Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh trong phân tích urea

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT THỬ NHANH TRONG PHÂN TÍCH UREA 1 C CH HƯ ƯƠ ƠN NG G 1 1 . 2 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 3 1.1.1. Danh pháp quốc tế và phân loại 3 1.1.2. Tính chất vật lý của enzyme urease 3 1.1.3. Tính chất hóa lý của enzyme urease . 6 1.1.4. Trung tâm hoạt động 6 1.1.5. Cơ chế xúc tác 9 1.1.6. Cơ chất của urease 10 1.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease . 12 1.2. Các phương pháp thu nhận urease 23 1.2.1. Nguồn thu nhận . 23 1.2.2. Một số phương pháp tách chiết và tinh chế enzyme . 26 1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính urease . 27 1.3.1. Xác định hoạt tính urease dựa trên việc định lượng NH3 được giải phóng 29 1.3.2. Xác định hoạt tính urease bằng cách định lượng CO2 được giải phóng . 30 1.4. Ứng dụng của enzyme urease . 31 1.4.1. Trong nông nghiệp 31 1.4.2. Trong thực phẩm . 31 1.4.3. Trong phân tích hóa sinh 31 1.4.4. Trong công nghệ môi trường 32 1.4.5. Trong y học . 32 1.5. Tổng quan về urea . 32 1.5.1. Cấu tạo hóa học của urea . 32 1.5.2. Phát hiện . 33 1.5.3. Công dụng . 34 1.5.4. Mức độ nguy hiểm 35 1.5.5. Các nguồn phát sinh urea . 35 1.5.6. Các phương pháp xác định urea . 39 1.6. Kit thử nhanh trong phân tích urea 46 1.6.1. Tình hình các loại kit thử nhanh ở Việt Nam [52] . 46 1.6.2. Các loại kit phân tích urea . 47 C CH HƯ ƯƠ ƠN NG G 2 2 . 50 2.1. Nguyên liệu 51 2.1.1. Hóa chất 51 2.1.2. Dụng cụ . 51 2.2. Phương pháp nghiên cứu . 52 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 52 2.2.2. Phương pháp tìm chất chỉ thị màu tối ưu . 52 2.2.3. Phương pháp xác định lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit . 54 2.2.4. Phương pháp chọn dung môi thích hợp dùng để pha urease . 54 2.2.5. Phương pháp chọn thể tích chấm enzyme phù hợp . 58 2.2.6. Phương pháp nghiên cứu lượng enzyme urease thích hợp cho lên kit . 59 2.2.7. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH 60 2.2.8. Phương pháp xác định thời gian hiện màu của kit 60 2.2.9. Phương pháp xác định thời gian sử dụng của kit . 60 2.2.10. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 61 2.2.11. Các phương pháp xử lý số liệu . 61 C CH HƯ ƯƠ ƠN NG G 3 3 . 62 3.1. Khảo sát các loại chất chỉ thị màu 63 3.2. Khảo sát lượng chất chỉ thị thích hợp cho lên kit . 65 3.3. Khảo sát dung môi pha urease 68 3.3.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme urease theo phương pháp Nessler 68 3.3.2. Khảo sát dung môi dùng để pha urease 70 3.4. Khảo sát lượng enzyme thích hợp cho lên kit 72 3.4.1. Khảo sát thể tích chấm enzyme urease lên kit 72 3.4.2. Khảo sát nồng độ dung dịch enzyme urease cho lên kit . 72 3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện của kit, xây dựng thang màu bán định lượng urea và đường chuẩnpH 76 3.5.1. Xác định khả năng phát hiện của kit . 76 3.5.2. Xây dựng thang màu bán định lượng urea . 77 3.5.3. Xây dựng đường chuẩnpH để định lượng urea 78 3.6. Khảo sát thời gian hiện màu của kit . 83 3.7. Khảo sát thời gian sử dụng của kit 85 3.8. Khảo sát khả năng phát hiện của kit trong mẫu thực 87 3.8.1. Sữa . 87 3.8.2. Nước mắm . 89 3.8.3. Thủy sản 90 C CH HƯ ƯƠ ƠN NG G 4 4 . 95 4.1. Kết luận 96 4.2. Kiến nghị: . 97 T TA À ØI I L LI IE Ệ ÄU U T TH HA AM M K KH HA Ả ÛO O 98

pdf114 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 12/01/2013 | Lượt xem: 1857 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh trong phân tích urea, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
iÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC NGHIEÂN CÖÙU CHEÁ TAÏO KIT THÖÛ NHANH TRONG PHAÂN TÍCH UREA SVTH : TRÒNH THÒ THANH TAÂM MSSV : 60302440 CBHD : TS. TRAÀN BÍCH LAM BOÄ MOÂN KYÕ THUAÄT THÖÏC PHAÅM TP Hoà Chí Minh, 01/2008 NHAÄÄN XEÙÙT CUÛÛA GIAÙÙO VIEÂÂN HÖÔÙÙNG DAÃÃN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... NHAÄÄN XEÙÙT CUÛÛA GIAÙÙO VIEÂÂN PHAÛÛN BIEÄÄN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... LÔØI CAÙM ÔN GVHD: TS. Traàn Bích Lam ii LÔØØI CAÛÛM ÔN  Tröôùc heát, em xin gôûi lôøi caùm ôn ñeán thaày coâ tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa, ñaëc bieät laø caùc thaày coâ Boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm ñaõ truyeàn ñaït nhöõng kieán thöùc vaø kinh nghieäm quyù baùu cho chuùng em trong suoát gaàn naêm naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng ñaïi hoïc. Em xin göûi lôøi caùm ôn saâu saéc ñeán coâ Traàn Bích Lam ñaõ taän tình höôùng daãn, giuùp ñôõ em raát nhieàu ñeå em coù theå hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Cuoái cuøng, toâi xin caûm ôn caùc baïn lôùp HCTP03 ñaõ giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong thôøi gian laøm luaän vaên. Chuùc caùc baïn luoân vui veû vaø thaønh coâng trong cuoäc soáng. Sinh vieâân Trònh Thò Thanh Taââm MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam iii MUÏÏC LUÏÏC ÑEÀÀ MUÏÏC: Trang TRANG BÌA ................................................................................................................ i LÔØØI CAÛÛM ÔN ................................................................................................................................ ii MUÏÏC LUÏÏC..................................................................................................................................... iii DANH SAÙÙCH HÌNH VEÕÕ ........................................................................................................... vii DANH SAÙÙCH BAÛÛNG BIEÅÅU....................................................................................................... ix LÔØØI MÔÛÛ ÑAÀÀU ................................................................................................................................ 1 CHÖÔNG 1 ................................................................................................................................... 2 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) ................................................................................................ 3 1.1.1. Danh phaùp quoác teá vaø phaân loaïi .................................................................................. 3 1.1.2. Tính chaát vaät lyù cuûa enzyme urease ............................................................................ 3 1.1.3. Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme urease ........................................................................... 6 1.1.4. Trung taâm hoaït ñoäng .................................................................................................... 6 1.1.5. Cô cheá xuùc taùc .............................................................................................................. 9 1.1.6. Cô chaát cuûa urease...................................................................................................... 10 1.1.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng cuûa urease ......................................... 12 1.2. Caùc phöông phaùp thu nhaän urease .................................................................................... 23 1.2.1. Nguoàn thu nhaän........................................................................................................... 23 1.2.2. Moät soá phöông phaùp taùch chieát vaø tinh cheá enzyme................................................. 26 1.3. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính urease..................................................................... 27 1.3.1. Xaùc ñònh hoaït tính urease döïa treân vieäc ñònh löôïng NH3 ñöôïc giaûi phoùng.............. 29 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam iv 1.3.2. Xaùc ñònh hoaït tính urease baèng caùch ñònh löôïng CO2 ñöôïc giaûi phoùng................... 30 1.4. ÖÙng duïng cuûa enzyme urease ........................................................................................... 31 1.4.1. Trong noâng nghieäp...................................................................................................... 31 1.4.2. Trong thöïc phaåm ......................................................................................................... 31 1.4.3. Trong phaân tích hoùa sinh ............................................................................................ 31 1.4.4. Trong coâng ngheä moâi tröôøng ...................................................................................... 32 1.4.5. Trong y hoïc ................................................................................................................. 32 1.5. Toång quan veà urea ............................................................................................................. 32 1.5.1. Caáu taïo hoùa hoïc cuûa urea........................................................................................... 32 1.5.2. Phaùt hieän ..................................................................................................................... 33 1.5.3. Coâng duïng ................................................................................................................... 34 1.5.4. Möùc ñoä nguy hieåm...................................................................................................... 35 1.5.5. Caùc nguoàn phaùt sinh urea ........................................................................................... 35 1.5.6. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh urea ................................................................................. 39 1.6. Kit thöû nhanh trong phaân tích urea.................................................................................... 46 1.6.1. Tình hình caùc loaïi kit thöû nhanh ôû Vieät Nam [52]..................................................... 46 1.6.2. Caùc loaïi kit phaân tích urea ......................................................................................... 47 CHÖÔNG 2 ................................................................................................................................. 50 2.1. Nguyeân lieäu........................................................................................................................ 51 2.1.1. Hoùa chaát ...................................................................................................................... 51 2.1.2. Duïng cuï ....................................................................................................................... 51 2.2. Phöông phaùp nghieân cöùu ................................................................................................... 52 2.2.1. Sô ñoà nghieân cöùu ........................................................................................................ 52 2.2.2. Phöông phaùp tìm chaát chæ thò maøu toái öu ................................................................... 52 2.2.3. Phöông phaùp xaùc đònh löôïng chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit................................. 54 2.2.4. Phöông phaùp choïn dung moâi thích hôïp duøng ñeå pha urease..................................... 54 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam v 2.2.5. Phöông phaùp choïn theå tích chaám enzyme phuø hôïp ................................................... 58 2.2.6. Phöông phaùp nghieân cöùu löôïng enzyme urease thích hôïp cho leân kit ..................... 59 2.2.7. Phöông phaùp khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit, xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea vaø ñöôøng chuaånpH........................................................................................ 60 2.2.8. Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian hieän maøu cuûa kit .................................................... 60 2.2.9. Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian söû duïng cuûa kit ....................................................... 60 2.2.10. Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong maãu thöïc.............................................. 61 2.2.11. Caùc phöông phaùp xöû lyù soá lieäu................................................................................. 61 CHÖÔNG 3 ................................................................................................................................. 62 3.1. Khaûo saùt caùc loaïi chaát chæ thò maøu .................................................................................... 63 3.2. Khaûo saùt löôïng chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit ............................................................. 65 3.3. Khaûo saùt dung moâi pha urease .......................................................................................... 68 3.3.1. Khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme urease theo phöông phaùp Nessler .......................... 68 3.3.2. Khaûo saùt dung moâi duøng ñeå pha urease .................................................................... 70 3.4. Khaûo saùt löôïng enzyme thích hôïp cho leân kit .................................................................. 72 3.4.1. Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit.............................................................. 72 3.4.2. Khaûo saùt noàng ñoä dung dòch enzyme urease cho leân kit............................................... 72 3.5. Khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit, xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea vaø ñöôøng chuaånpH.............................................................................................................................. 76 3.5.1. Xaùc ñònh khaû naêng phaùt hieän cuûa kit ......................................................................... 76 3.5.2. Xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea................................................................. 77 3.5.3. Xaây döïng ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea .................................................... 78 3.6. Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit ................................................................................. 83 3.7. Khaûo saùt thôøi gian söû duïng cuûa kit.................................................................................... 85 3.8. Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong maãu thöïc...................................................... 87 3.8.1. Söõa............................................................................................................................... 87 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam vi 3.8.2. Nöôùc maém................................................................................................................... 89 3.8.3. Thuûy saûn...................................................................................................................... 90 CHÖÔNG 4 ................................................................................................................................. 95 4.1. Keát luaän.............................................................................................................................. 96 4.2. Kieán nghò:........................................................................................................................... 97 TAØØI LIEÄÄU THAM KHAÛÛO............................................................................................................ 98 DANH SAÙCH HÌNH VEÕ GVHD: TS. Traàn Bích Lam vii DANH SAÙÙCH HÌNH VEÕÕ Chöông 1: TOÅNG QUAN Hình 1.1: Tinh theå urease ñöôïc J.B.Summer chieát taùch vaø keát tinh............................................... 4 Hình 1.2: Khoái löôïng phaân töû cuûa urease qua coät loïc gel Agarose A_15m .................................. 4 Hình 1.3: Caáu truùc cuûa enzyme urease........................................................................................... 6 Hình 1.4: Trung taâm hoaït đoäng cuûa urease.................................................................................... 8 Hình 1.5: Urease töø K.aerogenes vaø töø Bacillus pasterrii ............................................................. 8 Hình 1.6: Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme............................................................................................. 9 Hình 1.7: Cô cheá xuùc taùc cuûa urease ............................................................................................ 10 Hình 1.8: Coâng thöùc caáu taïo cuûa moät soá cô chaát chöùa phospho cuûa urease .............................. 11 Hình 1.9: Đoà thò bieåu dieãn vaän toác phaûn öùng theo noàng đoä cô chaát............................................ 12 Hình 1.10: Đoà thò hoaït tính urease theo pH trong 3 loaïi đeäm noàng ñoä M/8 ............................... 14 Hình 1.11: AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh ................................ 16 Hình 1.12: Cô cheá öùc cheá cuûa hydroxamic acid vôùi urease ......................................................... 17 Hình 1.13: Coâng thöùc hoùa hoïc cuûa caùc α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) ... 19 Hình 1.14: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát thiols, urea vaø acid boric tôùi khaû naêng öùc cheá urease cuûa dòch chieát toûi tröôùc khi uû........................................................................................................ 21 Hình 1.15: Ñoäng hoïc cuûa söï öùc cheá urease bôûi dòch chieát toûi ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau........... 21 Hình 1.16: Caáu truùc phaân töû urease cuûa Helicobacter Pylori..................................................... 23 Hình 1.17: Caùc loaïi ñaäu chöùa enzyme urease .............................................................................. 25 Hình 1.18: Caáu truùc phaân töû cuûa urea ......................................................................................... 32 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Hình 3.1: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc caát (pH = 6.5) ........................................................... 64 Hình 3.2: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc maùy (pH = 6.8) ......................................................... 64 Hình 3.3: Vò trí chaát chæ thò vaø enzyme urease treân kit ................................................................ 66 DANH SAÙCH HÌNH VEÕ GVHD: TS. Traàn Bích Lam viii Hình 3.4: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau tröôùc khi nhuùng dung dòch urea........ 66 Hình 3.5: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò PR treân kit sau khi nhuùng urea................................. 66 Hình 3.6: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau sau khi nhuùng dung dòch urea 2% .... 67 Hình 3.7: Kit thöû sau khi dung dòch urea chaïy heát kit ................................................................. 67 Hình 3.8: Kit thöû traéng sau khi dung dòch urea chaïy heát kit........................................................ 68 Hình 3.9: Đoà thò NH3 chuaån duøng đeå xaùc đònh hoaït tính urease ................................................. 69 Hình 3.10: Bieåu đoà so saùnh hoaït tính urease trong caùc loaïi dung moâi ....................................... 71 Hình 3.11: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 30µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm................................................ 74 Hình 3.12: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 60µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 – 100ppm, 8 – 50ppm ....................................................................................................................... 75 Hình 3.13: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm ................ 76 Hình 3.14: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 – 1000ppm ........................................................................................................................................ 77 Hình 3.15: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea 0.5% vaø 1%78 Hình 3.16: Caùc böôùc ñònh tính söï coù maët urea trong maãu thöû .................................................... 78 Hình 3.17: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc... 80 Hình 3.18: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc maém ............................................................................................................................................... 81 Hình 3.19: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong söõa..... 83 Hình 3.20: Ñoà thò bieãu dieãn hoaït tính urease treân kit theo thôøi gian .......................................... 86 Hình 3.21: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong söõa .................................................................... 88 Hình 3.22: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong nöôùc maém......................................................... 89 Hình 3.23: Caùch söû duïng kit thöû ñeå phaùt hieän urea trong maãu nöôùc ñaù öôùp thuûy saûn vaø maãu caù ....................................................................................................................................................... 92 DANH SAÙCH BAÛNG BIEÅU GVHD: TS. Traàn Bích Lam ix DANH SAÙÙCH BAÛÛNG BIEÅÅU CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN Baûng 1.1: Thaønh phaàn amino acid cuûa urease đaäu naønh vaø đaäu röïa ........................................... 5 Baûng 1.2: Km vaø vmax cuûa enzyme urease...................................................................................... 13 Baûng 1.3: Giaù trò pHopt ôû caùc loaïi đeäm ........................................................................................ 14 Baûng 1.4: AÛnh höôûng cuûa caùc ion leân hoaït tính urease ............................................................... 18 Baûng 1.6: Haøm löôïng urease trong caùc loaïi đaäu......................................................................... 25 Baûng 1.7: Caùc phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme ......................................................... 28 Baûng 1.8: Tính chaát hoùa lyù cuûa urea............................................................................................ 33 Baûng 1.9: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa söõa boø töôi vaø söõa toång hôïp............................................... 36 Baûng 1.10: Xaùc ñònh haøm löôïng urea theo phöông phaùp Rappoport .......................................... 43 Baûng 1.11: Xaùc ñònh haøm löôïng urea theo phöông phaùp Perkins ............................................... 45 Baûng 1.12: Caùc loại kit thử nhanh chế tạo bởi Tổng cục Kỹ thuật (Bộ Coâng an) ....................... 47 CHÖÔNG 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Baûng 2.1: Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc chaát chæ thò ................................................ 53 Baûng 2.2: Khaûo saùt phaûn öùng hieän maøu trong dung dòch NH4OH .............................................. 53 Baûng 2.3: Khaûo saùt noàng ñoä chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit ................................................... 54 Baûng 2.4: Phöông phaùp laäp ñöôøng NH3 chuaån ............................................................................ 57 Baûng 2.5: Phöông phaùp choïn theå tích chaám enzyme phuø hôïp ..................................................... 59 Baûng 2.6: Phöông phaùp nghieân cöùu löôïng enzyme thích hôïp cho leân kit .................................... 59 Baûng 2.7: Phöông phaùp khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit ...................................................... 60 Baûng 2.8: Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian söû duïng cuûa kit ........................................................ 61 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Baûng 3.1: Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc chaát chæ thò................................................ 65 DANH SAÙCH BAÛNG BIEÅU GVHD: TS. Traàn Bích Lam x Baûng 3.2: Xaây döïng ñöôøng chuaån NH3......................................................................................... 68 Baûng 3.3: Keát quaû ño hoaït tính enzyme urease ............................................................................ 69 Baûng 3.4: Hoaït tính cuûa urease trong caùc dung moâi khaùc nhau ................................................. 70 Baûng 3.5: Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit ............................................................ 72 Baûng 3.6: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau ....................................................................................................................................................... 73 Baûng 3.7: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau khi taêng soá laàn chaám urease leân kit .............................................................................................. 74 Baûng 3.8: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit khi thay ñoåi löôïng urease/kit ........................... 75 Baûng 3.9: Caùc thoâng soá cheá taïo cuûa kit ....................................................................................... 76 Baûng 3.10: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong caùc dung dòch urea coù noàng ñoä thaáp ... 77 Baûng 3.11: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa dung dòch urea tröôùc vaø sau khi cho urease .............. 79 Baûng 3.12: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa nöôùc maém chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease .... 80 Baûng 3.14: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa söõa chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease ............... 82 Baûng 3.15: Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit.......................................................................... 84 Baûng 3.16: Khaûo saùt hoaït tính cuûa urease treân kit theo thôøi gian .............................................. 86 Baûng 3.17: Khaûo saùt söï coù maët cuûa urea trong söõa..................................................................... 88 Baûng 3.18: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa caùc maãu nöôùc maém .................................................... 90 Baûng 3.19: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän urea cuûa kit trong thuûy saûn ....................................... 93 LÔØI MÔÛ ÑAÀU GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 1 LÔØØI MÔÛÛ ÑAÀÀU “AÊn ngon maëc ñeïp” laø nhu caàu khoâng theå thieáu cuûa con ngöôøi. Thöïc phaåm hieän nay ñoøi hoûi khoâng chæ ngon maø coøn phaûi baét maét, thu huùt ngöôøi tieâu duøng, do ñoù maø ngaønh coâng ngheä sau thu hoaïch ra ñôøi vôùi muïc ñích taïo ra giaù trò cho thöïc phaåm nhö baûo toaøn giaù trò dinh döôõng, taêng giaù trò caûm quan, ñaûm baûo an toaøn veä sinh thöïc phaåm, tieän duïng…Caùc giaù trò naøy khoâng taùch rôøi nhau; coù taùc ñoäng taêng hay buø tröø nhau nhöng toång theå phaûi taïo ra giaù trò gia taêng cho saûn phaåm. Tuy nhieân, ôû moät soá loaïi thöïc phaåm maø giaù trò caûm quan hay dinh döôõng ñoùng vai troø quan troïng thì ngöôøi baùn ñaõ söû duïng nhöõng thuû thuaät khoâng ñöôïc pheùp söû duïng nhö phun hoùa chaát ñeå laøm boùng traùi caây, ngaâm thòt gia suùc hay gia caàm trong dung dòch haøn the, öôùp urea cho thuûy saûn ñeå nhìn beà ngoaøi troâng töôi laâu hôn, cho urea vaøo trong nöôùc maém ñeå laøm taêng ñoä ñaïm…Nhöõng thuû thuaät “haøng chôï” naøy khoâng chæ ñaùnh löøa ngöôøi tieâu duøng trong vieäc mua caùc saûn phaåm thöïc phaåm khoâng coøn töôi ngon, khoâng ñuû chaát dinh döôõng maø coøn coù nguy cô aûnh höôûng tôùi söùc khoûe. Hieän nay, coâng taùc kieåm tra veä sinh an toaøn thöïc phaåm coøn nhieàu baát caäp, thieáu phöông tieän, chöa ñöôïc tieán haønh roäng raõi, vì vaäy ngöôøi tieâu duøng caàn chuû ñoäng traùnh mua thöïc phaåm keùm chaát löôïng, khoâng an toaøn. Moät bieän phaùp deã thöïc hieän daønh cho moïi ngöôøi laø söû duïng kit thöû nhanh ñeå kieåm tra söï coù maët cuûa moät hoùa chaát ñoäc haïi trong thöïc phaåm ngay khi vöøa mua veà vì ñôn giaûn, deã söû duïng, giaù thaønh reû vaø thôøi gian phaùt hieän ngaén. Kit thöû nhanh cuõng laø phöông tieän giuùp cho coâng taùc kieåm tra nhanh chaát löôïng thöïc phaåm ôû caáp cô sôû. Hieän nay, treân thò tröôøng coù baùn nhieàu loaïi kit thöû nhanh nhöng ña phaàn laø caùc kit ngoaïi chöa phuø hôïp laém vôùi ñieàu kieän cuûa Vieät Nam, khi söû duïng phaûi ñong, ño hoùa chaát töø caùc loï nhoû ñoùng saün, vì vaäy khoâng loaïi tröø ñöôïc sai soá chuû quan do ngöôøi söû duïng gaây ra. Trong soá caùc kit noäi baùn treân thò tröôøng chöa coù loaïi kit duøng ñeå phaân tích urea trong thöïc phaåm. Vôùi lyù do ñoù, chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu cheá taïo kit thöû nhanh duøng trong phaân tích urea trong khuoân khoå baøi luaän vaên naøy. Noäi dung nghieân cöùu goàm 2 phaàn chính:  Cheá taïo kit thöû nhanh duøng ñeå phaân tích urea döïa treân nguyeân taéc söû duïng enzyme urease ñeå thuûy phaân ñaëc hieäu urea.  ÖÙng duïng kit thöû ñeå phaân tích urea trong caùc maãu thöïc. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 2 CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 3 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 1.1.1. Danh phaùp quoác teá vaø phaân loaïi [2]  Danh phaùp: Urease coù teân heä thoáng laø carbamine amidohydrolase töùc laø enzyme xuùc taùc cho quaù trình thuûy phaân urea thaønh ammonia vaø khí cacbonic theo phöông trình phaûn öùng sau:  Phaân loaïi: Trong baûng phaân loaïi enzyme theo quy öôùc quoác teá, urease mang maõ soá EC 3.5.1.5 trong đoù:  Soá 3: chæ nhoùm chính laø nhoùm hydrolase (nhoùm caùc enzyme thuûy phaân nhö esterase, carbohydrase, peptidase, amidase…)  Soá 5: chæ nhoùm phuï enzyme taùc duïng leân lieân keát C–N, khaùc lieân keát peptid (asparaginase, glutaminase, urease…)  Soá 1: chæ phaân nhoùm phuï caét caùc amid thaúng (amidohydrolase).  Soá 5: chæ soá thöù töï cuûa urease trong phaân nhoùm phuï. 1.1.2. Tính chaát vaät lyù cuûa enzyme urease Urease laø enzyme laàn đaàu tieân đöôïc J.B.Sumner taùch chieát vaø keát tinh töø đaäu röïa (jack bean – Canavalia ensiformis) vaøo naêm 1926 [37]. Vaø chính coâng trình nghieân cöùu naøy đaõ đoaït giaûi Nobel vaøo naêm 1946 đoàng thôøi cuõng đaêït neàn taûng đaàu tieân cho caùc coâng trình nghieân cöùu veà urease sau naøy. Urease laø caùc tinh theå coù 8 caïnh, khoâng maøu, trong suoát, quan saùt đöôïc qua kính hieån vi vaø coù đöôøng kính d = 4 – 30µm tuøy theo phöông phaùp chieát taùch. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 4 Hình 1.1: Tinh theå urease ñöôïc J.B.Summer chieát taùch vaø keát tinh [37] Khoái löôïng phaân töû cuûa urease đöôïc 2 nhaø nghieân cöùu Joseph vaø Evelyn xaùc đònh baèng phöông phaùp loïc gel treân coät Agarose A_15m đoái vôùi urease đaäu röïa vaø đaäu naønh Brasil vaø so saùnh vôùi caùc protein đaõ bieát tröôùc khoái löôïng phaân töû [17]. Keát quaû cho thaáy urease töø đaäu naønh coù 2 peak öùng vôùi 2 phaân töû löôïng khaùc nhau đoù laø 540.000 Da vaø 420.000 Da, trong khi đoù urease töø đaäu röïa chæ xuaát hieän 1 peak duy nhaát vôùi phaân töû löôïng laø 480.000 Da. Hình 1.2: Khoái löôïng phaân töû cuûa urease qua coät loïc gel Agarose A_15m [17] Nhö vaäy, urease töø nhöõng nguoàn khaùc nhau coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau vaø ngay caû trong cuøng moät nguoàn laø đaäu naønh, coù tôùi 2 loaïi urease. Hai loaïi urease naøy khaùc nhau ôû thaønh phaàn apoenzyme nhöng baûn chaát cuûa coenzyme vaãn khoâng thay đoåi. Caùc apoenzyme laø nhöõng chuoãi polypeptide đöôïc hình thaønh töø nhieàu acid amin. Thaønh phaàn caùc acid amin naøy khoâng CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 5 gioáng nhau ôû nhöõng nguoàn khaùc nhau đaõ giaûi thích cho söï khaùc nhau veà khoái löôïng phaân töû nhö đaõ noùi ôû treân. Baûng 1.1: Thaønh phaàn amino acid cuûa urease đaäu naønh vaø đaäu röïa [17] a – Döõ lieäu do Joseph vaø Evelyn khaûo saùt b – Döõ lieäu đeå so saùnh (do Staples vaø Reithel khaûo saùt). Enzyme urease coù caáu truùc baäc 4. Theo nghieân cöùu cuûa Kunio TAKISHIMA, Tatsuko SUGA, Gunji MAMIYA (1988), enzyme urease ñaäu röïa coù 840 acid amine. Khoái löôïng phaân töû töông ñoái cuûa 1 tieåu ñôn vò protein laø 90770 Da, töø ñoù suy ra phaân töû urease goàm coù 6 tieåu ñôn vò. Coù 13 trong soá 25 histidine naèm taäp trung trong vuøng acid amine 479 ñeán 607 do ñoù vuøng naøy coù theå chöùa nikel. Cys•592, acid amine caàn thieát cho hoaït tính cuûa enzyme cuõng naèm trong vuøng giaøu histidine naøy. [23] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 6 Hình 1.3: Caáu truùc cuûa enzyme urease 1.1.3. Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme urease Theo Sumner, caùc tinh theå urease hoøa tan deã daøng trong dung dòch ammonia loaõng vaø dung dòch kieàm loaõng, coù theå hoøa tan hoaëc ñoâng tuï trong dung dòch muoái loaõng vaø acid höõu cô tuøy thuoäc noàng ñoä acid. [37] Sumner vaø Hand đaõ xaùc đònh đöôïc đieåm đaúng đieän cuûa urease naèm trong khoaûng pH = 5.0 – 5.1. Taïi đieåm đaúng đieän, đoä hoøa tan cuûa urease laø cöïc nhoû. Urease cuõng mang nhöõng đaëc tính cuûa protein nhö:  Tan trong nöôùc vaø dung dòch muoái loaõng.  Khoâng đi qua đöôïc maøng thaåm tích vì coù kích thöôùc phaân töû lôùn.  Tan khi coù lôùp aùo nöôùc vaø tích đieän, tuûa khi maát lôùp aùo nöôùc vaø trung tính.  Bò bieán tính döôùi taùc duïng cuûa caùc yeáu toá nhö acid, kieàm đaëc, caùc ion kim loaïi naëng vaø nhieät đoä cao…Khi đoù, urease maát tính xuùc taùc sinh hoïc, maát khaû naêng hoøa tan trong nöôùc, maát khaû naêng keát tinh vaø caùc tính chaát hoùa lyù khaùc nhau (đoä nhôùt, söùc caêng beà maët…), bieán đoåi hình daïng vaø kích thöôùc, deã bò phaân huûy bôûi protease.  Deã bò tuûa thuaän nghòch trong caùc dung moâi höõu cô nhö ethanol, acetone…hoaëc muoái ammonium sulfate, sodium chloride.  Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme coù theå thay đoåi khi keát hôïp vôùi moät soá chaát nhö cô chaát, coenzyme, ion kim loaïi hoaëc moät soá chaát höõu cô đaëc hieäu khaùc.  Phaân töû enzyme coù theå toàn taïi ôû caùc traïng thaùi ion nhö anion, cation hoaëc trung hoøa tuøy theo pH cuûa moâi tröôøng. 1.1.4. Trung taâm hoaït ñoäng CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 7 Trung taâm hoaït đoäng cuûa enzyme bao goàm caùc amino acid coù nhoùm hoùa hoïc hoaït đoäng maïnh. Caùc nhoùm hoùa hoïc hoaït đoäng naøy coù khaû naêng gaén vôùi cô chaát đeå taïo thaønh phöùc chaát enzyme – cô chaát. Caùc goác amino acid thöôøng khoâng naèm caïnh nhau trong chuoãi polypeptide nhöng do thöïc teá chuoãi polypeptide toàn taïi ôû traïng thaùi khoâng gian (caáu truùc caáp ba vaø boán) neân caùc amino acid thöôøng toàn taïi gaàn nhau. Ngoaøi ra trong trung taâm hoaït đoäng coøn coù maët cuûa ion kim loaïi. Caùc ion kim loaïi coù vai troø xuùc taùc raát lôùn, coù taùc duïng lieân keát giöõa enzyme vaø cô chaát hoaëc apoenzyme vaø coenzyme hoaëc tham gia vaøo quaù trình vaän chuyeån đieän töû. [2] Đaëc đieåm chung cuûa caùc hydrolase laø khoâng coù nhoùm ngoaïi neân taâm hoaït đoäng cuûa chuùng phaûi coù caùc goác acid amin đaëc hieäu. Taâm hoaït đoäng cuûa hydrolase thöôøng chöùa voøng imidazol cuûa histidine vaø nhoùm hydroxyl cuûa serine. Do caáu truùc baäc 3 cuûa enzyme/protein maø voøng imidazol vaø nhoùm hydroxyl naøy gaàn nhau hình thaønh neân lieân keát hydro nhö hình veõ sau: Sumner chöùng minh raèng urease laø enzyme khoâng coù baát cöù cofactor höõu cô naøo maø cuõng khoâng coù saét, manganese hay phosphorus [37]. Theo E. Jabri, M.B. Carr, R.P. Hausinger, P.A. Karplus thì trung taâm hoaït đoäng cuûa urease coù chöùa 2 nguyeân töû Ni. Urease coù đoä tinh khieát cao coù khoaûng 2g nguyeân töû Ni treân 1 tieåu đôn vò. Hai nguyeân töû Ni lieân keát vôùi nhau thoâng qua caàu noái carbamate. Moãi nguyeân töû Ni đöôïc noái vôùi 2 nguyeân töû N trong voøng imidazole vaø 1 nhoùm carboxylate, 1 phaân töû H2O (hình 1.4). Vaø chính 2 nguyeân töû Ni naøy đoùng vai troø raát quan troïng trong vieäc xuùc taùc phaûn öùng cuûa urease. Đoù cuõng chính laø lí do maø urease coøn đöôïc goïi laø “Nikel dependent enzyme”. [12] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 8 Hình 1.4: Trung taâm hoaït đoäng cuûa urease (Ni: 2 quaû caàu maøu xanh) [9][39] Tuy nhieân urease coù caùc nguoàn goác khaùc nhau nhö urease töø vi khuaån Bacillus pasteurii trong trung taâm hoaït đoäng chöùa ion kim loaïi Zn2+ [31], coøn ôû Klebsiella aerogenes coù cofactor laø Cu2+ [36] nhö hình beân döôùi: Hình 1.5: Urease töø K.aerogenes vaø töø Bacillus pasterrii ÔÛ pH trung tính, EDTA coù theå đöôïc söû duïng đeå baûo veä enzyme khoûi caùc kim loaïi taïp trong quaù trình tinh saïch. Tuy nhieân, ôû pH thaáp (3.6 – 4.0), EDTA coù theå khoâng nhöõng thuùc đaåy söï maát Ni maø coøn öùc cheá khoâng thuaän nghòch hoaït tính cuûa enzyme. [11] Ngoaøi ra, trong trung taâm hoaït đoäng cuûa urease coøn chöùa nhoùm –SH, baèng chöùng laø hoaït tính urease bò öùc cheá khi caùc nhoùm –SH bò khoùa. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 9 1.1.5. Cô cheá xuùc taùc Naêm 1913, hai nhaø khoa hoïc Leonom Michaelis vaø Maud Menten đöa ra moâ hình đoäng hoïc đeå giaûi thích phaûn öùng đöôïc xuùc taùc bôûi enzyme. Theo moâ hình naøy, enzyme vaø cô chaát seõ keát hôïp vôùi nhau, taïo neân phöùc hôïp enzyme – cô chaát (ES). Phöùc hôïp ES seõ laïi đöôïc chuyeån hoùa tieáp tuïc đeå taïo thaønh saûn phaåm (P) vaø giaûi phoùng enzyme (E). Enzyme đöôïc giaûi phoùng laïi thöïc hieän nhöõng phaûn öùng môùi. [2] Hoaït đoäng xuùc taùc cuûa trung taâm hoaït đoäng (TTHÑ) cuûa enzyme coù lieân quan đeán cô chaát vaø quan đieåm đöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc chaáp nhaän laø thuyeát trung taâm hoaït đoäng cuûa Koshland. Theo thuyeát naøy, trung taâm hoaït đoäng cuûa enzyme chæ đöôïc taïo thaønh khi coù söï taùc đoäng caûm öùng cuûa cô chaát, đònh höôùng thích hôïp đeå cô chaát gaén chính xaùc vaøo vaø thöïc hieän quaù trình xuùc taùc. Hình 1.6: Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme Đoái vôùi enzyme urease, cô cheá cuûa quaù trình xuùc taùc phaûn öùng theo phöông trình: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 10 Cuï theå xaûy ra ôû trung taâm hoaït đoäng nhö sau: Hình 1.7: Cô cheá xuùc taùc cuûa urease Theo sô đoà treân ta thaáy: ban đaàu phaân töû urea seõ taán coâng vaø taïo lieân keát vôùi 2 nguyeân töû Ni đoàng thôøi coù 2 phaân töû H2O đöôïc giaûi phoùng ra. Tieáp theo laø söï saép xeáp laïi cuûa caùc đieän töû, hình thaønh nhöõng moái lieân keát môùi taïi trung taâm hoaït đoäng. Cuoái cuøng laø söï taùi caáu truùc ôû trung taâm hoaït đoäng cuûa urease vôùi söï tham gia cuûa 2 phaân töû nöôùc, đaåy goác carbamate ra ngoaøi đoàng thôøi giaûi phoùng 1 phaân töû NH3. Nhö vaäy, vai troø cuûa 2 ion kim loaïi Ni laø raát quan troïng trong vieäc taïo lieân keát giöõa enzyme vôùi cô chaát ôû giai đoaïn taïo phöùc chaát trung gian. Đaây chính laø moät cofactor cuûa urease. Moät soá taùc giaû cho raèng vai troø cuûa 2 nguyeân töû Ni khaùc nhau. Moät nguyeân töû Ni giöõ nhieäm vuï lieân keát vaø hoaït hoùa phaân töû urea, nguyeân töû Ni coøn laïi giöõ nhieäm vuï lieân keát vaø hoaït hoùa phaân töû nöôùc aùi nhaân. [6] 1.1.6. Cô chaát cuûa urease Vieäc khaùm phaù ra daõy cô chaát cuûa enzyme urease khaù quan troïng trong vieäc moâ taû vai troø cuûa trung taâm hoaït đoäng Ni2+ trong quaù trình xuùc taùc. Moät soá cô chaát đöôïc bieát đeán cuûa enzyme urease laø: [6]  Urea CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 11  Semicarbazide  Formamide  Acetamide  N – Methylurea  N – Hydroxyurea  Dihydroxyurea  N – Benzoylphosphoric triamide  Phosphoramidate (hình 1.a)  Diamidophosphate (hình 1.b)  Phosphoric triamide (hình 1.c)  Phenyl phosphorodiamidate (Ar = Ph, PPD) (hình 1.d)  N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H3C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e) Trong đoù urea laø cô chaát đaëc hieäu cuûa urease vôùi naêng löôïng hoaït hoùa laø 8700 hoaëc 11700 calories/g.mol ôû 25oC coøn đoái vôùi caùc cô chaát nhö hydroxyurea hoaëc dihydroxyurea thì vaän toác nhoû hôn 120 laàn. Phaân töû urea raát beàn. Trong khoaûng pH = 2 – 12, söï phaân huûy urea khoâng enzyme trong dung dòch khoâng phuï thuoäc pH vaø coù chu kyø baùn huûy laø 3.6 naêm ôû 38oC. Ngöôøi ta chöùng minh raèng phaûn öùng naøy laø phaûn öùng khöû maø saûn phaåm duy nhaát laø ammonia vaø acid cyanic. Toác đoä khöû taêng khi pH > 12 vaø giaûm khi pH < 2. Neáu coù söï tham gia cuûa enzyme, enzyme seõ chuyeån phaûn öùng khöû thaønh phaûn öùng thuûy phaân vaø đieàu naøy noùi leân vai troø quan troïng cuûa Ni2+ nhö 1 acid Lewis trong tính chaát hoùa hoïc cuûa urease. Hay noùi caùch khaùc enzyme đaõ choáng laïi söï phaân huûy vaø taïo đieàu kieän cho urea bò nöôùc hay ion OH– taán coâng đeå taïo ra carbamate. Hình 1.8: Coâng thöùc caáu taïo cuûa moät soá cô chaát chöùa phospho cuûa urease CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 12 1.1.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng cuûa urease 1.1.7.1. AÛnh höôûng cuûa noàng đoä enzyme: [1][37] Noùi chung trong đieàu kieän thöøa cô chaát, vaän toác phaûn öùng phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng đoä enzyme: V = k . [E], V: vaän toác phaûn öùng, [E]: noàng đoä enzyme. Tuy nhieân, dung dòch enzyme urease loaõng deã bò maát hoaït tính hôn dung dòch coù noàng ñoä cao vôùi ñieàu kieän laø enzyme phaûi ñöôïc baûo quaûn laïnh. Cuõng coù tröôøng hôïp khi noàng đoä enzyme quaù lôùn, vaän toác phaûn öùng taêng chaäm. 1.1.7.2. Aûnh höôûng cuûa noàng đoä cô chaát, moâ hình Michaelis_Menten: [1][53] Phöông trình Michaelis_Menten: ]S[K ]S[vv m max    Trong đoù: Km: haèng soá Michaelis, laø haèng soá aùi löïc cuûa enzyme đoái vôùi cô chaát hay noàng đoä cô chaát đuû laøm cho toác đoä phaûn öùng đaït đeán ½ toác đoä cöïc đaïi, đaëc tröng cuûa moãi loaïi enzyme đoái vôùi moãi loaïi cô chaát. vmax: vaän toác phaûn öùng đaït cöïc đaïi. [S]: noàng đoä cô chaát Hình 1.9: Đoà thò bieåu dieãn vaän toác phaûn öùng theo noàng đoä cô chaát Töø phöông trình ta coù theå xeùt đeán 3 tröôøng hôïp:  Neáu [S] << Km thì: m max K ]S[vv  . Nhö vaäy, ôû noàng đoä cô chaát thaáp, v phuï thuoäc tuyeán tính vaøo [S]. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 13  Neáu [S] >> Km thì: v = vmax: töùc vaän toác phaûn öùng đaït cöïc đaïi, khoâng phuï thuoäc [S]. Nhö vaäy [S] đaõ đuû lôùn đeán möùc naøo đoù, neáu tieáp tuïc taêng [S], v cuõng khoâng taêng theo.  Neáu [S] = Km thì v = vmax/2: vaän toác phaûn öùng baèng nöûa vaän toác cöïc đaïi. Hoaëc ta cuõng coù theå xaùc đònh Km vaø Vmax theo phöông trình đöôïc vieát laïi töø phöông trình treân nhö sau: ]S[ 1 v K v 1 v 1 max m maxi  Töø đoù ta seõ bieåu dieãn söï phuï thuoäc cuûa 1/vi theo 1/[S] baèng moät phöông trình đöôøng thaúng vaø xaùc đònh Km, Vmax. Moät soá giaù trò Km vaø vmax cuûa urease trong caùc nghieân cöùu đöôïc cho baûng sau: Baûng 1.2: Km vaø vmax cuûa enzyme urease [53] Nguoàn goác pH Nhieät đoä (oC) Dung dòch đeäm Km (mol/l) vmax Đaäu naønh 7.0 25 Phosphate 19×10-3 10.5×10-6 (mol/l/s) Đaäu naønh 7.0 25 Sulfite 476×10-3 37×10-6(mol/l/s) Đaäu naønh 7.0 25 Thiosulfate 56×10-3 17.2×10-6(mol/l/s) 1.1.7.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät đoä: Gioáng nhö phaûn öùng hoùa hoïc, khi nhieät đoä taêng, vaän toác chuyeån đoäng cuûa caùc phaân töû taêng, söï tieáp xuùc giöõa caùc phaân töû cuõng taêng neân vaän toác phaûn öùng taêng. Tuy nhieân do baûn chaát enzyme laø protein neân nhieät đoä cao seõ laøm bieán tính protein, enzyme maát hoaït tính [1]. Do đoù, moãi enzyme seõ toàn taïi moät nhieät đoä maø ôû đoù hoaït tính cao nhaát, goïi laø nhieät đoä toái thích topt. Theo caùc nghieân cöùu töø đaäu röïa (jack bean) thì nhieät đoä topt vaøo khoaûng 45-50oC, khi nhieät đoä vöôït quaù 65oC thì hoaït tính urease bò giaûm vaø coù theå maát haún khi nhieät đoä đaït 85oC [17]. Tuy nhieân nhieät đoä topt cuûa urease khoâng coá đònh, maø noù phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö: nguoàn thu nhaän, noàng đoä enzyme, noàng đoä cô chaát, pH, thôøi gian phaûn öùng… Ngöôøi ta đaõ thaáy raèng đoä beàn nhieät cuûa urease taêng khi coù maët cô chaát hoaëc chaát oån đònh, chaát hoaït hoùa nhö L_cysteine, 2_mercaptoethanol...Urease ôû dung dòch loaõng khoâng coù cô chaát thöôøng keùm beàn nhieät nhaát, coøn ôû daïng boät khoâ vaø coù cô chaát thì khaù beàn nhieät [9]. ÔÛ nhieät đoä thaáp, hoaït tính cuûa urease giaûm nhöng khoâng bò bieán tính. 1.1.7.4. AÛnh höôûng cuûa pH vaø dung dòch ñeäm: [1][16] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 14 Enzyme raát nhaïy caûm vôùi söï bieán đoåi pH cuûa moâi tröôøng do pH aûnh höôûng đeán söï phaân ly ion cuûa phaân töû cô chaát. Do đoù moãi enzyme coù moät pH maø hoaït tính cuûa noù đaït cöïc đaïi, goïi laø pH toái thích (pHopt). Khi pH caøng xa pHopt thì hoaït tính caøng giaûm. Trong ñeäm phosphate, urease hoaït ñoäng toát trong khoaûng pH 5 – 9, trong ñeäm citrate laø pH 4 – 8.5, trong ñeäm acetate laø pH döôùi 3 – 7.5. Hoaït tính cao nhaát cuûa urease theo nghieân cöùu cuûa Stacey F. Howell and James B. Sumner laø vôùi dung dòch urea 1% trong ñeäm citrate M/8 pH 6.5. [16]. Nhö vaäy, hoaït tính cuûa urease phuï thuoäc vaøo dung dòch đeäm, giaù trò pH, noàng đoä urea, nhieät đoä, noàng ñoä muoái… Baûng 1.3: Giaù trò pHopt ôû caùc loaïi đeäm [16] Noàng đoä urea (%) Loaïi đeäm pHopt 2.5 Acetate Citrate Phosphate 6.4 6.5 6.9 0.1 Acetate Citrate Phosphate 6.7 6.7 7.6 Hình 1.10: Đoà thò hoaït tính urease theo pH trong 3 loaïi đeäm noàng ñoä M/8 [16] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 15 1.1.7.5. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa, chaát öùc cheá: Moãi enzyme đeàu toàn taïi moät soá hôïp chaát voâ cô hoaëc höõu cô maø söï coù maët cuûa chuùng coù khaû naêng kích thích hoaëc kìm haõm hoaït đoäng cuûa enzyme, goïi laø chaát kích thích (chaát hoaït hoùa) vaø chaát kìm haõm (chaát öùc cheá). Tuy nhieân khoâng coù söï phaân bieät roõ raøng chaát öùc cheá vaø kìm haõm vì moät chaát coù theå laø kích thích vôùi enzyme naøy nhöng laø kìm haõm cuûa enzyme khaùc hoaëc ôû noàng đoä naøy laø kích thích, noàng đoä khaùc laø kìm haõm [1].  Cô cheá taùc duïng cuûa chaát hoaït hoùa: [1][2] Caùc chaát hoaït hoùa coù theå laø chaát bieán enzyme töø traïng thaùi khoâng hoaït đoäng sang traïng thaùi hoaït đoäng, coù theå laø caùc chaát dò laäp theå döông hoaëc caùc chaát coù khaû naêng bieán tieàn enzyme khoâng hoaït đoäng sang hoaït đoäng maïnh. Caùc chaát naøy coù theå laø caùc anion, caùc ion kim loaïi töø oâ thöù 11 đeán oâ thöù 55 trong baûng tuaàn hoaøn Mendeleev, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp, coù theå đoùng vai troø nhoùm ngoaïi cuûa caùc enzyme 2 caáu töû hoaëc tham gia vaøo caáu taïo cuûa coenzyme, hoaëc laø noái giöõa enzyme vôùi cô chaát, hoaëc laø caàu noái giöõa phaàn apoenzyme vôùi coenzyme. Theo caùc nghieân cöùu thì nhoùm –SH (sulfuhydryl) cuûa cysteine laø nhoùm chöùc naêng thöôøng coù maët trong trung taâm hoaït đoäng cuûa phaân töû urease neân nhöõng chaát coù taùc duïng phuïc hoài nhoùm chöùc naêng naøy đeàu coù taùc duïng laøm hoaït hoùa urease nhö glutation daïng khöû hay L_cysteine. Nhoùm –SH chòu söï oxy hoùa döôùi taùc đoäng cuûa nhieàu yeáu toá trong đoù coù oxy khoâng khí. Tuy nhieân söï oxy hoùa töï nhieân bôûi oxy phaân töû chæ xaûy ra vôùi toác đoä đaùng keå khi coù maët ion kim loaïi xuùc taùc đaëc bieät laø saét vaø đoàng. Khi duøng EDTA đeå keát hôïp nhöõng veát kim loaïi naøy trong dung dòch thöôøng laøm taêng tính oån đònh cuûa urease noùi rieâng vaø caùc enzyme chöùa nhoùm –SH noùi chung. Nhö vaäy, baèng caùch giaùn tieáp, EDTA–Na2 cuõng laø moät chaát hoaït hoùa enzyme. Do ño,ù trong tinh saïch enzyme, ñeå baûo veä urease khoûi caùc kim loaïi taïp ngöôøi ta thöôøng duøng EDTA.  Cô cheá taùc duïng cuûa chaát öùc cheá: Caùc chaát kìm haõm ngöôïc laïi laø caùc chaát coù taùc duïng bieán enzyme töø traïng thaùi hoaït đoäng sang khoâng hoaït đoäng, hoaëc töø traïng thaùi hoaït đoäng maïnh sang hoaït đoäng yeáu. Caùc chaát naøy coù theå laø dò laäp theå aâm, toàn taïi hai loaïi kìm haõm: caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh. [1][2] Ngöôøi ta chöùng minh raèng cô cheá vaø tính chaát ñoäng hoïc cuûa hoaït ñoäng öùc cheá ñoái vôùi enzyme urease töø vi khuaån vaø ñaäu röïa laø nhö nhau. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 16 Nhöõng chaát öùc cheá maïnh nhaát enzyme urease bao goàm phosphoroamides, acetohydroxamic acid vaø kim loaïi naëng trong ñoù caùc hôïp chaát thiols coù tính öùc cheá yeáu hôn [10][36][50]. Trong nhöõng chaát öùc cheá ñöôïc ñeà caäp ôû treân thì acetohydroxamic ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát vì tính hieäu quaû vaø khoâng ñoäc cuûa noù, thöôøng ñöôïc söû duïng trong vieäc chöõa caùc beänh gaây ra bôûi vi khuaån sinh urease. Hình 1.11: AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh  ÖÙc cheá caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát kìm haõm coù caáu truùc töông đoàng vôùi cô chaát, vì vaäy cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme, giaûm moái lieân keát giöõa enzyme vaø cô chaát. [1][2] Đoái vôùi urease thì hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid laø nhöõng chaát öùc cheá đaëc hieäu caïnh tranh cuûa urease. Vì chuùng coù caáu taïo gaàn gioáng cô chaát neân chuùng cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme. Do đoù söï coù maët cuûa chuùng trong dung dòch laøm giaûm toác đoä phaûn öùng thuûy phaân urea. Coù theå laøm giaûm taùc duïng cuûa nhöõng chaát öùc cheá naøy baèng caùch taêng noàng đoä cô chaát urea. Ví duï ñoái vôùi hydroxamic acid, cô cheá öùc cheá nhö sau: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 17 Cuï theå nhö sau: Hình 1.12: Cô cheá öùc cheá cuûa hydroxamic acid vôùi urease [9] Hydroxamic acid do coù caáu taïo gaàn gioáng urea neân noù taán coâng vaøo trung taâm hoaït đoäng cuûa urease laø 2 quaû caàu Ni vaø đaõ “khoùa” chaët 2 quaû caàu naøy. Trong nhoùm caùc chaát öùc cheá caïnh tranh enzyme urease coøn coù phosphoroamides, acetohydroxamic acid, acid boric, sodium tetraborate…  ÖÙc cheá khoâng caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát öùc cheá coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme hoaëc cô chaát.  Ion kim loaïi [38] Caùc ion kim loaïi nhö Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+…

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfBao cao LVTN - Kit thu nhanh - Thanh Tam.pdf