Nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen

MỞ ĐẦU Hiện nay, trên thế giới việc chuyển gen vào thực vật đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong cải tạo giống cây trồng. Đã có hơn 50 loại gen được chuyển vào thực vật và có khoảng 400 loại cây trồng chuyển gen đã được kiểm tra ngoài đồng ruộng. Nhiều sản phẩm chuyển gen đang được tiêu thụ trên thị trường như bông, ngô, đậu tương có khả năng kháng sâu, kháng chất diệt cỏ, cải dầu có thành phần dầu thay đổi, cà chua chín chậm v.v Ở nước ta, một số phòng thí nghiệm đã và đang áp dụng kỹ thuật chuyển gen để cải tạo nhiều loại giống cây trồng khác nhau. Trong đó, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học là một trong những đơn vị đang tiến hành theo hướng nghiên cứu này. Cho đến nay, phòng đã tạo ra được một số dòng cây chuyển gen và đang đưa vào phân tích. Bên cạnh những đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển như chịu hạn, mặn, kháng sâu, kháng bệnh, những phân tích phân tử cũng được tiến hành. Cho đến nay, kết quả phân tích phân tử cây chuyển gen chỉ dừng lại bằng sử dụng kỹ thuật PCR. Lai Southern là kỹ thuật quan trọng, có giá trị khẳng định sự có mặt của gen chuyển. Ngoài ra, với kỹ thuật này mới có thể đánh giá chính xác số điểm gắn của gen chuyển, thông qua đó có thể phân tích được sự liên quan giữa mức biểu hiện và kiểu gắn của gen chuyển. Nhằm đưa quy trình lai Southern vào mục đích đánh giá cây chuyển gen, chúng tôi sử dụng các dòng bông kháng sâu làm nguyên liệu nghiên cứu và áp dụng hệ thống phi phóng xạ DIG để kiểm tra phân tích gen CryIA. Bản khoá luận này báo cáo lại những kết quả nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen. Đây là tiền đề cho các phân tích phân tử tiếp theo đối với các cây chuyển gen khác đã và đang được tạo ra.

doc37 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 05/06/2013 | Lượt xem: 1821 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu bước đầu về sử dụng kỹ thuật lai Southern trong phân tích cây chuyển gen, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
h­: - ChÞu chÊt diÖt cá Ng­êi ta dïng gen tæng hîp EPSP chuyÓn vµo c©y trång ®Ó chÞu ®­îc Glyphosphat. NhiÒu loµi thùc vËt ®· biÕn n¹p vµ ®ang ®­îc thö nghiÖm nh­ cñ c¶i ®­êng, ®Ëu t­¬ng, nho. c¶i h¹t dÇu, b«ng, cµ chua vµ thuèc l¸. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen chÞu thuèc diÖt cá khèng chÕ cá d¹i tèt h¬n, gãp phÇn n©ng cao hiÖu qu¶ cña c¸c trang tr¹i nhê tèi ­u ho¸ n¨ng suÊt vµ sö dông hiÖu qu¶ ®Êt trång trät, tiÕt kiÖm thêi gian cho n«ng d©n. Gièng míi nµy hoµn toµn gièng c¸c gièng ®Ëu t­¬ng kh¸c vÒ dinh d­ìng, cÊu t¹o vµ ph­¬ng thøc chÕ biÕn thµnh thùc phÈm vµ thøc ¨n gia sóc. §­îc trång nhiÒu ë Achentina, óc, Braxin, Canada, EU, NhËt b¶n, Hµn Quèc, Mexico, Nga, Thôy §iÓn, Mü vµ uruguay. C¶i dÇu chÞu thuèc diÖt cá ®­îc trång t¹i óc, Canada vµ Mü. - Kh¸ng bÖnh virus Ng­êi ta ®ang nghiªn cøu c¸c gen kh¸ng bÖnh virus ë thùc vËt. Ngoµi ra ®ang nghiªn cøu kh¶ n¨ng kh¸ng virus b»ng biÕn n¹p gen tõ ®éng vËt. §u ®ñ ®­îc chuyÓn gen cña virus m· ho¸ cho protein vá cña virus ®èm vßng. Protein nµy t¹o cho c©y kh¶ n¨ng tù b¶o vÖ chèng l¹i bÖnh ®èm vßng. Mét gen tõ nguån bÖnh ®· ®­îc sö dông ®Ó kh¸ng l¹i chÝnh nã. C©y khoai t©y ®· ®­îc chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y xo¨n l¸, c©y bÝ chuyÓn gen gióp kh¸ng virus g©y bÖnh. - Kh¸ng c¸c loµi g©y h¹i ChuyÓn gen ®éc tè tõ Bacillus thuringiensis (Bt) ®Ó t¹o gièng chÞu c«n trïng cã h¹i. C©y b«ng chuyÓn gen Bt kh¸ng s©u ®ôc qu¶ vµ ¨n l¸, ®­îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n­íc nh­ Trung quèc, Nam phi, Achentina,... C¸c c©y b«ng, lóa mang gen chuyÓn nµy cã kh¶ n¨ng chèng chÞu s©u ®ôc th©n rÊt tèt. - Chèng chÞu c¸c bÖnh nÊm Ng­êi ta ®ang ph©n lËp gen 1,3-glucanase (m· hãa enzym ph©n hñy thµnh tÕ bµo cña c¸c mÇm bÖnh nÊm) tõ thùc vËt kh¸ng bÖnh ®Ó chuyÓn vµo c¸c loµi c©y mÉn c¶m. - Thay ®æi thµnh c¸c axit bÐo Ng­êi ta lµm t¨ng hµm l­îng axit bÐo ®¬n kh«ng no vµ c¸c thµnh phÇn dÇu thùc vËt. C©y ®Ëu t­¬ng chuyÓn gen axit oleic cã hµm l­îng axit oleic cao, mét axit bÐo cã mét liªn kÕt kh«ng no. Theo c¸c nhµ dinh d­ìng th× chÊt bÐo kh«ng no ®­îc xem lµ tèt h¬n so víi chÊt bÐo no, ®­îc t×m thÊy ë thÞt bß, lîn, phomat vµ mét sè thøc ¨n th­êng ngµy kh¸c. C¶i dÇu chuyÓn gen cã hµm l­îng Laurate cao, ®­îc dïng trong c«ng nghiÖp thùc phÈm ®Ó lµm líp phñ ngoµi kÑo chocolate, b¸nh ngät, líp kem, b¬, ®­îc trång ë Canada vµ Mü. C¶i dÇu cã hµm l­îng axit oleic cao ®­îc trång ë Canada. - Lµm chËm chÝn qu¶ ë cµ chua C©y cµ chua mang mét gen chuyÓn lµm chËm qu¸ tr×nh lµm mÒm qu¶ tù nhiªn khi qu¶ chÝn. §©y lµ lo¹i thùc phÈm chuyÓn gen ®Çu tiª n ®­îc s¶n xuÊt ë c¸c n­íc ph¸t triÓn. Gièng cµ chua nµy cã thêi gian l­u trªn gi¸ b¸n hµng dµi h¬n. Ngoµi ra gièng chuyÓn gen cã c¸c ®Æc tÝnh nh­: - §iÒu chØnh sinh tæng hîp tinh bét ®Ó lµm chñ møc tinh bét trong s¶n phÈm. - C¶i thiÖn chÊt l­îng ®¹m tÝch lòy trong h¹t. - T¨ng hµm l­îng vitamin A trong h¹t g¹o, [7]. ë n­íc ta, mét sè phßng thÝ nghiÖm lín ®· vµ ®ang ®i s©u vµo c«ng t¸c c¶i thiÖn gièng c©y trång b»ng kü thuËt chuyÓn gen. T¹i phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, c¸c b­íc c¬ b¶n trong giai ®o¹n chuÈn bÞ ®· ®­îc thùc hiÖn. §ã lµ: Thu thËp vµ cÊt gi÷ c¸c nguån gen cã gi¸ trÞ nh­ gen CryIA(b), CryIA(c), gen øc chÕ tryspin ®Ó trõ s©u, gen Xa21 chèng b¹c l¸ vi khuÈn, gen chÞu l¹nh, gen protein giµu tryptopha. ThiÕt kÕ c¸c vector mang gen chuyÓn vµ thö nghiÖm thµnh c«ng c¸c kü thuËt chuyÓn gen: gi¸n tiÕp th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens, trùc tiÕp b»ng sóng b¾n gen. §Õn nay, nhiÒu dßng lóa chuyÓn gen Xa21, CryIA(c), ®u ®ñ chuyÓn gen chÝn chËm vµ kh¸ng virus ®èm vßng ®· ®­îc t¹o ra. C¸c dßng c©y chuyÓn gen nµy sÏ ®­îc ®­a vµo ph©n tÝch ph©n tö ChuÈn bÞ thiÕt bÞ ®Ó tiÕn hµnh c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö phôc vô viÖc ®¸nh gi¸ theo dâi c©y chuyÓn gen nh­ PCR, lai Southern, RFLP, AFPD. Nh­ vËy, cã thÓ tiÕn hµnh chuyÓn gen vµ ®­a kü thuËt nµy vµo c«ng viÖc t¹o gièng c©y trång ë ViÖt Nam [1]. 1.2. C¸c kü thuËt Ph©n tÝch ph©n tö ADN c©y chuyÓn gen Cïng víi c¸c ph©n tÝch vµ ®¸nh gi¸ sù biÓu hiÖn cña gen chuyÓn ë c¸c c©y chuyÓn gen nh­ c¸c chØ tiªu ho¸ sinh, n«ng sinh, møc ®é kh¸ng s©u bÖnh, chèng chÞu c¸c ®iÒu kiÖn ngo¹i c¶nh v.v., ph©n tÝch gen chuyÓn ë møc ph©n tö còng ®­îc tiÕn hµnh song song b»ng nhiÒu kü thuËt kh¸c nhau nh­ PCR, lai Southern, Western blost. Chóng t«i xin giíi thiÖu hai kü thuËt c¬ b¶n vµ quan träng ®Ó ph©n tÝch ph©n tö c©y chuyÓn gen lµ PCR vµ lai Southern. 1.2.1. Kü thuËt PCR Ph­¬ng ph¸p PCR (Polymerase Chain Reaction - ph¶n øng chuçi trïng hîp) do Karl Mullis vµ céng sù ph¸t minh n¨m 1985. Thùc chÊt ®©y lµ mét ph­¬ng ph¸p t¹o dßng ADN invitro kh«ng cÇn cã sù hiÖn diÖn cña tÕ bµo [5], [6]. 1.2.1.1. Nguyªn t¾c cña ph¶n øng PCR TÊt c¶ c¸c ADN polymeraza khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch ADN míi tõ m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng ®o¹n måi. Måi lµ nh÷ng ®o¹n ADN ng¾n cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ xung víi mét ®Çu cña m¹ch khu«n tõ ®ã ADN polymeraza sÏ g¾n c¸c dNTP tù do ®Ó nèi dµi ®o¹n måi, h×nh thµnh m¹ch míi. Do ®ã, nÕu ta cung cÊp hai ®o¹n måi ®ÆchiÖu b¾t cÆp bæ xung víi 2 ®Çu cña mét tr×nh tù ADN (måi xu«i vµ måi ng­îc) ta sÏ tæng hîp ®o¹n ADN n»m gi÷a 2 måi ®ã [5], [9]. 1.2.1.2. Thµnh phÇn ph¶n øng PCR: Thµnh phÇn cña mét ph¶n øng PCR bao gåm ADN khu«n tøc lµ ®o¹n tr×nh tù ADN cÇn ®­îc nh©n lªn; 2 ®o¹n måi, mçi måi dµi 18-24 nucleotid; ADN polymeraza (th­êng hiÖn nay sö dông lµ Taq polymeraza - lµ mét lo¹i enzym chÞu nhiÖt); bèn lo¹i deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) vµ dung dÞch ®Öm vµ ion Mg2+ [12]. Ph¶n øng PCR tèi ­u khi ADN khu«n tinh s¹ch, nh­ng mét ­u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p PCR lµ cho phÐp nh©n c¶ nh÷ng mÉu ADN kh«ng ®­îc b¶o qu¶n tèt, ®· bÞ ph¸ huû tõng phÇn nh­ nh÷ng vÕt m¸u ®Ó l©u ngµy, tinh dÞch ®· kh«, ho¸ th¹ch, tãc, mãng tay cña ng­êi ®· chÕt... Måi lµ chØ tiªu quan träng nhÊt ®Ó ®¹t ®­îc mét sù khuyÕch ®¹i mét ®o¹n ADN ®Æc tr­ng. Måi lu«n g¾n víi ADN khu«n ë ®Çu 3’ vµ ADN Polymeraza kÐo dµi chuçi tæng hîp theo chiÒu 5’ ® 3’ [5]. Tr×nh tù måi, nhiÖt ®é g¾n måi vµ nång ®é trong ph¶n øng PCR lµ nh÷ng nh©n tè quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña ph¶n øng PCR. ViÖc chän måi còng ph¶i tu©n thñ mét sè nguyªn t¾c sau: Tr×nh tù cña måi ®­îc chän sao cho kh«ng cã sù b¾t cÆp bæ sung gi÷a måi “xu«i” vµ måi “ng­îc”, vµ còng kh«ng cã nh÷ng cÊu tróc “kÑp tãc” do sù b¾t cÆp bæ xung gi÷a c¸c phÇn kh¸c nhau cña mét måi. Tm cña måi xu«i vµ måi ng­îc kh«ng c¸ch biÖt nhau mét c¸ch qu¸ xa. C«ng thøc nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm=81,5 + 16,6(log10[J+] + 0,41(%G+C) - (600/I) - 0,63(% FA) Trong ®ã [J+] : Nång ®é c¸c cation ho¸ trÞ 1 FA : ChÊt dïng g©y biÕn tÝnh ADN I : ChiÒu dµi måi C¸c måi chän ph¶i ®Æc tr­ng cho tr×nh tù ADN cÇn khuyÕch ®¹i kh«ng trïng víi c¸c tr×nh tù lÆp l¹i trªn gen. Tr×nh tù n»m gi÷a 2 måi kh«ng qu¸ lín. Ph¶n øng PCR sÏ tèi ­u nÕu ®o¹n tr×nh tù nhá h¬n 1kb [5], [12]. Tr­íc ®©y trong ph¶n øng PCR ng­êi ta th­êng dïng ADN polymeraza I t¸ch chiÕt tõ E. coli vµ ADN polymeraza cña Phage T4. V× ®©y lµ enzyme kh«ng chÞu nhiÖt nªn thao t¸c phøc t¹p vµ hiÖu qu¶ thÊp (ph¶i thªm enzyme míi vµo sau mçi lÇn biÕn tÝnh v× enzyme cò ®· bÞ nhiÖt ph©n huû). ViÖc ph¸t hiÖn ra c¸c ADN polymeraza chÞu nhiÖt nh­ Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza, ®· cho phÐp qu¸ tr×nh nh©n b¶n ®­îc thùc hiÖn mét c¸ch tù ®éng ho¸. Th«ng dông nhÊt lµ Taq Polymerse ®­îc t¸ch ra tõ vi khuÈn chÞu nhiÖt Thermus aquaticus sèng ë suèi n­íc nãng 94-1000C. Enzym nµy cã ho¹t tÝnh cao nhÊt ë nhiÖt ®é 70-800C, cã träng l­îng ph©n tö lµ 94kD, gåm 832 axit amin do gen cã 2499 cÆp baz¬ tæng hîp nªn [28]. N¨m 1988, Saiki ®· chØ ra r»ng ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza gi¶m 50% sau 130 phót ë nhiÖt ®é 92,50C, sau 40 phót ë 950C vµ sau 5-6 phót ë 970C. MÆt kh¸c, nång ®é ion Mg2+ vµ d NTP trong hçn hîp ph¶n øng còng ¶nh h­ëng rÊt nhiÒu ®Õn ho¹t tÝnh cña Taq polymeraza [14], [28]. Ngµy nay, nhiÒu enzym polymeraza chÞu nhiÖt kh¸c ®· ®­îc ®­a ra thÞ tr­êng víi nhiÒu chøc n¨ng chuyªn biÖt hay hoµn thiÖn h¬n. Tth pal lµ mét enzyme t¸ch tõ Thermus thermophilus cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh­ mét enzyme phiªn m· ng­îc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ Mg2+ , mÆt kh¸c Tth pal l¹i xóc t¸c ph¶n øng khuyÕch ®¹i ADN nÕu trong m«i tr­êng cã ADN khu«n vµ Mg2+. Bèn lo¹i nucleotit th­êng ®­îc sö dông ë nång ®é lµ 20 – 200 mM/mçi lo¹i nucleotit, nÕu sù mÊt c©n b¨ng trong thµnh phÇn c¸c nucleotit xÈy ra sÏ dÉn tíi c¸c lçi sao chÐp cña ADN polymeraza. Nång ®é ion Mg2+ còng lµ nh©n tè ¶nh h­ëng m¹nh ®Õn ph¶n øng PCR. Tuy nhiªn kh«ng cã mét quy luËt chung cho vÊn ®Ò nµy. Nång ®é tèi ­u ph¶i ®­îc x¸c ®Þnh cho tõng ph¶n øng qua thö nghiÖm. Trong thùc tÕ sè chu kú cña ph¶n øng PCR kh«ng v­ît qu¸ 40 chu kú. Së dÜ nh­ vËy lµ v× ph¶n øng PCR diÔn ra qua 2 giai ®o¹n. Trong giai ®o¹n ®Çu sè l­îng b¶n sao t¨ng theo cÊp sè nh©n tû lÖ víi l­îng mÉu ban ®Çu. Sau ®ã hiÖu qu¶ khuyÕch ®¹i gi¶m do c¸c nguyªn nh©n sau: Ho¹t tÝnh cña polymeraza gi¶m theo thêi gian ë nhiÖt ®é cao Sù c¹n kiÖt c¸c thµnh phÇn cña ph¶n øng. C¸c b¶n sao võa ®­îc tæng hîp kh«ng kÕt hîp víi måi mµ kÕt hîp víi nhau Sù xuÊt hiÖn cña c¸c s¶n phÈm phô øc chÕ ph¶n øng [5]. 1.2.1.3. C¸c b­íc cña ph¶n øng PCR Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi gåm nhiÒu chu kú nèi tiÕp nhau mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n sau: Giai ®o¹n 1: BiÕn tÝnh ADN ë nhiÖt ®é tõ 94-950C trong thêi gian ng¾n 30 gi©y ®Õn 1 phót. §©y lµ giai ®o¹n m¹ch ®«i t¸ch thµnh 2 m¹ch ®¬n. Giai ®o¹n 2: G¾n måi, nhiÖt ®é ®­îc h¹ thÊp (thÊp h¬n Tm cña måi) cho phÐp c¸c måi b¾t cÆp víi khu«n. NhiÖt ®é nµy dao ®éng tõ 40-600C tuú thuéc vµo Tm cña måi mµ thêi gian b¾t cÆp kh¸c nhau. §©y lµ giai ®o¹n quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Giai ®o¹n 3: Giai ®o¹n kÐo dµi. NhiÖt ®é t¨ng lªn 72 0C. §ã lµ ®iÒu kiÖn ®Ó cho Taq polymeraza ho¹t ®éng tæng hîp kÐo dµi m¹ch theo nguyªn t¾c bæ xung tõ 2 ®Çu sîi khu«n ban ®Çu. Theo Geifand vµ White (1990), tèc ®é tæng hîp cña Taq lµ 150 nucleotit/gi©y ë nhiÖt ®é 75oC - 80oC; 60 nucleotit/gi©y ë 70oC; 24 nucleotit/gi©y ë 55oC; 1,5 nucleotit/gi©y ë 37oC vµ ë nhiÖt ®é 22oC chØ cßn 0,25 nucleotit/gi©y [14]. Sau mét chu kú gåm ba giai ®o¹n nh­ trªn, mét ph©n tö ADN khu«n ®­îc nh©n lªn thµnh hai, c¸c ®o¹n ADN võa ®­îc nh©n trong chu kú l¹i lµm khu«n cho chu kú nh©n b¶n tiÕp theo v× hai ®Çu tËn cïng cña s¶n phÈm bæ sung víi måi. Do ®ã sau mçi chu kú sè l­îng ®o¹n ADN ®­îc tæng hîp sÏ t¨ng lªn gÊp ®«i vµ nh­ vËy sau n chu kú nh©n b¶n sÏ t¹o ra 2n b¶n ADN tõ mét khu«n ban ®Çu [6]. 1.2.1.4. øng dông cña kü thuËt PCR PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch bé genom cña ®éng vËt vµ thùc vËt v× nã cho phÐp t¹o ra mét l­îng lín c¸c ®o¹n tr×nh tù ®Æc hiÖu. PCR cã nhiÒu øng dông vµo c¸c môc ®Ých kh¸c nhau, nh­ viÖc x¸c ®Þnh tr×nh tù cña ADN ®­îc nh©n b¶n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen. ph©n tÝch tiÕn ho¸, ph©n tÝch sù ®a d¹ng di truyÒn ë møc ®é ADN trong vµ gi÷a c¸c quÇn thÓ. HiÒn nay PCR ®­îc xem lµ mét ph­¬ng ph¸p nhanh vµ t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n ®Ó ph©n tÝch s¬ bé c©y chuyÓn gen [1]. 1.2.2. Kü thuËt lai Southern vµ øng dông 1.2.2.1. Nguyªn lý cña lai Southern Kü thuËt lai ph©n tö (molecular hybridization) nãi chung vµ lai Southern nãi riªng dùa trªn nguyªn lý lµ lai ph©n tö gi÷a mÉu dß ADN (ARN) víi c¸c ph©n tö ADN (ARN, protein) ®­îc l­u gi÷ trªn gi¸ thÓ ®Ó dß t×m c¸c ph©n tö sinh häc ®Æc tr­ng. Kü thuËt nµy cã hiÖu qu¶ cao trong nghiªn cøu ph¸t hiÖn c¸c ®¹i ph©n tö sinh häc cã cÊu tróc ph©n tö phøc t¹p. Nã cã thÓ ¸p dông cho mäi lo¹i ®¹i ph©n tö sinh häc cã kh¶ n¨ng g¾n kÕt vµo gi¸ thÓ l­u gi÷ nh­ mµng nitrocellulose, mµng nylon, mµng giÊy cellulose, nh­ng vÉn duy tr× ®­îc kh¶ n¨ng g¾n kÕt víi c¸c nhãm chÊt hiÓn thÞ kh¸c [1]. §èi víi ADN, ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc Edwind M. Southern x©y dùng vµ thö nghiÖm thµnh c«ng vµo n¨m 1975. ë ®©y, qu¸ tr×nh lai ph©n tö x¶y ra khi hai ®o¹n m¹ch ®¬n ADN b¾t cÆp vµ g¾n kÕt víi nhau trªn nguyªn t¾c bæ xung cho nhau. C¸c b­íc tiÕn hµnh trong kü thuËt nµy cã thÓ ®­îc tãm t¾t nh­ sau: ADN bé gen ®­îc c¾t thµnh nh÷ng ®o¹n cã kÝch th­íc kh¸c nhau b»ng mét hay nhiÒu enzym giíi h¹n (RE) vµ ®­îc ph©n t¸ch b»ng ®iÖn di trªn b¶n gel. ADN ®­îc biÕn tÝnh ngay trªn b¶n gel råi ®­îc thÊm truyÒn lªn mµng lai. Trong qu¸ tr×nh thÊm truyÒn vÞ trÝ c¸c ®o¹n ADN trªn mµng lai ®­îc gi÷ nguyªn nh­ trªn b¶n gel. ADN cè ®Þnh trªn mµng ®­îc ®em lai víi mÉu dß ADN cã ®¸nh dÊu b»ng phãng x¹ hoÆc ho¸ häc . Sau qu¸ tr×nh lai ng­êi ta röa mµng lai ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng b¾t cÆp. Cuèi cïng ng­êi ta dïng kü thuËt phãng x¹ hoÆc ho¸ häc tù ghi ®Ó ®Þnh vÞ c¸c ph©n tö lai vµ hiÓn thÞ trªn phim thµnh tõng b¨ng d¹ng v¹ch ngang. Kü thuËt nµy ®­îc gäi lµ kü thuËt ph©n tÝch mµng thÊm chuyÓn Southern (Southern blot analysis), gäi t¾t lµ lai Southern [1], [5]. Khi øng dông lai Southern ®èi víi c¸c ARN, kü thuËt nµy ®­îc ®Æt tªn lµ lai Northern. B­íc ph¸t hiÖn c¸c b¨ng ARN ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua lai víi mÉu ADN hoÆc ARN ®¸nh dÊu. Cßn khi tiÕn hµnh kü thuËt nµy víi protein th× gäi lµ lai Western ®Ó ph¸t hiÖn c¸c b¨ng protien b»ng kh¸ng thÓ ®¸nh dÊu. Tíi nay ®· cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p c¶i tiÕn, h×nh thµnh nhiÒu kü thuËt phèi hîp nh­ Southwestern, ph¸t hiÖn b¨ng protein b»ng ADN ®¸nh dÊu hoÆc Western xa, dïng mÉu protein kh«ng ph¶i kh¸ng thÓ (non-antibody) [5]. VÒ nguyªn t¾c, kü thuËt thÊm chuyÓn kh«ng thay ®æi nhiÒu tõ khi ®­îc ph¸t minh, nh­ng chñng lo¹i c¸c mµng vµ kü thuËt ph¸t hiÖn c¸c lo¹i ®¹i ph©n tö th«ng qua lai ®¸nh dÊu hay miÔn dÞch ®¸nh dÊu kÌm víi c¸c bé kit lu«n ®­îc c¶i tiÕn cho tiÖn lîi vµ an toµn. Mµng nitrocellulose ®­îc dïng rÊt nhiÒu, nh­ng gÇn ®©y trong hai lo¹i mµng nylon trung tÝnh vµ mµng tÝch ®iÖn th× lo¹i mµng sau do tÝch ®iÖn nªn cã søc g¾n ADN cao h¬n. §­¬ng nhiªn trong kü thuËt Western, chÊt liÖu nitrocellulose vÉn ®ang ®­îc sö dông réng r·i, ngoµi ra cßn cã mµng polyvinylidene diflouride (PVDF) vµ mµng nylon [6]. ViÖc ph¸t hiÖn c¸c ph©n tö trªn mµng ®­îc tiÕn hµnh th«ng qua kü thuËt ®¸nh dÊu. Trong nhiÒu n¨m kü thuËt ®¸nh dÊu b»ng ®ång vÞ phãng x¹ ®· ®­îc øng dông mét c¸ch réng r·i, phæ biÕn nhÊt lµ g¾n c¸c nucleotide víi c¸c ®ång vÞ phãng x¹ 32P d¹ng 32P-dNTP. ¦u ®iÓm lín cña ph­¬ng ph¸p phãng x¹ nµy lµ cã ®é nh¹y rÊt cao, cã thÓ ph¸t hiÖn ®­îc vÕt ADN ë møc ng (10-9 g) vµ thÊp h¬n. Tuy nhiªn ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu phãng x¹ ®ßi hái phßng thÝ nghiÖm cã nh÷ng thiÕt bÞ kiÓm tra vµ b¶o ®¶m an toµn phãng x¹ ®ång bé. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y kü thuËt phi phãng x¹ (non-radioactive) hay kü thuËt ®¸nh dÊu l¹nh (cold labelling) ®ang tõng b­íc thay thÕ kü thuËt phãng x¹. Trong ®ã næi bËt lµ kü thuËt ph¸t quang ho¸ häc kÝch ho¹t (Enhancing Chemical Luminecsence, ECL) vµ kü thuËt sö dông ®¸nh dÊu víi digoxigenin (DIG) [1]. 1.2.2.2. HÖ thèng phi phãng x¹ DIG HÖ thèng phi phãng x¹ DIG lµ ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu vµ ph¸t hiÖn axÝt nucleic rÊt nh¹y vµ h÷u hiÖu. HÖ thèng nµy mang nhiÒu tÝnh ­u viÖt nh­ an toµn, mÉu dß ®¸nh dÊu cã ®é bÒn cao vµ dung dÞch lai cã thÓ dïng l¹i vµi lÇn. So víi ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu b»ng chÊt phãng x¹, ph­¬ng ph¸p nµy còng cã thuËn lîi nh­ ®é nh¹y cao vµ ph«ng nÒn s¹ch. Nh­ng l¹i tr¸nh ®­îc nh÷ng bÊt lîi nh­ sù rñi ro trong khi sö dông chÊt phãng x¹, chÊt th¶i ®éc h¹i, thêi gian hiÖn phim l©u, tÝnh kh«ng bÒn cña mÉu dß ®· ®¸nh dÊu. H×nh 1: CÊu tróc cña Alkali-labile Digoxigenin (DIG) - dUTP Trong hÖ thèng DIG, mÉu dß lµ ADN, ARN ®­îc ®¸nh dÊu b»ng c¸ch g¾n víi digoxigenin (DIG). §èi víi mÉu dß lµ ADN, yÕu tè DIG-11-dUTP ®­îc dïng ®Ó ®¸nh dÊu vµ ®­îc g¾n kÕt víi ph©n tö ADN th«ng qua ph¶n øng PCR hay lai víi c¸c ®o¹n nucleotit ngÉu nhiªn (h×nh 1). ë ph­¬ng ph¸p thø nhÊt (h×nh 2a), víi DIG-dUTP cã trong hçn hîp ph¶n øng PCR, s¶n phÈm mÉu dß ®­îc t¹o ra rÊt ®Æc hiÖu vµ cã ®é nh¹y cao. ChØ cÇn 10 pg ®èi víi ADN plasmit hoÆc 10 ng ®èi víi ADN genom lµ ®ñ ®Ó t¹o ra mÉu dß lai Southern. Ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu ADN b»ng PCR ®Æc biÖt thuËn lîi trong dß t×m b¶n gen ®¬n lÎ trªn mµng thÊm genom hay ARN th«ng tin hiÕm trªn mµng thÊm Northern. Trong ph­¬ng ph¸p thø hai (h×nh 2b), enzym Klenow sao chÐp khu«n mÉu ADN víi sù cã mÆt cña c¸c ®o¹n måi 6 nucleotit ngÉu nhiªn, c¸c nucleotit tù do trong ®ã cã DIG-dUTP. Trung b×nh cø 20-25 nucleotit trªn m¹ch ADN míi tæng hîp cã mét ph©n tö DIG g¾n vµo. Nh­ vËy, mÉu dß t¹o ra ®­îc ®¸nh dÊu ®ång ®Òu, rÊt nh¹y, cã thÓ dß t×m ®Ých trong 0.10-0.03 pg ADN. S¶n phÈm mÉu dß lµ tæ hîp cña c¸c ®o¹n cã ®é dµi kh¸c nhau. Kh«ng gièng nh­ ®¸ng dÊu b»ng PCR, ph­¬ng ph¸p nµy ®ái hái ph¶i cã khu«n mÉu ADN rÊt s¹ch. TÝn hiÖu tõ mÉu dß sau khi ®· lai víi axit nucleic trªn mµng ®­îc ph¸t hiÖn nhê kü thuËt ho¸ miÔn dÞch. §ã lµ ph¶n øng liªn kÕt gi÷a kh¸ng thÓ cña Digoxigenin vµ Digoxigenin g¾n trong mÉu dß. TiÕp theo, c¸c ph©n tö liªn kÕt nµy ®­îc nh×n thÊy nhê vµo ph¶n øng víi hîp chÊt t¹o s¾c hoÆc ph¸t quang. C¸c hîp chÊt t¹o s¾c t¹o ra tÝn hiÖu mÇu trùc tiÕp trªn mµng. Cßn c¸c hîp chÊt ph¸t quang cã ®é nh¹y cao th× s¶n sinh ra ¸nh s¸ng r»ng cã thÓ ghi nhËn l¹i trªn phim X-quang gièng nh­ ë ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÊu b»ng chÊt phãng x¹ 32P hay 35S [16]. DIGG dUTP DIG dUTP DIG DIG DIG + Taq ADN polymeraza + Måi + Klenow a b H×nh 2: C¸c ph­¬ng ph¸p ®¸nh dÉu cña DIG: a: §¸nh dÊu b»ng PCR, b: §¸nh dÊu b»ng c¸c ®o¹n 6 nucletit ngÉu nhiªn vµ DIG 1.2.2.3. øng dông cña kü thuËt lai Southern Kü thuËt lai Southern lµ mét trong nh÷ng kü thuËt sinh häc ph©n tö rÊt quan träng vµ ®­îc sö dông nhiÒu trong c¸c ph©n tÝch ph©n tö nh­: LËp b¶n ®å giíi h¹n cña mét gen Ph¸t hiÖn c¸c ®a h×nh ®é dµi (fragment polymorphism) cña cïng mét gen ë c¸c chñng kh¸c hay gi÷a c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau qua sù so s¸nh b¶n ®å giíi h¹n gi÷a chóng Ph¸t hiÖn c¸c ®ét biÕn mÊt ®o¹n, ®ét biÕn ®iÓm hay t¸i tæ hîp trªn mét gen v× chóng lµm thay ®æi b¶n ®å giíi h¹n Ph¸t hiÖn sinh vËt chuyÓn gen, ®¸nh gi¸ sè l­îng b¶n gen vµ ®iÓm g¾n cña gen chuyÓn. Trong b¶n luËn v¨n nµy chóng t«i ®i s©u vµo c¸c chi tiÕt tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ph©n tÝch ph©n tö c¸c dßng c©y b«ng chuyÓn gen th«ng qua kü thuËt lai Southern b»ng hÖ thèng DIG [1]. 1.3. nghiªn cøu c¶i t¹o c©y b«ng ë ViÖt Nam 1.3.1. Sù ph¸t triÓn trong s¶n xuÊt vµ nghiªn cøu c¶i t¹o c¸c gièng b«ng ë ViÖt Nam Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, s¶n xuÊt b«ng ë ViÖt Nam kh«ng ngõng t¨ng tr­ëng vÒ diÖn tÝch, n¨ng suÊt vµ s¶n l­îng. §Æc biÖt, trong vô trång b«ng 2001/2002, diÖn tÝch ®¹t xÊp xØ 30.000 ha, cao nhÊt tõ tr­íc ®Õn nay, t¨ng h¬n 20% so víi n¨m 2000 vµ gÊp 3 lÇn so víi c¸c n¨m tõ 1990 ®Õn 1996. §ång thêi s¶n l­îng ®¹t trªn 10.000 tÊn x¬, gÊp 5 lÇn so víi c¸c n¨m tõ 1990 ®Õn 1996. Cã thÓ kh¼ng ®Þnh sù t¨ng tr­ëng kh«ng ngõng vÒ mäi mÆt cña ngµnh b«ng ë n­íc ta trong thêi gian qua cã sù ®ãng gãp quan träng cña c«ng t¸c nghiªn cøu khoa häc, t¹o ®iÒu kiÖn cho s¶n xuÊt b«ng thùc sù ®em l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ cao vµ ®ñ søc c¹nh tranh víi c¸c c©y trång kh¸c trong hÖ thèng n«ng nghiÖp n­íc ta. Trong c¸c thµnh tùu cña c«ng t¸c nghiªn cøu c©y b«ng cã thÓ kÓ ®Õn viÖc x©y dùng ®­îc ng©n hµng gen c©y b«ng gåm h¬n 1.800 mÉu gièng, l­u gi÷ vµ cung cÊp nguån vËt liÖu khëi ®Çu phong phó cho c«ng t¸c gièng. NhiÒu dßng, gièng b«ng thuÇn ®· ®­îc t¹o ra ®Ó lµm bè mÑ cho s¶n xuÊt h¹t gièng lai. Næi bËt lµ tõ n¨m 1995, ®· lai t¹o vµ ®­a vµo s¶n xuÊt thµnh c«ng 3 gièng lai ®¬n F1 (L18, VN20 vµ VN35). C¸c gièng nµy ®Òu cã ­u thÕ lai cao vµ æn ®Þnh, chèng chÞu ®­îc s©u bÖnh h¹i vµ ngo¹i c¶nh bÊt lîi, chÊt l­îng x¬ ®¹t yªu cÇu c«ng nghiÖp dÖt, gãp phÇn t¹o nªn b­íc nh¶y vät vÒ diÖn tÝch, n¨ng suÊt vµ s¶n l­îng. Quy tr×nh s¶n xuÊt h¹t gièng lai ®­îc x©y dùng hoµn thiÖn cho n¨ng suÊt h¹t cao (1,5 tÊn h¹t/ha) víi chÊt l­îng ®¶m b¶o vµ gi¸ thµnh s¶n xuÊt h¹ chØ b»ng mét nöa so víi gi¸ nhËp tõ n­íc ngoµi. Nghiªn cøu sö dông tÝnh bÊt dôc ®ùc cho thµnh c«ng b­íc ®Çu rÊt kh¶ quan gãp phÇn gi¶m ®¸ng kÓ chi phÝ s¶n xuÊt tõ 20% ®Õn 30% t¹o ®iÒu kiÖn t¨ng n¨ng lùc s¶n xuÊt h¹t gièng víi gi¸ thµnh h¹ [3]. 1.3.2. Nghiªn cøu c©y b«ng chuyÓn gen kh¸ng s©u h¹i C©y b«ng chuyÓn gen kh¸ng s©u (b«ng Bt) chøa mét protein do gen CryIA qui ®Þnh cã nguån gèc tõ vi sinh vËt ®Êt tù nhiªn lµ Bacillus thuringiensis (Bt). Protein Bt ®em l¹i cho c©y b«ng kh¶ n¨ng kh¸ng s©u æn ®Þnh. Do tÝnh kh¸ng s©u cao, protein Bt ®· ®­îc sö dông lµm thuèc trõ s©u sinh häc an toµn trong h¬n 40 n¨m qua. Do vËy, ®èi víi c©y b«ng chuyÓn gen Bt th× nhu cÇu sö dông thuèc trõ s©u ®Ó diÖt nh÷ng s©u bÖnh nµy sÏ ®­îc h¹n chÕ hay gi¶m tèi ®a. Ngoµi ra, c©y b«ng Bt còng lµm gi¶m sù nhiÔm ®éc do nÊm trªn nh÷ng vÕt th­¬ng hë g©y nªn. Víi nh÷ng lîi Ých thùc tiÔn, c©y b«ng Bt ®· nhanh chãng ®­îc sö dông vµ mang l¹i lîi Ých to lín ë nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi. T¹i Trung Quèc, trång b«ng Bt ®· lµm t¨ng gÊp ®«i thu nhËp so víi viÖc trång c©y b«ng th­êng. Nh÷ng n«ng d©n trång nh÷ng gièng b«ng nµy gi¶m ®­îc 20-23% chi phÝ s¶n xuÊt so víi nh÷ng gièng b«ng kh«ng ph¶i lµ c©y b«ng Bt. Sö dông b«ng Bt còng lµm gi¶m l­îng thuèc trõ s©u kho¶ng 47 kg/ha. ë Nam Phi, diÖn tÝch trång b«ng kho¶ng trªn 80.000 ha vµ hµng n¨m bÞ thiÖt h¹i ®¸ng kÓ do s©u bÖnh g©y nªn. Tõ n¨m 1997, ngµy cµng nhiÒu n«ng d©n lùa chän viÖc trång b«ng Bt do lîi Ých nh­ t¨ng n¨ng suÊt vµ gi¶m l­îng thuèc trõ s©u. N¨m 1998-1999, diÖn tÝch trång b«ng Bt lµ 200 ha, n¨m 1999-2000 lªn tíi 789 ha vµ n¨m 2000-2001 lµ 1250 ha. ViÖc trång b«ng Bt ë Achentina còng ®em l¹i nh÷ng lîi Ých t­¬ng tù cho nh÷ng ng­êi n«ng d©n ®Þa ph­¬ng. Trong mïa 1999-2000, lîi nhuËn t¨ng tíi 65,05 ®« la/ha. §iÒu nµy cã ®­îc lµ do t¨ng s¶n l­îng, c¶i thiÖn chÊt l­îng vµ tiÕt kiÖm ®­îc chi phÝ sö dông thuèc trõ s©u. C¸c nghiªn cøu thùc ®Þa ë ch©u ¸ ®Òu kh¼ng ®Þnh nh÷ng lîi Ých cña trång b«ng Bt. Ch¼ng h¹n, ë In®«nªxia, gièng b«ng Bt ­u viÖt h¬n c¸c gièng b«ng ®Þa ph­¬ng ë tÊt c¶ 15 ®Þa ®iÓm ®­îc kiÓm tra vµ hiªn nay ®ang ®­îc trång réng r·i ë Nam Sulawesi. Ngoµi ra c¸c nghiªn cøu ë Ên §é, Philipin còng cho nh÷ng kÕt qu¶ t­¬ng tù [7]. Tõ nh÷ng kinh nghiÖm vÒ b«ng Bt ë Trung Quèc, Nam Phi vµ Achentina, nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ë ViÖt Nam, c¸c c¸n bé ngµnh b«ng ®· chó träng thu thËp, trao ®æi c¸c nguån gièng kh¸ng ®­îc mét sè lo¹i s©u h¹i chÝnh ë trong n­íc. TÊt c¶ c¸c dßng b«ng nµy ®Òu thuéc loµi b«ng luåi (Gosipium hirsutum L.) lµ loµi b«ng trång trät chÝnh t¹i ViÖt Nam. C¸c dßng nµy ®­îc ®¸nh gi¸ lµ kh¸ng ®­îc s©u xanh (Helicoverpa armigera) vµ s©u hång (Spodoptera gossypiella), hai lo¹i s©u h¹i b«ng nguy hiÓm nhÊt ë trong n­íc. Trªn c¬ së nguån vËt liÖu ban ®Çu nh­ trªn, c¸c c¸n bé khoa häc ®· tiÕn hµnh lai nh÷ng dßng b«ng kh¸ng s©u víi gièng trong n­íc vµ ®· chän läc ra ®­îc mét sè dßng cã biÓu hiÖn kh¸ng s©u hång vµ s©u xanh ë ngoµi ®ång ruéng. GÇn ®©y ®· ®­a vµo s¶n xuÊt thö nghiÖm c¸c dßng b«ng lai kh¸ng s©u cña ViÖt Nam nh­ VN15, VN01-4, VN01-2 trong ®iÒu kiÖn mËt ®é s©u cao vÉn cho n¨ng suÊt cao h¬n c¸c gièng lai F1 thÕ hÖ tr­íc. Chóng cã thÓ trång ®­îc ë c¸c vô, vïng cã ¸p lùc s©u lín [2]. §Ó ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ë møc ®é ph©n tö, chóng t«i sö dông kü thuËt PCR vµ lai Southern kiÓm tra sù cã mÆt cña gen CryIA vµ ®¸nh gi¸ sè l­îng c¸c ®iÓm g¾n kÕt vµ b¶n gen chuyÓn trong c¸c dßng b«ng nµy. Qua ®ã, cã thÓ t×m hiÓu mèi liªn quan gi÷a sè l­îng c¸c b¶n gen chuyÓn nÕu cã vµ møc kh¸ng s©u cña c©y b«ng. KÕt qu¶ cña nh÷ng thùc nghiÖm nµy cã ý nghÜa to lín trong viÖc hoµn thiÖn quy tr×nh lai Southern vµ n¾m v÷ng c¸c thao t¸c kü thuËt. §©y lµ b­íc ®Çu trong qu¸ tr×nh ph©n tÝch hµng lo¹t c¸c dßng chuyÓn gen kh¸c nhau mµ phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, viÖn C«ng nghÖ Sinh häc ®· t¹o ra trong thêi gian qua vµ trong t­¬ng lai. Dông cô t¸ch chiÕt ADN: Cèi, chµy sø (nÕu kh«ng cã dïng chÐn vµ ®òa thñy tinh): sè l­îng b»ng hoÆc h¬n l­îng mÉu cÇn t¸ch ADN. H20: n­íc cÊt khö trïng 2 lÇn vµ ®· ®­îc lo¹i ion (deion). CÇn 500ml dïng dÇn. èng effpendox khö trïng 1.5ml giÊy thÊm khö trïng II. Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè ADN tæng sè ®­îc t¸ch tõ l¸ mÇm hay l¸ non cña c©y b«ng tr­ëng thµnh. PCR vµ lai Southern lµ hai kü thuËt ®­îc sö dông ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch ph©n tö gen chuyÓn CryIA ë c¸c c©y b«ng kh¸ng s©u. C¸c ho¸ chÊt, dung dÞch cÇn chuÈn bÞ, thiÕt bÞ sö dông vµ quy tr×nh tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm liªn quan ®­îc nªu chi tiÕt ë d­íi ®©y. 2.2.1. T¸ch chiÕt ADN tõ l¸ b«ng 2.2.1.1. Ho¸ chÊt, dung dÞch vµ thiÕt bÞ Ho¸ chÊt: Tris-HCl; NaCl; EDTA-Na2; Sorbitol; CTAB; Sodium bisulfite (NaH2PO4); Chloroform; Isomylalcohol; Isopropanol ; Ethanol; ARN-ase vµ n­íc cÊt hai lÇn khö ion. C¸c dung dÞch mÑ: 1M Tris-HCl, pH 8.0; 5M NaCl; 0,5 EDTA-Na2; Sorbitol 2M; Chloroform isomylalcohol (CIA 24:1); Isopropanol l¹nh (-20oC); Ethanol 70%; TE ( 10 mM Tris, pH 8,0, 1mM EDTA, pH 8,0). C¸c dung dÞch t¸ch chiÕt ADN: bao gåm dung dÞch ®Öm röa vµ ®Öm chiÕt cã c¸c thµnh phÇn vµ nång ®é ®­îc nªu ë b¶ng 2 vµ 3. B¶ng 2: Dung dÞch ®Öm röa STT Dung dÞch mÑ Nång ®é pha cuèi cïng ThÓ tÝch 10 ml 1 1M Tris HCl, pH8,0 100 mM 1 ml 2 0,5 M EDTA, pH8,0 5 mM 100 ml 3 2 M Sorbitol 0,35 M 1,75 ml 4 Sodiumbisulfite (NaH2PO4) 0,4% 0,04 g 5 H2O - 8.15 ml B¶ng 3: Dung dÞch ®Öm chiÕt STT Dung dÞch mÑ Nång ®é pha cuèi cïng ThÓ tÝch 10 ml 1 1M Tris HCl, pH8,0 200 mM 2 ml 2 0,5 M EDTA, pH8,0 50 mM 1 ml 3 CTAB 2 % 0,2 g 4 5M NaCl 2 M 4 ml 5 H2O - 6 ml ThiÕt bÞ: Nåi æn nhiÖt; m¸y ly t©m (Sigma), m¸y ®iÖn di (Biorad); m¸y soi gel (Gel Doc-Pharmacia), m¸y chôp ¶nh (Poloriod). 2.2.1.2. Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN Thu l¸ vµ b¶o qu¶n l¸ b«ng Nh÷ng h¹t b«ng ch¾c, ®Òu ®­îc ®Æt trong cèc nhùa cã lãt giÊy thÊm. T­íi n­íc Êm kho¶ng 60oC vµ ®Ó trong tñ Êm ë 37oC hai ngµy. Sau ®ã chuyÓn ra ngoµi, t­íi Èm hµng ngµy. Khi mÇm c©y ®­îc hai ngµy tuæi th× thu l¸ mÇm ®Ó t¸ch ADN, nÕu kh«ng t¸ch ADN ngay th× lµm l¹nh trong nit¬ láng vµ b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u (-84oC). C©y mÇm cã thÓ ®­a ra trång trong nhµ l­íi ®Ó thu l¸ non cña c©y tr­ëng ®Ó t¸ch ADN. Trung b×nh 200-300 mg (2l¸) cho thu ho¹ch 5-7 m ADN tæng sè. T¸ch ADN tæng sè tõ l¸ b«ng Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè thùc hiÖn theo ph­¬ng ph¸p Haiwen vµ CS (2001). Chóng t«i l­îc bá b­íc bæ xung sarcosine ë b­íc 2. §Æt mÉu l¸ trong èng eppendorf 2 ml, ®æ nit¬ láng vµ nghiÒn nhanh, kü b»ng ®òa thuû tinh. Bæ sung 0,8 ml ®Öm röa, vortex trong 40 gi©y. Ly t©m 12.000 vßng/phót ë nhiÖt ®é phßng trong 15 phót, lo¹i bá dÞch næi. Cã thÓ lÆp l¹i b­íc 2 vµ 3. Bæ sung 200 ml ®Öm röa, vortex trong kho¶ng 40-60 gi©y, sau ®ã bæ sung thªm 2-4ml RNase (nång ®é 10mg/ml). Bæ sung 800 ml ®Öm chiÕt, ®¶o ng­îc èng eppendorf kho¶ng 20-40 lÇn. ñ ë 65 0C trong 30-45 phót. Bæ sung 600 ml CIA vµ l¾c m¹nh trong 15-20 phót cho ®Õn khi dung dÞch chuyÓn sang mÇu s÷a. Ly t©m 12.000 vßng/phót ë 40C trong 15 phót, nhÑ nhµng hót vµ chuyÓn dÞch chiÕt næi sang èng eppendorf 1,5 ml míi. Cã thÓ lÆp l¹i c¸c b­íc 8 vµ 9 nÕu dÞch chiÕt kh«ng trong. Bæ sung 700 ml Isopropanol l¹nh, gi÷ dÞch chiÕt ë -200C trong 30 phót cã thÓ ®Ó qua ®ªm. Ly t©m 13.000 vßng/phót ë 40C trong 10 phót. Röa cÆn ADN trong Ethanol 70%. Lµm kh« vµ hoµ tan cÆn ADN b»ng 50 ®Õn 100 ml TE hoÆc n­íc khö ion. X¸c ®Þnh hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN b»ng ®o quang phæ Hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña ADN ®­îc x¸c ®Þnh b»ng ®o quang phæ mÉu ADN pha lo·ng 200 lÇn (995 ml n­íc + 5 ml ADN) ë b­íc sãng 260 nm vµ 280 nm theo c¸c c«ng thøc d­íi ®©y: Hµm l­îng ADN = 50 x HSPL x OD260 §é s¹ch ADN = OD260/OD280 Trong ®ã: HSPL : HÖ sè pha lo·ng. 50 : h»ng sè. OD260 : ChØ sè ®o d­îc ë b­íc sãng l = 260 nm. OD280 : ChØ sè ®o ®­îc ë b­íc sãng l = 280 nm. NÕu ®é s¹ch n»m trong kho¶ng tõ 1,8-2,0 th× mÉu ®­îc coi lµ s¹ch. X¸c ®Þnh hµm l­îng vµ chÊt l­îng ADN b»ng ®iÖn di trªn gel agarose Hµm l­îng ADN cã thÓ ®­îc x¸c ®Þnh chÝnh x¸c b»ng ch¹y ®iÖn di trªn gel agarose 0,6% khi so s¸nh víi mét l­îng ADN ®· ®­îc x¸c ®Þnh trªn cïng mét b¶n gel. Trªn b¶n gel ta cßn x¸c ®Þnh ®­îc ®é s¹ch cña ADN nh­ s¹ch ARN, kh«ng chøa c¸c chÊt cao ph©n tö kh¸c vµ kh«ng bÞ gÉy. Ph­¬ng ph¸p nµy rÊt tiÖn lîi cho c¸c thÝ nghiÖm víi ADN. 2.2.2. Ph¶n øng PCR nh©n gen CryIA Thµnh phÇn, nång ®é c¸c hîp chÊt vµ chu k× nhiÖt PCR Thµnh phÇn, nång ®é c¸c chÊt tham gia 25 ml ph¶n øng PCR mµ chóng t«i tiÕn hµnh ®Ó nh©n gen CryIA ®­îc nªu trong b¶ng 4. B¶ng 4: Thµnh phÇn vµ nång ®é c¸c ho¸ chÊt trong ph¶n øng PCR (25ml) STT Thµnh phÇn ph¶n øng Nång ®é cuèi cïng ThÓ tÝch 1 H20 - 2 §Öm PCR (Buffer) 1 X 2,5 ml 3 25mM MgCl2 2,5 mM 2,5 ml 4 2,5mM dNTPs 200 nM 2 ml 5 10 pM Primer 0.4pM 0,5 ml 6 5u/ml Taq pol 0,1 u 0,2 ml 7 ADN 25 ng Tæng thÓ tÝch 25ml Nång ®é AND cña mÉu pha ®Ó lµm sao lÊy 2ml §Ó nh©n gen CryIA(b) vµ CryIA(c) chóng t«i sö dông cÆp måi T1, T2 cã tr×nh tù nh­ sau: T1: 5’-AGGTGCTGGGTTCGTTCTCG-3’. T2: 5’-CATTGTTGTTCTGTGGTGGGATTT-3’. Chu kú nhiÖt cña ph¶n øng PCR lµ: 95 0C , 3 phót. 94 0C , 30 gi©y. 56 0C , 35 gi©y. 72 0C , 1,5 phót. 72 0C , 8 phót. l­u gi÷ ë 4 0C. Tõ b­íc 2 ®Õn b­íc 4 tiÕn hµnh lÆp l¹i 30 chu kú. ThiÕt bÞ: M¸y PCR (Gene Amp* PCR System 9700 - Appied Biosystems); m¸y ®iÖn di (Biorad); m¸y soi gel (Gel Doc-Pharmacia), m¸y chôp ¶nh (Poloriod). 2.2.3. Kü thuËt lai Southern 2.2.3.1. Ho¸ chÊt, dung dÞch vµ thiÕt bÞ Ho¸ chÊt: NaCl; NaOH; Na-Citrat; Tris-HCl; SDS; axit maleic; N-lauroylsarcosine; Tween 20; bé kit lai DIG (DIG-High Prime DNA labeling and Detction Starter Kit II- Roche); n­íc cÊt 2 lÇn vµ khö trïng; thuèc hiÖn phim X-quang. Dung dÞch: Dung dÞch biÕn tÝnh ADN: 0,4M NaOH, 0,6M NaCl, tiÖt trïng. 20X SSC: 3M NaCl, 300 mM Na-Citrat, 5X SSC, 2X SSC vµ 0.5X SSC, tiÖt trïng. §Öm axit maleic: 0,1M axit maleic, 0,15M NaCl, pH7,5 (chØnh pH b»ng tinh thÓ NaOH), tiÖt trïng. N-lauroylsarcosine 10%, SDS 10% läc qua mµng läc v« trïng. Dung dÞch c¶n 10% (10X): nÊu 10 g bét g©y c¶n trong 100 ml ®Öm axit maleic, tiÖt trïng. Dung dÞch nµy cã thÓ cã s½n trong bé kit. Dung dÞch c¶n 1X: Pha lo·ng dd c¶n 10X (10%) trong ®Öm axit maleic, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. Dung dÞch tiÒn lai: 5X SSC, 0,1% N-lauroylsarcosine, 0,02% SDS, 1% dung dÞch c¶n, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. Dung dÞch lai: Dïng 64 ml n­íc cÊt hai lÇn tiÖt trïng ®Ó hoµ tan bét lai chøa trong mçi lä trong bé kit. §Öm röa: 0,3% thÓ tÝch tween 20 trong dung dÞch ®Öm axit maleic. §Öm dß: 0,1M Tris-HCl , 0,1M NaCl, pH 9,5, tiÖt trïng. Dung dÞch röa: 2X SSC, 0,1% SDS vµ 0,5X SSC, 0,1% SDS. Dung dÞch kh¸ng thÓ: Li t©m èng kh¸ng thÓ anti-DIG-AP trong bé kit ë 10.000v/p trong 5 phót. Pha lo·ng 1:10 000 (75 mU/ml) trong dung dÞch c¶n, chuÈn bÞ tr­íc khi dïng. ChÊt nÒn ph¸t quang: CSPD lµ dung dÞch nÒn ph¸t quang cã s½n trong bé kit. Dông cô vµ thiÕt bÞ: GiÊy thÊm (Whatman); mµng nylon (Positive charges 1417240 - Roche Diagroshc Gmh); bÓ thÊm chuyÓn (khay nhùa hoÆc thuû tinh); tñ Êm; èng lai; lß ph¶n øng lai (Bio-labo), hép chôp phim X-quang (Kodak X-OMATIC Cassette); phim X-quang vµ n­íc hiÖn. 2.2.3.2. Quy tr×nh thÊm chuyÓn vµ lai Southern C¾t ADN genom b»ng enzym giíi h¹n vµ ph©n gi¶i trªn gel Cho 5 mg ADN genom vµo èng eppendorf, bæ sung dung dÞch ®Öm, enzym (40-50 u) vµ n­íc tíi thÓ tÝch 35 ml. ñ ë 37oC, trong 16-18 giê. Ch¹y ®iÖn di ADN c¾t giíi h¹n trªn gel agarose 0,8%, ®iÖn thÕ 40-50V, 12-14 giê. ThÊm chuyÓn ADN lªn mµng nylon ADN ë d¹ng sîi ®¬n ®­îc chuyÓn lªn mµng nylon theo ph­¬ng ph¸p thÊm ng­îc (h×nh 7). C¸c b­íc tiÕn hµnh nh­ sau: Xö lý b¶n gel ®iÖn di ADN trong dung dÞch biÕn tÝnh, l¾c nhÑ 20 phót. §æ dung dÞch thÊm chuyÓn (0,4M NaOH vµ 0,6M NaCl) vµo bÓ. ThÊm ­ít 3 líp giÊy thÊm trong bÓ thÊm chuyÓn, ®Æt lªn vËt ®ì lµ tÊm kÝnh hay mét vËt cøng kh¸c t¹o thµnh cÇu giÊy cã chiÒu dµi ®ñ ngËp trong dung dÞch vµ réng khÝt víi chiÒu réng cña b¶n gel. §Æt óp mÆt b¶n gel lªn cÇu giÊy. ThÊm ­ít mµng nylon cã kÝch th­íc nh­ b¶n gel. §Æt mµng nylon lªn b¶n gel. §Æt 3 líp giÊy thÊm cã kÝch th­íc b»ng b¶n gel lªn mµng nylon. H×nh 3: BÓ thÊm chuyÓn Southern §Æt mét líp dÇy c¸c giÊy thÊm máng cã kh¶ n¨ng thÊm nhanh c¸c dung dÞch thÊm ng­îc tõ d­íi lªn; §Æt vËt nÆng kho¶ng 300-500 g ë trªn cïng, bªn d­íi vËt nÆng nªn ®Æt mét tÊm kÝnh máng ®Ó ph©n bè ®Òu träng lùc cña vËt nÆng lªn c¸c líp giÊy thÊm. Cho thÊm chuyÓn 10-12 giê. Röa mµng nylon trong dung dÞch 2X SSC. §Ó mµng kh« trong nhiÖt ®é phßng, sau ®ã xö lý ë nhiÖt ®é 65oC, trong 2 giê. B¶o qu¶n mµng nylon ë nhiÖt ®é phßng cho ®Õn khi tiÕn hµnh lai víi mÉu dß. §¸nh dÊu mÉu dß vµ thang ADN chuÈn b»ng lai víi måi ngÉu nhiªn §¸nh dÊu mÉu dß lai Southern víi DIG ®­îc tiÕn hµnh theo c¸c b­íc sau ®©y: BiÕn tÝnh ADN: Bæ sung H2O vµo 30 ng ADN (s¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA(b), 1,1 kb) thµnh thÓ tÝch 15 ml trong eppendorf. §Æt eppendorf vµo n­íc s«i, ñ trong 10 phót. LÊy èng ra vµ ®Æt ngay vµo ®¸. G©y ph¶n øng: Bæ sung hçn hîp 10X Hexanuleotide; 2ml 10X dNTPs vµ 1 ml enzym Klenow (nång ®é cuèi cïng lµ 100 u/ml). NÕu c¸c thµnh phÇn trªn cã s½n trong kit víi nång ®é 5X th× lÊy 4 ml bæ xung vµo 16 ml ADN ®· biÕn tÝnh. Trén ®Òu hçn hîp. ñ ë 37 OC qua ®ªm th× cã thÓ thu ®­îc kho¶ng 1050 ng ADN ®¸nh dÊu. Dõng ph¶n øng b»ng xö lý ë 65 0C, 10 phót. B¶o qu¶n ë -20 0C. Thang ADN chuÈn ®­îc ®¸nh dÊu nh­ trªn. ChØ cÇn g©y ph¶n øng trong 1 giê, thu ho¹ch 130 ng ADN ®¸nh dÊu lµ ®ñ cho nhiÒu thÝ nghiÖm lai. TiÕn hµnh lai Southern Lai Southern cã thÓ ®­îc tiÕn hµnh trong èng thuû tinh hay hép nhùa. NÕu dïng èng thuû tinh th× cÇn ph¶i cã trôc quay ®Ó quay ®Òu èng trong suèt qu¸ tr×nh lai. NÕu dïng hép lai th× dïng m¸y l¾c. Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i sö dông èng thuû tinh ®Ó lai vµ lß lai. Qui tr×nh lai mÉu dß trªn mµng Southern ®­îc tiÕn hµnh theo c¸c b­íc nh­ sau: Röa mµng trong dung dÞch 2X SSC, 5 phót. §Æt mµng vµo èng lai. §æ 50 ml dung dÞch tiÒn lai ®· ®­îc lµm nãng tr­íc vµo èng. Quay èng lai 12 vßng/phót ë nhiÖt ®é 67 OC, 2-3 giê. ChuÈn bÞ dung dÞch lai: §un s«i 10 phót mÉu dß vµ thang ADN chuÈn ®· ®¸nh dÊu, ®Æt nhanh lªn ®¸ vµ dïng pipet cho vµo dung dÞch lai ®· ®ung nãng ë 67 0C. ThÓ tÝch dung dÞch lai trung b×nh 3-4 ml/100 cm2 mµng. §Ó lai dß mét b¶n gen chuyÓn th­êng dïng mÉu dß 20-50 ng/ml. Cßn ®èi víi thang ADN chuÈn chØ cÇn 2-3 ng cho mét mµng. §æ dung dÞch tiÒn lai ®i. Thay thÕ nhanh b»ng dung dÞch lai. Quay èng lai ë nhiÖt ®é vµ tèc ®é nh­ ë tiÒn lai. Lai 10-20 giê. Chó ý: nhiÖt ®é lai lu«n ®­îc gi÷ æn ®Þnh trong suèt qu¸ tr×nh lai. §æ dung dÞch lai vµo èng, bäc b»ng giÊy b¹c vµ cÊt gi÷ tñ l¹nh s©u ®Ó cã thÓ dïng l¹i. Röa mµng lai trong 200 ml dung dÞch röa 2X ®· ®­îc lµm nãng ë 67 oC, 5 phót, 2 lÇn vµ röa b»ng c¸ch cho èng quay liªn tôc trong lß lai. Röa tiÕp mµng lai trong 200 ml dung dÞch röa 0.5X ®· ®­îc lµm nãng ë 67 OC, 15 phót, 2 lÇn. Ph¶n øng dß t×m ADN ViÖc dß ®Þnh vÞ c¸c ®iÓm lai gi÷a mÉu dß vµ ADN genom ®­îc tiÕn hµnh dùa trªn c¬ së ph¶n øng liªn hîp phosphatase kiÒm gi÷a kh¸ng thÓ cña DIG vµ chÊt nÒn ph¸t quang. §æ ®Öm röa (100 ml/100 cm2 mµng) vµo khay hay hép nhùa vµ röa mµng lai 2 phót, bá ®Öm röa ®i. Bæ sung dung dÞch c¶n (100 ml/100 cm2), ñ trªn m¸y l¾c 30 phót (cã thÓ tíi 3 giê), bá dung dÞch c¶n ®i. Bæ xung dung dÞch kh¸ng thÓ (20 ml/100 cm2), ñ trªn m¸y l¾c 30 phót, bá dung dÞch kh¸ng thÓ ®i. Röa mµng trong ®Öm röa (100 ml/100 cm2), 15 phót, 2 lÇn. C©n b»ng mµng trong ®Öm dß (20 ml/100 cm2). Nhá chÊt nÒn ph¸t quang CSPD (1 ml/100 cm2) lªn ®¸y mét khay thuû tinh hoÆc nhùa s¹ch, ®Æt óp mÆt mµng lªn giät chÊt nÒn ®ã. Chó ý: kh«ng ®­îc ®Ó mµng bÞ kh«, nÕu bÞ kh« sÏ cã ph«ng nÒn ®en khi hiÖn phim ; dïng cÆp máng di chuyÓn nhÑ mµng sao cho kh«ng ®Ó cã bät khÝ gi÷a chÊt nÒn vµ mµng nh»m môc ®Ých ph©n bæ ®Òu chÊt nÒn trªn bÒ mÆt cña mµng. ñ mµng 5 phót. Dïng kÑp g¾p mµng lªn vµ ®Ó ch¶y bít chÊt nÒn. §Æt nhanh mµng vµo tói ni l«ng vµ d¸n kÝn l¹i. ñ mµng ë nhiÖt ®é phßng, 5 phót. Cã thÓ ñ mµng tiÕp sau ®ã ë 37 0C, 10 phót ®Ó t¨ng c­êng ph¶n øng ph¸t quang. HiÖn phim X-quang §Æt phim X-quang vµo hép chôp phim vµ ®Æt mµng trong tói nylon lªn trªn. Cµi chÆt hép chôp phim vµ bäc kÝn trong v¶i ®en. Sau 1 giê ®em röa phim trong phßng tèi. NÕu tÝn hiÖu ph¸t quang yÕu th× kÐo dµi thêi gian chôp phim (cã thÓ ®Ó qua ®ªm). Ch­¬ng 3. kÕt qu¶ vµ th¶o luËn 3.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè §Ó thùc hiÖn ®­îc c¸c ph©n tÝch ph©n tö c©y b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR vµ lai Southern, ADN t¸ch chiÕt ph¶i ®¶m b¶o ®é tinh s¹ch vµ hµm l­îng cao. Chóng t«i ®· tham kh¶o vµ ¸p dông ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tæng sè cña c©y b«ng ®­îc c«ng bè gÇn ®©y nhÊt (Haiwen vµ cs, 2001) vµ thu ®­îc mét sè l­îng ®¸ng kÓ trong n¨ng suÊt ADN. Tuy nhiªn, khi b¸m s¸t theo c¸c b­íc cña quy tr×nh nµy chóng t«i chØ thu ®­îc l­îng ADN cßn thÊp vµ ch­a s¹ch. Sau 3 lÇn thö nghiÖm, lo¹i bá thµnh phÇn N-Lauroylsarcosine nh­ ®· nªu trong môc 2.2.1.2, n¨ng suÊt ADN ®­îc t¨ng lªn, ®ång thêi ADN còng s¹ch h¬n rÊt nhiÒu. KÕt qu¶ kiÓm tra ADN cho thÊy c¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã chÊt l­îng tèt vµ nång ®é cao, ®ñ ®iÒu kiÖn ®Ó tiÕn hµnh c¸c c«ng viÖc nghiªn cøu tiÕp theo. Khi ®o OD cña ADN ë c¸c b­íc sãng 260-280 nm, phæ hÊp phô chØ cã mét ®Ønh cùc ®¹i ë 260 nm (h×nh 4). C¸c mÉu ADN thu ®­îc ®Òu cã ®é tinh s¹ch cao, cã tû lÖ OD260/OD280 thÊp nhÊt lµ 1.810 ë dßngCS00-15 vµ cao nhÊt lµ 1.985 ë dßngCS00-35 (b¶ng 5). H×nh 4: Phæ hÊp phô cña ADN t¸ch tõ c¸c dßng b«ng ë b­íc sãng 260- 280 nm B¶ng 5: Hµm l­îng vµ ®é s¹ch cña c¸c mÉu ADN Tªn gièng Hµm l­îng ADN (ng/ml) §é tinh s¹ch Tªn gièng Hµm l­îng ADN (ng/ml) §é tinh s¹ch CS00-1 1070 1.896 CS01-29 754 1.895 CS00-2 3820 1.865 CS01-30 986 1.921 CS00-3 1264 1.856 CS01-31 2064 1.869 CS00-10 1120 1.985 CS01-32 1341 1.911 CS00-11 1257 1.852 CS01-33 1245 1.896 CS00-15 1052 1.810 CS01-34 2405 1.852 CS00-19 924 1.985 CS01-35 1248 1.985 CS00-20 1124 1.954 CS01-36 1243 1.874 CS00-22 1452 1.852 CS01-38 874 1.981 CS00-23 1248 1.984 CS01-39 862 1.897 CS00-24 1355 1.852 CS01-40 984 1.853 1520 1243 1.845 CS01-42 1452 1.930 CS01-26 957 1.954 CS01-43 1532 1.850 CS01-27 862 1.953 CS92 1596 1.852 CS01-28 489 1.954 CS95 965 1.869 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 H×nh 5: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c dßng b«ng, trong ®ã 1: ADN lamda, 50 ng; 2-16: ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ¶nh ®iÖn di kiÓm tra ADN trªn gen agaroza 0,6% chØ ra ADN tËp trung thµnh mét b¨ng, gän, kh«ng cã ADN bÞ ®øt gÉy (h×nh 5). Nång ®é ADN cña c¸c mÉu ®­îc ®¸nh gi¸ dùa trªn 1 mÉu ADN ®èi chøng cã nång ®é chuÈn ch¹y song song víi c¸c mÉu kiÓm tra. Nång ®é 50-200 ng/ml ADN trªn mçi giÕng ®iÖn di ®­îc ®¸nh gi¸ kh¸ chuÈn x¸c. Chóng t«i th­êng thu ®­îc 5-10 mg ADN tõ 200 mg l¸ b«ng. Nång ®é ADN x¸c ®Þnh trªn b¶n gel ®iÖn di thÊp h¬n so víi nång ®é tÝnh theo ®é hÊp phô quang phæ ®­îc gi¶i thÝch do l­îng ARN cßn cao trong c¸c mÉu ADN. Nh­ vËy, kÕt qu¶ ®iÖn di vµ ®o quang phæ hÊp phô c¸c mÉu ADN cho thÊy ®· thu ®­îc ADN s¹ch vµ cã träng l­îng ph©n tö lín, ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c kü thuËt PCR vµ lai Southern. 3.2. Ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR C¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ®­îc ®­a vµo ph©n tÝch ph©n tö do viÖn Nghiªn cøu C©y b«ng vµ C©y cã sîi cung cÊp. §©y lµ c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u cã nguån gèc tõ n­íc ngoµi, kh«ng cã lý lÞch chøng minh nguån gen chuyÓn. Nãi c¸ch kh¸c, chóng t«i kh«ng n¾m ®­îc c¸c dßngnµy ®­îc chuyÓn gen CryIA(b) hay CryIA(c). Kh¶ n¨ng kh¸ng s©u xanh cña c¸c dßng nµy ®· ®­îc kiÓm ®Þnh khi thö nghiªm trong nhµ l­íi vµ ngoµi ®ång ruéng. Sè liÖu ®¸nh gi¸ tØ lÖ s©u ¨n l¸ chÕt trong phßng thÝ nghiÖm cña mét sè dßng ®­îc nªu trong b¶ng 1, môc 2.1. §Ó ph©n tÝch c©y b«ng kh¸ng s©u b»ng kü thuËt PCR, chóng t«i sö dông cÆp måi ®Æc hiÖu T1 vµ T2 cã chiÒu dµi vµ tr×nh tù nh­ ®· nªu ë ch­¬ng 2. §©y lµ cÆp måi ®­îc thiÕt kÕ ®Ó cã thÓ nh©n 1 ®o¹n ADN nh­ nhau cã ®é dµi 1,1 kb tõ gen CryIA(b) hoÆc CryIA(c). Khi ¸p dông cÆp måi nµy vµo ph¶n øng PCR ®èi víi c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u, chóng t«i nhËn ®­îc s¶n phÈm PCR víi ®é lín nªu trªn, dßngnh­ s¶n phÈm nh©n ®­îc tõ mÉu ®èi chøng lµ plasmit mang gen CryIA(c) hay CryIA(b). Dùa vµo l­îng s¶n phÈm PCR, chóng t«i cã thÓ ®¸nh gi¸ s¬ bé sè l­îng b¶n gen CryIA cã trong c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. KÝch th­íc cña plasmit mang CryIA kho¶ng 11.5kb vµ cña genom b«ng kho¶ng 2118 Mb (2n). TØ lÖ träng luîng ph©n tö gi÷a chóng lµ 1/151000. NghÜa lµ, nÕu trén 0,07 pg plasmit-CryIA víi 25 ng genom b«ng ta cã hçn hîp t­¬ng ®­¬ng 1 genome b«ng vµ 1 b¶n gen CryIA . Dùa trªn tÝnh to¸n ®ã, chóng t«i lËp ph¶n øng PCR ®èi chøng du¬ng lµ genom b«ng cã 5, 3, 1 b¶n gen CryIA t­¬ng øng. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u trong h×nh 6a vµ 6b chØ ra r»ng c¸c c©y chuyÓn gen nµy mang tõ mét ®Õn h¬n mét b¶n gen CryIA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 1.1 Kb H×nh 6a. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: thang ADN chuÈn (Marker Mix), 2-4: ®èi trøng d­¬ng (genom b«ng + 5, 3, 1 b¶n gen CryIA); 5: ®èi trøng ©m (genom b«ng kh«ng chuyÓn gen), 6-21: c¸c dßng kh¸ng s©u. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 1.1 Kb H×nh 6b. KÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: thang ADN chuÈn (Marker Mix), 2-4: ®èi trøng d­¬ng (genom b«ng + 5, 3, 1 b¶n gen CryIA); 5: ®èi trøng ©m, genom b«ng kh«ng chuyÓn gen, 6-19: c¸c dßng kh¸ng s©u Trong 30 dßng b«ng ®­a vµo ph©n tÝch, chóng t«i thu ®­îc 26 dßng cã kÕt qu¶ PCR nh©n gen CryIA d­¬ng tÝnh (b¶ng 6). Sù cã mÆt cña gen CryIA sÏ ®­îc kh¼ng ®Þnh b»ng lai Southern. Ngoµi ra, c¸c v¹ch s¶n phÈm PCR trªn b¶n gel ®iÖn di ®«i khi mê h¬n c¶ ®èi chøng d­¬ng cña 1 b¶n gen CryIA. §iÒu nµy cã thÓ ®­îc gi¶ thÝch bëi qu¸ tr×nh ®ãng më cña c¸c sîi chromatin trong c¸c m¹ch ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u lµm c¶n trë qu¸ tr×nh b¾t cÆp måi nh©n gen CryIA, trong khi ë ®èi chøng d­¬ng, CryIA n»m trong plasmit cã ®é dµi chØ 11.5 kb, nªn qu¸ tr×nh th¸o xo¾n ADN x¶y ra dÔ dµng vµ nhanh h¬n, g©y thuËn lîi cho PCR. B¶ng 6: KÕt qu¶ nh©n gen CryIA(b) vµ CryIA(c) b»ng PCR ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u STT Tªn gièng Kªt qu¶ STT Tªn gièng KÕt qu¶ 1 CS00-1 + 16 CS01-29 + 2 CS00-2 + 17 CS01-30 - 3 CS00-3 + 18 CS01-31 + 4 CS00-10 + 19 CS01-32 + 5 CS00-11 + 20 CS01-33 + 6 CS00-15 + 21 CS01-34 - 7 CS00-19 + 22 CS01-35 + 8 CS00-20 + 23 CS01-36 + 9 CS00-22 + 24 CS01-38 + 10 CS00-23 - 25 CS01-39 + 11 CS00-24 + 26 CS01-40 + 12 1520 + 27 CS01-42 + 13 CS01-26 + 28 CS01-43 + 14 CS01-27 - 29 CS92 + 15 CS01-28 + 30 CS95 + Ghi chó: + lµ kÕt qu¶ PCR d­¬ng tÝnh - lµ kÕt qu¶ PCR ©m tÝnh 3.3. KÕt qu¶ ph©n tÝch c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u b»ng lai Southern 3.3.1. ChuÈn bÞ mÉu dß MÉu dß trong thùc nghiÖm lai Southern ph©n tÝch c©y b«ng kh¸ng s©u lµ gen CryIA. Chóng t«i dïng s¶n phÈm PCR nh©n gen nµy tõ plasmit p2300 mang gen CryIA(b). Plasmit p2300 cã b¶n ®å ph©n tö ®­îc nªu ë h×nh 7. §Ó chuÈn bÞ mÉu dß, b­íc ®Çu tiªn chóng t«i ph¶i nh©n dßng tÕ bµo E.coli mang plasmit p2300 vµ b­íc tiÕp theo lµ t¸ch ADN plasmit. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN plasmit ®¹t yªu cÇu, khi ®iÖn di trªn gel agarose 0,8% ta thÊy plasmit t¸ch thµnh nh÷ng b¨ng kh¸c nhau ®Æc tr­ng cho c¸c d¹ng kh¸c nhau cña plasmit ®ã lµ: d¹ng d·n vßng, d¹ng so¾n vµ d¹ng siªu so¾n (h×nh 8a). S¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA b»ng cÆp måi T1 vµ T2 cã ®é dµi 1,1 kb (h×nh 8b), ®­îc lµm s¹ch, x¸c ®Þnh nång ®é vµ sö dông ®Ó ®¸nh dÊu víi DIG. Kanamycin(R) p2300-CryIA(b) 11.5Kb Kpn I Hind III T-Border(L) T-Border(R) Sac I Xba I CryIA(b) Nos ter 35S promoter Kanamycin(R) 35S Promoter H×nh 7: B¶n ®å ph©n tö cña plasmit p2300-CryIA(b) 1.1Kb a b H×nh 8: ChuÈn bÞ mÉu dß. a. ADN plasmit mang gen CryIA(b) ®uîc t¸ch tõ c¸c dßng tÕ bµo E.coli; b. S¶n phÈm PCR nh©n gen CryIA Chóng t«i dïng 30 ng CryIA ®Ó ®­a vµo ph¶n øng lai víi hçn hîp c¸c ®o¹n måi 6 nucleotit ngÉu nhiªn vµ DIG-UTP trong thêi gian dµi tèi ®a cho phÐp lµ 20 giê. Dïng l­îng ADN khu«n mÉu Ýt vµ ®¸nh dÊu trong thêi gian dµi cho chóng ta thu ®­îc dung dÞch mÉu dß cã thµnh phÇn ®­îc ®¸nh dÊu lµ chñ yÕu, gi¶m bít c¸c ph©n tö ADN ch­a ®­îc ®¸nh dÊu, tèi ­u qu¸ tr×nh lai cña c¸c ®o¹n dß mang DIG ®¸nh dÊu. Sau 20 giê l­îng ADN ®¸nh dÊu lµ 1050 ng trong 20 ml, nång ®é 52 ng/ml [16]. C¾t genom b«ng b»ng enzym giíi h¹n Khi dïng enzym h¹n chÕ ®Ó c¾t genom thµnh c¸c ®o¹n ng¾n, ta ph¶i b¶o ®¶m enzym ®ã kh«ng c¾t vôn, lµm lo¹i mÊt gen ®Þnh dß t×m ra khái c¸c ®o¹n ADN cã thÓ ®­îc gi÷ l¹i trªn b¶n gen ®iÖn di. V× vËy, tr­íc khi thùc nghiÖm c¾t ADN genom b»ng enzym h¹n chÕ ®Ó tiÕn hµnh lai Southern, chóng t«i nghiªn cøu b¶n ®å enzym c¾t h¹n chÕ cña gen CryIA(b) vµ CryIA(c). Tr×nh tù hai gen nµy sau khi quÐt trªn ch­¬ng tr×nh PC/GENE, cã danh s¸ch c¸c enzym kh«ng c¾t bªn trong gen nh­ ë b¶ng 7. Trong danh s¸ch c¸c enzym nµy chän ra ®­îc 2 enzym HindIII vµ KpnI ®Ó thö c¾t genom c©y b«ng. v× ®©y lµ 2 enzym phæ biÕn, th­êng ®­îc dïng trong c¸c thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö. B¶ng 7: Danh s¸ch c¸c enzym giíi h¹n kh«ng c¾t trong gen CryIA(b) vµ CryIA(c) Chóng t«i thö nghiÖm c¾t ADN genom c©y b«ng ë 2 l­îng kh¸c nhau lµ 5 mg vµ 10 mg. ADN ®­îc c¾t víi enzym h¹n chÕ ë nång ®é 10 u/mg, ë thÓ tÝch 30 ml, trong 12-14 giê. ADN c¾t b»ng enzym sau ®ã ®­îc ch¹y ®iÖn di ë hiÖu ®iÖn thÕ thÊp, 40-50 V, trong 10-14 giê. ¶nh chôp b¶n ®iÖn di s¶n phÈm c¾t ADN cho thÊy ADN ®­îc c¾t hoµn toµn b»ng HindIII, nh­ng kh«ng hoµn toµn b»ng KpnI (h×nh 9). V× vËy, chóng t«i sö dông HindIII ®Ó c¾t genom b«ng trong c¸c thùc nghiÖm lai Southern tiÕp theo, vÒ l­îng ADN chän c«ng thøc 5 hoÆc 7 mg ®Ó c¾t. a b H×nh 9: KÕt qu¶ thö nghiÖm c¾t genom c©y b«ng b»ng: a. KpnI (5 mg); b. HindIII (5 mg vµ 10 mg genom) ThÊm chuyÓn ADN genom lªn mµng nylon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H×nh 10: B¶n ®iÖn di ph©n gi¶i genom c©y b«ng ®­îc c¾t bëi HindIII tr­íc khi thÊm chuyÓn lªn mµng nylon. 1: Thang ADN chuÈn; 2-14: ADN c©y b«ng kh¸ng s©u (5 mg) C¸c mÉu ADN cña c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u ®­a vµo lai Southern ®­îc c¾t bëi HindIII. H×nh 10 ghi l¹i ®é ph©n gi¶i tèt cña c¸c mÉu 5 mg ADN trªn b¶n gel ®iÖn di tr­íc khi thÊm chuyÓn. H×nh 11 lµ ¶nh ®iÖn di cña 7 mg ADN ®­îc c¾t b»ng cïng enzym HindIII. §é dµi cña b¶n gel ®iÖn di theo chÕ ®é ®· nªu ë trªn th­êng lµ 10-11 cm. V× vËy, kÝch th­íc cña mµng lai t­¬ng øng lµ 100-110 cm2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 H×nh 11: B¶n ®iÖn di ph©n gi¶i genom c©y b«ng ®­îc c¾t bëi HindIII tr­íc khi thÊm chuyÓn lªn mµng nylon. 1: Thang ADN chuÈn; 2-12: ADN c©y b«ng kh¸ng s©u (7 mg) Trong thùc nghiÖm thÊm chuyÓn ADN lªn mµng lai, chóng t«i dïng lo¹i giÊy läc cã s½n trong phßng thÝ nghiÖm ®Ó lµm cÇu dÉn dung dÞch chuyÓn, mµ kh«ng dïng ®óng chñng lo¹i Whatman nh­ quy tr×nh chuÈn khuyªn dïng. TÇng giÊy thÊm ë phÝa trªn mµng lµ lo¹i giÊy ¨n b¸n trªn thÞ tr­êng. ë thùc nghiÖm ®Çu tiªn, thÊy r»ng sù thÊm ng­îc lªn tÇng giÊy thÊm x¶y ra qu¸ nhanh. Sau 3 giê, dung dÞch chuyÓn ®· thÊm hÕt tÇng giÊy cao 15 cm. Do ®ã ph¶i thay tÇng giÊy thÊm nµy trong qu¶ tr×nh thÊm chuyÓn. Tuy nhiªn, khi kiÓm tra b¶n gel sau thÊm chuyÓn cho thÊy ADN ®· ®­îc chuyÓn hÕt mµ kh«ng sãt l¹i trªn gel. ë thùc nghiÖm sau, 3 líp giÊy läc cña cÇu giÊy ®­îc thay b»ng 2 líp. Cßn 3 líp giÊy läc trªn mµng ®­îc thay b»ng mét líp cã ®é dµy 1.5 cm. Trong ®iÒu kiÖn nµy, qu¸ tr×nh thÊm chuyÓn chËm l¹i, sau 10-12 giê ®é dµi thÊm ­ít cña tÇng giÊy thÊm lµ 6-7 cm, ®­îc coi lµ b×nh th­êng theo kinh nghiÖm. KÕt qu¶ lai Southern C¸c c«ng bè vÒ kÕt qu¶ ph©n tÝch gen chuyÓn b»ng lai Southern ë c©y lóa, lóa m×, lóa m¹ch, yÕn m¹ch chØ ra r»ng sè l­îng ®iÓm g¾n cña gen chuyÓn thay ®æi phô thuéc vµo kü thuËt ®· ¸p dông khi chuyÓn gen [15], [26]. Khi t¹o c©y chuyÓn gen b»ng b¾n gen, ®iÓm g¾n gen chuyÓn th­êng lµ ®a ®iÓm, thay ®æi tõ 1 ®Õn nhiÒu ®iÓm, cã khi tíi 10 ®iÓm kh¸c nhau [10], [11], [13], [17]. Trong khi ®ã, ë c¸c c©y chuyÓn gen th«ng qua Agrobacterium, gen chuyÓn ®a phÇn g¾n ë ®¬n ®iÓm [21], [29], [30]. Trong thÝ nghiÖm cña chóng t«i, ®Ó t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu qu¸ tr×nh lai gi÷a mÉu dß gen CryIA vµ genom b«ng chuyÓn gen, chóng t«i tiÕn hµnh lai ë nhiÖt ®é cao lµ 67 0C. Qu¸ tr×nh lai x¶y ra trong 14-16 giê. Trong thÝ nghiÖm ®Çu ®· kh«ng thu ®­îc ¶nh lai cña gen CryIA mµ chØ cã thang ADN chuÈn. §iÒu nµy chøng tá quy tr×nh lai ®­îc thùc hiÖn ®óng, chØ cã qu¸ tr×nh lai cña gen CryIA lµ kh«ng x¶y ra hoÆc x¶y ra qu¸ yÕu. Khi t¨ng nång ®é mÉu dß lªn tèi ®a lµ 50 ng/ml dung dÞch lai trong thÝ nghiÖm lÇn thø 2, ®· thu ®­îc c¸c b¨ng lai ë 4/12 dßng trªn mµng lai, trong ®ã mét dßng mang gen chuyÓn ë hai ®iÓm kh¸c nhau, sè cßn l¹i cã gen chuyÓn ë mét ®iÓm (h×nh 12). ë ®©y qu¸ tr×nh lai gi÷a mÉu dß vµ gen CryIA trong c©y b«ng chuyÓn gen ®· x¶y ra, nh­ng kh«ng ph¶i ë tÊt c¶ c¸c mÉu ADN. Theo chóng t«i, cã yÕu tè ®· c¶n trë qu¸ tr×nh lai trªn genom c©y b«ng. Trªn mµng lai thø 3, chóng t«i còng chØ nhËn ®­îc b¨ng lai ë 1/16 dßng. §iÒu nµy cµng nhÊn m¹nh sù c¶n trë qu¸ tr×nh lai gen CryIA trong genom c©y b«ng. ë c¶ 3 mµng, ¶nh lai c¸c v¹ch cña thang ADN chuÈn rÊt râ. Tµi liÖu tham kh¶o vÒ c¸c thÝ nghiÖm ph©n tÝch lai Southern c©y b«ng chuyÓn gen rÊt h¹n chÕ. Chóng t«i ch­a t×m ®­îc mét c«ng bè ®Çy ®ñ vµ cô thÓ nµo liªn quan ®Õn kÕt qu¶ lai Southern ë c©y b«ng trªn c¸c m¹ng l­u tr÷ tµi liÖu khoa häc nh­ PubMed, PNAS online. Chóng t«i sÏ tiÕn hµnh lai Southern cña gen CryIA(c) ë c¸c c©y lóa chuyÓn gen kh¸ng s©u. Qua so s¸nh kÕt qu¶ chóng t«i cã thÓ kh¼ng ®Þnh quy tr×nh sö dông hÖ thèng DIG ®· ®­îc hoµn thiÖn hay cÇn söa ®æi chi tiÕt nµo. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H×nh 12: KÕt qu¶ lai Sothern cña gen CryIA ë c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u. 1: Thang ADN chuÈn; 2-13: C¸c dßng b«ng kh¸ng s©u KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn: §Ó ph©n tÝch ph©n tö c¸c dßng b«ng kh¸ng s©u, ADN tæng sè ®· ®­îc t¸ch tõ l¸ mÇm hoÆc l¸ non cña c©y b«ng. Hµm l­îng ADN thu ®­îc 7-10 mg tõ 200 mg l¸. ADN ®ñ chÊt l­îng ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch ph©n tö. Ph¶n øng PCR nh©n gen CryIA ®­îc tiÕn hµnh víi 30 dßng b«ng kh¸ng s©u, trong ®ã 26 dßng cã kÕt qu¶ d­¬ng tÝnh. §· thùc hiÖn thµnh c«ng kü thuËt lai Southern bao gåm c¸c b­íc nh­ sau: Chän HindIII lµm enzym c¾t ADN genom b«ng; ADN ph©n gi¶i ®Òu trªn b¶n gel ®iÖn di vµ ®­îc thÊm chuyÓn hoµn toµn lªn mµng lai nylon; ®¸nh dÊu mÉu dß b»ng hÖ thèng phi phãng x¹ DIG vµ thu ®­îc kÕt qu¶ ë 5 dßng, trong ®ã 1 dßng mang 2 ®iÓm g¾n gen, sè cßn l¹i mang 1 ®iÓm g¾n. KiÕn nghÞ: §©y lµ kÕt qu¶ b­íc ®Çu hoµn thiÖn quy tr×nh lai Southern b»ng sö dông hÖ thèng phi phãng x¹ DIG. §Ò nghÞ øng dông kü thuËt nµy vµo ph©n tÝch tiÕp c¸c loµi chuyÓn gen kh¸c (lóa kh¸ng s©u, chÞu bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn, ®u dñ kh¸ng bÖnh virus ®èm vßng).

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • doc6.doc
Luận văn liên quan