Nghiên cứu xạ khuẩn streptospoangium phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên

Trang nhan đề Lời cảm ơn Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục các bảng, hình Lời mở đầu Chương_1: Tổng quan tài liệu Chương_2: Vật liệu và phương pháp Chương_3: Kết quả và biện luận Chương_4: Kết luận và đề nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục MỤC LỤC ٭٭٭ Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU 01 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 02 1.1. Đặc điểm .03 1.1.1. Phân loại 03 1.1.2. Đặc điểm sinh thái .03 1.1.3. Đặc điểm bộ gen và tính bất ổn định về di truyền .04 1.1.4. Hợp chất biến dưỡng thứ cấp ở xạ khuẩn 06 1.2. Xạ khuẩn Streptosporangium .08 1.2.1. Đặc điểm phân loại 08 1.2.2. Đặc điểm chung . .14 1.2.3. Sự hình thành bào tử ở Streptosporangium .14 1.2.4. Đặc điểm sinh thái . .15 1.2.5. Hợp chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học từ Streptosporangium . .15 1.2.6. Lý do chọn Streptosporangium làm đối tượng nghiên cứu của đề tài 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .18 2.1. Vật liệu .19 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ .19 2.1.2. Hoá chất 20 2.1.3. Môi trường . .24 2.1.4. Vật liệu sinh học . 28 2.1.5. Địa điểm tiến hành thí nghiệm 30 2.2. Phương pháp . 30 2.2.1. Thu và chuẩn bị mẫu đất 30 2.2.2. Xác định hàm lượng hữu cơ . 31 2.2.3. Phương pháp phân lập xạ khuẩn Streptosporangium .31 2.2.4. Làm tiêu bản mẫu và chụp hình dưới kính hiển vi 32 2.2.5. Thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium phân lập . .33 2.2.6. Tách chiết bộ gen xạ khuẩn .35 2.2.7. Thu nhận gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR .36 2.2.8. Tạo dòng sản phẩm PCR của bộ gen 16S rRNA .37 2.2.9. Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .41 3.1. Kết quả phân lập xạ khuẩn Streptosporangium từ mẫu đất Vườn quốc gia Cát Tiên .42 3.2. Đặc điểm hình thái thô đại và hiển vi điển hình của Streptosporangium của các chủng phân lập Streptosporangium dự tuyển . 44 3.3. Đặc điểm phân bố của xạ khuẩn Streptosporangium phân lập được tại Vườn quốc gia Cát Tiên . .55 3.4. Đặc điểm tăng trưởng và hình thái của các chủng Streptosporangium dự tuyển trên các môi trường thạch khác nhau 56 3.5. Nuôi cấy và thử nghiệm khả năng tạo kháng sinh của các chủng xạ khuẩn trên môi trường lỏng 60 3.5.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh từ dịch nuôi cấy 60 3.5.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của dịch chiết xuất xạ khuẩn .61 3.6. Thu nhận và tạo dòng gen 16S rRNA của các chủng Streptosporangium phân lập . .68 3.7. Giải trình tự gen 16S rRNA và định danh các chủng Streptosporangium .70 3.7.1. Trường hợp chủng CAT-1.20 70 3.7.2. Trường hợp chủng CAT-1.21 .72 3.7.3. Trường hợp chủng CAT-1.22 .74 3.7.4. Trường hợp chủng CAT-7.32 76 3.7.5. Trường hợp chủng CAT-23.25 . 78 3.7.6. Trường hợp chủng CAT-23.26 . 80 3.7.7. Trường hợp chủng CAT-56.54 82 3.7.8. Trường hợp chủng CAT-58.56 . 84 3.7.9. Trường hợp chủng CAT-63.46 . 86 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .89 4.1. Kết luận .90 4.2. Đề nghị .90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC KẾT QUẢ . .i

pdf48 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 20/08/2013 | Lượt xem: 1664 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu xạ khuẩn streptospoangium phân lập từ vườn quốc gia Cát Tiên, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.3.D, E, F) chủng CAT-1.22 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 5-9µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E F Hình 3.3 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-1.22. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X. - Chủng CAT-7.32 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-7.32 có khuẩn lạc đều và phát triển tốt. Bào tử khí sinh nhiều. Đường kính khuẩn lạc 9-12mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: vàng cam đậm 66 (Hình 3.4.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.4.C), chủng CAT-7.32 có khuẩn lạc phẳng. Đường kính khuẩn lạc 8-10mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: trắng Trang 48 hồng nhạt 9. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hòa tan được hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.4.D, E, F) chủng CAT-7.32 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 4-6µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E F Hình 3.4 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-7.32. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X. - Chủng CAT-23.25 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-23.25 có khuẩn lạc phát triển không đều, nhăn nheo ở tâm. Bào tử khí sinh cực ít. Đường kính khuẩn lạc 13- 15mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: hồng nhạt 4. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu đỏ nhạt 42 (Hình 3.5.A,B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.5.C), chủng Trang 49 CAT-23.25 có khuẩn lạc phẳng. Đường kính khuẩn lạc 6-7mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hòa tan được hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.5.D, E, F) chủng CAT-23.25 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-9µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E F Hình 3.5 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-23.25. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X. - Chủng CAT-23.26 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-23.26 có khuẩn lạc không đều. Bào tử khí sinh cực ít. Đường kính khuẩn lạc 11mm. Màu sắc khuẩn ty khí Trang 50 sinh: từ màu hồng nhạt 4. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu đỏ vừa tới nâu hơi vàng đậm 43 tới strong 74 (Hình 3.6.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.6.C), chủng CAT-23.26 có khuẩn lạc đều, hơi dẹp. Bào tử khí sinh phát triển mạnh. Đường kính khuẩn lạc 10-11mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sự hình thành sắc tố hòa tan trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.6.D, E, F) chủng CAT-23.26 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-8µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E F Hình 3.6 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-23.26. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X. Trang 51 - Chủng CAT-26.27 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-26.27 có khuẩn lạc phát triển không đều và nhăn ở tâm. Bào tử khí sinh rất ít. Đường kính khuẩn lạc 11- 13mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: vàng nhạt 89. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: vàng sáng 83 (Hình 3.7.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.7.C), chủng CAT-23.25 có đường kính 7-8mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.7.D, E, F) chủng CAT-26.27 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-9µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E F Hình 3.7 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-26.27. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi Trang 52 trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X - Chủng CAT-56.54 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-56.54 có khuẩn lạc phát triển không đều, hơi nhô cao và nhăn ở tâm. Bào tử khí sinh phát triển ít. Đường kính khuẩn lạc 11mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: hồng ánh vàng đậm 26. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: hồng ánh vàng 27 (Hình 3.8.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.8.C), chủng CAT-56.54 có khuẩn lạc đều, hơi dẹp. Bào tử khí sinh phát triển tốt. Đường kính khuẩn lạc 7-8mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.8.D, E, F) chủng CAT-56.54 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-12µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C D E Trang 53 Hình 3.8 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-56.54. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 100X - Chủng CAT-58.56 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-58.56 có khuẩn lạc phát triển không đều, hơi nhô cao và nhăn ở tâm. Bào tử khí sinh phát triển tốt. Đường kính khuẩn lạc 11-15mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: trắng hơi hồng tới hồng nhạt 9 tới 7. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: cam đậm 51 (Hình 3.9.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.9.C), chủng CAT-58.56 có khuẩn lạc phẳng. Bào tử khí sinh phát triển tốt. Đường kính khuẩn lạc 7-8mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.9.D, E, F) chủng CAT-58.56 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-11µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C Trang 54 D E F Hình 3.9 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-58.56. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, F, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 40X; 100X - Chủng CAT-63.46 Trên môi trường thạch nuôi cấy ISP-2, chủng CAT-63.46 có khuẩn lạc phát triển không đều, nhô cao và nhăn ở tâm. Bào tử khí sinh phát triển mạnh. Đường kính khuẩn lạc 11mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: từ hồng sáng tới hồng nhạt 4 tới 7. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: cam đậm tới cam nâu 51 tới 54 (Hình 3.10.A, B). Trên môi trường Humic acid agar (Hình 3.10.C), chủng CAT-63.46 có khuẩn lạc phẳng. Bào tử khí sinh phát triển tốt. Đường kính khuẩn lạc 7-8mm. Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu trắng 263. Màu sắc khuẩn ty cơ chất: nâu xám 80. Không có sắc tố hình thành trên các môi trường sử dụng. Khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.10.D, E, F) chủng CAT-63.46 có khuẩn ty khí sinh tạo túi bào tử hình cầu đường kính 6-14µm. Đây là đặc trưng của xạ khuẩn Streptosporangium. A B C Trang 55 D E Hình 3.10 Hình thái thô đại và hiển vi của chủng Streptosporangium dự tuyển CAT-63.46. A, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt trước); B, Khuẩn lạc trên môi trường ISP-2 (mặt sau); C, khuẩn lạc trên môi trường Humic acid agar; D, E, khuẩn ty và túi bào tử, độ phóng đại 40X LD; 100X. 3.3. Đặc điểm phân bố của xạ khuẩn Streptosporangium phân lập được tại Vườn quốc gia Cát Tiên Xạ khuẩn Streptosporangium thường hiện diện nhiều trong đất vườn giàu mùn, và hơi acid. Ngoài ra, chúng còn hiện diện trong trầm tích hồ và đất biển. Do vậy, chúng tôi muốn khảo sát mối tương quan phân bố của chủng xạ khuẩn Streptosporangium với hàm lượng hữu cơ và độ pH của mẫu đất. Độ pH và hàm lượng hữu cơ tương ứng của các mẫu đất có sự hiện diện của chủng xạ khuẩn Streptosporangium được trình bày trong Bảng 3.2. Có thể thấy rõ rằng các mẫu đất này đều có pH trong phạm vi hơi acid đến trung tính, là dãy pH khá thích hợp cho sự phát triển của chủng xạ khuẩn Streptosporangium. Trong khi hàm lượng hữu cơ thay đổi khá rộng từ 0.54% đến 2.03%. Bảng 3.2 Đặc điểm sinh thái pH và hàm lượng chất hữu cơ của những mẫu đất có sự hiện diện của Streptosporangium Trang 56 Ký hiệu mẫu Loại mẫu Hệ sinh thái pH Hàm lượng chất hữu cơ (%) CAT-1 Đất cát Rừng thường xanh 5,97 0,83 CAT-7 Đất gần vũng nước Rừng thường xanh 5,83 0,80 CAT-23 Đất Rừng thường xanh đất thấp 6,13 1,43 CAT-26 Đất quanh gốc cây Rừng thường xanh đất thấp 6,97 2,03 CAT-56 Đất quanh bụi tre Rừng tre nứa 5,30 1,18 CAT-58 Đất quanh bụi tre Rừng tre nứa 5,22 0,99 CAT-63 Đất quanh cây dầu Rừng dầu 5,68 0,54 3.4. Đặc điểm tăng trưởng và hình thái của các chủng Streptosporangium dự tuyển trên các môi trường thạch khác nhau Bảy loại môi trường khác nhau được khảo sát là môi trường ISP-2, ISP-2 M, A9, A9 M, Bennett’s agar, Glycerol agar và Humic acid agar. Đây là các môi trường điển hình trong việc phân lập và nuôi cấy các xạ khuẩn thuộc họ Streptosporangiaceae. Các đặc trưng được quan sát và ghi nhận bao gồm: sự phát triển và màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, tính tan của sắc tố. Các chủng xạ khuẩn được quan sát sau 3 tuần nuôi cấy ở các môi trường khác nhau ở nhiệt độ 28oC. Màu sắc của chủng xạ khuẩn nuôi cấy được xác định dựa vào hệ thống bảng màu “NBS/ISCC Color System”. Đặc điểm của các chủng xạ khuẩn nuôi cấy trên các môi trường thử nghiệm được tóm tắt theo Bảng 3.3. Do xạ khuẩn Streptosporangium phát triển khá chậm trên môi trường thạch do đó chúng tôi tiến hành khảo sát đặc điểm tăng trưởng và hình thái của các chủng trên các môi trường khác nhau để có thể chọn được môi trường nuôi cấy phù hợp với từng chủng, đồng thời để đặc trưng hóa chi tiết hơn đặc điểm hình thái của chủng. Qua khảo sát trên các môi trường thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các chủng xạ khuẩn có khả năng hình thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh trên hầu hết các môi trường được thử nghiệm. Các chủng CAT-1.20, CAT-1.21, CAT- 1.22 và CAT-7.32 phát triển khá tốt trên hầu hết các môi trường thử nghiệm và đặc Trang 57 biệt phát triển mạnh đặc biệt trên môi trường ISP-2 và Bennett’s agar. Các chủng xạ khuẩn CAT- 56.54, CAT-58.56, CAT-63.46 thì phát triển tốt trên môi trường ISP-2 và A9 M. Như vậy có thể thấy rằng môi trường ISP-2 là môi trường chung thích hợp cho sự phát triển của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium đã phân lập. Bảng 3.3 Mô tả hình thái của những chủng Streptosporangium phân lập Chủng xạ khuẩn Môi trường nuôi cấy Sự phát triển, màu sắc của khuẩn ty cơ chất Sự phát triển, màu sắc của khuẩn ty khí sinh Sắc tố hòa tan A9 Khá 10 Khá 4 Không A9 M Khá 28 Mạnh 4 27 Không ISP-2 M Mạnh 68 Mạnh 4 Không ISP-2 Mạnh 37 Mạnh 4 Không Bennett’s agar Mạnh 50 Mạnh 7 9 Không Glycerol agar Mạnh 52 Mạnh 7 Không CAT-1.20 Humic acid agar Khá 80 khá 9 Không A9 Yếu 8 Vừa 26 Không A9 M Khá 53 Khá 4 27 Không ISP-2 M Mạnh 50 Mạnh 26 Không ISP-2 Mạnh 54 Mạnh 4 8 Không Bennett’s agar Mạnh 48 50 Mạnh 6 18 Không Glycerol agar Mạnh 50 Mạnh 4 28 Không CAT-1.21 Humic acid agar Khá 80 khá 9 Không A9 Vừa 73 khá 25 Không A9 M Khá 52 khá 4 Không ISP-2 M Mạnh 54 Mạnh 25 Không ISP-2 Mạnh 54 Mạnh 4 Không CAT-1.22 Bennett’s agar Mạnh 53 54 Mạnh 4 Không Trang 58 Glycerol agar Mạnh 53 Mạnh 25 Không Humic acid agar Khá 80 khá 9 Không A9 Vừa 92 Vừa 92 Không A9 M Vừa 73 khá 9 Không ISP-2 M Khá 70 Mạnh Màu trắng Không ISP-2 Mạnh 66 Mạnh 263 Không Bennett’s agar Mạnh 72 Mạnh 263 Không Glycerol agar Khá 73 khá 9 Không CAT-7.32 Humic acid agar Khá 80 khá 9 Không A9 Yếu 10 Yếu 76 4 Không A9 M Yếu 42 45 Yếu 60 Không ISP-2 M Yếu 42 Yếu 33 79 Không ISP-2 Yếu 54 Yếu 4 Không Bennett’s agar Yếu 74 Yếu 80 Không Glycerol agar Yếu 38 Yếu 4 40 Không CAT- 23.25 Humic acid agar Yếu 80 Vừa Màu trắng Không A9 10 4 Không A9 M Yếu 10 Vừa 8 Không ISP-2 M Vừa 39 Vừa 4 Không ISP-2 Vừa 74 76 Vừa 43 76 Không Bennett’s agar khá 77 Vừa 77 Không Glycerol agar khá 53 Vừa 25 Không CAT- 23.26 Humic acid agar Khá 80 Mạnh Màu trắng Không A9 Yếu 92 Yếu 92 9 Không CAT- 26.67 A9 M Yếu 93 Yếu 39 92 Không Trang 59 ISP-2 M Yếu 79 Yếu 72 Không ISP-2 Vừa 83 Vừa 89 Không Bennett’s agar Yếu 90 Yếu 89 Không Glycerol agar Yếu 68 Yếu 67 Không Humic acid agar Vừa 80 khá Màu trắng Không A9 Khá 89 Khá 92 Không A9 M Khá 89 Khá 92 Không ISP-2 Khá 27 Khá 26 Không ISP-2 M Vừa 86 Vừa 92 Không CAT- 56.54 Humic acid agar Vừa 80 Vừa Màu trắng Không A9 Vừa 89 Vừa 92 Không A9 M Khá 89 Khá 92 Không ISP-2 Khá 51 Khá 7 9 Không ISP-2 M Vừa 86 Vừa 92 Không CAT- 58.56 Humic acid agar Vừa 80 Vừa Màu trắng Không A9 Vừa 82 89 Vừa 92 Không A9 M Khá 89 Khá 92 Không ISP-2 Khá 51 54 Khá 4 7 Không ISP-2 M Vừa 86 84 Vừa 92 Không CAT- 63.46 Humic acid agar Vừa 80 Vừa Màu trắng Không 3.5. Nuôi cấy và thử nghiệm khả năng tạo kháng sinh của các chủng xạ khuẩn trên môi trường lỏng Môi trường ISP-2 được chọn là môi trường chung cho việc nuôi cấy xạ khuẩn để nhân giống cấp I. Các bước nhân giống tiếp theo được thực hiện bằng môi trường ISP-2 và L4. Các chủng xạ khuẩn đều được nuôi cấy lắc ở cùng một điều Trang 60 kiện nhiệt độ 28oC và tốc độ lắc là 250 vòng/phút trong thời gian 7 ngày. Chúng tôi nhận thấy việc sử dụng môi trường lỏng giúp rút ngắn thời gian nuôi cấy đặc biệt khi ta cần một lượng sinh khối lớn cho giữ giống, tách chiết bộ gen và cho thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn. 3.5.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh từ dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy sau 7 ngày nuôi cấy lắc các chủng xạ khuẩn Streptosporangium trên hai môi trường lỏng ISP-2 và L4 được dùng để kiểm tra hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đĩa giấy. Kết quả thí nghiệm là âm tính với các chủng vi sinh vật kiểm định. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến kết quả âm tính của thí nghiệm trên. Theo Egorov [17] thì một số vi sinh vật trong quá trình sống có thể phóng thích kháng sinh (penicillin, streptomycin, tetracycline, …) ra môi trường xung quanh; một số vi sinh vật sản xuất kháng sinh nhưng chỉ phóng thích một lượng nhỏ kháng sinh (candidicin, ristomycin, …) ra môi trường; một số vi sinh vật tạo kháng sinh ra môi trường xung quanh trong suốt quá trình sống của chúng (gramicidins, endomycin, rimocidin, …) và các kháng sinh này phần lớn vẫn còn nằm, gắn chặt với tế bào sản sinh ra chúng. Như vậy, có thể cho rằng các chủng xạ khuẩn Streptosporangium nuôi cấy trong thí nghiệm này có thể sinh kháng sinh và kháng sinh sinh ra có thể được tích lũy bên trong tế bào vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển hoặc chúng chỉ được phóng thích ra môi trường xung quanh với một lượng nhỏ hoặc các kháng sinh được phóng thích hoàn toàn ra môi trường bên ngoài nhưng hàm lượng rất thấp. Do đó sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy từ các chủng xạ khuẩn Streptosporangium này đã không thể hiện được hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi sinh vật kiểm định. Mặt khác, kết quả âm tính với thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium nói trên không chứng minh được các chủng chúng tôi đang thí nghiệm có khả năng sản sinh kháng sinh hay không vì chúng tôi chỉ mới sử dụng một điều kiện nuôi cấy cho hai loại môi trường nên có thể chúng tôi vẫn chưa chọn được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy phù hợp để thúc đẩy khả năng sinh hoạt chất của xạ khuẩn. Trang 61 3.5.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng sinh của dịch chiết xuất xạ khuẩn Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh kháng sinh của những chủng Streptosporangium. Chủng vi khuẩn kiểm định Số ký hiệu Môi trường nuôi cấy Ngày nuôi cấy E.coli. Pseu. Bac. Staph. Sac. Can. Asp. Pen. 30MC ISP-2 7 NA NA NA NA 16mm, 20mm 12mm, 15mm NA 13mm, 13mm 14CF L4 7 NA NA NA NA 11mm, 14mm NA NA NA 15MC L4 14 NA NA NA NA 18mm, 19mm 28mm, 30mm NA 16mm, 21mm 15CF L4 14 NA NA NA NA 11mm, 12mm 14mm, 17mm NA 15mm, 15mm 17MC L4 14 NA NA NA NA 19mm, 23mm 17mm, 17mm NA 19MC L4 14 NA NA NA NA NA NA 18mm, 19mm 10mm, 10mm NA: âm tính; Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Saccharomyces cereviae, Candida albicans, Aspergillus oryzae, Penicillium sp. Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên hai loại môi trường lỏng ISP-2 và L4 như trong 7 ngày và 14 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm để tách sinh khối khuẩn ty (MC) và dịch lên men (CF) và được ly trích hoạt chất như được mô tả trong phần vật liệu và phương pháp. Dịch chiết xuất có nồng độ là 10X được dùng để tẩm đĩa giấy và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh trên các chủng vi sinh vật kiểm định. Kết quả cho thấy dịch tách chiết từ các chủng xạ khuẩn Streptosporangium nói trên không có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram âm và Gram dương kiểm định, nhưng có hoạt tính đối với các chủng nấm men và nấm mốc kiểm định. Các đĩa giấy tẩm kháng sinh chuẩn và đĩa giấy tẩm methanol để làm đối chứng âm và dương trong thí nghiệm này. Kết quả thử hoạt tính sinh kháng sinh được tổng hợp trên Bảng 3.4. Chủng vi khuẩn gram âm E. coli cho đường kính vòng kháng Trang 62 khuẩn đối với kháng sinh Gentamycin là 20mm. Chủng Pseudomonas aeruginosa cho đường kính vòng kháng khuẩn đối với Gentamycin là 21mm. Tương tự chủng vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis có đường kính vòng kháng khuẩn đối với kháng sinh Gentamycin là 26mm, với Penicillin là 18mm. Chủng Staphylococcus aureus có đường kính vòng kháng khuẩn đối với Gentamycin là 24mm, với Penicillin là 33mm. Còn với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisae, Candida albicans thì đường kính vòng kháng khuẩn đối với kháng sinh Nystatin lần lượt là 38mm và 33mm. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae cho đường kính vòng kháng khuẩn đối với Nystatin là 23mm và chủng Penicillium sp. thì đường kính vòng kháng khuẩn đối với Nystatin là 22mm. Dung môi methanol được dùng trong tách chiết không có tác dụng ức chế đối với vi sinh vật kiểm định. Dịch chiết xuất ký hiệu số 30MC tương ứng với pha đặc hệ sợi thu được từ chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-7.32 được nuôi cấy ở thời điểm nuôi cấy 7 ngày trên môi trường lỏng ISP-2 có hoạt tính trên chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với đường kính vùng ức chế là 18mm, đường kính vùng ức chế với chủng nấm men kiểm định Candida albicans là 13,5mm và chủng nấm mốc Penicillium sp. là 13mm (Hình 3.11). A1 B1 C1 A2 B2 C2 Trang 63 Hình 3.11 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ chủng CAT-7.32. A, Trường hợp Penicillium sp. (A1,mặt trước; A2,mặt sau); B, Trường hợp Candida albicans (B1, mặt trước; B2, mặt sau); C, Trường hợp Saccharomyces cerevisiae (C1, mặt trước; C2, mặt sau). MC, dịch chiết từ khuẩn ty; CF, dịch chiết từ dịch lên men; 30, số ký hiệu dịch chiết xuất từ chủng CAT-7.32 sau 7 ngày nuôi cấy. Dịch chiết xuất ký hiệu số 14CF tương ứng với pha lỏng môi trường nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-63.46 sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng L4 có hoạt tính trên chủng nấm men kiểm định Saccharomyces cerevisiae với đường kính vùng ức chế là 12.5mm (Hình 3.12). A1 A2 Hình 3.12 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ chủng CAT-63.46. A, Trường hợp Saccharomyces cerevisiae (A1, mặt sau; A2, mặt trước); MC, dịch chiết từ khuẩn ty; CF, dịch chiết từ dịch lên men; 14, số ký hiệu dịch chiết xuất từ chủng CAT-63.46 sau 7 ngày nuôi cấy. Các mẫu chiết xuất số hiệu 15MC, 15CF, 17MC, 19MC thu được khi nuôi cấy trên môi trường lỏng L4 ở thời điểm 14 ngày cũng có hoạt tính trên chủng nấm men và nấm mốc kiểm định. Mẫu chiết xuất số hiệu 15MC tương ứng với pha đặc hệ sợi khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-58.56 trên môi trường lỏng L4 ở thời điểm 14 ngày có hoạt tính trên chủng nấm men Sacchromyces cerevisiae với đường kính vùng ức chế là 18,5mm, đường kính vòng kháng chủng nấm men Candida albicans Trang 64 tương ứng là 29mm, và với chủng nấm mốc Penicillium sp. đường kính vòng kháng nấm là 18,5mm. Mẫu chiết xuất số hiệu 15CF tương ứng với pha lỏng môi trường thu được khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptosporangium số 58.56 ở thời điểm nuôi cấy 14 ngày trên môi trường L4 có hoạt tính trên các chủng nấm men kiểm định Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans với đường kính vùng kháng nấm tương ứng lần lượt là 11,5mm và 15,5mm, đường kính vùng ức chế với chủng nấm mốc Penicillium sp. là 15mm (Hình 3.13). A1 B1 C1 A2 B2 C2 Hình 3.13 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ chủng CAT-58.56. A, Trường hợp Sacchromyces cerevisiae (A1, mặt sau; A2, mặt trước); B, Trường hợp Candida albicans (B1, mặt sau; B2, mặt trước); C, Trường hợp Penicillium sp. (C1, mặt sau; C2, mặt trước). MC, dịch chiết từ khuẩn ty; CF, dịch chiết từ dịch lên men; 15, ký hiệu của chủng CAT-58.56 ở thời điểm nuôi cấy 14 ngày. Trang 65 Dịch chiết xuất số hiệu 17MC tương ứng với pha đặc hệ sợi thu được khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-1.20 trên môi trường lỏng L4 sau 14 ngày nuôi cấy chỉ có hoạt tính ức chế trên các chủng nấm men kiểm định Saccharomyces cerevisiae và Candida albicans với đường kính vùng ức chế tương ứng là 21mm và 17mm và dịch chiết xuất 17MC nói trên cũng có khả năng ức chế một phần sự phát triển của chủng nấm mốc Penicilium sp.. A1 B1 C1 A2 B2 C2 Hình 3.14 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ chủng CAT-1.20. A, Trường hợp Sacchromyces cerevisiae (A1, mặt sau; A2, mặt trước); B, Trường hợp Candida albicans (B1, mặt sau; B2, mặt trước); C, Trường hợp Penicillium sp. (C1, mặt sau; C2, mặt trước); MC, dịch chiết từ khuẩn ty; CF, dịch chiết từ dịch lên men; 17, ký hiệu của chủng CAT-1.20 ở thời điểm nuôi cấy 14 ngày. Trang 66 Dịch chiết xuất số hiệu 19MC tương ứng với pha đặc hệ sợi thu được khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-1.21 ở thời điểm 14 ngày trên môi trường lỏng L4 chỉ có hoạt tính ức chế trên các chủng nấm mốc kiểm định Aspergillus oryzae và Penicillium sp. với đường kính vùng ức chế tương ứng là 18.5mm và 10mm. A1 B1 A2 B2 Hình 3.15 Hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ chủng CAT-1.21. A, Trường hợp Aspergillus oryzae (A1, mặt sau; A2, mặt trước); B, Trường hợp Penicillium sp. (B1, mặt sau; B2, mặt trước); MC, dịch chiết từ khuẩn ty; CF, dịch chiết từ dịch lên men; 19, ký hiệu của chủng CAT-1.21 ở thời điểm nuôi cấy 14 ngày. Trang 67 Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh kháng sinh từ dịch chiết xuất của các chủng xạ khuẩn Streptosporangium phân lập được tại Vườn quốc gia Cát Tiên cho thấy trong cùng một điều kiện nuôi cấy về tốc độ lắc, nhiệt độ và cùng thể tích nuôi cấy nhưng môi trường nuôi cấy L4 là thích hợp hơn so với môi trường ISP-2 cho mục đích tổng hợp các hợp chất có hoạt tính kháng sinh. Kết quả thí nghiệm đã cho thấy dịch chiết xuất thu được từ việc nuôi cấy 5 trong tổng số 8 chủng xạ khuẩn Streptosporangium trên môi trường L4 cho các kết quả ức chế sự phát triển các vi sinh vật kiểm định. Trong khi đó chỉ có 1 trong tổng số 8 chủng xạ khuẩn Streptosporangium nói trên cho kết quả kiểm định dương tính trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định khi chúng được nuôi cấy trên môi trường ISP-2. Ngoài ra thời gian nuôi cấy 14 ngày là thích hợp hơn so với 7 ngày. Các kết quả thử nghiệm khả năng sinh kháng sinh từ dịch chiết xuất của các chủng xạ khuẩn ở thời điểm nuôi cấy 14 ngày cho nhiều kết quả dương tính hơn so với dịch chiết xuất xạ khuẩn thu được ở thời điểm nuôi cấy 7 ngày. Điều này cũng có thể giải thích là do xạ khuẩn Strepsporangium có tốc độ tăng trưởng yếu, và thời gian nuôi cấy thường từ 2 tuần tới 1 tháng trên môi trường thạch. Kết quả thí nghiệm cho thấy nhiều dịch chiết từ khuẩn ty (MC) có hoạt tính kháng nấm hơn dịch chiết từ dịch lên men (CF) và đường kính vùng ức chế cũng lớn hơn. Điều này cho thấy các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm này chủ yếu được tích lũy bên trong tế bào và chỉ một lượng nhỏ được phóng thích ra môi trường. Do đó chỉ khi ta tiến hành tách chiết dịch nuôi cấy xạ khuẩn thì mới thu được kết quả kháng nấm dương tính. Kết quả này cũng phần nào giải thích kết quả thử nghiệm âm tính khi ta sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy xạ khuẩn ở phần thí nghiệm trước. 3.6. Thu nhận và tạo dòng gen 16S rRNA của các chủng Streptosporangium phân lập Gen 16S rDNA của các chủng xạ khuẩn được thu nhận bằng phản ứng PCR với bản mẫu là bộ gen DNA, mồi xuôi 27f và mồi ngược 1492r. Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với thang DNA 1kb. Trang 68 Kết quả cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR khuyếch đại gen 16S rDNA thu được có kích thước khoảng 1446kb tương ứng vạch có kích thước 1500kb trên thang DNA (Hình 3.16). Như vậy ta đã thu nhận được gen 16S rDNA từ các chủng xạ khuẩn. Hình 3.16 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA Giếng 1, thang DNA 1kb; 2, chứng âm; 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, sản phẩm phản ứng PCR tương ứng với các chủng xạ khuẩn Streptosporangium CAT-1.20; CAT- 23.25; CAT-1.21; CAT-1.22; CAT-56.54; CAT-58.56; CAT-63.46; CAT-7.32, CAT- 23.26. Trước khi dòng hóa, plasmid PGEM được xử lý mở vòng bằng enzyme EcoRV và được loại bỏ nhóm phosphat bằng enzyme CIAP để nối với sản phẩm PCR chứa gen 16S rRNA có chứa nhóm phosphat để tạo plasmid PGEM tái tổ hợp. Tiếp theo sản phẩm nối được hóa biến nạp vào chủng E.coli DH5α. Các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp thu được sẽ được sàng lọc sơ bộ dựa vào khả năng kháng Ampicillin trên môi trường LB-Agar có bổ sung X-gal. Những tế bào nào mang plasmid tái tổ hợp sẽ sống sót và hình thành khuẩn lạc màu trắng. Các dòng khuẩn lạc dự tuyển này sẽ được giữ lại để chuẩn bị cho các bước sàng lọc và kiểm tra phía sau. Trang 69 Thực hiện phản ứng cắt plasmid pGEM tái tổ hợp với enzyme EcoRV. Plasmid pGEM có kích thước khoảng 3000kb và đoạn gen 16S rRNA chèn có kích thước 1446kb nên plasmid pGEM tái tổ hợp có kích thước dự kiến 4446kb. Điện di các sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra plasmid pGEM tái tổ hợp trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb và plasmid pGEM (Hình 3.17). Hình 3.17 Kiểm tra plasmid pGEM tái tổ hợp bằng enzyme EcoV M, thang DNA chuẩn 1kb; 1, pGEM; 2-10, pGEM tái tổ hợp chứa gen 16S rRNA từ các chủng CAT-1.20; CAT-23.25; CAT-1.21; CAT-1.22; CAT-56.54; CAT- 58.56; CAT-63.46; CAT-7.32, CAT-23.26. Kết quả điện di cho một vạch nằm giữa vạch 4000kb và 5000kb phù hợp với kích thước lý thuyết của plasmid pGEM tái tổ hợp là 4500kb. Như vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công đoạn gen 16S rRNA của 9 chủng xạ khuẩn Streptosporangium vào plasmid pGEM. 3.7. Giải trình tự gen 16S rRNA và định danh các chủng Streptosporangium Plasmid pGEM tái tổ hợp sau khi qua quá trình kiểm tra được giải trình tự với cặp mồi T7 và SP6 theo phương pháp Sanger cải tiến trên máy Big DyeTM terminator của công ty Marcogen, Hàn Quốc. Đoạn trình tự DNA của 16S rRNA của các chủng xạ khuẩn được xếp gióng cột bằng chương trình Clustal X (version 1.64b; Thompson và cộng sự, 1997) với các trình tự tương ứng đại diện cho chủng Streptosporangium từ ngân hàng gen GenBank để định danh các chủng phân lập. Trang 70 3.7.1. Trường hợp chủng CAT-1.20 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-1.20. GCAGTCGAGCGAAAAGGCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAG TAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACACGCTTC CGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGG TGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACAACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTG GGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGG AAGCCTGACGCACCGACCCCACGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAG GGACAAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTTGTCCCGT CGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTCAATACGGGCTGGCTAGAGGTAGGCA GGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCG AAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCTTCCACGGTTTCCGC GCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTT ACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCTCTTCGGACCGGGTGACAGG TGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTC AACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATG CTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTAAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCT CAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGC AACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCA ACACCCGAAGCCCGTTGCCCAACCGGGGGAGCGTCGAGGGCGCC. Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-1.20 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.19. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-1.20 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-1.20 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.18). Đặc biệt CAT-1.20 có độ tương đồng cao nhất với S. nondiastaticum nên có thể thuộc loài này. Trang 71 Hình 3.18 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-1.20 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 72 3.7.2. Trường hợp chủng CAT-1.21 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-1.21. CTTACACATGCAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGT AACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAC GACACGCTTCCGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTCTTTTCGGTTGGGGATGGACTCGCGGCCTATC AGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC GGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCG CAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCT CTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGG CTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTA GAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAAC ACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCTTCCA CGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAA ACTGAAAGGAATGGAGGGGGGCCGGCACAAGCGGAGGATCATGTTGCTTAATTAGAAGCAACGC GAAAACCCTTACCAAGCATTGACTTCGCCCGGAAAGTTCGGGAGACGGATCCCTTTTGGGACTG GGTGACAGTTGGTCCATGGTTGTTGTCAGCTTGTGTGTTAAGATGTTGGGTTAAGTCCGGCAATT GAGAGCAACCCTTCCTTCATGTTCCCAGCAGGCCTTTTGGGTTGGGGGGGACTCATGGGGGACT GCTGGGGTCAACTTGGAGGAAGGAGGGGATGAGGTCAAGTCTACATGCCCGTTAGGTCTGGGGC CGCAAACATCCGACAATGCCTGGTACAGAGGGTAGCGATGCCCACAGGCGGAGACAATCCTTAA AAGCGGGTCTCAGTTCGGATGGGGGTATGCAACTCGACCCCATGAAGTGGCAGTGCCTAGTATTC GCAAATCAGCACAGTTCCGGGGAATACGTTCCCGGGCCTGGTCCACTCCGCCCGTCATGTCACGA AAGTCGCCAACACCCGAAGCCCGGTGGCCCATCCCTTGGGGGGACCGTTAATGTGGGCGCACTT CCG Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-1.21 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.19. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-1.21 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-1.21 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.19). CAT-1.21 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-1.21 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần khảo Trang 73 sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-1.21. Hình 3.19 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-1.21 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 74 3.7.3. Trường hợp chủng CAT-1.22 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-1.22. GCTTACACATGCAGTCGAGCGGAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGT AACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAC GACACGCTTCCGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTCTTTTCGGTTGGGGATGGACTCGCGGCCTATC AGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACC GGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCG CAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCT CTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCA GCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGG CTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTA GAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAAC ACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCTTCCC CGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTTAGCGCCCCCCCTGGGGAGTACGGCCCCAAGGCTAAAA CTCAAAGGAATTGAGGGGGGCCGGCACAAGCGGAGGAGCATGTTGCTTAATTGGAAGCAACGG GAAGACCCTTACCAAGCATTGACTTCGCCCGGAAAGTTCGGGAGACGGATCCCTTTTGGGACTG GGTGACAGTTGGTCCATGGTTGTCTTCAGCTTGGTCGTTAAGATGTTGGGTTAAGTCCGGCAACG AGCGCAACCTTGCTCCATGTTGCCAGCGGGCCCTTTGGGTCGGGGGGGACTCATGGGGGCATTC CGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGAGGTCAAGTCTTCATGCCCCTTAGGTCTTGGGCTG CAAACATCCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTAGGGATACCCCAAGGTGGACAGAATCCCTAAAA GCGGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTTTGCACCTCGACCCCATGAAGTGGGAGTGGCTAGTAATCGC AGATCAGCAACGTTTCGGGGAATACGTTCCGGGCCTTGTCCACACCGCCCGTCACGTCACGAAA GTCGGCAACACCCGAAGCCGGTGGCCCATCCCTTTGGGGGGAGCGTCTAAGCTGCGCGCGTGGC CC Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-1.22 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.20. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-1.22 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-1.22 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.20). CAT-1.22 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-1.22 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần khảo Trang 75 sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-1.22. Hình 3.20 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-1.22 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 76 3.7.4. Trường hợp chủng CAT-7.32 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-7.32. GTGAGCGGAGAGGCCATTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAA CCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACACGCTCCTGC ATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGG GGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGA CTGATACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGC CTGACGCAGCGACTCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAC GAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACC TAAGGCCGCAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTACGTGGCTTGTCGCGTCAGA TGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCACGTCTGCATTCAATACGGGCTGGCTACCAGTCAGCATGGG GAACCGAATTCCTGGTGTACCGGTGAAATGCGCCCATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGC GGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTCAGGAACGAAAGCGTGGGGGGCCAACATGATTAAATACC CTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGCGGGGTCTTTACACGGTTTCGTCGCCGTA GTTAACGCATTAAGGGCCCCGCGTGGGGAGTCTGGCCGCAAGTTAAAAACTCAAAGGAATTGAG GGGGGCCCGCACAAGCGGCGGACCATGTTGCTTAATTGGCAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAG GCTAGACATCGCCCGGAAACACCCAGAGATGGTTGCCTCTTCGGACCGGGTGACAGGTGGTGCA TGGCTGTTGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTC CATGTTGCCAGCAGCATTTTCGGATGGCGGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGA GGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCATTATGTCTGGGGCCGCAAACAGGCTACAATG GCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCATAAAACCCGGTTTCATTTCGGA TTGGGGTATGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGTTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCG GTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAGGTCATGAAAGTCGGCAACACCCGAA GCCCGGTCGCCAACCCGTTG Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-7.32 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.21. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-7.32 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-7.32 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.21). CAT-7.32 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-7.32 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-7.32. Trang 77 Hình 3.21 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-7.32 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 78 3.7.5. Trường hợp chủng CAT-23.25 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-23.25. GCTTACCATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAG TAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATA CGACACGCTCCCGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGACTCGCGGCCTAT CAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGAC CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC GCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAAC CTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGT GGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGC TAGAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGA ACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAG CGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCTTC CACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTA AAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAAC GCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCTCTTCGGAC CGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAGCATCTTCGGATGGCTGGGGACTCATGGGGGA CTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGG CTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTA AAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAAT CGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCAC GAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCCTTTGGGGGGAGCGGTCGAAGGGGCTGC ATGCC Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-23.25 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.22. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-23.25 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-23.25 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.22). CAT-23.25 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-23.25 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần Trang 79 khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-23.25. Hình 3.22 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-23.25 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 80 3.7.6. Trường hợp chủng CAT-23.26 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-23.26. CGCTGGCGGCGTGCTTAACACATCGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAA AGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTC TGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACACGCTCCTGCATGGGATGCGTGTG GAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACC AAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGAC GCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGT ACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCG TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGG GGCTTAACTCCAGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTC CTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGG CCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA CGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGGCCTTCCACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATT AAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATC GCCCGGAAACACCCAGAGATGGGTGCCTCTTCGGACCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCA GCAGCATCTTCGGATGGCTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACA GAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTC TGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATAC GTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGG CCCAACCCGTTTGGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-23.26 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.23. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-23.26 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-23.26 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.23). CAT-23.26 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-23.26 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần Trang 81 khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-23.26. Hình 3.23 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-23.26 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 82 3.7.7. Trường hợp chủng CAT-56.54 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-56.54. CGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGC GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGG GTCTAATACCGGATACGACACGCTCCCGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGAT GGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGG CCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCT TCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGAGCTCGTAGGTGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTC GATACGGGCTGGCTAGAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCA GATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGA AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGG TGTGGGGGCCTTCCACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACG GCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTT AATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCTCTGGAGACAGA GCCCTCTTCGGACCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAGCATCTTCGGATGGCTGGGG ACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCC CTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGG AGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGG AGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCCTTTTTGGGGGGAGCG GTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-56.54 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.24. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-56.54 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-56.54 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.24). CAT-56.54 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-56.54 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần Trang 83 khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-56.54. Hình 3.24 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-56.54 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 84 3.7.8. Trường hợp chủng CAT-58.56 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-58.56. CGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGC GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGG GTCTAATACCGGATACGACACGCTCCTGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGAT GGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGG CCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCT TCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGAGCTCGTAGGTGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTC GATACGGGCTGGCTAGAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATCCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCA GATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGA AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGG TGTGGGGGCCTTCCACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACG GCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTT AATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCTCTGGAGACAGA GCCCTCTTCGGACCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAGCATCTTCGGATGGCTGGGG ACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCC CTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGG AGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGG AGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCCGTTTGGGGGGGAGCG GTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-58.56 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.25. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-58.56 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-58.56 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.25). CAT-58.56 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-58.56 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần Trang 85 khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-58.56. Hình 3.25 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-58.56 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 86 3.7.9. Trường hợp chủng CAT-63.46 Trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng CAT-63.46. CGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGC GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGG GTCTAATACCGGATACGACACGCTCCTGCATGGGATGCGTGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGAT GGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGG CCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCT TCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA AGAGCTCGTAGGTGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCTTGGGGCTTAACTCCAGGTCTGCATTC GATACGGGCTGGCTAGAGGTAGGCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCA GATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTTACCTGACGCTGAAGAGCGA AAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGG TGTGGGGGCCTTCCACGGTTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACG GCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTT AATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCCGGAAAGCTCTGGAGACAGA GCCCTCTTCGGACCGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAGCATCTTCGGATGGCTGGGG ACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCC CTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGG AGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGG AGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCCGTTTGGGGGGGAGCG GTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA Kết quả sắp gióng cột trình tự của chủng CAT-63.46 với trình tự của các chủng đại diện của Streptosporangium được trình bày trên Hình 3.26. Trình tự gen 16S rRNA của chủng CAT-63.46 đã được xác định. Trình tự này được xếp gióng cột với các trình tự đại diện tương ứng của các chủng xạ khuẩn trong họ Streptosporangiaceae. Kết quả cho thấy chủng CAT-63.46 nằm chung cluster của các loài Streptosporangium (Hình 3.26). CAT-63.46 có độ tương đồng cao với S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum nên có thể kết luận chủng CAT-63.46 là Streptosporangium và có thể là một trong ba loài trên. Cần Trang 87 khảo sát thêm để có thể kết luận chính xác về tên loài của chủng Streptosporangium CAT-63.46. Hình 3.26 Cây phát sinh loài neighbour-joining của CAT-63.46 với các chủng thuộc họ Streptosporangiaceae. Trang 88 Tóm lại, từ trình tự 16S rRNA, chúng tôi đã có cơ sở kết luận chủng CAT-1.20 thuộc loài Streptosporangium nondiastaticum. Các chủng CAT-1.21, CAT-1.22, CAT-7.32, CAT-23.25, CAT-23.26, CAT-56.54, CAT-58.56 và CAT-63.46 cũng là Streptosporangium nhưng chưa xác định được thuộc loài nào trong 3 loài S. nondiastaticum, S. pseudovulgare, S. viridalbum. Các kết quả giải trình tự 16S rRNA đã khẳng định kết quả được phân lập và chọn làm Streptosporangium dự tuyển dựa vào đặc điểm hình thái.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf9.pdf
  • pdf1.pdf
  • pdf10.pdf
  • pdf11.pdf
  • pdf12.pdf
  • pdf2.pdf
  • pdf3.pdf
  • pdf4.pdf
  • pdf5.pdf
  • pdf6.pdf
  • pdf7.pdf
  • pdf8.pdf
Luận văn liên quan