Nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phương pháp nuôi cấy mô

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN HỮU ĐỊNH Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Trần Thị Dung Nguyễn Hữu Định KS. Nguyễn Thị Kim Linh Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh  Quí thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các quí thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.  Các quí thầy, cô, cán bộ, công nhân viên của khoa Công Nghệ Sinh Học của trƣờng đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này. Đặc biệt, tôi xin đƣợc tỏ lòng biết ơn chân thành đến o Tiến sĩ Trần Thị Dung o Kỹ sƣ Nguyễn Thị Kim Linh  Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khoá luận.  Xin đƣợc gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn bè, các anh chị em trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 27 dã góp ý, động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trƣờng  Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh chị em trong gia đình và ngƣời thân. ii TÓM TẮT NGUYỄN HỮU ĐỊNH, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: Tiến sĩ TRẦN THỊ DUNG Kỹ sƣ NGUYỄN THỊ KIM LINH Thí nghiệm “Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô” đƣợc tiến hành tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM từ ngày 3 tháng 3 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005. Gồm 3 thí nghiệm. 1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Tetracylin. Thí nghiệm 1b: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Streptomycin. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS. Kết quả đạt đƣợc: sau 15 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 6 giờ và Tetracylin cho hiệu quả khử trùng tốt hơn Streptomycin. 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36 iii Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng BA và IBA có hàm lƣợng thay đổi theo 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng trên. Kết quả đạt đƣợc: sau 45 ngày nuôi cấy mẫu lá cho thấy môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA cho mô sẹo mọc sớm nhất (7 ngày sau cấy) và có khả năng phát triển chồi. Ngoài ra, môi trƣờng có 3mg/L BA + 2mg/L IBA và môi trƣờng có 1mg/L BA + 1mg/L IBA cũng cho mô sẹo phát triển tốt. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng 3mg/L BA và hàm lƣợng TDZ hoặc Ki thay đổi theo 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng sau: Nghiệm thức BA (mg/L) TDZ (mg/L) Ki (mg/L) Số bình Số mẫu C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45 Kết quả đạt đƣợc: Sau 60 ngày nuôi cấy mô sẹo kết quả cho thấy môi trƣờng có 0,3mg/L TDZ cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất. Ngoài ra, môi trƣờng có 0,1mg/L TDZ và môi trƣờng có 0,5 mg/L TDZ cũng cho hiệu quả nhân chồi khá cao. iv MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ...................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................... ii Mục lục ......................................................................................................................... iv Danh mục các từ viết tắt .............................................................................................. vii Danh mục các bảng ..................................................................................................... viii Danh mục các hình ....................................................................................................... ix PHẦN 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2 Mục đích .................................................................................................................. 2 1.3 Yêu cầu .................................................................................................................... 2 1.4 Giới hạn đề tài ......................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................ 3 2.1.1 Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) ....................................................................... 3 2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) ............................................................ 3 2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) ......................................... 4 2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật ...................... 4 2.2 Tổng quan về cây tiêu ............................................................................................... 5 2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu ............................................................... 5 2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam ........................ 5 2.2.2.1 Thế giới ............................................................................................................... 5 2.2.2.2 Việt Nam............................................................................................................. 7 2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu .............................................................................. 10 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc .................................. 11 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài ...................... 12 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô .......... 12 2.4.1 Auxin ................................................................................................................... 12 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin.............................................................................. 13 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng ....................................................................................... 13 v 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp ................................................................................... 14 2.4.2 Gibbérelline ......................................................................................................... 14 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline.................................................................... 14 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng ............................................................................. 15 2.4.3 Cytokinine ........................................................................................................... 15 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine ...................................................................... 15 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng ............................................................................... 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 17 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 17 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................................... 17 3.2.1 Phòng chuẩn bị .................................................................................................... 17 3.2.2 Phòng cấy ............................................................................................................ 17 3.2.3 Phòng nuôi cây .................................................................................................... 17 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm .......................................................... 17 3.3. Vật liệu nuôi cấy .................................................................................................... 18 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm ........................................................................................ 18 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy ..................................................................... 19 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá ............................................................................................................. 21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ................................. 23 3.5 Phân tích thống kê .................................................................................................. 24 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 25 4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy ......................................................................... 25 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá ................................................................................................................... 27 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo ................................................ 29 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 34 5.1 Kết luận................................................................................................................... 34 5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 34 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35 PHẦN 7. PHỤ LỤC ..................................................................................................... 37 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NT: Nghiệm thức T2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Tetracylin T6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Tetracylin T10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Tetracylin S2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Streptomycin S6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Streptomycin S10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Streptomycin TLMS: Trọng lƣợng mô sẹo HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo HSNC: Hệ số nhân chồi TLTCC: Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi NSC: Ngày sau cấy TDZ: Thidiazuron BA: Benzyladenine IBA: Indolylbutyrique acid Ki: Kinetine vii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) 6 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) ........................ 8 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế9 Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 200010 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a ...................................................................................... 19 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b ...................................................................................... 19 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 ........................................................................................ 22 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 ........................................................................................ 23 Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin ................................................ 25 Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin ........................................... 26 Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ ..................................................................................................... 26 Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá .......................... 27 Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy ............................................................................................................... 28 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng hình thành chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày ............................................................................... 29 DANH MỤC CÁC HÌNH viii Tên hình Trang Hình 4.1 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 8) sau 7 ngày nuôi cấy. ........ 31 Hình 4.2 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 2mgIBA/L (nghiệm thức thứ 9) sau 16 ngày nuôi cấy. ...... 31 Hình 4.3 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 1mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 5) sau 17 ngày nuôi cấy. ...... 32 Hình 4.4 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.3mgTDZ/L (nghiệm thức 2) sau 60 ngày nuôi cấy. .......................... 32 Hình 4.5 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.1mgTDZ/L (nghiệm thức1) sau 60 ngày nuôi cấy. ............................ 33 Hình 4.6 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.5mgTDZ/L (nghiệm thức 3) sau 60 ngày nuôi cấy. .......................... 33 1 PHẦN 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Điều kiện khí hậu nƣớc ta nhìn chung rất thích hợp cho việc phát triển cây hồ tiêu.Tuy nhiên, do nƣớc ta có mùa mƣa rất tập trung và có mùa nắng kéo dài nên đây sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sâu bệnh phát triển và đây sẽ là nguyên nhân gây giảm năng suất, sản lƣợng và phẩm chất cho cây tiêu. Bên cạnh các loại sâu hại (rầy, rệp sáp, tuyến trùng...) còn có cả virus gây bệnh tiêu điên, thối rễ, rụng đốt. Đây là các nhân tố gây bệnh cho cây tiêu mà nó có thể ẩn tích trong thân của cây tiêu. Bởi vậy, bằng phƣơng pháp nhân giống thông thƣờng nhƣ: Chiết, ghép, giâm cành hoặc trồng bằng hạt thì hệ số nhân giống sẽ thấp mà cây giống khi đem trồng sẽ vẫn mang theo mầm bệnh thông qua các thao tác nhân giống này và sẽ gây hại cho cây giống. Vì vậy, hiện nay việc nhân giống vô tính cây tiêu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô thực sự cần thiết vì cho hệ số nhân giống cao đồng thời sẽ làm giảm đƣợc tác nhân gây hại cho cây giống và đã đem lại hiệu quả rất thiết thực trong việc nâng cao chất lƣợng giống cây con. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro hồ tiêu để kháng nấm bệnh Phytophthora. Đặc biệt, công tác nhân giống in vitro còn là tiền đề thuận lợi cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hay xử lí nhiệt để tạo các giống tiêu sạch bệnh để nâng cao năng suất, phẩm chất cho cây tiêu. Ngoài ra, công tác nhân giống in vitro cây tiêu có thể nhân giống đƣợc hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt nhƣ các cây bố mẹ đã chọn lọc cũng nhƣ có thể cung cấp nhiều giống tiêu thích hợp cho năng suất theo từng vùng để phục vụ cho nhu cầu sản xuất của nông dân. Trƣớc thực trạng trên và đặc biệt để tận dụng điều kiện khí hậu, địa lí của nƣớc ta để phát triển, nâng cao năng suất, phẩm chất và sản lƣợng cho cây tiêu; đồng thời nhằm từng bƣớc đƣa nƣớc ta lên vị trí cao nhất trong các nƣớc sản xuất và xuất khẩu tiêu trên thế giới, đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành đề tài “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. 1.2 Mục đích: 2 Tìm ra công thức khử trùng mẫu cấy ban đầu đạt hiệu quả cao. Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ lá. Tìm ra môi trƣờng thích hợp tái sinh chồi tiêu từ mô sẹo. 1.3 Yêu cầu: Ghi nhận các chỉ tiêu về số mẫu sống, số mẫu sạch để xác định công thức khử trùng hiệu quả. Theo dõi và ghi nhận về thời gian xuất hiện mô sẹo, trọng lƣợng và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo sau 45 ngày nuôi cấy. Theo dõi và ghi nhận số chồi và trọng lƣợng chồi và hệ số nhân chồi sau 60 ngày nuôi cấy. 1.4 Giới hạn đề tài: Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chƣa thực hiện đƣợc các thí nghiệm nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua gần trăm năm phát triển, và có thể phân chia ra thành 4 giai đoạn phát triển nhƣ sau: 2.1.1 Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) Đầu tiên là các thí nghiệm của Haberlandt (1898) khi ông đề xƣớng ra tính toàn thế của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng tế bào lƣợc, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để minh chứng cho luận điểm của ông nhƣng không thành công. Tiếp theo Haberlandt còn có các thí nghiệm khác của Winkler (1902), Thielmann (1924) và Kuster (1928) tiến hành tƣơng tự nhƣng không nhận đƣợc tế bào phân chia nào. Phải đến những năm 30 của thế kỷ thứ 20 ngƣời ta mới đạt đƣợc những tiến bộ thực sự: Schmucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931, 1933), Larue (1933) thông báo về nuôi cấy thành công đoạn đầu rễ riêng rẽ. Trong môi trƣờng nhân tạo những đoạn rễ này đã phát triển thành những chiếc rễ hoàn chỉnh. Đây là một tiến bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới. 2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) Bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy đƣợc một dòng rễ cà chua sinh trƣởng mạnh và liên tục. Năm 1934 Gautheret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ tƣợng tầng của cây Salix apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã liên tục phân chia trong nhiều tháng trên môi trƣờng Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. Trong thời kỳ này Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra IAA là một auxin tồn tại tự nhiên trong cơ thể thực vật. IAA đã đƣợc Gautheret sử dụng vào môi trƣờng nuôi cấy, kết quả thu đƣợc mới chỉ hạn chế ở mô tƣợng tầng của cây Salix. Năm 1938 Nobecourt nhận đƣợc phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota. Cùng năm 1938, White đã nuôi cấy đƣợc mô tƣợng tầng của cây thuốc lá lai Nicotiana 4 glauca lai với N.langsdorffi. Vào cuối thời kỳ này đã có những quan sát về sự phân hóa cơ quan rễ, lá trong mô nuôi cấy của cây cà rốt hoặc cây thuốc lá lai. 2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) Đại diện cho giai đoạn này là: Miller, Skoog, Steward, Reinert. Giai đoạn phát sinh hình thái bắt đầu bằng công trình của Camus (1949) ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hóa ống mạch xảy ra trong khối mô. Năm 1956 Miller và Skoog đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy. Trong giai đoạn này Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Năm 1958-1959 Steward và Reinert đã sử dụng nƣớc dừa vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu đƣợc phôi từ tế bào cà rốt nuôi cấy. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn trong dịch lỏng đƣợc Muir (1953) xây dựng đối với tế bào của cây Tagetes erecta và Nicotiana tabacum và Nickell (1956) nuôi đƣợc tế bào đơn của Phaseolus vulgaris trong dịch lỏng thông qua cấy chuyền 4 năm liên tục. Năm 1960 Bergmann đã phát triển kỹ thuật tế bào đơn lên một bƣớc mới tạo đƣợc khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch. 2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật 1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antirrhinum majus nghiên cứu tính biến động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến. 1967 Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo đƣợc cây đơn bội từ bao phấn thuốc lá. 1960 Cocking tách đƣợc tế bào trần protoplast. 1964 Guha và Maheswari tạo đƣợc cây cà độc dƣợc có bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ nuôi cấy túi phấn. 1968 Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo đƣợc cây đơn bội ở lúa (Ozyza sativa). 1971 Takebe tái sinh đƣợc cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi. 1977 Melchers lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây. 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên đƣợc công bố. 1994 giống củ cải đƣờng mang gen kháng bệnh virus biến nạp đƣợc đƣa vào sản xuất đại trà tại Na Uy. 5 2.2 Tổng quan về cây tiêu 2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae. Có nguồn gốc từ tây nam Ấn Độ nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng, đƣợc ngƣời Ấn Độ phát hiện, sử dụng đầu tiên và cho rằng việc phát hiện này là rất quý giá. Đến đầu thế kỷ thứ XIII cây tiêu mới đƣợc trồng rộng rãi và sử dụng trong bữa ăn hàng ngày. Lúc này, cây tiêu đã đƣợc trồng cả ở Indonesia và Malaysia. Đến thế kỷ thứ XVIII cây tiêu đƣợc trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ thứ XX thì cây tiêu đƣợc trồng tiếp ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Châu Phi nhƣ: Madagasca, Nigieria, Congo và ở châu Mỹ nhƣ: Brazil, Mexico… Ở nƣớc ta cây tiêu đƣợc trồng rất lâu từ trƣớc khi ngƣời Pháp đến xâm chiếm. Khi những ngƣời Trung Hoa di dân vào Campuchia ở dọc vùng biển vịnh Thái Lan nhƣ: Konpong Trach, Kep, Campot và lúc đó tiêu đƣợc trồng ở nƣớc ta chủ yếu ở đảo Phú Quốc, Hòn Chông, Hà Tiên, một số ít ở Bà Rịa và Thủ Dầu Một. 2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 2.2.2.1 Thế giới Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 quốc gia trồng tiêu. 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn hột tiêu. 1978 là 160.000 tấn hột tiêu. 1983 là 180.000 tấn hột tiêu. Sau 1982 sản lƣợng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết. Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trƣờng gây ảnh hƣởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu. Đến năm 1989-1990 diện tích trồng tiêu trên toàn thế giới đã tăng vọt và sản lƣợng đạt khoảng 185.000 tấn tiêu hột. Các nƣớc sản xuất tiêu nhiều nhất trên thế giới lúc này là Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Brazil, Madagasca và Srilanka. Hiện nay, những nƣớc trồng tiêu nhiều nhất là Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Trên thế giới mức tiêu thụ hạt tiêu hàng năm đạt khoảng 4-5%. Các sản phẩm đƣợc trao đổi dƣới dạng: tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu. Hiện nay, nƣớc Mỹ đang đứng đầu về nhập khẩu tiêu với khoảng 1/3 lƣợng tiêu của thế giới. Sau đó là các nƣớc Nga, Đức, Pháp, Ý và thị trƣờng của Anh. Ngoài ra thị trƣờng các nƣớc Trung Đông và Bắc Phi cũng đang tiêu thụ ngày càng nhiều. 6 Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) Quốc gia 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Trung bình Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320 India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R. 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983 Brunei Darus 15 15 15 15 15 15 15 South Pacific 158 159 164 168 168 168 197 Fiji 140 145 145 150 150 150 176 Samoa 5 5 6 6 6 6 7 Micronisea 13 9 13 12 12 12 14 Latin America 51,774 30,615 26,427 25,303 21,940 21,690 29,625 Brazil 50,000 27,500 25,000 23,000 20,000 19,500 27,500 Mexico 894 2,395 734 1,363 1,000 1,250 1,273 Guatemala 360 370 380 380 380 380 375 Honduras 420 160 213 400 400 400 332 Saint Lucia 100 190 100 160 160 160 145 Africa 5,427 4,543 4,665 4,565 4,565 4,565 5,833 Madagasca 2,160 2,000 2,300 2,300 2,500 2,500 2,327 Malawi 1,000 900 700 700 700 700 900 Zimbabue 700 800 900 700 700 700 750 Benin 894 150 150 150 150 150 299 Kenya 200 300 400 300 300 300 300 Cote di Voire 100 100 100 100 100 100 100 Cameroon 63 63 65 65 65 65 64 Ethiopia 100 200 50 Zambia 30 30 50 50 50 50 43 Tổng 239,038 219,038 176,232 188,064 195,862 180,411 199,975 Nguồn: Proc. Peper Tech. Meet, 1997. 7 2.2.2.2 Việt Nam a. Tình hình sản xuất Trƣớc năm 1975, Miền Bắc đƣợc trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình và Miền Nam đƣợc trồng ở Phú Quốc, Long Khánh, Lộc Ninh. Năm 1995 diện tích từng bƣớc gia tăng song biến động không ổn định bởi thiên tai, bệnh tật. Từ 1990-1995 do giá tiêu bị giảm mạnh và không có thị trƣờng tiêu thụ nên các vƣờn tiêu bị phá đi rất nhiều. Từ năm 1996 các nƣớc nhƣ Indonesia, Brazil,… bị ảnh hƣởng của thiên tai, khu vực Đông Nam Á bị khủng hoảng tài chính, nên giá tiêu đã gia tăng lên 4.000 USD/tấn vào năm 2000, và đó là cơ hội thuận lợi cho hồ tiêu Việt Nam vƣơn lên chiếm lĩnh thị trƣờng hạt tiêu thế giới. Năm 1997-1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha. Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nƣớc). 8 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn). Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000 Số thứ tự Hạng Mục Năm 1997 Năm 1998 Năm 1999 Diện tích Tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng Cả nƣớc 9777 6243 2.08 13007 12783 7609 2.09 15883 15641 8939 2.12 18970 A Miền Bắc 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 I Bắc TBộ 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 1 Nghệ An 279 226 0.70 158 279 230 0.70 161 284 230 0.75 172 2 Quảng Bình 181 149 0.64 95 199 153 0.48 73 209 156 0.55 86 3 Quảng Trị 842 702 0.70 491 1153 798 0.82 652 1284 870 0.80 696 B Miền Nam 8372 5090 2.40 12212 11029 6348 2.36 14951 13741 7602 2.36 17968 I DH Trung bộ 329 306 1.14 348 424 312 1.10 344 476 322 1.15 369 1 Quảng Nam 37 33 0.48 16 42 35 0.46 16 47 37 0.49 18 2 Bình Định 60 47 0.68 32 79 47 0.55 26 107 56 0.55 31 3 Phú Yên 97 97 1.92 186 166 105 1.91 201 186 115 1.95 224 4 Khánh Hòa 11 10 1.40 14 9 8 0.88 7 12 9 0.89 8 II Tây Nguyên 1712 999 1.63 1626 2492 1585 1.66 2638 3551 1833 2.00 3666 1 Gia Lai 303 128 0.70 89 695 238 0.75 179 1274 333 2.45 816 2 Đắc Lắc 1409 871 1.76 1537 1797 1347 1.83 2459 2277 1500 1.90 2850 III Đông Nam bộ 5893 3415 2.76 9412 7726 4080 2.75 11230 9115 5061 2.55 12925 1 Lâm Đồng 52 31 2.06 64 129 49 1.96 96 190 47 1.64 77 2 Bình Phƣớc 3437 704 10.06 7080 911 2100 3.78 7943 4816 2405 3.80 9139 3 Tây Ninh 245 185 1.25 231 298 240 1.63 391 495 263 1.82 478 4 Bình Dƣơng 244 138 2.21 305 249 143 2.30 329 262 145 2.30 334 5 Đồng Nai 52 520 0.92 480 611 428 1.07 457 630 430 1.07 461 6 Bình Thuận 270 150 1.93 289 656 291 1.65 480 850 496 1.71 846 7 BR-Vũng Tàu 996 565 1.38 780 1743 705 1.91 1349 1743 1150 1.22 1404 IV Đồng Bằng SCL 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 1 Kiên Giang 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 9 Năng suất tăng chậm và có sự sai khác rất lớn giữa các vùng và tỉnh có trồng tiêu. Năng suất bình quân năm 1997 là 2,08 tấn/ha đến năm 1999 cũng chỉ đạt 2,12 tấn/ha nhƣng cao nhất là ở vùng Đông Nam Bộ đạt 2,55 tấn/ha, trong khi năng suất thấp nhất là ở vùng Bắc Trung Bộ chỉ đạt 0,75 tấn/ha (bằng 29,4% so với năng suất tiêu của vùng Đông Nam Bộ). Đặc biệt tỉnh Bình Phƣớc với diện tích thu hoạch 2.405 ha, năng suất đạt 3,8 tấn/ha (gấp 6,9 lần năng suất tiêu của tỉnh Quảng Bình). Năng suất bình quân năm 1997 đạt 18.970 tấn. Sản lƣợng tiêu tính trên diện tích cho thu hoạch theo thống kê năm 1997 là 13.007 tấn và năm 1999 tăng lên 18.970 tấn song thực tế xuất khẩu năm 1999 đạt 34.000 tấn. Tổng lƣợng tiêu 3 năm 1997- 1999 là 47.860 tấn trong khi lƣợng tiêu xuất khẩu lại là 74.500 tấn. Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế Đơn vị tính: Tấn Năm Sản lƣợng hạt tiêu sản xuất Khối lƣợng xuất khẩu Thƣơng mại quốc tế 1996 1997 1998 1999 Tổng cộng 10.500 13.007 15.883 18.970 58.360 25.300 24.700 23.000 34.800 107.800 195.700 243.700 225.000 Nguồn: Bộ thương mại, năm 2000 b.Tình hình tiêu thụ Nƣớc ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trƣờng tiêu thụ trong nƣớc hàng năm chỉ đạt khoảng 3.500-4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lƣợng tiêu dành cho xuất khẩu. Theo Bộ Thƣơng Mại, hạt tiêu Việt Nam đã xuất khẩu cho 30 nƣớc trên thế giới. Cả nƣớc xuất khẩu từ 1996-1999 là 107.800 tấn (bình quân một năm 26.950 tấn), tốc độ tăng 12% /năm. Riêng số liệu xuất khẩu mà cơ quan kiểm dịch tại cảng TP.Hồ Chí Minh cho biết từ 1996 đến 20/6/2000 là 110.656 tấn. Đặc biệt 6 tháng đầu năm 2000 đã xuất khẩu 28.801 tấn. Thị trƣờng tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996-6/2000) là các nƣớc: Mỹ, các nƣớc EU, Singapore. 10 Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) Năm Số lƣợng (tấn) Thị trƣờng nhập 1996 1997 1998 1999 6 tháng đầu năm 2000 Tổng cộng 24.776,80 20.815,51 7.669,78 28.593,42 28.801,16 110.656,67 Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp, Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel, Hy lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000 2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu sạch virus do Đoàn Thị Ái Thuyền, TS.Thái Xuân Du và Đỗ Đăng Giáp; Viện Sinh học Nhiệt Đới thực hiện. Mẫu chồi sau khi lấy đƣợc rửa sạch và sát trùng bằng cồn 700 rồi dung nƣớc tẩy Javel pha loãng 1/3 khử trùng mẫu trong khoảng 30-40 phút. Có thể dùng HgCl2 (0,1%) hoặc ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin (1%) từ 1-2 giờ. Sau khi ngâm trong dung dịch kháng sinh Cefotaxin 1% (1, 2, 24 giờ). Kết quả cho 20-70% mẫu bị nhiễm sau 7- 14 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung kháng sinh Cefotaxin (1%) vào môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả cho khoảng 20-30% mẫu đƣợc vô trùng hoàn toàn sau 3-4 tuần nuôi cấy. Đồng thời khi cấy chuyền sang môi trƣờng mới không có kháng sinh, chồi mới không có khả năng tái nhiễm trở lại. Ngoài ra, thử nghiệm khử trùng bằng cách kết hợp dung dịch Acid Benzoic bão hòa, dung dịch tẩy Javel và kháng sinh. Kết quả thu đƣợc khoảng 40-50% mẫu khử trùng không tái nhiễm. Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so với đốt giữa và đốt ngọn. Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tƣơng tự nhƣ ở tạo chồi. Khi nồng độ BA hơn 5,0mg/L hoặc TDZ sẽ ức chế khả năng hình thành chồi, và khi bổ sung một nồng độ Cytokinin và Auxin thích hợp sẽ làm tăng số chồi hình thành ở đốt cấy hồ tiêu. Nồng độ NAA hoặc IBA càng cao thì khối mô sẹo tạo ra càng nhiều. Các mô sẹo trắng, xốp khi cấy chuyền sang môi trƣờng tạo chồi sẽ ít có khả năng tái tạo chồi. Môi trƣờng MS 11 có bổ sung BA (5,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) là thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng độ BA (3,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trƣờng MS thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi trƣờng còn lại. Môi trƣờng tạo rễ là ½ MS + NAA (0,1-1,0mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0mg/L). Môi trƣờng ½ MS có bổ sung than hoạt tính (1,0mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử dụng Auxin cho mục đích ra rễ (Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 2003). 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài: Phƣơng pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy nhƣ: đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trƣởng thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và ctv. 1992; Nazeem và ctv. 1993; Nirmal Babu và ctv. 1993; Joseph và ctv. 1996; Lissamma và ctv. 1996). Trong phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy, 1996). Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất. Tốc độ nhân chồi của tiêu khoảng 6 chồi / 90 ngày nuôi cấy. Các cây con in vitro phải đƣợc để trong phòng ẩm mát khoảng 20-30 ngày để cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều kiện sống bên ngoài. Cây tiêu in vitro phát triển khá tốt trên đồng ruộng. Qua báo cáo sớm về phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cây tiêu (Chua 1981, Fitchet 1988), phenolic đƣợc tiết ra từ vết cắt của mẫu cấy và vi sinh vật gây nhiễm nội sinh trong mẫu cấy (Mohan 1985, Fitchet 1988) là hai yếu tố ngăn cản qui trình nhân giống in vitro cây tiêu. Madhusudhanan và Rahiman (1996) báo cáo họ đã sử dụng hoạt chất charcoal (200mg/L) kết quả là đã làm giảm đƣợc sự hóa nâu mẫu cấy của các giống tiêu P. nigrum, P. longum, P. attenuatum và P. betle. Sự kết hợp chất kháng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy đã kiểm soát đƣợc vi sinh vật nội sinh trong cây tiêu nuôi cấy theo Kelkar và Krishnamurthy (1996). Tái sinh cây tiêu từ nuôi cấy mô sẹo đã đƣợc hệ thống hóa mô sẹo phát triển thành lá và chồi để tái sinh cây tiêu mới (Nirmal Babu và ctv. 1993, Nazeem và ctv. 1993, Bhat và ctv. 1995). Cây mới đƣợc tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn mô sẹo (Nirmal Babu và ctv. 1993). 12 Những báo cáo về phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu đã đóng góp quan trọng cho nền kinh tế và mối liên hệ giữa các giống tiêu: Piper viz, P. longum, P. chaba, P. betle, P. colubrinum, P. attenuatum và P. barberi. Các Protocol của P. longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ (Sarasan và ctv. 1993, Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995). Phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã đƣợc (Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân sinh ngọn đã giúp cây con phát triển, ở cây tiêu P. longum và P.colurinum đã đƣợc báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và ctv. 1993). Các cây con in vitro của giống tiêu này đã đƣợc đánh giá, thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn Độ. Cây tiêu đã đƣợc tái sinh từ lá và thân là: P. longum, P. betle, P. chaba, P. attenuatum và P. colubrinum chúng tái tạo các cơ quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Bhat và ctv. 1992, Bhat, ctv. 1995, Rema và ctv. 1995, Madhusudhanan và ctv. 1996). 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô Sự hiện diện của các hormone tăng trƣởng đã đƣợc khám phá ra cuối thế kỷ 20. Trong đó chất Auxin là chất đƣợc khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là các chất Gibbérellines và chất cytokinin trong những năm 1950. Các hormone này đều có tác dụng kích thích lên sự chuyển hóa của tế bào .Các chất này có nguồn gốc nội sinh, ngoài ra còn có các chất tổng hợp khác do con ngƣời điều chế mà nó có công thức hóa học gần giống hoặc khác với các chất trong thiên nhiên, nhƣng chúng biểu hiện một hoạt động về một sinh lý tƣơng tự. *Một số đặc tính cơ bản của các chất kích thích sinh trưởng Chúng hoạt động ở liều rất yếu; ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một số chất kích thích tố đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt cỏ. Chúng can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, điều này bao hàm ít nhiều dạng thức hoạt động của chúng, từ sự kiện này khái niệm về “hormone chuyên biệt” hiện tại đã đƣợc bỏ đi. 2.4.1 Auxin Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique. 13 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau: Kéo dài tế bào: làm ra tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+ , ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+. Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique. Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”. Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất etylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở. Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non. Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. Có tác dụng kích thích tạo rễ. 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. 14 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp Gồm các chất chính sau:  Acid indolylbutyrique (AIB)  Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ:  Acid naphtyloxyacetique (ANOA)  Acid naphtylacétamide (NAD)  Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D) Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. (Dƣơng Công Kiên, 2002) 2.4.2 Gibbérelline Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trƣớc khi đƣợc nhận dạng. Chất Gibbérelline đầu tiên đƣợc nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA3, kế đến là GA4 + GA7 và GA7. Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lƣợng và vị trí của các chất gắn trên nhân. 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn. Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trƣởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trƣởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa. Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt. Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm. Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dƣờng nhƣ đối ngƣợc với hiện tƣợng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không đƣợc sử dụng vào mục đích này, nhƣng 15 chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trƣởng, chồi ngọn, chồi thân…). 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng Gibbérelline đƣợc tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm, ở đây chúng đƣợc phân bố không đồng đều, một vài loại có trong vài loại cây, một vài loại nấm và một vài chất Gibbérelline có trong cả hai nhóm (nhƣ GA1, 3, 4, 7, 9). Trong cây trồng, một vài loại cây chỉ có một chất Gibbérelline, các loài cây khác có thể có nhiều loại chất Gibbérelline. 2.4.3 Cytokinine Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất. Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine.  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp. Có hai loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là:  Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine).  Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine). 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome. Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải. Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. 16 Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa. 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 17 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 - Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM. 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ. Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy. Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ. Bể rửa chai, ống nghiệm. Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất. Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất. Máy đo pH. 3.2.2 Phòng cấy Tủ cấy vô trùng. Đèn cực tím. Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy. Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng. 3.2.3 Phòng nuôi cây Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy, trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m. Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20 C. Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây. Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây. 18 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau: Nguyên tố đa lượng: NH4NO3 1650 mg/L KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L Nguyên tố vi lượng: H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI 0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L Vitamins: Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin Hcl 0,5 mg/L Thiamin Hcl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Fe EDTA: FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L 3.3. Vật liệu nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm Trong giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các nội dung: 19 Hiệu quả khử trùng của hai loại kháng sinh Tetracylin, Streptomycin. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo từ các mẫu lá trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các mô sẹo trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Các nội dung trên đƣợc nghiên cứu lần lƣợt qua các thí nghiệm. 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy 3.4.1.1 Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Tetracylin. 3.4.1.2 Thí nghiệm 1b:Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Streptomycin.  Bố trí thí nghiệm 1a và 1b: Thực hiện thí nghiệm về thời gian xử lí kháng sinh. - Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy một mẫu. - Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức - Tổng số ống nghiệm cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu trong thí nghiệm: 90 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi T2 T6 T10 Tetracylin Tetracylin Tetracylin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi S2 S6 S10 Streptomycin Streptomycin Streptomycin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 20  Tiến hành thí nghiệm: * Chuẩn bị mẫu: Cắt phần ngọn của cây tiêu dài khoảng 3-5 cm rồi cắt bỏ hết phần lá. Rửa sạch mẫu dƣới vòi nƣớc. Lắc mẫu trong dung dịch xà bông loãng khoảng 15 phút, rồi rửa sạch lại mẫu dƣới vòi nƣớc cho sạch xà bông. Cho mẫu vào dung dịch kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomycin đã pha sẵn, rồi bỏ lên máy lắc và tính giờ để lấy mẫu ra. * Vào tủ cấy: Rửa lại mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Ngâm mẫu trong dung dịch nƣớc Javel với tỷ lệ giữa nƣớc và Javel là 1:1 trong khoảng 15 phút. Rửa sạch Javel trong nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lắc mẫu trong dung dịch cồn 70o trong 30 giây. Rửa lại nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lột bỏ hết lớp lá cho tới khi lộ ra phần ngọn nhỏ màu xanh (không còn phần màu đen) thì dùng dao cấy bén cắt lấy phần ngọn này (dài khoảng 0,5 – 1 cm). Đƣa các phần ngọn này vào trong các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng của thí nghiệm này là: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu ngọn đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose. Môi trƣờng đã khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 15ml / ống nghiệm Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m2.s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 15 ngày 21  Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm: Tỉ lệ mẫu sống = (số mẫu sống/tổng số mẫu) * 100 Tỉ lệ mẫu sạch nấm khuẩn = (số mẫu sạch/tổng số mẫu) * 100 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá:  Bố trí thí nghiệm: - Thực hiện thí nghiệm về môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng là BA và IBA. + Chất kích thích sinh trƣởng BA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 3mg/L + Chất kích thích sinh trƣởng IBA với 3 mức độ: 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L - Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 chai ứng với một nghiệm thức, mỗi bình đƣợc cấy 4 mẫu. - Tổng số chai: 81 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 36 - Tổng số mẫu cho cả thí nghiệm: 324  Tiến hành: Do chồi tiêu vô mẫu lâu mọc lá mà thời gian làm thí nghiệm thì có giới hạn nên chúng tôi sử dụng nguồn mẫu lá tiêu in vitro sạch có sẵn trong phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm này. Chuẩn bị mẫu: Lấy lá của cây tiêu in vitro sạch cắt ra thành các mẫu nhỏ khoảng 0,5 × 0,5 cm, đặt mặt trên của lá trên môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. 22 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Mẫu cấy Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu lá tiêu 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36  Điều kiện thí nghiệm: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose + BA + IBA với sự thay đổi hàm lƣợng của BA và IBA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn Nhiệt độ: 25 ± 20 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian theo dõi thí nghiệm: 4