Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene

Trang nhan đề Lời cảm ơn Mục lục Danh mục Phần 1: Giới thiệu đề tài Phần 2: Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa Phần 3: Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào Phần 4: Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene Phần 5: Kết quả và thảo luận Phần 6: Thực nghiệm Tài liệu tham khảo MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời Cảm Ơn . I MỤC LỤC II DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ IX DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ X 1. Giới thiệu đề tài . 1 2. Giới thiệu một số phương pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 2.1 Khái niệm về gốc tự do . 3 2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể 3 2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể . 4 2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 6 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 6 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 7 2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA 9 2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) 10 2.4.5 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 10 2.4.5.1 Giới thiệu . 10 2.4.5.2 Cấu tạo . 10 2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO . 10 2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO 11 3. Giới thiệu phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 12 III 3.1 Nuôi cấy tế bào 12 3.2 Các phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào . 13 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào . 13 3.2.2 Phương pháp SRB . 13 4. Tổng quan các chất nghiên cứu thuộc họ lignan và stilbene 14 4.1 Lignan 14 4.1.1 Isotaxiresinol (ITR) 15 4.1.2 Secoisolariciresinol (SSR) . 15 4.2 Stilbene 16 4.2.1 Resveratrol (RES) . 17 4.2.2 Pterostilbene (PTS) . 18 4.2.3 Piceatannol (PI) 19 5. Kết quả và thảo luận 21 5.1 Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa 21 5.1.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 21 5.1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 25 5.1.3 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 27 5.1.4 Tóm tắt kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa 28 5.2 Kết quả nghiên cứu độc tính tế bào . 31 5.2.1 Isotaxiresinol . 31 5.2.2 Secoisolariciresinol . 34 5.2.3 Resveratrol, Pterostilbene và Piceatannol 37 5.2.4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu độc tính tế bào 42 6. Thực nghiệm . 45 6.1 Hóa chất và dụng cụ 45 6.1.1 Hóa chất 45 IV 6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 46 6.1.3 Chuẩn bị mẫu 47 6.1.4 IC50 và cách xác định 48 6.1.4.1 Định nghĩa 48 6.1.4.2 Cách xác định IC50 . 48 6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 49 6.2.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH . 49 6.2.1.1 Nguyên tắc . 49 6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH 49 6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất . 50 6.2.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 51 6.2.2.1 Nguyên tắc . 51 6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất . 52 6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO . 52 6.2.3 Phương pháp ức chế enzyme XO . 54 6.2.3.1 Nguyên tắc . 54 6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất . 54 6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO . 54 6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào . 56 6.3.1 Phương pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào . 56 6.3.2 Phương pháp SRB . 57 7. Tài Liệu Tham Khảo . 63

pdf16 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 12950 | Lượt tải: 30download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và độc tính tế bào của một số hợp chất lignan và stilbene, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
45 6. Thực nghiệm 6.1 Hóa chất và dụng cụ 6.1.1 Hóa chất - Isotaxirecinol (ITR) Cô lập từ gỗ thông đỏ T.wallichiana - Secoisolaricirecinol (SSR) Cô lập từ gỗ thông đỏ T.wallichiana - Resveratrol (RES) Sigma Aldrich - Pterostilbene (PTS) Sigma Aldrich - Piceatannol (PIC) Sigma Aldrich - Natri nitroprussid Trung Quốc - N-1-napthylethylendiamindihydrochlorid Merck - Sulfanilamid Trung Quốc - HNO3 Trung Quốc - H3PO4 Trung Quốc - NaOH Trung Quốc - Na2HPO4.12H2O Trung Quốc - NaH2PO4.2H2O Trung Quốc - DPPH Merck - Ethanol (99,7%) Trung Quốc - HCl Trung Quốc - Bovine milk xanthine oxidase Sigma Aldrich - Xanthine Kanto chemical - Allopurinol Sigma Aldrich - Quercetin Sigma Aldrich - Trypsin Lonza - Versene Gibco - Acetic acid Merck - McCoy’s 5A Gibco - Gentamicin Gibco - Phosphate buffer saline (PBS) Gibco 46 - Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich - Dòng tế bào DLD-1 American Type 6.1.2 Dụng cụ thí nghiệm - Ống nghiệm 10 mL có nắp đậy. - Típ nhựa 2ml. - Pipet 10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL. - Micropipet. - Becher 1000 mL,100 mL, 50 mL. - Bình định mức 100 mL, 50 mL. - Đũa thủy tinh. - Máy chỉnh pH. - Máy quang phổ UV-VIS Shimadzu 1800 với phần mềm điều khiển UV-Winlab. - Cân phân tích. - Cuvet thủy tinh và cuvet thạch anh. - Multichanel pipet. - Máy quang phổ UV-VIS cho đọc đĩa 96 giếng Synergy Biotek với phần mềm điều khiển KC4. - Máy lắc đĩa. - Tủ ủ CO2. - Kính hiển vi hình ảnh với giá đỡ cho chụp hình đĩa 24 hoặc 96 giếng Leica DM IRB kết hợp với phần mềm i-View 32. - Đĩa 96 giếng đáy phẳng Nunc. - Đĩa 24 giếng đáy phẳng Nunc. - Máy đếm tế bào RAMCOM A/S Z2 Beckman Coulter Counter với phần mềm điều khiển Multi32. - Phần mềm xử lý hình ảnh ImageJ và Linear 10 micrometer 20X cho tính toán diện tích chạy trên nền Java. - Chƣơng trình FilterBJ ứng dụng cho xử lý lại dữ liệu từ phần mềm Multi32 để xác định đƣờng kính và số tế bào. 47 - Chƣơng trình Coulter Accucomp Import Master chạy trên nền Microsoft Excel hỗ trợ cho việc xuất dữ liệu từ chƣơng trình FilterBJ. 6.1.3 Chuẩn bị mẫu Mẫu khảo sát gồm 2 hợp chất của họ lignan (isotaxiresinol và secoisolariciresinol), đƣợc cô lập từ gỗ cây thông đỏ T.wallichiana với độ tinh khiết ít nhất 99.9% (kiểm tra bằng HPLC, GC và NMR) và 3 hợp chất thuộc họ stilbene (resveratrol > 99%, pterostilbene > 97%, piceatannol > 99%) mua từ hãng SigmaAldrich. Mẫu khảo sát đƣợc cân và tùy quy trình thử hoạt tính mà đƣợc hòa tan vào hệ dung môi thích hợp. Với quy trình thử hoạt tính bằng DPPH mẫu đƣợc hòa tan hoàn toàn trong etanol 99.7%. Còn với hai quy trình thử hoạt tính bằng NO và XO mẫu sẽ đƣợc hòa tan trong hỗn hợp dung dịch đệm phosphate – ethanol (nồng độ ethanol phải ≤ 2% , đây là tỉ lệ đƣợc khảo sát bảo đảm hòa tan hoàn toàn mẫu mà không ảnh hƣởng đến kết quả phân tích). Với quy trình thử độc tính tế bào, chuẩn bị dung dịch gốc ITR, SSR, RES, PTS, PIC 60µM trong DMSO 100% và đƣợc giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng, sau đó pha loãng thành các nồng độ cần thiết cho nghiên cứu. Fetal serum cho quá trình nuôi cấy và khảo sát độc tính tế bào đƣợc chuẩn bị từ McCoy’s 5A, FBS và gentamicin sau đó đƣợc giữ lạnh đến -20oC cho đến khi sử dụng. Dung dịch cho quá trình trypsin hóa đƣợc chuẩn bị từ trypsin và versene sau đó đƣợc giữ lạnh đến -20oC cho đến khi sử dụng. Khả năng chống oxi hóa và độc tính tế bào của các hợp chất đƣợc tính dựa trên phần trăm ức chế (I%). Phần trăm ức chế (I%) đƣợc xác định theo công thức: I(%) = Ac - As Ac *100% Với :  Ac: Giá trị mật độ quang hoặc số tế bào của dung dịch không có mẫu thử (control). 48  As: Giá trị mật độ quang hoặc số tế bào của dung dịch có chứa mẫu thử (sample).  Cách pha mẫu thử, mẫu control và blank sẽ đƣợc trình bày cụ thể ở từng quy trình. Đối với quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa, mỗi mẫu ban đầu đƣợc thử ở 4 nồng độ khác nhau: 100, 50, 25, 10 µM. Mỗi nồng độ đƣợc tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính đƣợc 3 giá trị % ức chế (I%). Lấy trung bình 3 giá trị I% từ đó ta sẽ xác định đƣợc giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát, nếu hoạt tính của mẫu thử khá mạnh sẽ đƣợc thử tiếp ở các nồng độ 10, 5, 2, 1 µM để tìm ra giá trị IC50. Đối với quy trình thử độc tính tế bào, mẫu ban đầu đƣợc thử các nồng độ 120, 60, 30, 15 µM và sau đó tính toán giá trị IC50 sau 48 giờ, nếu giá trị IC50 không thu đƣợc từ khoảng nồng độ trên thì tiếp tục thay đổi nồng độ đến mức tối đa 300 µM cho nghiên cứu. 6.1.4 IC50 và cách xác định 6.1.4.1 Định nghĩa IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 đƣợc định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. 6.1.4.2 Cách xác định IC50 - Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. - Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đƣờng thẳng y = ax+b qua tất cả các điểm (với y là % ức chế và x là nồng độ). - Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dƣới 50% và cũng tiến hành vẽ đƣờng thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu đƣợc phƣơng trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết. 49 - Thay y = 50 % vào phƣơng trình ta sẽ thu đƣợc giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế đƣợc 50 % gốc tự do (IC50). 6.2 Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa 6.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 6.2.1.1 Nguyên tắc DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. 6.2.1.2 Quy trình thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH Quy trình thử hoạt tính DPPH đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 1 dƣới đây: -1500l DPPH (100M) trong etanol -Ủ 30 phút trong bóng tối 1500l Dung dịch mẫu V1 µl mẫu V2 µl etanol Dung dịch sau ủ Đo quang (=517nm) 50 Sơ đồ 1. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH. 6.2.1.3 Chuẩn bị hóa chất  Dung dịch DPPH: cân 3.94mg DPPH định mức bằng ethanol 99.7% thành 1000µl đƣợc dung dịch trữ DPPH 10.000µM. Lấy 500µl dung dịch trữ định mức thành 50ml đƣợc dung dịch DPPH 100 µM (dung dịch làm việc).  Dung dịch làm việc của mẫu có nồng độ 500µM. Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 14 sau: C (μM) Control 100 50 25 10 V1(mẫu) μl 0 600 300 150 60 V2(etanol) μl 1500 900 1200 1350 1440 V(DPPH) μl 1500 Bảng 14.Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 10 đến 100 μM Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay VDPPH bằng Vethanol. Đối với những mẫu có hoạt tính mạnh (IC50 < 10μM), phải tiến hành thử mẫu ở các nồng độ 10, 5, 2, 1 μM, khi đó sử dụng mẫu làm việc có nồng độ 100M và mẫu thử sẽ đƣợc pha theo bảng 15 sau: 51 C (μM) 10 5 2 1 V1(mẫu) μl 300 150 60 30 V2(etanol) μl 1200 1350 1440 1470 V(DPPH) μl 1500 Bảng 15. Cách pha dung dịch thử hoạt tính DPPH có nồng độ từ 1 đến 10 μM. Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng tôi sử dụng quercetin làm chất đối chứng dƣơng, vì đây là chất có hoạt tính mạnh đối với gốc tự do đƣợc sử dụng làm chất chuẩn trong các tài liệu tham khảo. Hình 14. Công thức cấu tạo của Quercetin 6.2.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO 6.2.2.1 Nguyên tắc Natri nitroprusside dƣới ánh sáng sẽ phân hủy sinh ra gốc tự do NO, gốc này sẽ phản ứng với O2 tạo thành sản phẩm bền vững là NO2 và NO3. Nếu trong mẫu có hoạt tính ức chế gố tự do NO thì hoạt chất sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả làm giảm nồng độ NO2 trong dung dịch. Dựa trên sự giảm hàm lƣợng nitrite tạo thành của mẫu có hoạt tính ức chế NO so với mẫu không có hoạt OHO OH OH OH OH O 52 chất ức chế NO (mẫu control), ta tính đƣợc khả năng ức chế gốc tự do NO của hoạt chất. Hàm lƣợng nitrite tạo thành trong dung dịch nƣớc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang, sử dụng thuốc thử Greiss để lên màu phản ứng. Phức màu diazo thu đƣợc hấp thu ở bƣớc sóng cực đại 540 nm. 6.2.2.2 Chuẩn bị hóa chất  Dung dịch natri nitroprusside 10mM: Cân chính xác khoảng 0.14898 g natri nitroprussid, sau đó hòa tan trong đệm phosphat pH=7.4 sử dụng bình định mức 50 mL. Dung dịch này đƣợc pha ngay trƣớc khi tiến hành phản ứng, đựng cẩn thận trong chai tối màu và giữ trong chỗ tối trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.  Thuốc thử Greiss (Merck): Thuốc thử Greiss bao gồm hai dung dịch A và B: o Dung dịch A: Sulfanilamid 2% trong acid H3PO4 4%: Cân khoảng 2g sulfanilamide hòa tan thành 100 mL dung dịch bằng dung dịch acid H3PO4 4%. o Dung dịch B: N-1-napthylethylene diamine 0.2%: Cân khoảng 0.2g N-1-napthylethylene diamine hòa tan thành 100 mL bằng nƣớc cất hai lần. o Cả hai dung dịch A và B đều đƣợc đựng trong chai tối màu và bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch A đƣợc trộn chung với dung dịch B với cùng tỉ lệ thể tích trƣớc khi tiến hành thí nghiệm.  Dung dịch đệm phosphate pH = 7.4: Hòa tan bằng muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O trong 1000 mL nƣớc cất hai lần. Dùng NaOH và H3PO4 chỉnh đến pH = 7.4 bằng máy pH.  Mẫu thử: pha dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500M. 6.2.2.3 Sơ đồ biểu diễn quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 2 dƣới đây: 53 Sơ đồ 2. Quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 16 bên dƣới: C(µL) control 100 50 25 10 V1mẫu(µL) 0 600 300 150 60 V2 đệm(µl) 750 150 450 600 690 Vnitroprusside(µl) 750 Vthuốc thử(μl) 1500 Bảng 16.Cách pha dung dịch thử hoạt tính NO có nồng độ từ 10 đến 100 μM - V1 (µl) mẫu - V2 (µl) đệm phosphat (pH 7.4) ủ 180 phút tại nhiệt độ phòng - 1500l Thuốc thử - Ủ 15 phút V3 (µl) natri nitroprusside (10 mM) Đo quang (= 540nm) 1500 µL mẫu Mẫu sau khi ủ 54 Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank) nhƣng thay Vnitroprusside bằng Vđệm. Cũng nhƣ phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát, chúng tôi sử dụng quercetin làm chất đối chứng dƣơng. 6.2.3 Phƣơng pháp ức chế enzyme XO 6.2.3.1 Nguyên tắc Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác phản ứng oxy hóa xanthine tạo acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O2 ● . Để thử hoạt tính ức chế XO ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp trắc quang để đo mật độ quang của acid uric hình thành khi có và không có mẫu thử. Acid uric có bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Chất có khả năng kháng enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó mật độ quang của acid uric sẽ giảm. 6.2.3.2 Chuẩn bị hóa chất  Đệm phosphate 70 mM, pH = 7.5: cân 3.702 g NaH2PO4.2H2O và 16.57 g Na2HPO4.12H2O định mức thành 1000ml bằng nƣớc cất 2 lần. Dùng NaOH và H3PO4 điều chỉnh pH đến 7.5 bằng máy pH.  Xanthine oxidase 0.05 U/ml: pha từ XO 25 U/ml theo nguyên tắc pha loãng (Một unit (U) của XO đƣợc định nghĩa là một lƣợng enzyme cần thiết để tạo ra 1 µmol của acid uric trong 1 phút ở 250C).  Xanthine 150 µM: cân chính xác 1.14 mg xanthine, pha trong bình định mức 50ml bằng đệm phosphate 70 mM pH=7.5.  HCl 1N: rút 16.7 ml HCl đậm đặc (37 %) thêm nƣớc cất 2 lần thành 200ml.  Dung dịch mẫu làm việc có nồng độ 500μM. 6.2.3.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO đƣợc tóm tắt bằng sơ đồ 3 dƣới đây: 55 Sơ đồ 3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO. - 100l XO (0.05U/ml) - Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng V1 l mẫu (500M) V2 µl đệm pH 7.5 Dung dịch sau ủ - 900l Xanthine 150M - Ủ lần 2 (30 phút) Dung dịch sau ủ lần 2 - 200l HCl 1N Đo tại = 293nm 56 Mẫu thử và mẫu control đƣợc pha theo bảng 17 sau: C (μM) control 100 50 25 10 V1 mẫu(μl) 0 600 300 150 60 V2 đệm(μl) 1800 1200 1500 1650 1740 VXO (μl) 100 Vxanthine(μl) 900 VHCl 1N(μl) 200 Bảng 17. Cách pha dung dịch thử hoạt tính ức chế enzyme XO có nồng độ từ 10 đến 100 μM. Tƣơng ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta làm một mẫu trắng (blank), mẫu trắng tƣơng tự nhƣ mẫu thử nhƣng thay 100μl XO bằng 100μl đệm. Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu chất khảo sát đối với enzyme XO, chúng tôi sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dƣơng, đây là một hợp chất ức chế enzyme XO rất mạnh, đã đƣợc sử dụng làm thuốc để chữa trị bệnh gút. 6.3 Nghiên cứu độc tính tế bào 6.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu sự phát triển tế bào Dòng tế bào DLD-1 sử dụng cho thực nghiệm đƣợc cho vào từng giếng của đĩa 24 giếng với mật độ khoảng 3.0 x 104 tế bào/giếng và đƣợc ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37 oC để đảm bảo tế bào kết dính vào đáy giếng và sau đó tế bào đã sẵn sàng cho thí nghiệm. Chuẩn bị các dung dịch các chất cần kiểm tra độc tính RES (0-60µM), PI (0-60µM), PTS (0-60µM), ITR (0-300µM), SSR (0-300µM) trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Fetal serum), trƣớc khi xử lý tế bào với các dung dịch trên, môi trƣờng tế bào cũ cần đƣợc rửa sạch bằng cách sử dụng 1ml PBS, sau đó đem ủ cho khảo sát ở 24, 48 và 72 giờ trong môi trƣờng CO2 5% tại 37 o C. 57 Sau khi đƣợc ủ tới thời gian cần khảo sát, tế bào đƣợc chụp ảnh sử dụng hệ thống kính hiển vi tƣơng phản pha Leica DMIRB (Leica Microsystem A/S) với độ phóng đại 200 lần. Sau đó, tế bào đƣợc rửa sạch bằng PBS (1ml/giếng), thêm trysine (0.2ml/giếng) để thực hiện quá trình trypsin hóa tách tế bào ra khỏi đáy giếng, tiếp tục thêm PBS (0.8ml/giếng), sau đó sử dụng pipet hút và xả ở lực mạnh cho tế bào tách khỏi nhau. Dùng micropipet hút chính xác 800µl dung dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên cho vào cốc đo có chứa 10ml NaCl 0.9%, sau đó thực hiện bƣớc đếm tế bào sử dụng máy đếm Coulter Z2, Beckman Coulter cho tế bào có kích thƣớc lớn hơn 11µm. Quá trình phát triển của tế bào đƣợc thể hiện trên số tế bào và phần trăm tế bào đã đƣợc xử lý với chất cần khảo sát so với mẫu control (tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy với DMSO). 6.3.2 Phƣơng pháp SRB Sulforhodamine B (SRB) 0.2% đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan 0.1g SRB vào 50ml axit acetic 1% và lắc đều, thuốc thử đƣợc chứa trong lọ sẫm màu và giữ lạnh cho đến khi sử dụng. Trichloroacetic acid (TCA) 50% đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm 50g tinh thể TCA vào 100mml nƣớc cất khử ion, đƣợc lƣu trong lọ thủy tinh và giữ lạnh cho đến khi sử dụng. Chuẩn bị dung dịch đệm Tris[hydroxymethyl]aminomethane 10mM bằng cách hòa tan 0.605g Tris-base vào 500 ml nƣớc và đƣợc giữ lạnh đến khi sử dụng. Quy trình phƣơng pháp SRB: 1. Cho 100 μL tế bào vào đĩa 96 giếng sao cho lƣợng tế bào khoảng 10.000 tế bào/giếng sau đó ủ qua đêm trong môi trƣờng CO2 5% tại 37 o C. 58 2. Kiểm soát sự phát triển, sự phân bố của tế bào trong giếng và mật độ tế bào trong các giếng khác nhau sử dụng kính hiển vi tƣơng phản pha. 3. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy không có chứa chất khảo sát vào các giếng blank và control. 4. Thêm 100 μL/giếng môi trƣờng nuôi cấy có chứa chất khảo sát ở các nồng độ khác nhau vào đĩa 96 giếng theo thiết kế thí nghiệm. 5. Ủ tế bào trong môi trƣờng CO2 5% tại 37 oC đến các thời gian cần khảo sát sự phát triển tế bào phụ thuộc vào thời gian phơi nhiễm các chất (24, 48, 72 giờ). 6. Sau 24 giờ, dừng tiến hành quá trình nuôi cấy cho đĩa khảo sát quá trình phát triển tế bào ở 24 giờ để tiến hành đo mật độ quang của tế bào theo các bƣớc sau. 7. Cố định lƣợng protein trong tế bào sử dụng 100 μL TCA 10% (4°C)/giếng, sau đó giữ lạnh đĩa ở 4°C ít nhất 1 giờ bằng cách đặt đĩa trong tủ lạnh trƣớc khi phân tích bằng phƣơng pháp SRB. 8. Sử dụng nƣớc cất khử ion (200 μL/giếng) để loại và rửa sạch TCA khoảng 5 lần và để khô tự nhiên trong không khí. 9. Dùng pipet lấy 100 μL dung dịch SRB cho vào mỗi giếng và nhuộm màu trong vòng 30 phút. 10. Sử dụng miro-pipet điện tử 8 kênh để loại SRB ra khỏi giếng và dùng acit acetic 1% để rửa sạch SRB, sau đó để khô tự nhiên trong không khí. 11. Để khô đĩa tự nhiên trong không khí cho đến khi không còn thấy ẩm bên trong giếng. 12. Hòa tan protein đã nhuộm màu bằng 100 μL Tris base 10 mM trên mỗi giếng. Lắc đĩa nhẹ trong vòng 10 phút để hòa tan và đồng nhất hóa chất nhuộm trong giếng. 13. Tiến hành đo mật độ quang sử dụng máy đọc ELISA ở bƣớc sóng 492 nm và sử dụng bƣớc sóng 620 nm làm so sánh. 59 14. Mật độ quang của mỗi giếng tỷ lệ trực tiếp với số tế bào, do đó có thể vẽ đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giá trị mật độ quang theo nồng độ chất khảo sát và tính toán giá trị IC50. 60 Trong đề tài này chúng tôi đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và độc tính tế bào của một số chất thộc họ lignan và stilbene, kết quả cho thấy: Hai lignan, SSR và ITR, có hoạt tính chống oxi hóa tƣơng đối mạnh thông qua việc ức chế gốc tự do DPPH và NO, giá trị IC50 lần lƣợt là 9.2 và 7.1 M đối với gốc DPPH và 61.9 và 36.2 M đối với gốc NO, nhƣng lại không có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1. Điều này cho thấy hạn chế của việc ứng dụng hai hợp chất này vào các loại dƣợc phẩm điều trị các bệnh liên quan đến dòng tế bào DLD-1. Tuy nhiên, có thể phát triển hƣớng nghiên cứu tiếp theo cho các dòng tế bào khác để chứng minh khả năng chống oxy hóa rất mạnh của hai hợp chất này. Ba hợp chất stilbene, RES, PTS và PI có hoạt tính chống oxi hóa trung bình nhƣng lại có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào DLD-1 mạnh, giá trị IC50 lần lƣợt là 30.8, 32.8 và 64.3M theo phƣơng pháp đếm tế bào và 76.3, 44.6 và 117.9M theo phƣơng pháp SRB. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh rằng, các hoạt tính sinh học nhƣ chống ung thƣ, tiểu đƣờng, tim mạch của các hợp chất thuộc họ stilbene này do hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Bên cạnh đó, độc tính tế bào của các hợp chất này cho thấy khả năng ứng dụng của chúng. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của RES lên dạng hình học của tế bào cũng phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây trên dòng tế bào HeLa 4. Điều này khẳng định ảnh hƣởng mạnh của RES lên dòng tế bào DLD-1. Trong số các hợp chất nghiên cứu cho thấy chỉ có PI thể hiện tất cả các hoạt tính nhƣ ức chế NO, ức chế DPPH và ức chế enzyme XO, độc tính tế bào đối với dòng tế bào DLD-1, vì vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn nhƣ là khảo sát khả năng chống peroxy hóa lipid màng tế bào theo phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA, nghiên cứu về chu kỳ tế bào theo phƣơng pháp flow cytometry, nghiên cứu chu trình chết (apotosis) trên các dòng tế bào khác nhau, từ đó đánh giá thêm các hoạt tính sinh học khác của PI để có thể sử dụng chất

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf9.pdf
  • pdf0.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf