieân quan ñeán nöôùc. Do ñoù, ñoä aåm laø moät yeáu toá coâng ngheä quan troïng trong quaù trình nuoâi caáy naám moác ñeå thu nhaän enzym. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy tôùi hoaït tính protease sinh ra bôûi Asp. oryzae vôùi caùc ñieàu kieän thí nghieäm nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = 90:10 (w/w). Tæ leä moác caáy: 3% v/w Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy thay ñoåi laàn löôït laø 45%, 50%, 55%, 60% BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 6: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 1) Ñoä aåm moâi tröôøngHoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)45%2.59a50%2.74b55%3.53c60%4.08dChuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 2: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 1) Nhö vaäy, hoaït tính protease cao nhaát khi nuoâi moác treân moâi tröôøng coù ñoä aåm 60%. Chuùng toâi tieáp tuïc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm vôùi caùc giaù trò ñoä aåm cheânh leäch gaàn 60% hôn. Caùc giaù trò ñoä aåm ñöôïc thay ñoåi nhö sau: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%. BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 7: Aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) Ñoä aåm moâi tröôøngHoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)50%2.73a55%3.53b60%4.11c65%3.88d70%3.36eChuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 3: Quan heä giöõa ñoä aåm moâi tröôøng vaø hoaït tính protease (laàn 2) Nhö vaäy, hoaït tính protease thu ñöôïc seõ taêng daàn khi ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng töø 45% ñeán 60%. Taïi moâi tröôøng coù ñoä aåm 60%, hoaït tính protease thu ñöôïc laø cao nhaát. Neáu ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy taêng hôn 60% thì hoaït tính protease seõ giaûm xuoáng. Coù theå giaûi thích keát quaû thí nghieäm nhö sau: Ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy laø yeáu toá aûnh höôûng tôùi hoaït ñoä nöôùc trong moâi tröôøng. Moãi loaøi vi sinh vaät muoán sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát thì caàn phaûi coù moät giaù trò hoaït ñoä nöôùc thích hôïp. Nöôùc chính laø moâi tröôøng vaän chuyeån caùc chaát dinh döôõng ra vaøo teá baøo, moâi tröôøng cho hoaït ñoäng trao ñoåi chaát vaø tham gia vaøo caùc phaûn öùng thuûy phaân trong teá baøo vi sinh vaät. Trong moâi tröôøng thieáu nöôùc, quaù trình trao ñoåi chaát seõ bò yeáu ñi vaø teá baøo bò öùc cheá hoaëc bò cheát. Vì vaäy, neáu moâi tröôøng nuoâi caáy coù ñoä aåm thaáp thì naám moác seõ sinh tröôûng vaø phaùt trieån yeáu, laøm giaûm hoaït tính protease sinh ra. Ngöôïc laïi neáu moâi tröôøng aåm cao, moâi tröôøng voùn cuïc, möùc ñoä thoâng thoaùng khí yeáu, söï trao ñoåi oxy gaëp khoù khaên neân hoaït tính protease thu ñöôïc seõ thaáp. So saùnh keát quaû thí nghieäm vôùi caùc nghieân cöùu tröôùc ñaây, chuùng toâi coù moät soá nhaän xeùt nhö sau: Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà ñieàu kieän sinh tröôûng cuûa naám moác Asp. oryzae baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng caùm thì ñoä aåm thích hôïp cho söï hình thaønh baøo töû ñeå laøm gioáng cuûa Asp. oryzae laø 45-50% vaø ñeå hình thaønh enzym thì ñoä aåm toái öu laø 58-60%. Khi naám moác ñöôïc nuoâi caáy trong ñieàu kieän tieät truøng nghieâm ngaët thì hoaït ñoä cuûa enzym seõ toát nhaát khi haøm aåm cao hôn 65-68% [1, 2, 6, 10]. Nhö vaäy, keát quaû thí nghieäm treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì maø chuùng toâi khaûo saùt töông töï vôùi keát quaû nghieân cöùu treân moâi tröôøng caùm. ÔÛ Nhaät Baûn, ngöôøi ta söû duïng haït ñaäu naønh hoaëc khoâ ñaäu naønh troän vôùi boät mì theo tæ leä 50:50 vaø sau ñoù boå sung theâm nöôùc tôùi ñoä aåm 60%, haáp tieät truøng vaø ñem nuoâi caáy naám moác [13]. Taïi Thaùi Lan, nöôùc töông leân men ñöôïc saûn xuaát ñi töø ñaäu naønh vaø boät mì vôùi tæ leä 7:1, ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy ban ñaàu ñöôïc hieäu chænh veà 55% [15]. Qua moät vaøi so saùnh treân, chuùng toâi nhaän thaáy, ñoä aåm thích hôïp cho naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao trong saûn xuaát nöôùc töông haàu nhö khoâng phuï thuoäc nhieàu vaøo ñaëc tính cuûa nguyeân lieäu vaø tæ leä phoái troän nguyeân lieäu trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Nhö vaäy, vieäc choïn ñoä aåm moâi tröôøng 60% ñeå nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì nhaèm sinh protease coù hoaït tính cao nhaát laø phuø hôïp. Aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy tôùi hoaït tính protease Tæ leä moác caáy ñöôïc söû duïng trong quaù trình nuoâi moác seõ aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác vaø do ñoù aûnh höôûng tôùi hoaït tính protease sinh toång hôïp ra. Ñeå khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy tôùi hoaït tính protease, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm vôùi caùc thoâng soá nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Tæ leä thaønh phaàn nguyeân lieäu (khoâ laïc : boät mì) = 90:10 (w/w). Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy: 60% Thôøi gian nuoâi moác: 42 giôø Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Tæ leä moác caáy: 1, 3, 5, 7, 9 % (v/w moâi tröôøng nuoâi caáy). Huyeàn phuø baøo töû coù chöùa 0.005 g baøo töû/ml. Nhö vaäy, caùc tæ leä treân töông öùng vôùi: 0.005; 0.015; 0.025; 0.035; 0.045 % (khoái löôïng baøo töû /khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). Sau 42 giôø nuoâi caáy, ta thu canh tröôøng vaø ño hoaït tính protease sinh ra bôûi naám moác. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 8: Aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae Tæ leä moác caáy % (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy)Hoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)0.0052.63a0.0153.82b0.0253.83b0.0354.16c0.0453.42dChuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 4: Quan heä giöõa tæ leä moác caáy vaø hoaït tính protease. Döïa vaøo ñoà thò, quy luaät chung ñöôïc deã daøng nhaän thaáy laø: khi tæ leä moác caáy taêng trong moät giôùi haïn nhaát ñònh thì hoaït tính protease taêng theo. Ñieàu ñoù coù nghóa laø khi maät ñoä baøo töû naám moác treân 1g moâi tröôøng nuoâi caáy taêng, protease ñöôïc sinh ra seõ coù hoaït tính cao. Cuï theå: hoaït tính protease taêng daàn töø tæ leä moác caáy 0.005% tôùi 0.035%, vaø ñaït giaù trò cöïc ñaïi khi tæ leä moác caáy laø 0.035%. Khi taêng tæ leä moác caáy leân 0.045% thì giaù trò hoaït tính protease ño ñöôïc laïi thaáp hôn so vôùi hoaït tính protease ôû tæ leä moác caáy 0.035%. Keát quaû thöïc nghieäm naøy ñöôïc giaûi thích nhö sau: Löôïng gioáng caáy coù aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác. Neáu löôïng gioáng caáy ban ñaàu quaù thaáp, naám moác seõ sinh tröôûng vaø phaùt trieån chaäm. Do vaäy, protease ñöôïc naám moác sinh toång hôïp ra vôùi soá löôïng vaø hoaït tính yeáu. Khi tæ leä moác caáy taêng thì toác ñoä sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa naám moác cuõng taêng daàn. Khi ñoù, naám moác sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao ñeå phaân huûy caùc hôïp chaát cao phaân töû trong moâi tröôøng, phuïc vuï cho quaù trình sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát. Tuy nhieân, vieäc taêng tæ leä moác caáy leân quaù cao laïi khoâng laøm taêng hoaït tính protease thu ñöôïc maø coøn laøm taêng chi phí cho quaù trình nhaân gioáng cho saûn xuaát. Nhö vaäy, tæ leä moác caáy thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì, nhaèm sinh toång hôïp protease coù hoaït tính cao nhaát laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). So saùnh vôùi moät soá tæ leä moác caáy ñaõ ñöôïc aùp duïng trong saûn xuaát nöôùc töông leân men: Williams (1980) ñeà nghò tæ leä moác caáy Asp. oryzae hoaëc Asp. sojae thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng 50% haït ñaäu naønh vaø 50% boät mì trong khoaûng töø 0.001% ñeán 10% so vôùi khoái löôïng cuûa moâi tröôøng [17]. Cuøng moät ñieàu kieän nuoâi caáy nhö treân, Bajracharya vaø coäng söï (1992) laïi ñöa ra tæ leä moác caáy thích hôïp ñöôïc thu heïp laïi trong khoaûng 0.01% - 0.02%. Tæ leä moác caáy lôùn hay nhoû phuï thuoäc vaøo hoaït löïc sinh protease cuûa chuûng naám moác Asp. oryzae ñöôïc söû duïng, thaønh phaàn dinh döôõng trong moâi tröôøng nuoâi caáy [12]. Töø thí nghieäm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa tæ leä moác caáy treân moâi tröôøng hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì, chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû tæ leä moác caáy thích hôïp laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi caáy). Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi moác tôùi hoaït tính protease Sau khi ñaõ tieán haønh khaûo saùt caùc yeáu toá veà tæ leä phoái troän nguyeân lieäu, ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy, tæ leä moác caáy thích hôïp cho quaù trình nuoâi moác sinh toång hôïp protease, chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt vaø choïn thôøi gian thích hôïp ñeå protease sinh toång hôïp bôûi Asp. oryzae coù hoaït tính cao nhaát. Ñieàu kieän thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän nhö sau: Caùc yeáu toá coá ñònh trong quaù trình nuoâi naám moác: Thaønh phaàn moâi tröôøng (khoâ laïc : boät mì) laø 90:10 (w/w). Ñoä aåm moâi tröôøng nuoâi caáy: 60% Tæ leä moác caáy: 0.035% (w baøo töû /w moâi tröôøng) Nhieät ñoä nuoâi moác: nhieät ñoä phoøng Yeáu toá thay ñoåi: Thôøi gian nuoâi caáy thay ñoåi laàn löôït laø: 24h, 36h, 42h, 48h, 60h, 72h. Keát quaû ño hoaït tính protease thu ñöôïc nhö sau: BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 9: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease (laàn 1) Thôøi gian nuoâi caáyHoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)0 giôø0.0024 giôø1.96a 36 giôø3.68b 42 giôø4.25c 48 giôø5.30d 60 giôø3.56b 72 giôø2.99e Chuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 5: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 1) Nhaän thaáy, hoaït tính protease ñaït cöïc ñaïi sau 48 giôø nuoâi caáy. Chuùng toâi tieáp tuïc thí nghieäm nuoâi caáy naám moác vôùi caùc khoaûng thôøi gian nuoâi caáy dao ñoäng xung quanh giaù trò 48 giôø. Keát quaû ño hoaït tính protease nhö sau: BAÛNG  STYLEREF 1 \s 4. SEQ BAÛNG \* ARABIC \s 1 10: Aûnh höôûng cuûa thôøi gian nuoâi caáy ñeán hoaït tính protease töø Asp. oryzae (laàn 2) Thôøi gian nuoâi caáyHoaït tính protease tb (Ñvhñ/g ctk)0 giôø0.0024 giôø2.29a42 giôø3.57d43 giôø4.21e44 giôø4.50f45 giôø4.13e46 giôø3.82de47 giôø3.15c48 giôø3.10c49 giôø2.97bc50 giôø2.67ab51 giôø2.67ab52 giôø2.65ab53 giôø2.65ab54 giôø2.48a60 giôø2.37aChuù thích: “a, b, c, d…”: kí töï gioáng nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät khoâng coù yù nghóa, kí töï khaùc nhau thì caùc giaù trò khaùc bieät coù yù nghóa vôùi P<0,05 HÌNH  STYLEREF 1 \s 4. SEQ HÌNH \* ARABIC \s 1 6: Quan heä giöõa thôøi gian nuoâi caáy vaø hoaït tính protease (laàn 2)  REF _Ref187321451 \h HÌNH 4.6 cho ta thaáy söï thay ñoåi hoaït tính cuûa enzym tuaân theo quy luaät nhö sau: trong khoaûng thôøi gian ñaàu, hoaït ñoä protease taêng daàn, ñeán moät thôøi ñieåm, hoaït ñoä protease ñaït cöïc ñaïi vaø sau ñoù giaûm daàn. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích nhö sau: Ban ñaàu, naám moác söû duïng caùc chaát coù phaân töû löôïng thaáp trong moâi tröôøng ñeå phaùt trieån. Do ñoù, hoaït löïc protease chæ toàn taïi ôû daïng veát trong canh tröôøng nuoâi caáy. Do haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng coù phaân töû löôïng thaáp trong moâi tröôøng khoâng nhieàu neân giai ñoaïn tieáp theo, naám moác baét buoäc sinh toång hôïp nhoùm enzym phaân giaûi caùc chaát dinh döôõng coù phaân töû löôïng cao thaønh nhöõng phaân töû löôïng thaáp, deã haáp thu qua maøng teá baøo, trong ñoù coù enzym protease. Hoaït tính protease do naám moác taïo ra baét ñaàu taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi. Neáu tieáp tuïc keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng giaûm daàn, quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám moác vaø moâi tröôøng giaûm do teá baøo ñaõ ñeán giai ñoaïn giaø. Maët khaùc, caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát trong moâi tröôøng quaù nhieàu baét ñaàu öùc cheá quaù trình trao ñoåi chaát cuûa teá baøo neân quaù trình sinh toång hôïp enzym protease seõ giaûm daàn. Ngoaøi ra, do laø enzym thuûy phaân neân caùc phaân töû protease coù theå thuûy phaân laãn nhau, laøm giaûm hoaït tính protease. Nhö vaäy, vieäc sinh toång hôïp enzym caûm öùng protease lieân quan khaù maät thieát vôùi vieäc phaân giaûi cô chaát dinh döôõng vaø sinh tröôûng vaø trao ñoåi chaát cuûa naám moác. Nhöõng thay ñoåi quan saùt ñöôïc trong quaù trình nuoâi caáy naám moác dieãn ra nhö sau: Trong khoaûng 6-10 giôø ñaàu tieân, ñaây laø giai ñoaïn naám moác thích nghi vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy neân chöa tieán haønh sinh saûn. Enzym baét ñaàu ñöôïc toång hôïp ôû giai ñoaïn naøy nhöng khoâng ñaùng keå. Trong khoaûng 14-36 giôø tieáp theo, khuaån ti xuaát hieän roõ reät, luùc naøy nguyeân lieäu hôi keát baùnh. Heä sôïi naám baét ñaàu phaùt trieån nhanh, maøu traéng ngaø, nhieät ñoä moâi tröôøng taêng leân khoaûng 30-32oC. Töø 36-48 giôø, naám moác baét ñaàu sinh baøo töû, heä sôïi chuyeån daàn töø maøu traéng sang maøu vaøng nhaït. Luùc naøy laø giai ñoaïn enzym protease ñöôïc hình thaønh chuû yeáu vaø hoaït tính cao nhaát. Sau 48 giôø, heä sôïi chuyeån daàn töø maøu vaøng sang maøu vaøng luïc. Nguoàn cô chaát trong moâi tröôøng coøn ít, quaù trình trao ñoåi chaát dieãn ra yeáu daàn vaø coù theå keát thuùc giai ñoaïn nuoâi moác ñeå chuyeån sang giai ñoaïn thuûy phaân. Quan saùt ñoà thò, ta nhaän thaáy, taïi thôøi ñieåm 44 giôø sau khi nuoâi caáy, ta thu ñöôïc giaù trò hoaït tính protease laø cao nhaát vaø giaù trò hoaït tính laø khaùc nhau coù yù nghóa so vôùi caùc giaù trò taïi caùc thôøi ñieåm nuoâi caáy khaùc. Nhö vaäy, 44 giôø laø thôøi gian thích hôïp ñeå nuoâi caáy naám moác sinh protease coù hoaït tính cao nhaát vôùi caùc ñieàu kieän thí nghieäm neâu treân. Theo caùc taøi lieäu nghieân cöùu veà thôøi gian sinh tröôûng cuûa Asp.oryzae thì thôøi gian nuoâi moác ñeå laøm gioáng laø 60-70 giôø vì luùc naøy baøo töû môùi hình thaønh ñaày ñuû, coøn ñeå hình thaønh protease cöïc ñaïi laø trong khoaûng 36-42giôø. Tuøy thuoäc vaøo hoaït löïc cuûa chuûng naám moác ñem nuoâi caáy maø thôøi gian coù theå daøi hay ngaén hôn [2]. Keát quaû khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy moác thích hôïp cuûa chuùng toâi laø 44 giôø, töông töï nhö keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu tröôùc ñaây. Trong thöïc teá saûn xuaát nöôùc töông leân men ôû moät soá quoác gia treân theá giôùi, thôøi gian nuoâi moác ñöôïc aùp duïng nhö sau: Nhaät Baûn: Ñoái vôùi moâi tröôøng nuoâi caáy chöùa (50-90%) haït ñaäu naønh hoaëc khoâ ñaäu naønh vaø(10-50%) boät mì thì quaù trình nuoâi moác ñöôïc thöïc hieän trong khoaûng 30 ñeán 50 giôø, nhieät ñoä nuoâi caáy laø 20-40oC. Thoâng thöôøng, hoï choïn 44 giôø laøm thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp (Bajracharya vaø coäng söï) [12]. Thaùi Lan: Söû duïng baøo töû Asp.oryzae ñeå nuoâi caáy treân moâi tröôøng haït ñaäu naønh vaø boät mì theo tæ leä 7:1. Thôøi gian nuoâi caáy keùo daøi 40-48 giôø, taïi nhieät ñoä phoøng [15]. Indonesia: Thôøi gian nuoâi caáy moác treân moâi tröôøng 100% ñaäu naønh keùo daøi 3 ngaøy (72 giôø), ôû nhieät ñoä phoøng [16]. Neáu keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy, naám moác seõ chuû yeáu hình thaønh baøo töû vaø löôïng enzym protease ñöôïc sinh toång hôïp ra vôùi hoaït tính thaáp. Hôn nöõa, thôøi gian nuoâi caáy quaù daøi seõ aûnh höôûng tôùi naêng suaát thieát bò vaø lôïi nhuaän kinh teá cuûa nhaø saûn xuaát. Nhö vaäy, choïn thôøi ñieåm keát thuùc thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy naám moác laø raát quan troïng. CHÖÔNG 5- KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ Keát luaän Qua quaù trình nghieân cöùu, vôùi nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc, chuùng toâi coù theå keát luaän nhö sau: Ñeå naám moác Aspergillus ozyae sinh toång hôïp enzym protease coù hoaït tính cao nhaát treân moâi tröôøng nuoâi caáy laø hoãn hôïp khoâ laïc vaø boät mì thì caùc thoâng soá thích hôïp cuûa quaù trình nuoâi moác laø: Tæ leä phoái troän nguyeân lieäu khoâ laïc vaø boät mì laø 90:10 Ñoä aåm moâi tröôøng laø 60% Tæ leä moác caáy laø 0.035% (khoái löôïng baøo töû khoâ/khoái löôïng moâi tröôøng nuoâi tröôøng) Thôøi gian nuoâi moác laø 44 giôø Khi ñoù, hoaït tính protease thu ñöôïc laø 4.50 (ñvhñ/g ctk) Ñieàu kieän thích hôïp thuûy phaân protein töø canh tröôøng khoâ laïc vaø boät mì ñeå haøm löôïng N amin töï do ñaït cao nhaát nhö sau: Tæ leä canh tröôøng : dung moâi (nöôùc muoái) trong quaù trình thuûy phaân laø 1:2 Noàng ñoä muoái trong dung dòch nöôùc muoái:10% (w/v) Nhieät ñoä thuûy phaân: 500C pH: 6.5 Thôøi gian thuûy phaân: 60 giôø Khi ñoù, löôïng N toång vaø N amin trong dòch thuûy phaân laø 10.34 (g/l) vaø 8.67 (g/l). Vieäc boå sung cheá phaåm protease trong quaù trình thuûy phaân cho keát quaû nhö sau: Khi boå sung cheá phaåm protease ôû thôøi ñieåm ñaàu cuûa quaù trình thuûy phaân thì: Ñoái vôùi cheá phaåm Neutrase: Tæ leä boå sung thích hôïp laø 0.5% (khoái löôïng dòch enzym/khoái löôïng canh tröôøng). Thôøi gian thuûy phaân laø 36 giôø. Haøm löôïng N toång vaø N amin thu ñöôïc trong dòch thuûy phaân laø 11.34 (g/l) vaø 8.37 (g/l) Ñoái vôùi cheá phaåm Flavourzymes: Tæ leä boå sung thích hôïp laø 0.5% (khoái löôïng dòch enzym/khoái löôïng canh tröôøng). Thôøi gian thuûy phaân laø 48 giôø. Haøm löôïng N toång vaø N amin thu ñöôïc trong dòch thuûy phaân laø 14.41 (g/l) vaø 8.93 (g/l) Kieán nghò Sau khi ñaõ coù ñöôïc nhöõng keát quaû treân, chuùng toâi coù moät soá kieán nghò nhö sau: Ñeå naâng cao hôn nöõa haøm löôïng acid amin trong nöôùc töông thaønh phaåm, taêng hieäu suaát thuûy phaân protein cuûa nguyeân lieäu, chuùng toâi ñeà nghò caùc höôùng nghieân cöùu tieáp theo nhö sau: Khaûo saùt choïn cheá ñoä boå sung nöôùc muoái nhieàu laàn trong quaù trình thuûy phaân. Khaûo saùt choïn cheá ñoä boå sung cheá phaåm enzym nhieàu laàn trong quaù trình thuûy phaân. Khaûo saùt vieäc boå sung keát hôïp nhieàu loaïi cheá phaåm enzym. Nghieân cöùu hoaøn thieän nöôùc töông thaønh phaåm veà muøi vò, maøu saéc theo höôùng: Ñieàu höông – ñieàu vò cho nöôùc töông baèng caùch söû duïng vi sinh vaät hoaëc baèng caùch boå sung caùc hôïp chaát taïo höông, vò ñaõ ñöôïc toång hôïp saün. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO - PAGE 75 - Taøi lieäu tham khaûo  SEQ sach \* ARABIC 1. Nguyeãn Troïng Caån, Coâng ngheä enzym, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1998.  SEQ sach \* ARABIC 2. Ngaïc Vaên Daäu, Cheá bieán ñaäu naønh vaø laïc thaønh thöùc aên giaøu protein, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1983. 3. Nguyeãn Laân Duõng (chuû bieân), Vi sinh vaät hoïc, Nhaø xuaát baûn giaùo duïc, 2003. 4. Leâ Song Döï, Giaùo trình caây laïc, Boä Noâng nghieäp – Vuï ñaøo taïo, Nhaø xuaát baûn Noâng nghieäp, 1979. 5. Traàn Bích Lam, Toân Nöõ Minh Nguyeät, Ñinh Traàn Nhaät Thu, Thí nghieäm hoùa sinh thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 6. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (chuû bieân), Coâng nghieäp enzym, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 7. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng ngheä vi sinh taäp 2, Vi sinh vaät hoïc coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh , 2002. 8. Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Thöïc phaåm leân men truyeàn thoáng, Nhaø xuaát baûn Ñaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004. 9. Leâ Vaên Thaïch, Kyõ thuaät eùp daàu vaø cheá bieán daàu môõ thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc & Kyõ thuaät, 1993. 10. Leâ Ngoïc Tuù(chuû yeáu), Hoùa sinh coâng nghieäp, Nhaø xuaát baûn Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät. Haø Noäi, 2002. 11. Dieäp Thanh Xuaân, Nghieân cöùu leân men baõ ñaäu naønh ñeå saûn xuaát nöôùc chaám, Luaän vaên toát nghieäp Ñaïi hoïc ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm, Tp. Hoà Chí Minh, 2007. 12. Bajracharya et al, Process for producing soya sauce, United States Patent, 1992. 13. Danji Fukushima, Industrialization of fermented soy sauce production centering around Japanese shoyu, Noda Institude for scientific research, Noda-shi, Japan. 14. Tzou-Chi Huang & Der-Feng Teng, Soy sauce: Manufacturing & Biochemical changes, National Pingtung University of science & technology, Pingtung, Taiwan. 15. Thawatchai Mongkolwai, “Technology transfer for small and medium soy sauce fermentation factories in Thailan: a consortium approach”, Food research international, vol.30, No.8, pp.555-563, 1997. 16. Wilfred F.M Roling, Physical factors influencing Microbial interactions and biochemical changes during the Baceman stage of Indonesian Kecap (Soy sauce) production, Journal of fermentation and bioengineering, vol.77, No.3, pp 293-300, 1994. 17. Williams, Koji process for producing soy sauce, United States Patent, 1980. 18. http// : www.wikipedia.com PHUÏ LUÏC Phuï luïc Ñöôøng chuaån tyrosine trong xaùc ñònh hoaït tính protease Baûng 1: Keát quaû ño ñoä haáp thu cuûa dung dòch tyrosine chuaån Noàng ñoä tyrosine (mol/ml)00.050.10.150.20.250.3Ñoïâ haáp thu00.1290.2620.3610.4860.6020.724 Phöông trình ñöôøng chuaån: y = 0.4122x Trong ñoù: x – Ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 750nm y – Noàng ñoä tyrosine trong dung dòch ñem so maøu (mol/ml) coâng thöùc tính löôïng aåm boå sung theâm Trong ñoù: X- Löôïng nöôùc caàn boå sung theâm a – Ñoä aåm cuûa hoãn hôïp nguyeân lieäu ban ñaàu b – Troïng löôïng nguyeân lieäu cho moät laàn nuoâi caáy c – Troïng löôïng chaát khoâ caàn ñaït ñöôïc sau khi chænh aåm Ñònh löôïng N toång Hoùa chaát: H2SO4 thoâ H2SO4 0,1N NaOH 0,1N NaOH 40% HclO4 tinh khieát Phenolphthalein 1% Caùch tieán haønh: Tröôùc tieân maãu ñöôïc voâ cô hoùa baèng H2SO4 ñaäm ñaëc ôû nhieät ñoä cao vaø coù chaát xuùc taùc. Caùc phaûn öùng cuûa quaù trình oxy hoùa xaûy ra nhö sau: Oxy taïo thaønh laïi oxy hoùa caùc nguyeân toá khaùc: Carbon taïo thaønh CO2, hydro taïo thaønh H2O, coøn nitô giaûi phoùng ra döôùi daïng NH3 keát hôïp vôùi H2SO4 dö taïo thaønh (NH4)2SO4 tan trong dung dòch. Ñuoåi NH3 ra khoûi dung dòch baèng NaOH Caát vaø thu NH3 baèng moät löôïng dö H2SO4 0,1N. Ñònh phaân löôïng H2SO4 coøn laïi baèng dung dòch NaOH 0,1N chuaån. Qua ñoù tính ñöôïc löôïng Nitô coù trong maãu nguyeân lieäu thí nghieäm. Voâ cô hoùa maãu: tieán haønh trong tuû hotte: huùt moät theå tích maãu nhaát ñònh cho vaøo bình Kjeldahl. Theâm töø töø 10ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Ñeå taêng nhanh quaù trình voâ cô hoùa caàn phaûi cho theâm chaát xuùc taùc, coù theå duøng HClO4 giaûi phoùng O2 cho phaûn öùng oxy hoùa. Caát ñaïm: tieán haønh trong maùy caát ñaïm töï ñoäng Gerhardt. Maãu sau khi caát ñaïm ñöôïc ñem ñi ñònh phaân baèng dung dòch NaOH 0,1N. Coâng thöùc tính toaùn: Trong ñoù: x: haøm löôïng nitô toång (g/l). a: soá ml H2SO4 0,1N ñem haáp thuï NH3 (ml). b: soá ml NaOH 0,1N tieâu toán cho chuaån ñoä (ml). T: heä soá hieäu chænh noàng ñoä NaOH 0,1N. 0,0014: löôïng gam nitô öùng vôùi 1ml H2SO4 0,1N. Vdm: theå tích ñònh möùc (ml). Vm: soá ml maãu ñem voâ cô hoùa (ml). ñònh löôïng nitô amin (AOAC) Ñònh löôïng nitô amin baèng phöông phaùp so maøu, söû duïng nynhydrin. Hoùa chaát Dung dòch chuaån glycine: hoøa tan 0,1072g glycine vaø ñònh möùc ñeán 100ml. Baûo quaûn ôû 4oC. Tröôùc khi söû duïng pha loaõng dung dòch naøy 100 laàn ñöôïc dung dòch A. Hoøa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin vaø 0,3g fructose trong nöôùc vaø ñònh möùc ñeán 100ml ñöôïc dung dòch B. Chænh pH cuoái 6,6 – 6,8. Dung dòch B ñöôïc baûo quaûn trong toái ôû 4oC, duøng trong 2 tuaàn. Hoøa tan 1g KIO3 trong 300ml nöôùc caát vaø 200ml coàn 96% v/v ñöôïc dung dòch C. Dung dòch C ñöôïc baûo quaûn ôû 5oC. Caùch tieán haønh. Cho 2ml maãu vaø 1ml dung dòch B vaøo moãi 3 oáng nghieäm. Ñun caùch thuûy (ôû 100oC) trong 16phuùt, laøm nguoäi veà nhieät ñoä 20oC trong thôøi gian 20 phuùt. Cho tieáp vaøo oáng nghieäm 5ml dung dòch C, laéc ñeàu vaø ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 570nm. Laøm 3 maãu chuaån song song vôùi 2ml dung dòch A. Laøm maãu traéng vôùi 2 ml dung dòch nöôùc caát ñeå hieäu chænh maùy so maøu veà 0. Keát quaû. N = Trong ñoù: N: soá mg nitôamin coù trong 1l dòch nha caàn ño. A1: ñoä haáp thu cuûa maãu thí nghieäm. A2: ñoä haáp thu cuûa maãu chuaån (giaù trò trung bình). d : heä soá pha loaõng cuûa maãu ñònh löôïng nitô ammoniac Hoùa chaát, caùch tieán haønh, coâng thöùc tính toaùn: Gioáng vôùi phöông phaùp xaùc ñònh N toång baèng Microkieldahl, chæ khaùc laø khoâng tieán haønh voâ cô hoùa maãu. ñònh löôïng lipid Hoùa chaát : Ete etylic hoaëc ete daàu hoaû. Tieán haønh Saáy khoâ nguyeân lieäu ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi (100-1050C). Caân 50g nguyeân lieäu ñaõ nghieàn nhoû cho vaøo goùi giaáy. Ñaët vaøo truï chieát. Laép truï vaøo bình caàu vaø gaén oáng sinh haøn (coù dung moâi trong bình caàu), qua oáng sinh haøn duøng pheãu cho dung moâi vaøo truï chieát sao cho moät löôïng dung moâi ñaõ chaûy xuoáng bình caàu, moät löôïng treân pheãu coøn ngaäp maãu. Duøng boâng laøm nuùt ñaàu oáng sinh haøn. Môû nöôùc laïnh. Môû coâng taéc ñeøn. Chieát 8-12h. Thöû xem heát chaát beùo chöa ôû ñaàu xiphon (khoâng coøn veát daàu khi dung moâi bay hôi). Laáy goùi giaáy, ñaët döôùi tuû hotte cho bay hôi dung moâi. Saáy ôû 100-1050C trong 1,5h. Ñeå nguoäi ôû bình huùt aåm. Caân treân caân phaân tích. Coâng thöùc Löôïng Lipid thoâ : Trong ñoù: M1 : khoái löôïng goùi giaáy vaø maãu ban ñaàu. M2 : khoái löôïng goùi giaáy vaø maãu sau khi trích vaø saáy. M : khoái löôïng maãu ban ñaàu. ñònh löôïng tinh boät Hoùa chaát duïng cuï Caùc duïng cuï ñeå xaùc ñònh ñöôøng khöû Enzym amilase vaø caùc hoùa chaát xaùc ñònh ñöôøng khöû (xem [5]) Caùch tieán haønh Caân 1-2g maãu, nghieàn nhuyeãn trong coái chaøy söù, chuyeån vaøo becher vaø theâm 3ml nöôùc caát. Khuaáy ñun soâi ñeå hoà hoùa tinh boät. Laøm nguoäi tôùi 40oC vaø theâm vaøo 2ml dung dòch enzym amilase ñeå thuûy phaân hoaøn toaøn tinh boät trong 20 phuùt. Kieåm tra ñaõ thuûy phaân hoaøn toaøn baèng moät gioït thuoác thöû Liugon. Sau ñoù tieán haønh gioáng nhö maãu xaùc ñònh ñöôøng khöû baèng phöông phaùp Ferrycyanure( tham khaûo [5]) Tính keát quaû Haøm löôïng tinh boät % trong maãu nguyeân lieäu: Trong ñoù: Xtb – haøm löôïng % ñöôøng khöû sau thuûy phaân Xk - haøm löôïng % ñöôøng khöû tröôùc thuûy phaân 0.9 - heä soá chuyeån ñoåi töø glucose sang tinh boät ñònh löôïng cellulose Duïng cuï, hoùa chaát Tuû saáy, loø nung, coái chaøy söù, cheùn nung. Bình caàu 150 coù gaén oáng sinh haøn khí, pheãu, giaáy loïc khoâng tro, becher. HCl ñaëc, KOH 10%, CH3COOH 2%. Thuoác thöû Liugon. Tieán haønh Caân 25g nguyeân lieäu ñaõ ñöôïc nghieàn mòn, cho vaøo moät bình caàu cao coå ñaõ chöùa 50ml nöôùc caát, theâm vaøo 10ml HCl ñaäm ñaëc. Ñaët bình caàu leân beáp ñieän trong tuû hotte, gaén oáng sinh haøn khí vaø ñun soâi thaät kyõ cho ñeán khi tinh boät bò thuûy phaân hoaøn toaøn, thöû ñieåm keát thuùc thuûy phaân baèng caùch chaám moät gioït dung dòch thuûy phaân leân lam kính vaøo gioït thuoác thöû Luigon ñeán maát maøu xanh. Laáy bình caàu ra khoûi beáp, loïc qua giaáy loïc khoâng tro, laáy baõ. Röûa baõ nhieàu laàn baèng nöôùc caát. Duøng bình tia nöôùc chuyeån heát baõ vaøo laïi bình caàu ñaõ duøng treân. Theâm vaøo bình caàu 10ml KOH 10%. Ñaët bình caàu leân beáp, ñun soâi 20- 30 phuùt nöõa. Loïc laáy baõ treân hai giaáy loïc khoâng tro coù troïng löôïng baèng nhau. Röûa baõ 5 laàn baèng nöôùc caát, moãi laàn 20ml. Sau ñoù röûa 3 laàn baèng dung dòch CH3COOH 2% roài baèng röôïu etylic nguyeân chaát (coàn tuyeät ñoái). Sau khi röûa baõ coù maøu traéng trong laø ñöôïc. Ñaët caû 2 giaáy loïc vaø baõ vaøo ñóa petri roài ñöa vaøo tuû saáy 1050C trong 2 giôø, laáy ra ñeå nguoäi trong bình huùt aåm vaø caân. Ñöa caû hai giaáy loïc vaø baõ vaøo cheùn nung (ñaõ ñöôïc nung trong loø nung ôû 400- 5000C, ñeå nguoäi vaø caân treân caân phaân tích), tieán haønh nung baõ trong loø nung ôû nhieät ñoä 400- 5000C trong 3 giôø ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. Laáy ra ñeå nguoäi trong bình huùt aåm vaø caân cheùn nung chöùa tro sau khi nung. Tính keát quaû Löôïng cellulose coù trong maãu ñöôïc tính theo coâng thöùc: Trong ñoù: m1: khoái löôïng baõ sau khi saáy (g). m 2: khoái löôïng cheùn nung vaø tro sau khi nung (g). m 3: khoái löôïng cheùn nung (g). m: khoái löôïng maãu (g). ñònh löôïng tro Tieán haønh: Nung cheùn söù ñaõ röûa saïch ôû loø nung (6000C) ñeán troïng löôïng khoâng ñoåi. Ñeå nguoäi ôû bình huùt aåm vaø caân treân caân phaân tích. Cho vaøo cheùn m (g) chaát thöû, caân treân caân phaân tích roài cho vaøo loø nung 6000C, nung ñeán tro traéng. Laáy ra cho vaøo bình huùt aåm vaø caân chính xaùc treân caân phaân tích. Tieáp tuïc nung 30 phuùt roài laáy ra cho vaøo bình huùt aåm vaø caân chính xaùc treân caân phaân tích ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. Coâng thöùc: Ñoä tro = Trong ñoù: G laø troïng löôïng cheùn. G1 laø troïng löôïng cheùn vaø maãu. G2 laø troïng löôïng cheùn vaø tro. ñònh löôïng hoaït tính protease Hoùa chaát: Dung dòch Casein 1% pha trong dung dòch ñeäm 0,2N Glycin-NaOH pH 9,5. Thuoác thöû Folin Dung dòch tyrosin chuaån (1 mol/ml): caân 18,12mg tyrosin, hoøa tan trong HCl 0,2N vaø ñònh möùc ñeán 100ml baèng dung dòch HCl 0,2N. Töø dung dòch naøy tieáp tuïc pha loaõng baèng dung dòch HCl 0,2N ñeå nhaän ñöôïc caùc dung dòch coù noàng ñoä tyrosin töø 0,05 ñeán 0,3 mol/ml. Caùch pha dung dòch tyrosin chuaån (Baûng 2) Dung dòch casein 2%: caân chính xaùc 2g casein, hoøa tan trong 30ml dung dòch NaOH 0,1N, coù theå ñun caùch thuûy cho ñeán khi tan heát casein (khuaáy ñeàu khi ñun). Duøng dung dòch KH2PO4 1/15M ñeå chænh pH veà khoaûng 6- 7, sau ñoù ñònh möùc ñeán 100ml baèng dung dòch ñeäm phosphat 1/15M. Baûng 2: Caùch pha dung dòch chuaån tyrosin OÁng nghieäm soá123456Noàng ñoä tyrosin0,050,10,150,20,25 0,3Vtyrosin/VHCl1/191/93/171/41/33/7Dung dòch A (NaH2PO4 1/15 M): caân 11,866g NaH2PO4.12H2O pha trong 1 lít nöôùc caát. Dung dòch B: (KH2PO4 1/15 M): caân 9,073g KH2PO4 pha trong 1 lít nöôùc caát. Dung dòch ñeäm phosphat pH= 7,4: troän dung dòch A vaø B theo tyû leä 4:1. Dung dòch acid tricloacetic (TCA) 10%. Dung dòch Na2CO3 6%. Thuoác thöû Folin-Cio-Calteau. Tieán haønh Trích ly dòch chieát enzym thoâ (hình 1) Maãu kieåm chöùng: tieán haønh maãu kieåm chöùng gioáng nhö ñoái vôùi maãu thí nghieäm, nhöng thay 1ml dòch enzym baèng 1ml nöôùc caát. Döïng ñöôøng chuaån tyrosin: töø dung dòch tyrosin chuaån ñaõ pha loaõng ôû treân, laáy 1ml dung dòch cho vaøo oáng nghieäm, theâm vaøo 4 ml dung dòch Na2CO3 6%, laéc ñeàu, theâm tieáp 1ml thuoác thöû Folin-Cio-Calteau, laéc ñeàu, ñeå phaûn öùng 30 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng, ño ñoä haáp thu A ôû böôùc soùng 750nm, tieán haønh döïng ñöôøng chuaån tyrosin theo keát quaû thu ñöôïc. Tính keát quaû: Hoaït tính cuûa protease trong 1ml dòch enzyme (ñvht/ml) Trong ñoù: [T]: noàng ñoä tyrosine ñöôïc suy ra töø ñöôøng chuaån vaø ñoä haáp thu cuûa maãu nghieân cöùu, (mol/ml) 8: soá ml toaøn boä hoãn hôïp phaûn öùng (1ml dòch enzyme, 2ml dung dòch casein, 5ml dung dòch TCA 10%) n: heä soá pha loaõng : Thôøi gian phaûn öùng (10 phuùt) Hoaït tính cuûa protease trong 1g canh tröôøng khoâ (ñvht/g ctk) Trong ñoù:V- theå tích ñònh möùc, (ml) soá g canh tröôøng khoâ, (g) Hình 1: Sô ñoà trích ly dòch chieát enzym thoâ Hình 2: Sô ñoà xaùc ñònh hoaït tính protease thaønh phaàn moâi tröôøng giöõ gioáng Moâi tröôøng Crapek ñeå giöõ gioáng Aspergillus oryzae: Nöôùc caát : 1000ml Saccharose : 30g NaNO3 : 3g KH2PO4 : 1g MgSO4.7H2O: 0,5g FeSO4 : 0,01g Thaïch : 25g

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docban thuyet minh.doc