Luận văn Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng lên hoạt động quang hợp và hô hấp của vi tảo Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge

3, gần như không đổi so với ngày 3 ở ngày 4, sau đó giảm nhanh vào các ngày 5, 6, 7 (Bảng 3.14, Hình 3.14). Khi được chiếu ánh sáng xanh dương, hàm lượng diệp lục tố của dịch trích thấp hơn đối chứng trong suốt quá trình tăng trưởng (Bảng 3.14, Hình 3.14). Dưới ánh sáng xanh lục, hàm lượng diệp lục tố cao hơn đối chứng ở ngày thứ nhất, nhưng thấp hơn ở ngày 2, đạt đỉnh vào ngày 5 và luôn cao hơn đối chứng từ ngày 3 trở đi (Bảng 3.14, Hình 3.14). Hàm lượng diệp lục tố dưới ánh sáng tím luôn giảm và thấp hơn đối chứng trong bốn ngày khảo sát (Bảng 3.14, Hình 3.14). 99 Hình 3.14: Hàm lượng diệp lục tố của S. subsalsum (A.Cleve) Bethge dưới các điều kiện chiếu sáng đơn sắc khác nhau ở cùng cường độ 50 µmol photon.mP-2P.sP-1 Bảng 3.14: Hàm lượng diệp lục tố của S. subsalsum (A.Cleve) Bethge dưới các điều kiện chiếu sáng đơn sắc khác nhau ở cùng cường độ 50 µmol photon.mP-2P.sP-1 Thời gian tăng trưởng Hàm lượng diệp lục tố (mg.mP-3P) AS trắng AS xanh dương AS xanh lục AS tím N1 45,54 ± 1,60Pa 33,56 ± 3,85Pa* 50,92 ± 3,21Pa* 13,70 ± 2,89Pd* N2 102,05 ± 8,66Pe 65,91 ± 6,74Pbc* 90,36 ± 16,41Pb* 5,81 ± 3,21Pc* N3 125,43 ± 9,30Pe 96,31 ± 4,81Pd* 144,15 ± 16,04Pd* 3,16 ± 1,28Pb* N4 120,41 ± 13,15Pe 90,22 ± 7,12Pd* 150,67 ± 13,15Pe* 2,65 ± 0,96Pa* N5 110,44 ± 12,83Pd 74,15 ± 14,49Pc* 163,37 ± 19,88Pf* N6 103,70 ± 3,66Pc 67,99 ± 10,26Pbc* 148,74 ± 8,34Pe* N7 86,06 ± 3,21Pb 65,19 ± 9,30Pb* 121,63 ± 17,96Pc* Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05. Dấu * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức so với đối chứng. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 H àm lư ợn g di ệp lụ c tố ( m g. m -3 ) Thời gian tăng trưởng (ngày) AS Trắng AS Xanh dương AS Xanh lục AS Tím 100 3.2. Thảo luận 3.2.1. Khảo sát môi trường nuôi thích hợp cho sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge Trong các môi trường f/2, Aquil*, và DAM đường cong tăng trưởng của S. subsalsum (A.Cleve) Bethge đều có dạng hình chữ S, riêng môi trường ESAW đường cong tăng trưởng của vi tảo không ổn định nhất và mật độ tế bào không cao. Đường cong tăng trưởng dạng chữ S cũng đã được ghi nhận ở các loài vi tảo khác và được thừa nhận từ rất lâu trên thế giới (Laval – Martin, Mazliak, 1979; Moretti et al., 1999; Clark, 2001; Puskaric, Mortain-Bertrand, 2003; Helm et al., 2006) cũng như trong nước (Lê Thị Phương Hồng và cs., 1997, Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Trọng Nho, 2004; Nguyễn Tấn Đại, 2007; Nguyễn Thị Kim Ánh, 2008, Huỳnh Thị Ngọc Như, 2010). Môi trường f/2 được sử dụng nhiều trong nuôi vi tảo đại trà nhưng không phù hợp trong phòng thí nghiệm. Thành phần chính của f/2 là nước biển tự nhiên vô trùng, việc thu và vận chuyển nước biển tự nhiên gặp nhiều khó khăn ở những nơi sâu trong nội địa. Do đó, nhu cầu về lượng lớn thành phần chính này, không phải phòng thí nghiệm xa biển nào cũng có thể đáp ứng được. Trong khi đó, môi trường nước biển nhân tạo rất đa dạng, được nhiều tác giả nghiên cứu rất sớm và điều chỉnh thành phần cho phù hợp với từng loại vi tảo (Allen E. J., et al., 1914; Berges J. A., et al., 2001), hơn nữa hoàn toàn có thể chủ động được lượng môi trường cần dùng. Lợi ích của các môi trường nước biển nhân tạo là có thể kiểm soát chính xác nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ chất dinh dưỡng và có cơ hội để lặp lại các thí nghiệm giống điều kiện ban đầu (Harrison, Berges, 2005; Moreaux et al., 2007). Ngoài ra, các môi trường nước biển nhân tạo còn chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng thiết yếu cũng như: các ion quan trọng, các tác chelat nhân tạo để duy trì đầy đủ hàm lượng các nguyên tố vi lượng trong dung dịch và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ. Thiamin (vitamin B1), cyanocobalamin (vitamin B12) và biotin là các nhân tố sinh trưởng hữu cơ quan trọng nhất. Theo Droop (1961, 1962) 101 thì sự hình thành chelat của các nguyên tố vi lượng, đệm pH và sự cân bằng thế oxi hóa khử, một số hay tất cả các đặc tính hóa lý này trong một môi trường có thể quyết định đến sự sinh trưởng của loài thực vật phù du hơn là tỷ lệ của các ion chính (Fogg and Thake, 1987). Vì những ưu điểm đó, có thể nói môi trường nước biển nhân tạo đã được sử dụng rất phổ biến trên thế giới. Nhưng ở Việt Nam nước biển nhân tạo hầu như chưa được áp dụng rộng rãi. Tùy từng đối tượng vi tảo mà môi trường nước biển nhân tạo nào sẽ thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng và mỗi loài thích hợp với điều kiện pH khác nhau của từng môi trường. Vì thế cùng là nước biển nhân tạo, nhưng sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge trong môi trường Aquil* nhanh, mạnh và ổn định hơn các môi trường DAM và ESAW thông qua hình thái tế bào, mật độ tế bào và đường cong tăng trưởng. 3.2.2. Khảo sát mật độ khởi đầu thích hợp Ở điều kiện nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, việc chọn mật độ tế bào xuất phát thích hợp cho nghiên cứu sinh lý là rất cần thiết. Mật độ khởi đầu có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng tăng trưởng của vi tảo. Nó là một trong những yếu tố có liên quan mật thiết đến sinh khối và thời gian tảo đạt cực đại (Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Trọng Nho, 2001). Mật độ xuất phát càng cao, đường cong tăng trưởng càng ngắn lại, pha tăng trưởng mạnh bắt đầu sớm hơn, nhưng sự suy vong cũng diễn ra nhanh hơn do mối quan hệ cạnh tranh của số lượng tế bào trên một thể tích môi trường và hàm lượng chất dinh dưỡng. Ở Việt Nam, tảo Nitzschia sp. được nuôi cấy ở mật độ 0,2.10P4P tb/ml (Nguyễn Thị Lĩnh và cs., 1999); 0,5.10P4P tế bào/ml đối với loài Chaetoceros lauderi và Chaetoceros subtilis (Nguyễn Thị Kim Ánh, 2009); 5. 10P4P tế bào/ml đối với loài Nitzschia closterium (Nguyễn Thị Hương và cs., 2010). Khi cấy chuyền Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge ở mật độ 3,4.10P4 P tế bào/ml, thời gian tăng trưởng của quần thể tế bào vi tảo được rút ngắn hơn, quần thể nhanh chóng suy yếu và tàn lụi thể hiện rõ qua màu sắc dịch nuôi, hình thái tế 102 bào, đường cong tăng trưởng và mật độ cực đại. Có lẽ vì mật độ quá cao, tế bào cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và ánh sáng, chất thải nhiều ảnh hưởng sự tăng trưởng, pH tăng và nhanh suy là điều tất yếu. Ở mật độ 1,4.10P4P tế bào/ml và 1,8.10P4P tế bào/ml và 2,2.10P4P tế bào/ml, thời gian tăng trưởng của quần thể kéo dài, do ban đầu mật độ thấp nên số lượng tế bào phân chia thấp, pha tăng trưởng mạnh kéo dài nhưng mật độ tế bào trong pha này cũng thấp hơn. Mật độ 3.10P4P tế bào/ml thích hợp hơn mật độ 2,6.10P4P tế bào/ml. Mặc dù đường cong tăng trưởng của quần thể ở hai mật độ này gần như khá ổn định, nhưng về hình thái tế bào qua các pha tăng trưởng, mật độ cực đại, cũng như thời gian đạt mật độ cực của S. subsalsum (A.Cleve) Bethge thì quần thể khi xuất phát ở mật độ 3.10P4P tế bào/ml tốt hơn, nhanh hơn và cao hơn. 3.2.3. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge Vi tảo quang tự dưỡng cần ánh sáng để quang hợp (MacIntyre Hugh L., Cullen John J., 2005). Trong các yếu tố bên ngoài thì ánh sáng là nhân tố thiết yếu, tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp và có vai trò quyết định. Do đó, sẽ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tăng trưởng của vi tảo. Nghiệm thức đối chứng khi được đặt trong điều kiện tối, sự tăng trưởng của quần thể bị hạn chế do quang hợp không xảy ra, không có năng lượng để bù lại phần năng lượng đã bị tiêu hao do hô hấp. Tảo chuyển sang dinh dưỡng bằng các chất hữu cơ hoà tan thậm chí tiêu biến thể màu (Dương Đức Huyến, 2009; Hoàng Thị Sản, 2003). Trong thí nghiệm này, các cường độ ánh sáng khác nhau: 20, 50, 80, 100, và 140 µmol photon.mP-2P.sP-1 Pkhi chiếuP Plên mẫu nguồn đã được xử lí thiếu sáng đều cho thấy sự kích thích tăng trưởng rõ rệt thể hiện qua tất cả các chỉ tiêu khảo sát như: hình thái tế bào, mật độ tế bào, đường cong tăng trưởng, CĐQH, CĐHH, hàm lượng diệp lục tố. Tuy nhiên, mỗi mức cường độ ánh sáng có tác động khác nhau đến từng chỉ tiêu trên. 103 Về mặt hình thái, các cường độ ánh sáng: 20, 50, 80, 100, và 140 µmol photon.mP-2P.sP-1 Pđều kích thích thể sắc tố phát triển, nhanh chóng chiếm trọn thể tích tế bào, và kích thích sự phân chia tế bào ngay các ngày đầu sau khi cấy chuyền. Tuy nhiên, khi xử lí cường độ ánh sáng càng cao, sự tàn lụi biểu hiện qua hình thái tế bào và hình thái chuỗi xảy ra càng nhanh. Hơn nữa, mật độ tế bào ở nghiệm thức AS 100 và AS 140 tuy không có sự khác biệt với nhau, nhưng thấp hơn so với mật độ tế bào các nghiệm thức AS 20, AS 50, AS 80. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên Chaetoceros calcitrans (Lê Viễn Chí, 1994; Nguyễn Thị Huơng, Nguyễn Trọng Nho, 2004), đối tượng này phát triển tốt khi nuôi dưới cường độ ánh sáng 4.000 lux tương đương khoảng 85 µmol photon.mP-2P.sP-1P. Mặt khác, với mẫu nguồn được xử lí thiếu sáng, khi nuôi dưới các cường độ ánh sáng 20, 50, 80 µmol photon.mP-2P.sP-1P, có khuynh hướng thích nghi nhanh và đáp ứng tốt hơn vì tảo silic rất cần ánh sáng, nhưng chúng thuộc loại thực vật ưa bóng hơn cả (Dương Đức Huyến, 2009; Hoàng Thị Sản, 2003). Bên cạnh đó, sự quang thích nghi bao gồm một loạt quá trình vật lý, sinh lý, sinh hóa liên quan đến nhau và điều đó hỗ trợ tế bào vi tảo tối ưu hóa việc sử dụng của ánh sáng có sẵn. Sự thiệt hại do quá nhiều ánh sáng phụ thuộc nhất định vào tình trạng thích nghi với ánh sáng trước đó của tế bào: tế bào thích nghi với ánh sáng tương đối thấp trước khi tiếp xúc với ánh sáng có cường độ cao sẽ bị quang hại ở cường độ chiếu sáng thấp hơn so với các tế bào đã được thích nghi với ánh sáng có cường độ cao (Carvalho et al., 2011). Tất cả các nghiệm thức với các cường độ ánh sáng khác nhau đều cho CĐQH, CĐHH cao hơn rất nhiều lần so với đối chứng. Tuy nhiên CĐQH của quần thể vi tảo dưới cường độ 140 µmol photon.mP-2P.sP-1P thấp hơn so với CĐQH dưới các nghiệm thức khác. Có thể khi cường độ ánh sáng cung cấp quá cao, vượt ra ngoài khu vực ổn định, quang hệ thống II có thể nhanh chóng bị hư hỏng. Vì vậy, phản ứng sinh lý của tế bào vi tảo làm giảm quá trình quang hợp gọi là quang ức chế (Carvalho et al., 2011). Điều này cũng được ghi nhận ở loài Haematococcus pluvialis, khi được chiếu sáng với cường độ 250 µmol photon.mP-2P.sP-1P, quang hợp 104 ròng giảm trong khi hô hấp tối tăng lên suốt quá trình hình thành carotenoid thứ cấp (Qui Baosheng, Li Ying, 2006). Màu xanh lục của dịch chiết diệp lục tố ở các nghiệm thức đậm đần từ ngày 1 đến ngày 4 theo thứ tự AS 20 > AS 50 > AS 80 > AS 100 > AS 140, tương ứng với sự đậm dần của dịch nuôi từ ngày đầu cấy chuyền đến giữa quá trình tăng trưởng. Ngoài ra, hàm lượng diệp lục tố ở nghiệm thức AS 20, AS 50 cao hơn hẳn so với các nghiệm thức khác. Điều này có thể do khuynh hướng phổ biến của tế bào đáp ứng với cường độ ánh sáng thấp là tăng hàm lượng diệp lục tố a (Qiang Hu, 2004). 3.2.5. Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng ở cùng cường độ 20 µmol photon.m-2.s-1 lên sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge Độ dài bước sóng ánh sáng có ý nghĩa sinh thái vô cùng quan trọng đối với thực vật nói chung và vi tảo nói riêng (6TBùi Trang Việt, 20020T6). Cả quá trình quang hợp và tăng trưởng của vi tảo đều chịu tác động của thành phần quang phổ ánh sáng (Nielsen M. V., Sakshaug E., 1993) Dưới ở các nghiệm thức đối chứng, AS đơn sắc xanh dương, đỏ, xanh lục, tím, màu nâu vàng của dịch nuôi đậm dần từ ngày đầu đến khoảng cuối pha log, giữ ổn định ở pha cân bằng ngắn, sau đó nhạt màu dần, kèm hiện tượng kết vón và lắng xuống đáy bình ở pha suy vong. Trong đó, màu nâu vàng dịch nuôi dưới điều kiện đối chứng và ánh sáng xanh lục đậm hơn so với dịch nuôi dưới ánh sáng xanh dương, đỏ và tím. Sự thay đổi màu sắc dịch nuôi tương ứng với sự thay đổi về hình thái tế bào và đường cong tăng trưởng. Về mặt hình thái tế bào, trên mẫu nguồn đã được xử lí thiếu sáng, ánh sáng trắng, ánh sáng xanh dương, ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh lục, ánh sáng tím ở cường độ 20 µmol photon.mP-2P.sP-1 Pđều kích thích tế bào nhanh chóng phân chia ngay ngày đầu sau khi cấy chuyền, sắc tố đậm, chiếm trọn thể tích tế bào từ ngày 2 đến ngày 4. Cùng với sự gia tăng về hàm lượng sắc tố, CĐQH, CĐHH cũng tăng nhanh chóng để đáp ứng nhu cầu tăng trưởng của tế bào. 105 Tuy nhiên, tế bào chết xuất hiện dưới ánh sáng đỏ vào ngày thứ 5, sớm hơn so với đối chứng và với các nghiệm thức AS xanh dương một ngày; sớm hơn 2 ngày so với AS xanh lục, và sớm hơn 3 ngày so với AS tím. Ở cùng cường độ 20 µmol photon.mP-2P.sP-1P, quần thể S. subsalsum (A.Cleve) Bethge dưới các nghiệm thức đều cho đường cong tăng trưởng dạng chữ S. Nghiệm thức AS xanh dương, AS đỏ cùng đạt mật độ cực đại vào ngày 4, cùng thời điểm với đối chứng và mật độ tương đương so với đối chứng trong suốt quá trình tăng trưởng. Ánh sáng đơn sắc tím cho mật độ tế bào thấp rõ rệt và thời gian đạt cực đại lâu hơn so với đối chứng. Theo 0TNguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, 2008, phản ứng quang hoá chỉ có thể xảy ra trong giới hạn lượng tử từ 147 đến 587 kJ/mol. Như vậy, trong các lượng tử của tia đỏ (176 kJ/mol) chứa một năng lượng đủ để thực hiện các phản ứng quang hoá. Trong khi hấp thu lượng tử tia xanh (261 kJ/mol), các phân tử 0Ttham gia phản ứng sẽ thu được năng lượng dư thừa. Và năng lượng dư thừa sẽ cao hơn khi 0Tcác phân tử 0Ttham gia phản ứng hấp thu lượng tử tia tím. Khi nuôi dưới ánh sáng đơn sắc xanh lục, quần thể vi tảo đạt đỉnh tăng trưởng vào ngày 5, mật độ cực đại không có khác biệt với đối chứng, tuy nhiên quần thể suy vong chậm hơn và mật độ tế bào cao hơn đối chứng vào các ngày cuối của quá trình tăng trưởng. Theo Richmond Amos, (2004), hai điều nổi bật cần quan tâm trong nuôi cấy thu sinh khối vi tảo là: sự thâm nhập của ánh sáng theo độ sâu trong nuôi cấy (cho thấy vai trò quan trọng của bước sóng ánh sáng) và mật độ tế bào0T. Ba vùng bước sóng cần đòi hỏi là: vùng xanh dương, 400 – 500 nm; vùng xanh lục, 500 – 600 nm (vùng được hấp thụ yếu bởi diệp lục tố và carotenoid); vùng đỏ, 600 – 700nm0T (chứa cực đại hấp thu của diệp lục tố ở 678nm). Theo ghi nhận thì sự thâm nhập theo độ sâu của vùng đỏ và vùng xanh dương nhỏ hơn đến 20 lần so với vùng xanh lục (tuy được hấp thụ yếu hơn). Vì vậy, ánh sáng xanh lục có thể có vai trò quan trọng trong nuôi cấy vi tảo với mật độ cao – trong đó tế bào có thể bị giới hạn ánh sáng mạnh (Gitelson et al., 1996, 2000) vẫn tăng được lượng ánh sáng đến 106 trung tâm phản ứng. Hơn nữa, theo Dương Đức Huyến, 2009; Hoàng Thị Sản, 2003, tảo silic thường gặp ở vùng nước trong suốt có độ sâu 50 – 65 m. Ở ngoài biển, chúng có thể phân bố ở độ sâu tới 100 – 350 m. Do đó, dù đạt mật độ cao nhất chậm hơn so với đối chứng một ngày nhưng mật độ tế bào dưới ánh sáng xanh lục cao hơn và giảm chậm hơn đối chứng khi quần thể rơi vào pha suy vong. Theo 0TNguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, 2008; Bùi Trang Việt, 2002, diệp lục tố a có đỉnh hấp thu tại ánh sáng đỏ và quang hợp đạt hiệu quả nhất khi được chiếu tia đỏ.Tuy nhiên, khi chiếu ánh sáng đỏ suốt các giai đoạn tăng trưởng S.subsalsum (A.Cleve) Bethge lại không cho CĐQH đạt cao nhất, điều này có thể do ánh sáng đỏ kích thích sự hình thành 0Tnhiều gluxit hơn ánh sáng bước sóng ngắn (như xanh dương, tím, xanh lục); nhưng thành phần axit amin, protein chủ yếu được tạo ra dưới ánh sáng có bước sóng ngắn lại ít. Hơn nữa các thành phần này tham gia tạo các phức hợp với sắc tố trên màng thylakoid. Do đó, việc chiếu ánh sáng đỏ suốt quá trình tăng trưởng cũng không đẩy mạnh quá trình quang hợp của vi tảo. Nhưng theo Carvalho et al., 2011, trong quang phổ ánh sáng đầy đủ thì khoảng một nửa trong số đó là hữu ích cho quang hợp (400 – 700nm) và thường được sử dụng cho vi tảo tăng trưởng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã công nhận rằng ánh sáng màu xanh dương (420 – 450 nm) và cam đỏ (660 – 700 nm) cho hiệu quả quang hợp như quang phổ của ánh sáng đầy đủ. Nhận định này phù hợp với kết quả thí nghiệm dưới ánh sáng xanh dương ở cường độ 20 µmol photon.mP-2P.sP-1P. Trong khi đó, CĐHH của quần thể vi tảo dưới các ánh sáng đơn sắc khác nhau chủ yếu khác nhau về thời gian đạt đỉnh hô hấp: ánh sáng xanh dương và ánh sáng đỏ đạt đỉnh hô hấp vào ngày 5, chậm hơn một ngày và chậm hơn ba ngày đối với ánh sáng xanh lục và ánh sáng tím so với đối chứng. Có thể đỉnh hô hấp của quần thể vi tảo dưới các ánh sáng đơn sắc chậm hơn một ngày so với đỉnh mật độ, lúc này, mật độ tế bào quá cao, dẫn đến sự cạnh tranh về dưỡng khí cũng như các chất dinh dưỡng khác, quần thể đẩy mạnh hô hấp cho các nhu cầu tăng trưởng trước khi vào pha suy vong. 107 Dưới ảnh hưởng của các ánh sáng đơn sắc khác nhau, độ đậm của dịch trích diệp lục tố khác nhau. Ánh sáng tím và xanh dương cho màu sắc dịch trích nhạt màu hơn so với dịch trích diệp lục tố dưới điều kiện đối chứng, với ánh sáng xanh lục và với ánh sáng đỏ qua tất cả các ngày của quá trình tăng trưởng. Sự biến đổi độ đậm của màu xanh lục đặc trưng cho dịch trích diệp lục tố cũng tương ứng với hàm lượng diệp lục tố trong kết quả thí nghiệm. Hàm lượng diệp lục tố trong các nghiệm thức AS xanh dương, AS đỏ, AS xanh lục, AS tím luôn thấp hơn ở mức có ý nghĩa so với đối chứng qua các ngày tăng trưởng. Kết quả này phù hợp với nhận định của 0THumphrey, 1983; Rivkin, 1989 trên một số loài tảo khác0T. Điều này có thể lí giải cho sự thấp hơn về CĐQH, CĐHH của các nghiệm thức so với đối chứng. Tuy nhiên, theo 0TWallen, Geen, 1971, ở một số loài tảo, hàm lượng diệp lục tố a dưới ánh sáng xanh dương kết hợp với xanh lục cao hơn so với dưới ánh sáng trắng, ở một số loài khác kết quả lại không có sự khác biệt (Holdsworth, 1985). 3.2.6. Ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng ở cùng cường độ 50 µmol photon.m-2.s-1 lên sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge Dưới ánh sáng trắng đối chứng, ánh sáng xanh dương, ánh sáng xanh lục, màu nâu vàng của dịch nuôi đậm dần từ ngày 1 đến 5, nhạt màu dần kèm hiện tượng kết vón và lắng xuống đáy bình vào ngày 6, 7 của quá trình tăng trưởng. Dịch nuôi được chiếu ánh sáng xanh lục có màu nâu vàng đậm hơn so với đối chứng. Trong khi đó, khi nuôi vi tảo dưới ánh sáng tím, màu sắc dịch nuôi gần như trong suốt qua các ngày của thí nghiệm. Kết hợp với hình thái tế bào cho thấy, ánh sáng trắng, ánh sáng xanh dương và ánh sáng xanh lục đều kích thích sự hình thành sắc tố, kích thích phân chia tế bào ngay ngày đầu cấy chuyền và các ngày tiếp theo. Bên cạnh đó, đường cong tăng trưởng của vi tảo ở nghiệm thức đối chứng, AS xanh dương và AS xanh lục có dạng chữ S, nhưng dạng này không thể hiện rõ khi nuôi vi tảo dưới ánh sáng tím. CĐQH, CĐHH của quần thể vi tảo dưới ánh sáng xanh dương, ánh sáng xanh lục ở cùng cường độ 50 µmol photon.mP-2P.sP-1 Pkhông khác 108 biệt nhiều so với đối chứng. Ánh sáng tím có tác dụng kích thích hình thành sắc tố chỉ trong ngày thứ nhất. Trong các ngày tiếp theo, tế bào chết tăng rất nhanh, quần thể gần như không tăng trưởng được dưới ánh sáng tím ở cường độ 50 µmol photon.mP-2P.sP-1P. Khi chiếu ánh sáng tím liên tục qua các ngày thí nghiệm CĐQH, CĐHH của quần thể vi tảo liên tục giảm. Có thể ở cùng một cường độ ánh sáng, nhưng lượng tử tia tím mang năng lượng quá cao, phân tử diệp lục được kích thích đến trạng thái triplet, đây là một hình thức rất không ổn định, phản ứng với oxygen và truyền năng lượng trong khi giảm xuống trạng thái cơ bản. Oxygen bị kích thích phản ứng với axit béo hình thành lipid peroxide gây phương hại đến màng tế bào, và thậm chí có thể dẫn đến chết tế bào (Carvalho et al., 2011). 109 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Từ các kết quả thu nhận được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Vi tảo Skeletonema sp. được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh chính là loài Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge.  Loài tảo này tăng trưởng tốt trong môi trường Aquil* với mật độ xuất phát 30.000 tế bào/ml, trong điều kiện chu kì sáng tối 12:12, nhiệt độ 25PoPC ± 2, cường độ ánh sáng 50 µmol photon.mP-2P.sP-1P.  Ánh sáng trắng thích hợp cho sự tăng trưởng cũng như hoạt động quang hợp, hô hấp của loài ở cường độ từ 20 – 80 µmol photon.mP-2P.sP-1P.  Ở cường độ 20 µmol photon.mP-2P.sP-1P: • Các ánh sáng xanh dương, đỏ, xanh lục thích hợp cho sự tăng trưởng của Skeletonema subsalsum, tương đương với ánh sáng trắng, thể hiện rõ qua hình thái tế bào, mật độ cực đại và hoạt động quang hợp, hô hấp. • CĐQH dưới ánh sáng xanh dương, đỏ, xanh lục tương đương với dưới ánh sáng trắng trong bốn ngày đầu của quá trình tăng trưởng. Từ ngày thứ năm CĐQH thấp hơn. CĐHH đạt đỉnh chậm hơn so với dưới ánh sáng trắng. • Ánh sáng tím không thích hợp cho sự tăng trưởng, cũng như hoạt động quang hợp và hô hấp của quần thể vi tảo.  Ở cường độ 50 µmol photon.mP-2P.sP-1P, sự tăng trưởng cũng như hoạt động quang hợp, hô hấp của Skeletonema subsalsum dưới ánh sáng xanh dương, xanh lục, tương đương dưới ánh sáng trắng. Vi tảo không thể tăng trưởng và quang hợp, hô hấp tốt dưới ánh sáng tím ở cường độ trên. 110 4.2. Đề nghị Nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục: - Tìm hiểu ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng, cường độ chiếu sáng khác nhau lên thành phần và hàm lượng của các chất hữu cơ trong các giai đoạn tăng trưởng của Skeletonema subsalsum (A.Cleve) Bethge. - Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của cường độ ánh sáng khác nhau với nồng độ COR2R. 111 Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt 1. Trương Ngọc An, (1993), Phân Loại Tảo Silic Phù Du Biển Việt Nam, NXB Khoa Học Và Kĩ Thuật. 2. Nguyễn Thị Kim Ánh, (2008), Nghiên cứu ảnh hưởng của của một số điều kiện môi trường lên sự sinh trưởng của vi tảo Chaetoceros lauderi Rales và Chaetoceros subtilis Cleve phân lập từ biển Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ, chuyên ngành sinh học thực nghiệm, hướng sinh lí thực vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Minh Châu, (2006), Phương pháp thí nghiệm ngoài đồng, Giáo trình cao học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM, tr. 1 – 34 [tài liệu luu hành nội bộ]. 4. Lê Viễn Chí, Phạm Thị Loan và Hà Đức Thắng, (1994), Kết quả nghiên cứu nuôi và sử dụng một số loài tảo đơn bào làm thức ăn cho ấu trùng trai biển (Pteria martensii), Tuyển tập công trình nghiên cứu Hải sản, Hà Nội, tr. 302 – 308. 5. Nguyễn Tấn Đại, (2007), Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi trồng lên sự tăng trưởng của một số loài tảo Silic ở thủy vực ven bờ biển Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh, Luận văn thạc sĩ, chuyên ngành sinh học thực nghiệm, hướng sinh lí thực vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà, (2006), Vi tảo, Tài liệu trực tuyến (3TU 7. Phạm Hoàng Hộ, (1972), Tảo học, Sài Gòn: Trung tâm học liệu, Bộ Giáo Dục, trang 97 – 111. 8. Nguyễn Thị Huơng, Nguyễn Trọng Nho, (2004), Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Chaetoceros calcitrans 112 Paulsen, 1905, trong Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản III – Nha Trang – Bộ thuỷ sản, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1984 – 2004), Tp.Hồ Chí Minh: Nông nghiệp, tr. 424 - 435. 9. Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Thị Thanh Thuỷ, Hoàng Thị Châu Long, Lê Thị Thu Hương, (2010), Thu thập và nuôi sinh khối vi tảo biển làm thức ăn nuôi thủy sản, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Tạp chí Thương mại thuỷ sản - số 124, tháng 4/2010. 10. Dương Đức Huyến (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Khoa học và Tài nguyên Sinh vật), (2009), Phân loại thực vật bậc thấp, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Hà Nội. 11. Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng, (2008), Sinh lý học thưc vật, NXB Giáo Dục. 12. Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, (1999), Công nghệ sinh học vi tảo (giáo trình cao học Sinh học), NXB nông nghiệp, Hà Nội, trang 25. 13. Lê Thị Phương Hồng, Bùi Trang Việt, Phạm Thành Hổ, (1997), Sự hiện diện và vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở tảo lam Spirulina platensis. Tập san Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp, Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh, số tháng 3, tr. 69 – 72. 14. Huỳnh Thị Ngọc Như, (2010), Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên sự tăng trưởng của vi tảo Thalassiosira sp., Luận văn thạc sĩ, chuyên ngành sinh học thực nghiệm, hướng sinh lí thực vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. 15. Hoàng Thị Sản, (2003), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục. 16. Bùi Trang Việt, (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Phần I- Dinh dưỡng, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 17. Bùi Trang Việt, (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II- Phát triển, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng nước ngoài 113 18. Andersen P., Throndssen J. 2004. Estimating cell numbers. In: Hallegraef GM. Anderson DM, Cembella AD (eds), Manual on hamlful marine microalgae. Paris UNESCO Publishing, p 99-130. 19. Balzano 3TS.3T, Sarno 3TD.3T, 3TWiebe H. C. F. Kooistra3T, (2010), Effects of salinity on the growth rate and morphology of ten Skeletonema strains. 20. Baz F. K. E., Aboul-Enein A. M., El-Baroty G. S., Youssef A. M., Abdel- Baky H. H., (2002), Accumulation of antioxidant vitamins in Dunaliella salina, Online Journal of Biological Science, vol 2 (4), pp. 220 – 223. 21. Ben-Amotz A., Katz A., Avron M., (1982), Accumulation of b-carotene in halotolerant algae: purification and characterization of b-carotene-rich globules from Dunaliella bardawil (Chlorophyceae), J. Phycol., 18, pp. 529 – 37. 22. Berner T., Wyman K., Dubinsky Z., Falkowski P.G., (1989), Photoadaptation and the package effect in Dunaliella tertiolecta (Chlorphyceae), J. Phycol., 25, pp. 70 – 78. 23. Carvalho A. P., Silva S. O., Baptista J. M., Malcata F. X., (2011), Light requirements in microalgal photobioreactors: an overview of biophotonic aspects. Applied Microbiology and Biotechnology. Vol. 89 (5), pp. 1275– 1288. 24. Fisher T., Minnaard J., Dubinsky Z., (1996), Photoacclimation in the marine alga Nannochloropsis sp. (Eustigmatophyte), kinetics study, J. Plankton Res., 18 (10), pp. 1797 – 818. 25. Friedman O., Dubinsky Z., Arad (Malis) S., (1991), Effect of light intensity on growth and polysaccharide production in red and blue-green Rhodophyta unicells, Bioresource Technol., 38, pp. 105 – 10. 26. Fogg G. E., Thake B., (1987), Algae cultures and phytoplankton ecology, The University of Wisconsin Press, ed. 3, pp. 12 – 42. 27. Gitelson A., Hu Q., Richmond A., (1996), The photic volume in photobioreactors supporting ultra-high population densities of the 114 photoautotroph Spirulina platensis, Appl. Environ. Microbiol., 62 (5), pp. 1570 – 73. 28. Gitelson A.A., Grits Y.A., Etzion D., Zou N., Richmond A., (2000), Optical properties of Nannochloropsis sp. and their application to remote estimation of cell mass. Biotechnol. Bioeng., 69 (5), pp. 516–26. 29. Guillard GRL, (1975), Culture of phytoplankton for feeding marine invetebrates. In: Smith WL, Chanley MH (eds), Culture of marine invertebrate animals. New York: Plenium Press, pp. 29 – 60. 30. Harrison P. J. and Berges J. A. (2005), Chapter 3: Marine culture media. In: Andersen R. A., 2005. Algal culturing techniques, Elsevier Academic Press, p. 21 – 35. 31. Hasle, G.R & Syvertsen, E5T. (0T51997)0T5, Marine Diatoms. – In Tomas, C. (ed.) Identifying Marine Phytoplankton, Academic Press, pp. 5 – 27. 32. Helcom, (2001) , Manual of marine monitoring in the COMBINE programme of HELCOM. Part C. programme for monitoring of eutrophication and its effects [ trực tuyến]. Baltic Marine Enviroment Protection Commission (Helsinki Commission) [tham khảo ././2007]. Địa chỉ truy cập: ex4/?u4.highlight=extract%20chlorophin 33. 0THoldsworth E. S., (1985), Effect of growth factors and light quanlity on the growth, pigmentation and photosynthesis of two diatom, Thalassiosira gravida and Phaeodactylum tricornutum. Mar. Bio. Vol 86, pp 253 – 262. 34. 0THumphrey G. F., (1983), The effect of the spectral composition of light on the growth, pigments, and photosynthesis rate of unicellular marine algae, J. Exp. Mar. Biol. Ecol. Vol 66, pp 49 – 67. 115 35. Jung et al., (2009), Morphological Characteristics of Four Species in the Genus Skeletonema in Coastal Waters of South Korea, Algae Vol. 24(4), pp.195 – 203. 36. Laws E. A., Bannister T. T., (1980), Nutrient – and light – limited growth Thalassiosira fluviatilis in continuous culture, with implications for phytoplankton growth in the ocean, Limn. Oceanogr., vol 25 (3), pp. 457 – 473. 37. Lund JWG, Kipling, Le Cren ED, (1958), The inverted microscope method of estimating algal numbers and the stastistical basis of estimations of counting. Hidrobiologia, 11: 143-170. 38. MacIntyre Hugh L., Cullen John J., (2005), Using cultures to investigate the physiological ecology of microalgae, In: Andersen Robert A., Algal culturing techniques, chapter 19, pp. 287 – 326. 39. Masojídek J., Koblížek M., Torzillo G., (2004), Photosynthesis in microalgae. In: Richmond A., Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, Blackwell Science Publishing, pp. 20 – 36. 40. Moreaux S. G., Moreau C., Gonzalez J. L. and Cosson R. P. (2007), “Diatom artificial medium (DAM): a new artificial medium for the diatom Haslea ostrearia and other marine microalgae”, J Appl Phycol, Vol. 19, p. 549–556. 41. Moretii A, Fernandez-Criado MP, Cittolin G, Guidastri R, (1999), Manual on hatchery production of seabass and gilthead seabream, Rome: FAO, pp. 46 – 61. 42. 0TNielsen M. V., Sakshaug E., (1993), Photobiological studies of Skeletonema costatum adapted to spectrally different light regimes, 0TLimnol. Oceanogr., Vol. 38 (7), pp. 1576–1581. 116 43. Qiang Hu, (2004), Environmental Effects on Cell Composition. In: Richmond A., Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, Blackwell Science Publishing, pp. 20 – 36. 44. Qui Baosheng, Li Ying, (2006), Photosynthesis acclimation and photoprotective machanism of Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) during the accumulation of secondary carotenoids at elevated irradiation, Phycologia Vol 45 (2), p. 117 – 126. 45. Richmond Amos, (2004), Biological Principles of Mass Cultivation. In: Richmond A., Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, Blackwell Science Publishing, pp. 20 – 36. 46. 0TRivkin R. B., (1989), Influence of irradiance and spectral quality on the carbon metabilism of phytoplankton. 1. Photosynthesis, chemical composition and growth. Mar. Ecol. Prog. Ser. Vol 55, pp 291 – 304. 47. Rocha J. M. S., Garcia J. E. C., Henriques M. H. F., (2003), Growth aspects of the marine microalga Nannochloropsis gaditana, Biomolecular Engineering, vol 20, pp. 237 – 242. 48. Round F. E., Crawford R. M., Mann D. G., (2000), The cell cycle, in: The Diatoms: biology & morphology of the genera, The press syndicate of the university of Cambridge, pp. 62 – 87. 49. Sunda W. G., Price N. M., Morel F. M. M., (2005), Trace metal ion buffers and their use in culture studies. In: Andersen R. A. (ed.), Algal culturing techniques. Amsterdam: Elsevier Academic Press, pp. 35 – 63. 50. Tomaselli Luisa, (2004), The Microalgal Cell, In: Richmond A., Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, Blackwell Science Publishing, pp. 20 – 36. 51. Vechtel B., Eichenberger W., Ruppel H.G., (1992), Lipid bodies in Eremosphaera viridis De Bary (Chlorophyceae), Plant Cell Physiol., 33, pp. 41 – 48. 117 52. Vetter Y. A., Sharp J. H., (1993), The influence of light intensity on dimethyl sulfide production by a marine diatom, Limno. Oceanogr., vol 38 (2), pp. 419 – 425. 53. 0TWallen D. G., Geen G. H., (1971), Light quality and concentration of protein, RNA, DNA and photosynthesis pigments in two species of marine plankton algae, Mar. Biol. Vol 10, pp 44 – 51. 3T 3T 3T simg009.html3T 3Thttps://ccmp.bigelow.org/node/1223T Phụ lục 1 Môi trường f/2 (Guillard và Ryther, 1962; Guillard, 1975) Môi trường f/2 bao gồm nước biển tự nhiên đã lọc bằng màng lọc 0,22 µm, bổ sung thêm các chất khoáng đa lượng (NaNOR3R, NaHR2RPOR4R.HR2RO, NaR2RSiOR3R.9HR2RO), 7 loại khoáng vi lượng và 3 loại vitamin. Môi trường này được sử dụng để nuôi tảo silic nước mặn sống ven bờ. Cần pha dung dịch gốc sơ cấp (stock) cho khoáng vi lượng và vitamin trước khi tiến hành pha dung dịch gốc thứ cấp để dùng cho môi trường cuối cùng.  Pha stock dung dịch khoáng đa lượng Pha stock 50 ml cho mỗi loại khoáng. Hấp vô trùng. Bảo quản trong tủ lạnh. Thành phần Lượng sử dụng Khối lượng cân/50ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) NaNOR3 75,0 g/l 3,75g 8,82 x 10P-4 NaHR2RPOR4R.HR2RO 5,0 g/l 0,25g 3,62 x 10P-5 NaR2RSiOR3R.9HR2RO 30,0 g/l 1,50g 1,06 x 10P-4  Pha dung dịch khoáng vi lượng • Dung dịch khoáng vi lượng gốc sơ cấp Pha stock 50 ml cho mỗi loại khoáng. Bảo quản trong tủ lạnh. Thành phần Lượng sử dụng Khối lượng cân/50ml nước cất FeClR3R.6 HR2RO - - NaR2REDTA.2HR2RO - - MnClR2R.4HR2RO 180,0g/L 9,000g ZnSOR4.R7HR2RO 22,0 g/L 1,100g CoClR2R.6HR2RO 10,0 g/L 0,500g CuSOR4.R5HR2RO 9,8 g/L 0,490g NaR2RMoOR4R.2HR2RO 6,3 g/L 0,315g • Dung dịch khoáng vi lượng gốc thứ cấp (50ml) Thành phần (từ dung dịch gốc sơ cấp) Lượng dùng/50ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) FeClR3R.6 HR2RO 3,15 g 1,17 × 10P-5P NaR2REDTA.2HR2RO 4,36 g 1,17 × 10P-5P MnClR2R.4HR2RO 50 µl 9,10 × 10P-7P ZnSOR4.R7HR2RO 50 µl 7,65 × 10P-8P CoClR2R.6HR2RO 50 µl 4,20 × 10P-8P CuSOR4.R5HR2RO 50 µl 3,93 × 10P-8P NaR2RMoOR4R.2HR2RO 50 µl 2,60 × 10P-8P  Pha dung dịch vitamin • Dung dịch gốc sơ cấp Thành phần Lượng sử dụng/lit Lượng dùng /50ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Thiamine.HCl (vitamin B1) - - 2,96 x 10P-7 Biotine (vitamin H) 1,0 g/L 0,05g 2,05 x 10P-9 Cyanocobalamin (vitamin B12) 1,0 g/L 0,05g 3,69 x 10P -10 • Dung dịch gốc thứ cấp: pha từ các dung dịch gốc sơ cấp vitamin. Lọc vô trùng qua lưới lọc 0,22 µm. Bảo quản trong tủ lạnh. Thành phần (dung dịch gốc sơ cấp) Lượng lấy /50ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Thiamine.HCl (vitamin B1) 0,01g 5,92 × 10P-7 Biotine (vitamin H) 50 µl 4,10 × 10P-9P Cyanocobalamin (vitamin B12) 50 µl 7,38 × 10P -10 P  Pha chế dung dịch f/2 hoàn chỉnh: Môi trường f/2 được pha chế từ: 995,5 ml nước biển tự nhiên đã được hấp vô trùng, bổ sung thêm dung dịch khoáng đa lượng, dung dịch gốc vi lượng và dung dịch gốc vitamin, lắc đều. Dung dịch/dung dịch gốc Lượng sử dụng Nồng độ dung dịch cuối (M) NaNOR3 1ml 8,82 × 10P-4P M NaHR2RPOR4 1ml 3,62 × 10P-5P M NaR2RSiOR3R.9HR2RO 1ml 1,06 × 10P-4P M vi lượng 1ml vitamin 0,5ml Phụ lục 2 Môi trường Aquil* (Sunda W. G., et. al., 2005) Chuẩn bị pha môi trường nước biển nhân tạo Aquil*, dùng 600 ml nước cất và hòa tan lần lượt mỗi muối anhydrous. Tiếp theo, dùng 300 ml nước cất và hòa tan lần lượt mỗi muối hydrous. Kết hợp 2 dung dịch và hấp vô trùng. Thêm 1 ml mỗi dung dịch stock dinh dưỡng đa lượng, thêm 1 ml dung dịch khoáng vi lượng, và thêm 1 ml dung dịch vitamin. Thể tích nước biển nhân tạo cần pha là 1000 ml.  Pha muối anhydrous: trong 600 ml nước cất Thành phần Lượng sử dụng Nồng độ dung dịch cuối (M) NaCl 24,540 g 4,20 x 10P-1 NaR2RSOR4 4,090 g 2,88 x 10P-2 KCl 0,700 g 9,39 x 10P-3 NaHCOR3 0,200 g 2,38 x 10P-3 KBr 0,100 g 8,40 x 10P-4 HR3RBOR3 0,003 g 4,85 x 10P-5 NaF 0,003 g 7,15 x 10P-5  Pha muối hydrous: Pha trong 300 ml nước cất Thành phần Lượng sử dụng Nồng độ dung dịch cuối (M) MgClR2R,6HR2RO 11,100 g 5,46 x 10P-2 CaClR2R,2HR2RO 1,540 g 1,05 x 10P-2 SrClR2R,6HR2RO 0,017 g 6,38 x 10P-5 Kết hợp dung dịch muối anhydrous và muối hydrous, rồi chia đôi lượng dung dịch để hấp vô trùng bằng autoclave.  Pha chế dung dịch gốc khoáng đa lượng Pha riêng từng dung dịch gốc để chuẩn bị trực tiếp. Lượng pha đề nghị cho mỗi dung dịch gốc là 50 ml. Hấp vô trùng bằng autoclave.  Pha chế dung dịch khoáng vi lượng • Pha chế stock sơ cấp (50ml) Thành phần Nồng độ (g/l H2O) Khối lượng cân/50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) CuSOR4R. 5HR2RO 4,9 g 0,245 g 1,96 x 10P-8 NaR2RSeOR3 1,9 g 0,095 g 1,00 x 10P-8 • Pha chế stock thứ cấp (50ml) Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) EDTA (anhydrous) 29,200 g 1,460 g 1,00 x 10P -4 FeClR3R. 6HR2RO 0,270 g 0,0135 g 1,00 x 10P-6 Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Khối lượng cân/50 ml nước cất Lượng stock dùng cho 1 lit dung dịch hoàn chỉnh Nồng độ dung dịch cuối (M) NaHR2RPOR4R HR2RO 1,38 g 0,069 g 1ml 1,00 x 10P-5 PM NaNOR3 85,00 g 4,25 g 1ml 1,00 x 10P-4 PM NaR2RSiOR3R 9HR2RO 28,40 g 1,42 g 1ml 1,00 x 10P-4 PM ZnSOR4R. 7HR2RO 0,023 g 0,0115 g 7,97 x 10P-8 MnClR2R. 4HR2RO 0,0240 g 0,0012 g 1,21 x 10P-7 CoClR2R. 6HR2RO 0,0120 g 0,0006 g 5,03 x 10P-8 NaR2RMoOR4R. 2HR2RO 0,0242 g 0,00121 g 1,00 x 10P-7 CuSOR4R. 5HR2RO 50µl 1,96 x 10P-8 NaR2RSeOR3 50µl 1,00 x 10P-8 Pha các thành phần vi lượng với lượng như trên, sau đó đem hấp vô trùng bằng autoclave.  Pha chế vitamin • Pha stock vitamin sơ cấp (50 ml) Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Biotin (vitamin H) 5,0 g 0,25 g 2,25 x 10P-9 Cyanocobalamine (B12) 5,5 g 0,275 g 3,70 x 10P-10 • Pha stock vitamin thứ cấp (50 ml) Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Thiamine. HCl (B1) 0,1 g 0,005 g 2,97 x 10P-7 Biotin (vitamin H) 50 µl 2,25 x 10P-9 Cyanocobalamine (B12) 50 µl 3,70 x 10P-10 Pha stock vitamin thứ cấp với các thành phần và lượng như trên, sau đó đem lọc qua màng lọc vô trùng.  Pha dung dịch Aquil* hoàn chỉnh Trộn các thành phần sau và lắc đều: 600 ml dung dịch muối anhydrous (đã hấp vô trùng) + 300 ml dung dịch muối hydrous (đã hấp vô trùng) + 3 ml đa lượng (mỗi loại 1 ml) + 1 ml vi lượng + 1 ml vitamin + 95 ml nước cất đã được hấp vô trùng được 1000 ml dung dịch. Phụ lục 3 Môi trường DAM (Moreax S. G., et al., 2007) Pha các dung dịch stock với thành phần như sau:  Dung dịch I (dung dịch ion) (pha trong 1 lít stock) Thành phần Lượng dùng (g/l HR2RO) Nồng độ dung dịch cuối (M) HR3RBOR3 1,50 3,64 x 10P-4 KBr 5,00 6,30 x 10P-4 KCl 35,00 7,04 x 10P-3 NaF 0,15 5,36 x 10P-5 NaHCOR3 10,00 1,79 x 10P-3 SrClR2R-6HR2RO 0,85 4,61 x 10P-5  Dung dịch II (dung dịch dinh dưỡng) (pha mỗi chất tạo 3 lít dung dịch stock riêng biệt) Thành phần Lượng dùng (g/l HR2RO) Nồng độ dung dịch cuối (M) NaHR2RPOR4R.HR2RO 1,38 g 2,00 x 10P-5 NaNOR3 25,50 g 3,00 x 10P-4 NaR2RSiOR3R.9HR2RO 28,40 g 2,00 x 10P-4  Dung dịch III (dung dịch khoáng vi lượng) (pha trong 1 lít) • Pha dung dịch stock sơ cấp Thành phần Lượng dùng (g/l HR2RO) CoClR2R-6HR2RO 10 g CuSOR4R-5HR2RO 9,80 g MnClR2R-4H2O 180 g NaR2RMoOR4R-2HR2RO 6,30 g NaR2RSeOR3R-5HR2RO 0,85 g NiClR2R-6HR2RO 0,74 g ZnSOR4R-7HR2RO 22 g • Pha dung dịch stock thứ cấp Pha 3,15 g FeClR3R.6HR2RO và 4,36 g NaR2REDTA.2HR2RO trong 900 ml nước cất. Sau đó bổ sung 1ml mỗi dung dịch stock bên trên vào và thêm nước cất cho đủ 1 lít. Thành phần Lượng dùng pha stock sơ cấp (g/l HR2RO) Lượng dùng pha stock thứ cấp/1000 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) CoClR2R-6HR2RO 10 g 1ml 8,41 x 10P-8 CuSOR4R-5HR2RO 9,80 g 1ml 8,41 x 10P-8 MnClR2R-4HR2RO 180 g 1ml 1,82 x 10P-6 NaR2RMoOR4R-2HR2RO 6,30 g 1ml 5,21 x 10P-8 NaR2RSeOR3R-5HR2RO 0,85 g 1ml 6,46 x 10P-9 NiClR2R-6HR2RO 0,74 g 1ml 6,30 x 10P-9 ZnSOR4R-7HR2RO 22 g 1ml 1,53 x 10P-7 FeClR3R.6HR2RO 3,15 g 2,33 x 10P-5 NaR2REDTA.2HR2RO 4,36 g 2,34 x 10P-5  Dung dịch IV (dung dịch vitamin) • Dung dịch vitamin sơ cấp Thành phần Lượng dùng (g/l HR2RO) Biotin 0,1 g Cyanocobalamin 1 g • Dung dịch vitamin thứ cấp Thành phần Lượng dùng pha stock sơ cấp (g/l HR2RO) Lượng dùng pha stock thứ cấp/1000 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Biotin 0,1 g 10ml 4,09 x 10P-9 Cyanocobalamin 1 g 1ml 7,38 x 10P-10 Thiamine-HCl 0,20 5,93 x 10P-7  Pha dung dịch DAM hoàn chỉnh Bổ sung các dung dịch stock đã pha ở trên với lượng như bảng bên dưới, thêm nước cho đủ 1l dung dịch hoàn chỉnh. Thành phần Lượng dùng Thành phần muối Lượng dùng Dung dịch I 15 ml NaCl 20,570 g Dung dịch II NaHR2RPOR4R-HR2RO NaNOR3R NaR2RSiOR3R-9HR2RO 2 ml 1 ml 2 ml NaR2RSOR4 3,067 g Dung dịch III 2 ml CaClR2R.2HR2RO 1,150 g Dung dịch IV 1 ml MgClR2R.6HR2RO 11,100 g Phụ lục 4 Môi trường ESAW (Harrison và cs,1980, Berges và cs, 2001) Môi trường này được thiết kế cho thực vật phù du gần bờ và xa bờ. Muối anhydrous và muối hydrous được hòa tan riêng và hấp vô trùng riêng rẽ. Kết hợp chúng lại sau khi đã nguội hoàn toàn. pH = 8,2.  Pha chế các stock khoáng đa lượng: Lượng đề nghị là 50 ml đối với mỗi loại muối đa lượng Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Lượng dùng pha dung dịch hoàn chỉnh Nồng độ dung dịch cuối (M) NaNOR3 46,67 g 2,3335 g 1ml 5,49 x 10P -4 P M NaHR2RPOR4R.HR2R0 3,094 g 0,1547 g 1ml 2,24 x 10P -5 P M NaR2RSiOR3R.9HR2RO 15 g 0,7500 g 2ml 1,06 x 10P -4 P M  Pha dung dịch stock Fe – EDTA: • Pha stock sơ cấp (50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) FeClR3R.6HR2RO 1,77 g 1 ml 6,55 x 10P-6P M • Pha stock thứ cấp Fe-EDTA(50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) NaR2REDTA.2HR2RO 2,44 g 0,122 g 6,56 x 10P -6 FeClR3R.6HR2RO 1,77 g 50 μl 6,55 x 10P -6  Pha chế dung dịch khoáng vi lượng: • Pha stock sơ cấp (50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất NaR2RMoOR4R.2HR2RO 1,48 g 0,074 g NaR2RSeOR3 0,173 g 0,00865 g NiClR2R. 6HR2RO 1,49 g 0,0745 g • Pha stock thứ cấp (50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) NaR2REDTA.2HR2RO 3,09 g 0,1545 g 8,30 x 10P-6P M ZnSOR4R.7HR2RO 0,073 g 0,00365 g 2,54 x 10P-7P M CoSOR4R.7HR2RO 0,016 g 0,0008 g 5,69 x 10P-8P M MnSOR4R.4HR2RO 0,54 g 0,027 g 2,42 x 10P-6P M NaR2RMoOR4R.2HR2RO 1 ml 6,12 x 10P-9P M NaR2RSeOR3 1 ml 1,00 x 10P-9P M NiClR2R. 6HR2RO 1 ml 6,27 x 10P-9P M  Pha chế dung dịch vitamin: • Pha stock sơ cấp (50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Biotin (vitamin H) 1,0 g 0,05 g 4,09 x 10P -9 P M Cyanocobalamin (vitamin BR12R) 2,0 g 0,1 g 1,48 x 10P -9 P M • Pha stock thứ cấp (50 ml): Thành phần Nồng độ (g/l HR2RO) Lượng dùng/ 50 ml nước cất Nồng độ dung dịch cuối (M) Biotin (vitamin H) 50µl 4,09 x 10P -9 P M Cyanocobalamin (vitamin BR12R) 50µl 1,48 x 10P -9 P M Thiamine · HCl (vitamin BR1R) 0,1 g 0,005 2,96 x 10P -7 P M  Pha dung dịch muối I (Anhydrous salts): Pha với 600 ml nước cất Thành phần Lượng sử dụng (g/lit HR2RO) Nồng độ cuối (M) NaCl 21,194 g 3,63 x 10P-1 NaR2RSOR4 3,550 g 2,50 x 10P-2 KCl 0,599 g 8,03 x 10P-3 NaHCOR3 0,174 g 2,07 x 10P-3 KBr 0,0863 g 7,25 x 10P-4 HR3RBOR3 0,0230 g 3,72 x 10P-4 NaF 0,0028 g 6,67 x 10P-5  Pha dung dịch muối II (hydrous salts): Pha với 300 ml nước cất Thành phần Lượng sử dụng (g/l HR2RO) Nồng độ cuối (M) MgClR2R 6HR2RO 9,592 g 4,71 x 10P-2P M CaClR2R 2HR2RO 1,344 g 9,14 x 10P-3P M SrClR2R 6HR2RO 0,0218 g 8,18 x 10P-5P M Chú ý: Dung dịch muối I và II phải được hấp vô trùng riêng rẽ, để nguội hoàn toàn sau đó mới hợp chúng lại  Pha 1000 ml dung dịch ESAW hoàn chỉnh: Hoà tan đều: 600 ml dung dịch I + 300 ml dung dịch II + 1 ml NaNOR3R + 1 ml NaHR2RPOR4R. HR2RO + 2 ml NaR2RSiOR3R. 9HR2RO + 1 ml Fe-EDTA + 1 ml vi lượng + 1 ml Vitamin + 93 ml nước cất vô trùng = 1000 ml. Phụ lục 5 ĐO CƯỜNG ĐỘ QUANG HỢP VÀ CƯỜNG ĐỘ HÔ HẤP BẰNG MÁY HANSATECH (PHA LỎNG) 1. Chuẩn bị hóa chất: NaR2RSR2ROR4R bão hòa, KCl 1M, KHCOR3R (NaHCOR3R) 1M. 2. Chuẩn bị điện cực Nhỏ 1 giọt dung dịch KCl 1M lên trên đầu điện cực Cathode (Pt) và 3 giọt vào rãnh chứa anode (Ag). Đặt giấy thấm kích thước (1,5 cm x 1,5 cm) lên đầu điện cực Pt, và đặt tiếp màng thấm oxy S4 (kích thước tương tự) lên trên cùng. Hình: Cách đặt màng và giấy đệm vào điện cực Giấy đệm dùng làm cầu nối dẫn điện nên phải tiếp xúc cả 2 điện cực. A B Hình: giấy đệm (A) và màng điện cực (B) Sau đó dùng dụng cụ kèm theo máy để đặt 1 vòng đệm cao su bao lấy vòm điện cực và làm căng giấy đệm cùng màng bán thấm. Đặt vòng đệm cao su kế tiếp bên ngoài điện cực và lắp điện cực vào đáy buồng. Hình : Cách dùng dụng cụ cố định màng và giấy đệm vào điện cực nhờ vòng cao su Cách lắp điện cực vào buồng đo tương tự như lắp vào buồng đo pha khí. 3. Chuẩn điện cực: A B C Hình: cá từ (A), nắp đậy và buồng đo pha lỏng (B), đặt buồng đo lên máy (C) Cho cá từ (hình 4A) vào buồng đo pha lỏng và đậy nắp lại (hình 4B) và đặt buồng đo lên máy Hansatech (hình 4C). - Chuẩn điện cực UKhôi phục cài đặt gốc:U Trên giao diện của phần mềm, chọn Configure  Control box. Đánh dấu chọn Auto calibrate và nhấn nút Default setting và chọn OK. UBắt đầu chuẩn điện cực:U Nhấn nút Calibrate (hoặc Calibrate  Oxygen  New) UKhai báo nhiệt độ buồng đo:U Nhập giá trị nhiệt độ buồng đo (đọc trên nhiệt kế, ví dụ 25PoPC), chọn pha lỏng (liquid phase) và chọn OK • UBước 1:U Khi xuất hiện bảng Oxygen calibration lần đầu (có khuyến cáo của chương trình: Establish “air line” in chamber): cho khoảng 1,5 ml nước cất vào buồng đo. Mở nắp và cho cá từ quay (nhấp nút stirres, chọn tốc độ quay là 5). ULưu ý:U Bước này chương trình ghi nhận lượng oxy trong buồng đo (cũng chính là lượng oxy bên ngoài vì không đậy nắp buồng đo). Chờ cho tới khi đường biểu diễn OR2R ổn định (đường thẳng song song với trục hoành) chọn Stop. • UBước 2U: Khi xuất hiện bảng Oxygen calibration lần 2, rút nước cất ra và cho vào khoảng 1,5 ml NaR2RSR2ROR4R bão hòa (trường hợp dung dịch NaR2RSR2ROR4R bão hòa mới pha xong thì chỉ bổ sung 2, 3 giọt vào 1,5 ml nước cất trước rồi mới cho vào buồng đo để tránh làm trơ điện cực), đậy nắp buồng đo, không khuấy cá từ. Chọn OK. Sau đó chờ cho đường biểu diễn ổn định chọn STOP. Lưu ý: Bước này chương trình ghi nhận lượng oxy trong buồng đo bão hòa. • UBước 3:U Khi xuất hiện bảng Oxygen calibration lần 3 (có khuyến cáo của chương trình: Establish “air line” in chamber tương tự bước 1), rút hết NaR2RSR2ROR4R và rửa nhiều lần buồng đo bằng nước cất. Sau đó cho nước cất vào, đậy nắp không khuấy cá từ. Chờ cho tới khi đường biểu diễn ổn định chọn STOP. Kết thúc quá trình chuẩn điện cực (chọn OK). Và bắt đầu cho 1,5 ml mẫu vào đo. - Đo cường độ quang hợp: khi đo quang hợp có thể bổ sung 2-3 giọt KHCOR3R hoặc NaHCOR3R, lắp đèn chiếu sáng (hình 5) và nhấp vào nút on/off ở góc phải trên màn hình, chỉnh cường độ cho phù hợp (thường nhập giá trị 500). Nhấn Start để bắt đầu ghi nhận đồ thị và Stop để dừng. Thời gian đo khoảng 3-10 phút (tùy mẫu), lúc đó đường biểu diễn sự gia tăng oxygen tuyến tính và hệ số góc (rate) là số mol oxy gia tăng trong 1 phút. Hình: lắp đèn chiếu sáng vào buồng đo khi đo quang hợp - Đo cường độ hô hấp: Tắt nguồn sáng và thao tác tương tự đo quang hợp. Thời gian đo khoảng 3-5 phút, lúc đó đường biểu diễn sự gia giảm oxygen tuyến tính và hệ số góc (rate) là số mol oxy giảm trong 1 phút. 4. Ghi nhận kết quả Chọn menu Tools  Get rate để vào chế độ ghi nhận số liệu từ biểu đồ. Chọn đoạn tuyến tính (di chuyển 2 mũi tên đỏ) trên biểu đồ hoặc chọn nút options và nhập khoảng thời gian cần lấy số liệu. Nên chọn đoạn tuyến tính vì đây là giá trị quang hợp hay hô hấp ổn định của mẫu. Click lên đoạn vừa chọn (hoặc nhấn Options, nhập khoảng thời gian và chọn OK), máy tính sẽ tính toán và đưa ra số liệu. Chọn OK để ghi nhận số liệu vào bảng. Đây là số liệu trung bình của đoạn vừa chọn. Nếu cần lấy sai số máy theo thời gian thì chọn và lấy số liệu của từng đoạn rồi tính trung bình. Kết quả là hệ số góc (Rate) trên trên bảng rate measurement với đơn vị: µmolOR2R/10cmP2P/phút là số mol Oxygen được phóng thích (quang hợp) hay thu vào (hô hấp) của mẫu trong 1 phút. 5. Cách lưu và mở biểu đồ Nếu xuất hiện bảng Start Recording: Chọn Save để lưu lại đường biểu diễn thành 1 tập tin; chọn append thì đường biểu diễn mới sẽ tiếp nối đường biểu diễn cũ; Chọn Overwrite để xóa đường biểu diễn cũ và bắt đầu đường biểu diễn mới. Chọn Files  Save để lưu biểu đồ. Đánh vào ô file name tên của tập tin muốn lưu và chọn Save. Nhập ghi chú về tập tin này và chọn OK để hoàn tất quá trình lưu. Tương tự, chọn Files  Load để lấy lại biểu đồ. Có thể lấy số liệu từ biểu đồ như bước ghi nhận kết quả. Chọn tập tin cần lấy và chọn Open. 6. Lưu ý khi sử dụng máy - Việc chuẩn bị điện cực chỉ do 1 người hiểu rõ về máy làm. Không tự ý chuẩn bị điện cực. Nếu điện cực có vấn đề cần báo cho người quản lý máy. - Sau khi đo xong, nếu hôm sau vẫn tiếp tục đo thì rửa sạch buồng đo và cho 1,5 ml nước cất vào buồng đo để giữ điện cực. - Nếu không sử dụng máy nữa, rửa sạch buồng đo, cho cá từ vào lọ, tháo và rửa điện cực lau khô, giữ trong túi hút ẩm. Dọn vệ sinh sau khi đo xong, đậy nắp đựng máy Hansatech. Phụ lục 6 Phụ lục 7