Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương

34 trang ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học và dược động học của thuốc là một lĩnh vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Trong khi đó, ở các nước khác, đây là một tiêu chí bắt buộc các hãng Dược phẩm phải làm nếu muốn đưa thuốc ra thị trường. Một trong những vấn đề đánh giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương. Các phương pháp phân tích hay dùng để xác định nồng độ thuốc trong huyết tương (dịch sinh vật) là sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ), sắc ký khí (GC), sắc ký khí gắn với máy khối phổ (GC - MS ), phóng xạ miễn dịch, điện di mao quản Trong đó, HPLC đặc biệt là HPLC pha đảo với detector UV là phương pháp hayđược dùng hơn cả, do tinh ưu việt nổi trội về độ nhạy, tính chính xác, độ chọn lọc, tính kinh tế. Để có một qui trình dùng HPLC đảm bảo độ tin cậy để phân tích thuốc trong dịch sinh vật, chúng ta khảo sát các điều kiện sắc ký thích hợp như cột; dung môi pha động; lưu lượng dòng; bước sóng quy trình xử lý mẫu, khoản nồng độ khảo sát. Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - là thuốc chống viêm phi steroid; có tác dụng giảm đau, chống viêm, ức chế quá trình tổng hợp prostaglandin và leukotrien; ức chế sự kết dính tiểu cầu được dùng nhiều trong điều trị thấp khớp mãn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, thoái hoá khớp nặng. Ketoprofen là thuốc mới được đưa vào sản xuất ở nước ta và chưa có tài liệu trong nước nào đánh giá định lượng ketoprofen trong huyết tương. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương” với mục tiêu: -Khảo sát và lựa chọn dung môi chiết ketoprofen trong huyết tương cho hiệu xuất chiết cao. -Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng ketoprofen trong huyết tương . -Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương bằng HPLC. -Áp dụng định lượng ketoprofen trong huyết tương người sau khi uống thuốc và theo dõi độ ổn định của ketoprofen theo thời gian bảo quản. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ y tế ( 2002 ) - Dược điển Việt Nam, Nhà xuất bản y học Hà nội. 2. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An ( 1998 ) - Hoá phân tích 2, chế bản và in tại trung tâm thông tin Đại học dược Hà Nội. 3. Phạm Luận ( 1989 ) - GT cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng cao áp - HPLC, Trường đại học Tổng hợp Hà nội. 4. Tào Duy Cần ( 1999 ) - Tra cứu và sử dụng thuốc và biệt dược nước ngoài, quyển 1. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật 5. Từ điển bách khoa dược học ( 1999 ). Nhà xuất bản từ điển bách khoa Hà nội. 6. Vidal. 7. Công ty dịch vụ y tế tổng hợp Q4 TPHCM - TCCS. 8. XNLD Phone - Doulenc Poren - TCCS. 9. AHSF Drug Fuformation. 10. BP 93,98. 11. Chi Yin Wong, Da Peng Wang - Drug development and industrial; Pharmany, 20, 1994, page 1077 - 1078. 12. The transdermal Penetration of a series of Nonsteroidal Ation flammatory Drugs - Journal of pharmaceutical Sciences, 1997, Số 86, trang 503. 13. John Mc Ewen, Masimo De Luca,Alessandro casini, .(1998 ) - the Effect of Foood and Antacid on the Bioavailability of Dexketoprrofen Trometamol - JournalClinical Pharmacology, page 42. 14. J.R.Veraat et al. - At line Solid- phase extraction for capillary electrophoresis application to negatively charged Solutes (1998 ) - Journal of Chromatography B, No 719, page 199 -208. 15. Martindal: The complete drug reference 32thEdi, 1999. 16. N. Tarimci, D. Ermis (1997) - Sustained release characteristics and pharmacokinetic parameters of ketoprofen suppositories using chitosan, - International Journal of Pharmaceutics, No 147, page 72,73. 17. S. Heitmeier, G. Blaschke (1999) - Direct assay of nonopiod analyesic and their metabolites in human urine by capillary ellectrophoresis and capillary electrophoresis - mass spectrometry- Journal of Chromatography B, No 721, page 124. 18. USP 24.

doc37 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 02/02/2013 | Lượt xem: 1975 | Lượt tải: 5download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
®Æt vÊn ®Ò HiÖn nay ë n­íc ta, viÖc nghiªn cøu sinh d­îc häc vµ d­îc ®éng häc cña thuèc lµ mét lÜnh vùc t­¬ng ®èi míi, ®ang ngµy cµng ®­îc quan t©m. Trong khi ®ã, ë c¸c n­íc kh¸c, ®©y lµ mét tiªu chÝ b¾t buéc c¸c h·ng D­îc phÈm ph¶i lµm nÕu muèn ®­a thuèc ra thÞ tr­êng. Mét trong nh÷ng vÊn ®Ò ®¸nh gi¸ sinh d­îc häc cña thuèc lµ møc ®é hÊp thu thuèc vµ nång ®é thuèc ®¹t ®­îc trong huyÕt t­¬ng. C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hay dïng ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é thuèc trong huyÕt t­¬ng (dÞch sinh vËt) lµ s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ), s¾c ký khÝ (GC), s¾c ký khÝ g¾n víi m¸y khèi phæ (GC - MS ), phãng x¹ miÔn dÞch, ®iÖn di mao qu¶n.... Trong ®ã, HPLC ®Æc biÖt lµ HPLC pha ®¶o víi detector UV lµ ph­¬ng ph¸p hay®­îc dïng h¬n c¶, do tinh ­u viÖt næi tréi vÒ ®é nh¹y, tÝnh chÝnh x¸c, ®é chän läc, tÝnh kinh tÕ. §Ó cã mét qui tr×nh dïng HPLC ®¶m b¶o ®é tin cËy ®Ó ph©n tÝch thuèc trong dÞch sinh vËt, chóng ta kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn s¾c ký thÝch hîp nh­ cét; dung m«i pha ®éng; l­u l­îng dßng; b­íc sãng.... quy tr×nh xö lý mÉu, kho¶n nång ®é kh¶o s¸t. Ketoprofen- acid -2 (- benzoyl phenyl ) propionic - lµ thuèc chèng viªm phi steroid; cã t¸c dông gi¶m ®au, chèng viªm, øc chÕ qu¸ tr×nh tæng hîp prostaglandin vµ leukotrien; øc chÕ sù kÕt dÝnh tiÓu cÇu ®­îc dïng nhiÒu trong ®iÒu trÞ thÊp khíp m·n tÝnh, ®Æc biÖt viªm ®a khíp d¹ng thÊp, tho¸i ho¸ khíp nÆng. Ketoprofen lµ thuèc míi ®­îc ®­a vµo s¶n xuÊt ë n­íc ta vµ ch­a cã tµi liÖu trong n­íc nµo ®¸nh gi¸ ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Do ®ã chóng t«i thùc hiÖn ®Ò tµi “ Nghiªn cøu x©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng” víi môc tiªu: -Kh¶o s¸t vµ lùa chän dung m«i chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng cho hiÖu xuÊt chiÕt cao. -Kh¶o s¸t vµ t×m ®iÒu kiÖn s¾c ký thÝch hîp ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . -X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b»ng HPLC. -¸p dông ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng thuèc vµ theo dâi ®é æn ®Þnh cña ketoprofen theo thêi gian b¶o qu¶n. PhÇn i: tæng quan. 1.1 §¹i c­¬ng vÒ Ketoprofen. 1.1.1 C«ng thøc vµ tÝnh chÊt lý ho¸[1] [ 5]. CH – COOH C O CH3 - Ph©n tö l­îng : 254.29 - Tªn khoa häc :acid 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic - TÝnh chÊt: Bét kÕt tinh tr¾ng, kh«ng mïi. Thùc tÕ kh«ng tan trong n­íc ë 200C, tan hoµn toµn trong kiÒm m¹nh, ethanol 960, aceton cloroform vµ ether. pKa =5,94 trong hçn hîp methanol - n­íc (3 : 1). Cùc ®¹i hÊp thô trong methanol ë b­íc sãng 255 nm. NhiÖt ®é nãng ch¶y kho¶ng 950C. 1.1.2 T¸c dông d­îc lý vµ d­îc ®éng häc [5] [6]. Ketoprofen lµ thuèc chèng viªm phi steroid, thuéc dÉn chÊt cña acid aryl propionic, cã t¸c dông gi¶m ®au, h¹ sèt, chèng viªm. Ketoprofen øc chÕ qu¸ tr×nh tæng hîp prostaglandin vµ øc chÕ sù kÕt tËp tiÓu cÇu. Ketoprofen ®­îc hÊp thu rÊt nhanh vµo m¸u , ®¹t nång ®é tèi ®a sau 45 - 60 phót nÕu ®Æt hËu m«n vµ 60- 90 phót sau khi uèng. Liªn kÕt víi protein huyÕt t­¬ng 99%, thêi gian b¸n th¶i lµ 1,5-2,5 giê. Sau khi uèng 4 giê nång ®é ketoprofen trong bao ho¹t dÞch cao h¬n trong m¸u. Thuèc qua ®­îc hµng rµo nhau thai. Mét phÇn nhá chuyÓn ho¸ b»ng c¸ch hydroxyl ho¸, cßn phÇn lín liªn hîp víi acid glucuronic. Th¶i trõ chñ yÕu qua n­íc tiÓu (75- 90%), mét Ýt qua ph©n( 1-8% ). ë n­íc tiÓu ( 65-75%) lµ d¹ng glucuronyl, 1% lµ d¹ng ch­a biÕn ®æi. Sau khi uèng 6 giê ketoprofen sÏ bÞ th¶i trõ 50% qua thËn. 1.1.3 ChØ ®Þnh [5] [6]: Ketoprofen ®­îc chØ ®Þnh ®iÒu trÞ dµi h¹n c¸c triÖu chøng trong: - Viªm thÊp khíp m·n tÝnh, ®Æc biÖt lµ viªm ®a khíp d¹ng thÊp, viªm cøng khíp cét sèng. - BÖnh cøng khíp g©y ®au vµ tµn phÕ. §iÒu trÞ ng¾n h¹n c¸c triÖu chøng trong c¸c c¬n cÊp tÝnh cña c¸c bÖnh: - BÖnh thÊp khíp ngoµi khíp (®au vai cÊp tÝnh, viªm g©n ... ). - Viªm khíp vi tinh thÓ. - Tho¸i ho¸ khíp. - D¹ng viªn nang cßn dïng ®Ó gi¶m ®au: ®au l­ng, ®au rÔ thÇn kinh... 1.1.4 Chèng chØ ®Þnh [6]: - DÞ øng víi ketoprofen, aspirin, vµ c¸c thuèc chèng viªm phi steroid cïng lo¹i. - LoÐt d¹ dµy-t¸ trµng tiÕn triÓn. - Suy thËn nÆng, suy gan tÕ bµo nÆng. - Phô n÷ cã thai( 3 th¸ng cuèi) vµ cho con bó. 1.1.5 T¸c dông kh«ng mong muèn [6] - T¸c dông phô ë ®­êng tiªu ho¸: khã chÞu vïng d¹ dµy-ruét, ®au d¹ dµy, buån n«n, n«n möa, t¸o bãn, tiªu ch¶y, nÆng th× loÐt d¹ dµy, xuÊt huyÕt tiªu ho¸, thñng ruét. - Nhøc ®Çu, chãng mÆt, buån ngñ. - Ph¶n øng qu¸ mÉn ë da( næi ban, mÒ ®ay, ngøa) vµ ®­êng h« hÊp (suyÔn, nhÊt lµ nh÷ng ng­êi dÞ øng víi aspirin vµ c¸c kh¸ng viªm kh«ng steroid kh¸c). - Gi¶m nhÑ hång cÇu ë ng­êi bÞ thiÕu m¸u, mét vµi tr­êng hîp gi¶m b¹ch cÇu nhÑ ®· ®­îc ghi nhËn. 1.1.6 LiÒu dïng: LiÒu khëi ®Çu: 300 mg chia lµm 3 lÇn, uèng khi no. LiÒu duy tr×: 150-200mg hoÆc n¹p ngµy 1-2 viªn thuèc ®¹n. Tiªm b¾p ngµy100-200mg chia 2 lÇn. Kh«ng nªn phèi hîp Ketoprofen víi thuèc chèng ®«ng m¸u ®­êng uèng vµ c¸c kh¸ng viªm kh«ng steroid kh¸c (kÓ c¶ salicylat liÒu cao) do lµm t¨ng nguy c¬ loÐt vµ xuÊt huyÕt tiªu ho¸. 1.1.7 D¹ng bµo chÕ [5] [6]. - Viªn nang 25mg, 50mg, 75mg. - Viªn nÐn 100mg, 150mg. - ViÕn bao tan ë ruét 50mg. - Viªn bao t¸c dông kÐo dµi 200mg, viªn nang t¸c dông kÐo dµi 100mg, 150mg, 200mg. - Thuèc tiªm 100mg. - Thuèc mì 2,5%. BiÖt d­îc: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketum, Ketopron…. 1.1.8 C¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng. A. Ph­¬ng ph¸p acid- baz¬: §Þnh l­îng ketoprofen nguyªn liÖu, x¸c ®Þnh ®iÓm t­¬ng ®­¬ng b»ng chØ thÞ ®á phenol [18] hoÆc b»ng ph­¬ng ph¸p ®o ®iÖn thÕ [ 10] [18]. TiÕn hµnh: Hoµ tan kho¶ng 200mg Ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) vµo 25ml alcol. Thªm 25ml n­íc vµ vµi giät ®á phenol. ChuÈn ®é víi NaOH 0,1N. Song song lµm mét mÉu tr¾ng trong cïng ®iÒu kiÖn. 1ml NaOH 0,1N t­¬ng ®­¬ng víi 25,43mg C16H14O3. - HoÆc: Hoµ tan kho¶ng 200mg Ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) vµo 25ml alcol. Thªm 25ml n­íc ChuÈn ®é víi NaOH 0,1N, x¸c ®Þnh ®iÓm t­¬ng ®­¬ng b»ng b­íc nh¶y ®iÖn thÕ. 1ml NaOH 0,1N t­¬ng ®­¬ng víi 25,43mg C16H14O3. B. Ph­¬ng ph¸p quang phæ [7] [8][10]: Dïng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong chÕ phÈm. Hoµ mét l­îng chÕ phÈm cã chøa kho¶ng 50 mg ketoprofen (c©n chÝnh x¸c) trong 300 ml methanol 75 %, l¾c trong 10 phót, thªm methanol 75 % võa ®ñ 500 ml. Läc. LÊy 5 ml dÞch läc pha lo·ng thµnh 100 ml víi methanol 75 % vµ ®em ®o ®é hÊp thô cña dung dich nµy ë b­íc sãng 258nm; cuvet th¹ch anh cã chiÒu dµy 1 cm víi mÉu tr¾ng lµ methanol 75%. TÝnh kÕt qu¶ dùa vµo A (1%, 1cm) ë b­íc sãng 258 nm lµ 662. C. Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ). Dïng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng vµ x¸c ®Þnh t¹p chÊt trong nguyªn liÖu. stt tµi liÖu pha ®éng cét mÉu thö 1 [10] [18] §Öm phosphat pH 3,5 - ACN - H2O (2:43:55) C18 5mm 150*4,6 mm Nguyªn liÖu 2 [10] NH4CH3COO 1% - MeOH - ACN (55:30:15) C18 5mm 200*4,6 mm Nguyªn liÖu 3 [13] §Öm phosphat pH 3,2 - ACN (60:40) C18 2mm 250*4,6 mm HuyÕt t­¬ng 4 [12] NH4CH3COO 20 mM - MeOH; ®iÒu chØnh pH 7,0. C18 4 mm HuyÕt t­¬ng 5 [11] ACN : AcOH 1% ( 38 : 62 ). C18 10mm 3,9*300 mm HuyÕt t­¬ng 6 [16] §Öm Phosphat 0,05M pH 7 : ACN (90 : 10 ). C18 5 mm 4,6*250mm HuyÕt t­¬ng D. Ph­¬ng ph¸p ®iÖn di mao qu¶n: §Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng [14] vµ t¸ch ®ång ph©n cña ketoprofen [17]. 1.2 Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( HPLC ). S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ( High Performance Liquid Chromatography ) cßn gäi lµ s¾c ký láng cao ¸p hay s¾c ký láng hiÖn ®¹i ra ®êi vµo nh÷ng n¨m cuèi 1960. Nã ®­îc x©y dùng vµ ph¸t triÓn kh«ng ngõng vµ ngµy cµng thÓ hiÖn râ tÝnh ­u viÖt, ®Æc biÖt lµ trong lÜnh vùc nghiªn cøu sinh d­îc häc cña thuèc. Ph©n lo¹i c¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký [ 2]: S¾c ký ph©n bè : + s¾c ký láng- láng. +s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt. S¾c ký hÊp phô hiÖu n¨ng cao. S¾c ký trao ®æi ion hiÖu n¨ng cao. S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao trªn gel ( s¾c ký theo lo¹i cì ). Trong ph©n tÝch sinh d­îc häc vµ kiÓm nghiÖm, ng­êi ta hay sö dông ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt (Bonded Phase Chromatography ). §Æc ®iÓm ph­¬ng ph¸p [2]: Trong s¾c ký láng ph©n bè pha liªn kÕt, pha tÜnh ®­îc g¾n ho¸ häc (liªn kÕt ) víi chÊt mang ( Silicagel ) t¹o nªn hîp chÊt c¬ Siloxan Si CH3 CH3 CH3 Cl CH3 OH Si R Si Si O CH3 CH3 R + H3C H3C Nhãm Silanol DÉn chÊt DÉn chÊt Siloxan cña Silicagel clorosilan - NÕu R lµ mét nhãm Ýt ph©n cùc nh­ octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl vµ dung m«i ph©n cùc nh­ methanol, acetonitril th× cã s¾c ký pha ®¶o (s¾c ký pha ng­îc ). - NÕu R lµ nhãm kh¸ ph©n cùc nh­: alkylamin - ( - CH2- )n-NH2 hay alkyl nitril -( - CH2- )n- CN vµ dung m«i Ýt ph©n cùc nh­ hexan th× ta cã s¾c ký pha thuËn. - C¸ch chän pha: th­êng chän pha tÜnh cã tÝnh chÊt ph©n cùc gièng c¸c chÊt cÇn t¸ch vµ kh¸c víi pha ®éng. Nguyªn t¾c cña ph­¬ng ph¸p [2] [3]: C¸c chÊt trong hçn hîp ®­îc t¸ch dùa trªn kh¶ n¨ng ph©n bè kh¸c nhau cña chóng vµo hai pha kh«ng hoµ lÉn vµo nhau, lu«n tiÕp xóc nhau: mét pha tÜnh vµ mét pha ®éng. Dung dÞch mÉu thö ®­îc ®­a vµo hÖ thèng s¾c ký qua van tiªm mÉu vµ ®­îc dung m«i pha ®éng kÐo tíi cét ph©n tÝch nhê mét b¬m cao ¸p. T¹i cét x¶y ra qu¸ tr×nh t¸ch, nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc thÊp víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra tr­íc, cßn nh÷ng ph©n tö nµo cã ¸i lùc m¹nh víi pha tÜnh th× ®­îc röa gi¶i ra sau. ChÊt ra khái cét ®­îc ph¸t hiÖn b»ng detector g¾n víi m¸y ghi, m¸y tÝnh hay m¸y tÝch ph©n. Thêi gian l­u tR lµ ®Æc tr­ng ®Þnh tÝnh cña chÊt, chiÒu cao hay diÖn tÝch pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh l­îng cña chÊt. S¾c ký ®­îc tiÕn hµnh so víi chuÈn. Mét sè th«ng sè ®Æc tr­ng cña HPLC [2]: VÝ dô: Ta cã 1 s¾c ®å sau: - Thêi gian l­u tR ( phót ) lµ thêi gian tÝnh tõ lóc tiªm mÉu vµo hÖ thèng s¾c ký ®Õn lóc xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic. So s¸nh thêi gian l­u cña mÉu thö vµ mÉu chuÈn lµm trong cïng ®iÒu kiÖn ta sÏ ®Þnh tÝnh ®­îc chÊt ®ã. - Thêi gian chÕt tM ( phót ) lµ thêi gian cña mét chÊt kh«ng bÞ l­u gi÷ tøc lµ b»ng tèc ®é di chuyÓn trung b×nh cña c¸c ph©n tö dung m«i. Thêi gian l­u hiÖu chÝnh tR, ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: tR = tR, + tM ( hay tR, = tR - tM ). - Thõa sè dung l­îng k’ dïng ®Ó m« t¶ tèc ®é di chuyÓn cña mét chÊt Qs t’R tR - tM VR -VM k’ = = = = QM tM tM VM - Thõa sè chän läc a : M« t¶ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt. kB k’B t’R,B a = = = kA k’A t’R,A Qui ­íc B lµ chÊt bÞ l­u gi÷ m¹nh h¬n A nªn a ³ 1. §Ó t¸ch riªng 2 chÊt th× a > 1, th­êng tõ 1,05 – 2,00. Sè ®Üa lý thuyÕt N: BiÓu thÞ hiÖu lùc cét s¾c ký. N = hoÆc N = Trong ®ã: WB chiÒu réng pic ë ®¸y pic. W1/2 chiÒu réng pic ®o ë nöa chiÒu cao cña ®Ønh. - §é ph©n gi¶i RS lµ ®¹i l­îng ®o møc ®é t¸ch hai chÊt trªn mét cét s¾c ký. tR,B – tR,A Rs = 1/2( WB + WA ) §Ó t¸ch riªng hai chÊt, Rs ³ 1,5 ( khi 2 s¾c ®å cã ®é lín cïng cì ). - ChiÒu cao pic hay diÖn tÝch pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh l­îng cña chÊt. Khi so s¸nh chiÒu cao pic hay diÖn tÝch pic cña mÉu thö vµ chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn lµm ta tÝnh ®­îc hµm l­îng ho¹t chÊt trong mÉu thö. Pha tÜnh vµ pha ®éng trong HPLC [3]. *Pha tÜnh trong HPLC chÝnh lµ chÊt nhåi cét ®Ó lµm nhiÖm vô t¸ch mét hçn hîp chÊt ph©n tÝch. Nã lµ nh÷ng chÊt r¾n, xèp vµ kÝch th­íc h¹t rÊt nhá, ®­êng kÝnh cì h¹t tõ 3-10mm, diÖn tÝch bÒ mÆt riªng th­êng tõ 50-500 m2/g.C¨n cø theo b¶n chÊt chÝnh cña qu¸ tr×nh s¾c ký trªn cét t¸ch, ng­êi ta chia nã thµnh nhiÒu lo¹i nh­ hÊp phô, ph©n bè, trao ®æi ion vµ r©y ph©n tö. T­¬ng øng víi lo¹i chÊt nhåi nh­ thÕ ng­êi ta cã mét lo¹i s¾c ký riªng trong kü thuËt HPLC. Trong ®Ò tµi nµy, chóng t«i sö dông ph­¬ng ph¸p s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt. B¶n chÊt chÝnh cña sù t¸ch trong lo¹i s¾c ký nµy lµ dùa trªn kh¶ n¨ng t¸ch cña c¸c chÊt trong hai pha kh«ng hoµ lÉn vµo nhau. C¸c yªu cÇu chung cña pha tÜnh trong kü thuËt HPLC: + Ph¶i tr¬ vµ bÒn v÷ng víi c¸c ®iÒu kiÖn cña m«i tr­êng s¾c ký, kh«ng cã c¸c ph¶n øng ho¸ häc phô víi dung m«i röa gi¶i hay víi chÊt ph©n tÝch. + Cã kh¶ n¨ng t¸ch chän läc mét hçn hîp chÊt tan nhÊt ®Þnh trong ®iÒu kiÖn s¾c ký. + TÝnh chÊt bÒ mÆt ph¶i æn ®Þnh. + C©n b»ng ®éng häc cña sù t¸ch ph¶i x¶y ra nhanh vµ lÆp l¹i tèt. + Cì h¹t ph¶i t­¬ng ®èi dång nhÊt. Pha tÜnh th­êng ®­îc chÕ t¹o trªn c¸c chÊt nÒn sau: + Pha tÜnh trªn nÒn Silicagel ( SiO2 ) + Pha tÜnh trªn nÒn Oxid nh«m ( Al2O3 ) + Pha tÜnh trªn nÒn cao ph©n tö h÷u c¬ ( polystyren, cellulo...) + Pha tÜnh trªn nÒn m¹ch carbon. Trong 4 lo¹i nµy th× nÒn Silicagel ®­îc sö dông nhiÒu nhÊt vµ pha tÜnh ®­îc chÕ t¹o trªn nÒn nµy còng cã nhiÒu ­u viÖt h¬n, nh­ kh¶ n¨ng chÞu ¸p cao, ®é tr­¬ng në nhá khi thay ®æi dung m«i röa gi¶i, bÒn víi nhiÖt. *Pha ®éng lµ dung m«i dïng ®Ó röa gi¶i c¸c chÊt tan ( chÊt ph©n tÝch ) ra khái cét t¸ch ®Ó thùc hiÖn mét qu¸ trÝnh s¾c ký. Pha ®éng trong HPLC cã thÓ chØ lµ mét dung m«i h÷u c¬ nh­ Metanol, Acetonitril, n-Hexan, hay còng cã thÓ lµ hçn hîp cña hai hay nhiÒu dung m«i trén víi nhau theo nh÷ng tû lÖ phï hîp. Nã còng cã thÓ lµ dung dÞch n­íc cña c¸c muèi cã chøa chÊt ®Öm, chÊt t¹o phøc, chÊt lµm chËm. Nãi chung mçi lo¹i s¾c ký sÏ cã c¸c hÖ dung m«i röa gi¶i riªng cho nã, ®Ó cã ®­îc hiÖu qu¶ tèt. Pha ®éng lµ mét trong nh÷ng yÕu tè quyÕt ®Þnh thêi gian l­u gi÷ cña chÊt mÉu vµ hiÖu qu¶ sù t¸ch s¾c ký, ¶nh h­ëng tíi sù ph©n gi¶i cña chÊt trong pha tÜnh. Pha ®éng trong kü thuËt HPLC cÇn ph¶i tho¶ m·n mét sè ®iÒu kiÖn sau: + Ph¶i tr¬ ®èi víi pha tÜnh. + Ph¶i hoµ tan ®­îc chÊt mÉu + Ph¶i bÒn v÷ng theo thêi gian +Ph¶i cã ®é tinh khiÕt cao + Ph¶i nhanh ®¹t c¸c c©n b»ng trong qu¸ tr×nh s¾c ký + Ph¶i phï hîp víi lo¹i detector dïng ®Ó ph¸t hiÖn c¸c chÊt ph©n tÝch. Trong s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt, pha ®éng lµ hÖ dung m«i ph©n cùc, nã lµ nh÷ng dung m«i trén lÉn ®­îcvíi n­íc vµ trong nhiÒu tr­êng hîp th× n­íc l¹i lµ mét thµnh phÇn chÝnh cña pha ®éng. Tiªu biÓu vµ ®­îc dïng kh¸ phæ biÕn trong lo¹i s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt lµ c¸c dung m«i methanol, tetrahydrofuran, acetonitril, hay hçn hîp cña methanol, acetonitril víi n­íc, víi ®Öm. S¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt ®­îc sö dông rÊt phæ biÕn ®Ó t¸ch nhiÒu lo¹i hçn hîp mÉu tõ v« c¬ ®Õn h÷u c¬, chÊt kh«ng ph©n cùc ®Õn ph©n cùc. Trong hÖ pha nµy th× thµnh phÇn cña pha ®éng còng ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶ t¸ch s¾c ký. C¸ch tÝnh kÕt qu¶ trong ph­¬ng ph¸p HPLC. - Ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn - Ph­¬ng ph¸p thªm - Ph­¬ng ph¸p so s¸nh §èi víi viÖc x¸c ®Þnh nång ®é ho¹t chÊt trong dÞch sinh häc, tÝnh to¸n kÕt qu¶ dùa vµo ®­êng chuÈn ®­îc x©y dùng b»ng c¸ch chñ ®éng cho chÊt chuÈn víi nång ®é kh¸c nhau vµo dÞch sinh vËt. Xö lý mÉu vµ ®em ch¹y s¾c ký. PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.1 Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu. 2.1.1 Nguyªn vËt liÖu vµ ho¸ chÊt *Nguyªn vËt liÖu: - Ketoprofen 99,3% (§¹t theo BP 2001). - Ibuprofen 99,0 % (§¹t theo USP 24). - Naproxen 99,6% (§¹t theo USP 24). *Ho¸ chÊt: - Acetonitril ( HPLC grade-Merck ). - Methanol ( HPLC grade- Merck ). - Acid acetic b¨ng ( HPLC grade - Merck ). - Triethylamin ( PA grade - Merck ). *Dông cô: - HÖ thèng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao. + B¬m cao ¸p Merck- Hitachi L-6000. + Detector Merck-Hitachi L-4000 UV. + M¸y tÝch ph©n Merck - Hitachi D-2500 chromato-integrator. + Van tiªm mÉu Rheohyne 1725 - USA. - M¸y quang phæ Beckman DU-640 spectrophotometer (Mü). - M¸y läc n­íc siªu s¹ch Elga (Anh). - C©n ph©n tÝch Satorius (§øc). - Ly t©m ®iÖn Jouan (Ph¸p). - M¸y siªu ©m Branson (Mü). - M¸y l¾c Labinco. - Autopipet 10-100mcl, 100 - 1000mcl. - Dông cô thuû tinh, b¬m tiªm, èng nghiÖm, b×nh ®Þnh møc. 2.1.2 Ph­¬ng ph¸p thùc nghiÖm a.Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn s¾c ký Kh¶o s¸t chän dung m«i chiÕt Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng Kh¶ n¨ng chiÕt ho¹t chÊt ®­îc biÓu thÞ b»ng hiÖu suÊt chiÕt vµ kh¶ n¨ng lo¹i t¹p c¶n trë sù ph¸t hiÖn ketoprofen trong mÉu ph©n tÝch. L¾c 1 phót C¾n Dung m«i h÷u c¬ MÉu thö ®­îc xö lý víi c¸c dung m«i kh¸c nhau theo s¬ ®å sau: HuyÕt t­¬ng L¾c 5 phót Ly t©m 15phót(3000 vßng/phót) KhÝ Pha ®éng DÞch chiÕt Läc Ly t©m 15 phót(3000 vßng /phót) DÞch läc H×nh 1: S¬ ®å xö lý mÉu huyÕt t­¬ng ( chiÕt ®¬n ) §Ó t¨ng hiÖu suÊt chiÕt, nh»m môc ®Ých chiÕt kiÖt hÕt ho¹t chÊt trong huyÕt t­¬ng, ta tiÕn hµnh chiÕt lÆp (chiÕt 3 lÇn). TiÕn hµnh nh­ s¬ ®å 1 thùc hiÖn thªm hai lÇn tõ lóc thªm dung m«i h÷u c¬ ®Õn khi thu ®­îc c¾n. TÊt c¶ c¸c dÞch chiÕt cña 3 lÇn ®­îc tËp trung vµo mét èng nghiÖm, ®uæi dung m«i thu ®­îc c¾n nh­ s¬ ®å 1. T×m chÊt chuÈn néi. Dïng nh÷ng chÊt cã c«ng thøc ho¸ häc gÇn gièng víi ketoprofen cho vµo huyÕt t­¬ng ®· chøa ketoprofen, xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1. Ch¹y s¾c ký ®Ó x¸c ®Þnh thêi gian l­u cña chÊt chuÈn néi vµ ketoprofen, tÝnh thõa sè chän läc a ( tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt ) xem møc ®é t¸ch cña hai chÊt. ChÊt chuÈn néi ph¶i t¸ch h¼n víi ketoprofen , hiÖu suÊt chiÕt æn ®Þnh, bÒn v÷ng, ph¸t hiÖn dÔ dµng ë ®iÒu kiÖn s¾c ký trªn. Kh¶o s¸t chän hÖ dung m«i ( pha ®éng ) ch¹y s¾c ký. Trong s¾c ký ph©n bè pha liªn kÕt, pha ®éng lµ mét hÖ dung m«i ph©n cùc, hay dïng lµ c¸c dung m«i methanol, acetonitril, hay hçn hîp cña methanol, acetonitril víi n­íc, víi ®Öm. ChuÈn bÞ c¸c hÖ dung m«i kh¶o s¸t, tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi tõng hÖ dung m«i mÉu huyÕt t­¬ng cã chøa ketoprofen vµ chuÈn néi ®­îc xö lý nh­ s¬ ®å h×nh 1.TÝnh RS cña tõng hÖ dung m«i tõ ®ã chän ®­îc hÖ ®Ó ph©n tÝch ketoprfen trong huyÕt t­¬ng. b.X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng X©y dùng ®­êng chuÈn trong pha ®éng: Pha 1 d·y dung dÞch hçn hîp ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi trong pha ®éng víi nång ®é ketoprofen lÇn l­ît lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml vµ nång ®é chÊt chuÈn néi lµ 25mg/ml. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, x¸c ®Þnh thêi gian l­u vµ diÖn tÝch pic cña ketoprofen vµ chuÈn néi, tõ ®ã tÝnh ®­îc tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi . X©y dùng mèi t­¬ng quan gi÷a nång ®é ketoprofen vµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi. X©y dùng ®­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng. Chñ ®éng cho ketoprofen vµo huyÕt t­¬ng ®Ó ®­îc mét d·y c¸c nång ®é 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml. TiÕp ®ã cho vµo c¸c èng nghiÖm cïng mét nång ®é chÊt chuÈn néi. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1.Ch¹y s¾c ký, tõ ®ã t×m ra mèi t­¬ng quan gi÷a nång ®é ketoprrofen vµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi. X¸c ®Þnh tÝnh chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p (trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ph©n tÝch). Lµm nhiÒu lÇn ë cïng mét nång ®é ®Ó x¸c ®Þnh sai sè cña ph­¬ng ph¸p ( biÓu thÞ b»ng RSD ). Lµm ë hai nång ®é : 0,5mcg/ml; 4mcg/ml. X¸c ®Þnh tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p: B»ng ph­¬ng ph¸p thªm Thªm chÝnh x¸c mét l­îng mÉu chuÈn vµo mÉu thö ®· biÕt nång ®é ketoprofen, xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký. TÝnh % ketoprofen chuÈn t×m l¹i ®­îc. øng dông Dïng ph­¬ng ph¸p ®· x©y dùng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen mÉu huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng viªn nang ketoprofen 50 mg; 1,50 giê vµ theo dâi ®é bÒn v÷ng cña ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b¶o qu¶n ë - 300C, sau 1; 2; 3 th¸ng. 2.2 KÕt qu¶ thùc nghiÖm vµ nhËn xÐt 2.2.1 Kh¶o s¸t t×m dung m«i chiÕt xuÊt Dung m«i h÷u c¬ dïng ®Ó chiÕt xuÊt ph¶i cã kh¶ n¨ng hoµ tan tèt ketoprofen vµ chÊt chuÈn néi, ®ång thêi ph¶i lo¹i ®­îc t¹p chÊt vµ lµm ®«ng vãn protein huyÕt t­¬ng. Kh¶o s¸t kh¶ n¨ng chiÕt cña mét sè dung m«i ta thu ®­îc kÕt qu¶ sau: B¶ng 1: HiÖu suÊt chiÕt ketoprofen tõ huyÕt t­¬ng. Dung m«i HiÖu suÊt chiÕt (%) Cloroform Ether Acetonitril Ethylacetat Dichloromethan 51.5 53.8 91.2 78.3 36,6 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy acetonitril cã hiÖu suÊt chiÕt ketoprofen cao nhÊt. Dïng Acetonitril chiÕt ketoprofen ë nång ®é 4mcg/ml. ChiÕt 1 lÇn vµ chiÕt 3 lÇn ta thu ®­îc kÕt qu¶ sau: B¶ng 2 : HiÖu suÊt chiÕt Ketoprofen b»ng ACN. LÇn ChiÕt ®¬n ( % ) ChiÕt lÆp ( % ) 1 83,32 96,45 2 84,56 99,91 3 80,44 96,72 4 82,32 95,1 5 81,5 97,12 Trung b×nh 82,43 97,06 RSD 1,934 1,818 Thêi gian chiÕt 60 phót 160 phót §èi víi mÉu chiÕt lÆp, sau khi lÊy riªng dÞch chiÕt lÇn ®Çu, chiÕt lÇn hai, chiÕt lÇn ba, chiÕt lÇn bèn ®uæi dung m«i, hoµ tan trong pha ®éng vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký th× kh«ng ph¸t hiÖn ®­îc ketoprofen trong dÞch chiÕt lÇn bèn. Nh­ vËy chiÕt ba lÇn lµ phï hîp. NhËn xÐt: ChiÕt lÆp ketoprofen b»ng ACN hiÖu xuÊt chiÕt cao, gÇn nh­ chiÕt ®­îc hÕt (97,06%) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng, nh­ng thêi gian xö lý mÉu qu¸ dµi. Cßn chiÕt ®¬n (chiÕt d­íi hîp thøc) ketoprofen trong huyÕt t­¬ng hiÖu xuÊt chiÕt tuy thÊp h¬n ( 82,43% ), nh­ng sai lÖch gi÷a c¸c lÇn lµm kh«ng cao ( RSD = 1,934 ), so víi chiÕt nhiÒu lÇn ( RSD = 1,818 ), vµ thêi gian xö lý mÉu kh«ng qu¸ dµi. Do ®ã, cã thÓ dïng ACN chiÕt mét lÇn ®Ó chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng mµ vÉn thu ®­îc kÕt qu¶ tèt. 2.2.2 Kh¶o s¸t vµ lùa chän ®iÒu kiÖn s¾c ký: Dïng s¾c ký ph©n bè pha ®¶o Cét s¾c ký: TiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn c¸c cét s¾c ký kh¸c nhau: cét C8, cét C18, cét phenyl. Qua c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc thÊy cét C18 phï hîp. Kh¶o s¸t t×m chÊt chuÈn néi : Dïng nh÷ng chÊt cã c«ng thøc ho¸ häc gÇn gièng víi ketoprofen, kh¶o s¸t ®Ó t×m ra chÊt chuÈn néi. ChÊt chuÈn néi ph¶i ®¶m b¶o t¸ch khái ketoprofen vµ æn ®Þnh trong ®iÒu kiÖn s¾c ký. Pha c¸c dung dÞch ketoprofen vµ acid-2-(4-isobutylphenyl) propionic, ketoprofen vµ acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) trong pha ®éng vµ trong huyÕt t­¬ng. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, x¸c ®Þnh thêi gian l­u tR cña c¸c chÊt, tÝnh thõa sè chän läc a cña c¸c chÊt ®èi víi ketoprofen, tõ ®ã x¸c ®Þnh chÊt néi chuÈn ( chÊt cã a lín nhÊt nh­ng thêi gian lµm mÉu kh«ng qu¸ dµi). KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: ChÊt tR a CH CH3 COOH C O Ketoprofen Acid - 2 ( - benzoyl phenyl ) propionic 6,77 CH3 CH COOH H3CO Acid -2-[( 6- methoxy) naphtyl] propionic (IS1) 6,90 1,019 CH3 CH COOH CH2 CH CH3 CH3 Acid - 2- ( 4 -isobutylphenyl ) propionic (IS2) 9,95 1,47 Trong ®ã a lµ tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña hai chÊt ®­îc ®Æc tr­ng bëi ®¹i l­îng thõa sè chän läc hay hÖ sè chän läc. a cµng lín th× hai chÊt cµng t¸ch ra khái nhau, th­êng dïng a trong kho¶ng 1,05- 2,0. ë ®©y aIS2/ket > aIS1/ket nªn kh¶ n¨ng t¸ch cña IS2 vµ ketoprofen sÏ tèt h¬n kh¶ n¨ng t¸ch cña IS1 vµ Ketoprofen. Tèc ®é di chuyÓn tû ®èi cña IS2 vµ ketoprofen a = 1,47 vµ tR,IS2 = 9,96 nªn thêi gian lµm mÉu còng kh«ng qu¸ l©u. V× vËy, cã thÓ dïng acid -2-(4 - isobutylphenyl) propionic lµm néi chuÈn trong ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . Pha ®éng: TiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn c¸c hÖ pha ®éng kh¸c nhau, x¸c ®Þnh ®é ph©n gi¶i vµ kh¶ n¨ng t¸ch cña ketoprofen víi c¸c t¹p chÊt trong huyÕt t­¬ng vµ kh¶ n¨ng t¸ch cña ketoprofen víi chÊt chuÈn néi. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh s¾c ký, dïng cét C18 víi c¸c hÖ pha ®éng sau: ACN: dung dÞch ®Öm phosphat 0,05M pH = 7 (90 : 10). NH4CH3COO 1%: MeOH: ACN (®iÒu chØnh vÒ pH= 6,5 b»ng CH3COOH b¨ng) ( 55 : 30 : 15 ) MeOH: AcOH: H2O ( 50 : 1 : 49 ). ACN: AcOH : H2O ( 60 : 1 : 39 ). NhËn xÐt : C¸c hÖ 1, 2, 3 cho kÕt qu¶ t¸ch kh«ng tèt, ketoprofen ch­a t¸ch ®­îc khái t¹p chÊt còng nh­ chÊt chuÈn néi. Riªng hÖ 4 ®· cho kÕt qu¶ t¸ch tèt nh­ng c¸c pic cßn bÞ tï vµ ch©n pic t¸ch kh«ng gän. Khi ta cho thªm Triethylamin vµo th× c¸c pic s¾c nÐt h¬n vµ ch©n pic gän h¬n. Kh¶o s¸t hÖ dung m«i gåm 4 thµnh phÇn ( ACN, AcOH, Tri, H2O ) víi c¸c tû lÖ ACN lµ 60, 50, 40, ta thu ®­îc c¸c s¾c ®å sau: H×nh 2: HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 40 : 1 : 0,3 : 58,7 ). H×nh 3 : HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 1 : 0,3 : 48,7 ). H×nh 4 : HÖ ACN : AcOH : Tri : H2O ( 60 : 1 : 0,3 : 38,7 ). H×nh 2 H×nh 3 H×nh 4 B¶ng 3: KÕt qu¶ RS cña c¸c hÖ dung m«i ®· ch¹y STT ACN AcOH Tri L­u l­îng dßng (ml/phót) RS , 1 RS ,2 RS ,3 Thêi gian (phót) 1 60 1 0,3 0,85 0,97 0,99 0,97 11 2 60 1 0,3 1,2 1,05 1,44 1,22 10,62 3 60 1 0,3 0,5 1,23 1,41 0,98 12,5 4 50 1 0,3 0,5 1,05 1,28 0,99 20,28 5 50 1 0,3 0,85 1,63 1,61 1,09 17,94 6 50 1 0,3 0,85 1,39 2,99 1,35 16,52 7 40 1 0,3 1,2 2,04 6,39 6,39 25,5 8 40 1 0,3 0,5 7,35 17,28 17,28 50,71 9 40 1 0,3 0,85 2,2 8,08 6,96 30,28 NhËn xÐt: §é ph©n gi¶i RS cña c¸c hÖ t¨ng dÇn khi tû lÖ ACN gi¶m dÇn. Nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký còng t¨ng lªn rÊt nhiÒu. HÖ 7, 8, 9 ( tû lÖ ACN lµ 40 ) cã ®é ph©n gi¶i RS cao nhÊt nh­ng thêi gian ch¹y s¾c ký qu¸ l©u. HÖ 6 cã ®é ph©n gi¶i RS,1 =1,39; RS,2 =2,99; RS,3 =1,35 ; c¸c pic t¸ch nhau gÇn nh­ hoµn toµn vµ thêi gian ch¹y s¾c ký kh«ng qu¸ l©u. Do ®ã trong ®Ò tµi nµy chóng t«i chän hÖ dung m«i pha ®éng sè 6. ACN : AcOH : Tri : H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 49,2 ). *B­íc sãng: §Ó t¨ng ®é nh¹y khi ph¸t hiÖn ketoprofen trong huyÕt t­¬ng chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh cùc ®¹i hÊp thô cña ketoprofen trong ®iÒu kiÖn gièng nh­ ph©n tÝch mÉu thùc. Pha dung dÞch ketoprofen chuÈn trong dung m«i pha ®éng. QuÐt phæ UV. Ketoprofen cã cùc ®¹i hÊp thô ë b­íc sãng 253 nm. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn, ®iÒu kiÖn s¾c ký ®­îc chän lµ: - Pha tÜnh : Cét Nucleosil ODS 5mm (4,6*250 mm) - Pha ®éng: ACN: AcOH : Tri :H2O ( 50 : 0,5 : 0,3 : 48,7). - L­u l­îng dßng: 0,85ml/ phót. - B­íc sãng : 253 nm. - ThÓ tÝch mÉu tiªm : 50ml. 2.2.3. X©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. X©y dùng ®­êng chuÈn trong pha ®éng: Pha mét d·y c¸c dung dÞch hçn hîp ket vµ IS trong pha ®éng víi c¸c nång ®é cña ket lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml ; 0,8mcg/ml ; 2mcg/ml ; 5mcg/ml vµ nång ®é IS lµ 25mcg/ml. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic tõ ®ã tÝnh tû sè diÖn tÝch pic cña ket vµ IS . B¶ng 4: KÕt qu¶ x©y dùng ®­êng chuÈn ®Þnh l­îng Ketoprofen trong pha ®éng Nång ®é ( mcg/ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 4245 17779 900375 242424 613525 AIS 118674 110665 127804 119413 114211 RKet/IS 0,036 0,161 0,704 2,030 5,372 §å thÞ 1 : §­êng chuÈn Ketoprofen trong pha ®éng. Ph­¬ng tr×nh håi qui y = 1,085 x - 0,087 Trong ®ã: y lµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a Ket vµ IS x lµ nång ®é Ketoprofen (mcg/ml ). HÖ sè t­¬ng quan håi qui : r = 0,9998. X©y dùng ®­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng . ChuÈn bÞ mét thang chuÈn trong huyÕt t­¬ng víi c¸c nång ®é ket lµ 0,05mcg/ml; 0,2mcg/ml; 0,8mcg/ml; 2mcg/ml; 5mcg/ml, nång ®é IS 25mcg/ml. TiÕn hµnh xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic, tõ ®ã tÝnh RKet/IS. B¶ng 5 : KÕt qu¶ x©y dùng ®­êng chuÈn Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Nång ®é ( mcg /ml ) 0,05 0,2 0,8 2 5 AKet 3882 14047 86292 232658 607150 AIS 105190 105131 105812 104177 106458 RKet/IS 0,037 0,134 0,815 2,233 5,730 §å thÞ 2 : §­êng chuÈn ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng . Ph­¬ng tr×nh håi qui : y = 1,154x - 0,074 Trong ®ã : y lµ tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS x lµ nång ®é Ketoprofen ( mcg/ml ). HÖ sè t­¬ng quan håi qui : r= 0,9998 y + 0,074 Tõ ®ã suy ra: x = 1,154 Nh­ vËy, ®­êng chuÈn cña ket/ huyÕt t­¬ng cã ®é dèc lín h¬n (1,154) so víi ®­êng chuÈn cña nã trong pha ®éng (1,085), do ®ã ®­êng chuÈn cã xu h­íng ®i lªn. X¸c ®Þnh tÝnh chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p. LÊy c¸c mÉu huyÕt t­¬ng cã chøa ketoprofen víi c¸c nång ®é 0,5 mcg/ml; 4mcg /ml vµ chÊt chuÈn néi cã nång ®é 25 mcg /ml. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng diÖn tÝch pic, tõ ®ã tÝnh ®­îc tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS. C 0,5 mcg/ml 4mcg/ml AKet AIS RKet/IS AKet AIS RKet/IS 1 55794 119470 0,4659 484278 115522 4,192 2 61432 128838 0,4768 483315 116414 4,152 3 57239 118666 0,4723 475357 114211 4,162 4 57678 129152 0,4466 483012 115792 4,171 5 58622 125792 0,4660 482356 116534 4,139 6 64353 148740 0,4426 476235 115235 4,132 TB Ph­¬ng sai RSD 0,4617 TB Ph­¬ng sai RSD 4,158 0,0139 0,0219 3,016 0,528 Chóng t«i tiÕn hµnh x¸c ®Þnh ®é chÝnh x¸c nh­ trªn ë mét ngµy ph©n tÝch kh¸c. KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: 0,5 mcg/ml 4mcg/ml TB Ph­¬ng sai RSD 0,4922 TB Ph­¬ng sai RSD 4,037 0,0123 0,023 2,5 0,581 Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc (trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ph©n tÝch) ®Ó ®¸nh gi¸ ®é lÆp l¹i cña ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ë 2 nång ®é 0,5mcg/ml; 4mcg/ml víi n = 6, cho thÊy ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chÝnh x¸c cao. TÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p: - MÉu thö: huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng viªn nang ketoprofen 50 mg kho¶ng 90 phót, thªm IS 25mcg/ml. - MÉu chuÈn: Ketoprofen chuÈn 0,8mcg/ml trong huyÕt t­¬ng, thªm IS 25 mcg/ml. - MÉu chuÈn + thö: mÉu thö + ketoprofen chuÈn 0,8mcg/ml + IS 25mcg/ml. Xö lý c¸c mÉu trªn nh­ s¬ ®å h×nh 1. TiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. X¸c ®Þnh tû sè diÖn tÝch pic gi÷a ketoprofen vµ IS, ta cã c¸c s¾c ®å sau: H×nh 5: MÉu tr¾ng. H×nh 6: MÉu chuÈn trong pha ®éng. H×nh 7: MÉu chuÈn trong huyÕt t­¬ng. H×nh 8: MÉu thùc. H×nh 5 H×nh 6 H×nh 7 H×nh 8 KÕt qu¶ thu ®­îc biÓu thÞ b»ng tû sè diÖn tÝch pic gi÷a Ketoprofen vµ chÊt néi chuÈn. MÉu ChuÈn Thö Thö + ChuÈn 1 0,704 1,116 1,867 2 0,684 1,217 1,845 3 0,712 1,119 1,905 4 0,728 1,136 1,83 5 0,685 1,122 1,901 Trung b×nh 0,7032 1,142 1,8696 RSD 2,5506 3,372 1,778 B¶ng 7 : KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p. % T×m l¹i = NhËn xÐt: Nh­ vËy, l­îng ketoprofen chuÈn t×m l¹i lµ 103,5%, RSD = 1,778, n = 5 cho thÊy ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng nµy cã tÝnh ®óng ®¶m b¶o cho phÐp ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. KÕt luËn: Víi tÝnh ®óng ®¶m b¶o, tÝnh chÝnh x¸c tèt vµ sù tuyÕn tÝnh chÆt chÏ gi÷a tû sè diÖn tÝch pic ketoprofen / IS vµ nång ®é ketoprofen trong kho¶ng kh¶o s¸t, cho thÊy ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. * ¸p dông ¸p dông ®Þnh l­îng mÉu thùc: mét ng­êi t×nh nguyÖn khoÎ m¹nh, uèng1 viªn nang 50 mg, sau 90 phót lÊy m¸u ®em ly t©m ®Ó lÊy huyÕt t­¬ng. Xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1, tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký thu ®­îc s¾c ®å h×nh 9. ThÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p dïng Detector UV Diod arrays (Phßng vËt lý- ViÖn kiÓm nghiÖm - Bé Y TÕ) ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong mÉu thùc Chän 5 ®iÓm: ch©n phÝa tr­íc cña pic, 1/2 phÝa tr­íc cña pic, ®Ønh pic, 1/2 phÝa sau cña pic, ch©n phÝa sau cña pic cña Ketoprofen. QuÐt phæ hÊp thô. Song song lµm mÉu chuÈn Ketoprofen trong pha ®éng, chång phæ hÊp thô cña mÉu thùc vµ mÉu chuÈn ë c¸c ®iÓm t­¬ng øng nhau. ë c¸c ®iÓm ®Òu thu ®­îc hÖ sè Match ³ 995. H×nh 10: Chång phæ hÊp thô cña mÉu thùc vµ mÉu chuÈn ë ®Ønh pic. H×nh 9 H×nh 10 KÕt luËn: víi ®iÒu kiÖn xö lý mÉu ®· chän vµ ch­¬ng tr×nh s¾c ký ®· x©y dùng cho thÊy ph­¬ng ph¸p nµy hoµn toµn thÝch hîp ®Ó ®Þnh l­îng Ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. Theo dâi ®é æn ®Þnh cña ket trong mÉu thö theo thêi gian b¶o qu¶n. MÉu huyÕt t­¬ng ng­êi sau khi uèng thuèc 90 phót, ®­îc b¶o qu¶n ë -300C, sau thêi gian 1, 2, 3 th¸ng lÊy ra ®em xö lý mÉu nh­ s¬ ®å h×nh 1 vµ tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký víi c¸c ®iÒu kiÖn nh­ ë trang 21. TÝnh kÕt qu¶ theo ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn ®­îc x©y dùng trong tõng ngµy ph©n tÝch. KÕt qu¶ thu ®­îc nh­ sau: STT Thêi gian b¶o qu¶n (th¸ng) Nång ®é (mcg/ml) 1 0 4,90 2 1 4,89 3 2 4.92 4 3 4,94 KÕt luËn: Sau 3 th¸ng b¶o qu¶n mÉu thö cã chøa ketoprofen ë –300C, thÊy nång ®é cña ketoprofen trong huyÕt t­¬ng vÉn æn ®Þnh. PhÇn 3:kÕt luËn vµ ®Ò xuÊt Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i ®· thùc hiÖn ®­îc mét sè c«ng viÖc sau: 1. §· kh¶o s¸t 5 dung m«i chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng t×m ®­îc ACN cã kh¶ n¨ng chiÕt tèt nhÊt, cho hiÖu xuÊt chiÕt cao (91,2%). X©y dùng qui tr×nh xö lý mÉu thÝch hîp ®Ó chiÕt ketoprofen trong huyÕt t­¬ng, thêi gian chiÕt ng¾n (60phót), ®é lÆp l¹i tèt (RSD = 1,934). Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn s¾c ký: Cét, pha ®éng, b­íc sãng. - Cét: kh¶o s¸t 3 lo¹i pha tÜnh C8, C18 , phenyl, cho thÊy cét C18 lµ phï hîp nhÊt. - Pha ®éng: Kh¶o s¸t 4 hÖ dung m«i pha ®éng vµ chän ®­îc mét hÖ cho kÕt qu¶ kh¶ quan. Kh¶o s¸t 9 l­ît víi hÖ võa t×m ®­îc víi tû lÖ c¸c thµnh phÇn vµ l­u l­îng dßng kh¸c nhau ®Ó chän ®­îc ®iÒu kiÖn hîp lý ( t¸ch khái t¹p vµ chÊt chuÈn néi, thêi gian lµm mÉu kh«ng qu¸ l©u ) ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng. - B­íc sãng: QuÐt phæ hÊp phô x¸c ®Þnh ®­îc lmax = 253nm. Tõ ®ã chän ®­îc ®iÒu kiÖn s¾c ký lµ: Cét: Nucleosil C18. Pha ®éng: ACN: AcOH: Tri: H2O ( 50: 1: 0,3: 48,7 ). B­íc sãng: 253nm. L­u l­îng dßng: 0,85 ml/phót. 3. X©y dùng ®­îc ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b»ng HPLC víi IS lµ acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic. - §­êng chuÈn trong huyÕt t­¬ng d­îc x©y dùng tõ 0,05 - 5 mcg/ml víi IS lµ acid 2- ( 4- isobutylphenyl )propionic 25mcg/ml cho hÖ sè r = 0,998. - TÝnh chÝnh x¸c: x¸c ®Þnh ®é lÆp l¹i trong cïng mét ngµy vµ gi÷a c¸c ngµy ë 2 nång ®é 0,5 mcg/ml; 4mcg/ml cho kÕt qu¶ tèt RSD ~ 2,5 ( nång ®é 0,5 mcg/ml ), RSD ~ 0,5 ( nång ®é 4mcg/ml ), n =6. - TÝnh ®óng: Dïng ph­¬ng ph¸p thªm cho kh¶ n¨ng t×m l¹i ketoprofen cho vµo lµ 103,5%. 4. ¸p dông: Dïng ph­¬ng ph¸p ®· x©y dùng ®Ó ®Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng ng­êi t×nh nguyÖn sau khi uèng viªn nang 50 mg cho kÕt qu¶ ®Þnh l­îng ®¸ng tin cËy ( ®· ®­îc kiÓm tra b»ng HPLC g¾n víi detector Diod array ). - §· theo dâi ®é æn ®Þnh cña mÉu thö trong ®iÒu kiªn b¶o qu¶n ë - 300C trong 1, 2, 3 th¸ng. §Ò tµi nµy ®­îc thùc hiÖn trong mét thêi gian ng¾n, do ®ã ch­a ®Þnh l­îng ®­îc nhiÒu mÉu thö. Trong thêi gian tíi, nÕu kinh phÝ cho phÐp cã thÓ sö dông ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó nghiªn cøu ®¸nh gi¸ sinh kh¶ dông vµ t­¬ng ®­¬ng sinh häc cña ketoprofen trong c¸c d¹ng bµo chÕ. Tµi liÖu tham kh¶o Bé y tÕ ( 2002 ) - D­îc ®iÓn ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n y häc Hµ néi. Ph¹m Gia HuÖ, TrÇn Tö An ( 1998 ) - Ho¸ ph©n tÝch 2, chÕ b¶n vµ in t¹i trung t©m th«ng tin §¹i häc d­îc Hµ Néi. Ph¹m LuËn ( 1989 ) - GT c¬ së lý thuyÕt s¾c ký láng cao ¸p - HPLC, Tr­êng ®¹i häc Tæng hîp Hµ néi. Tµo Duy CÇn ( 1999 ) - Tra cøu vµ sö dông thuèc vµ biÖt d­îc n­íc ngoµi, quyÓn 1. Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kü thuËt Tõ ®iÓn b¸ch khoa d­îc häc ( 1999 ). Nhµ xuÊt b¶n tõ ®iÓn b¸ch khoa Hµ néi. Vidal. C«ng ty dÞch vô y tÕ tæng hîp Q4 TPHCM - TCCS. XNLD Phone - Doulenc Poren - TCCS. AHSF Drug Fuformation. BP 93,98. Chi Yin Wong, Da Peng Wang - Drug development and industrial; Pharmany, 20, 1994, page 1077 - 1078. The transdermal Penetration of a series of Nonsteroidal Ation flammatory Drugs - Journal of pharmaceutical Sciences, 1997, Sè 86, trang 503. John Mc Ewen, Masimo De Luca,Alessandro casini,...(1998 ) - the Effect of Foood and Antacid on the Bioavailability of Dexketoprrofen Trometamol - JournalClinical Pharmacology, page 42. J.R.Veraat et al. - At line Solid- phase extraction for capillary electrophoresis application to negatively charged Solutes (1998 ) - Journal of Chromatography B, No 719, page 199 -208. Martindal: The complete drug reference 32th Edi, 1999. N. Tarimci, D. Ermis (1997) - Sustained release characteristics and pharmacokinetic parameters of ketoprofen suppositories using chitosan, - International Journal of Pharmaceutics, No 147, page 72,73. S. Heitmeier, G. Blaschke (1999) - Direct assay of nonopiod analyesic and their metabolites in human urine by capillary ellectrophoresis and capillary electrophoresis - mass spectrometry- Journal of Chromatography B, No 721, page 124. USP 24.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docNghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen trong huyết tương.DOC