Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LÖA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. TS. Lê Đình Đôn không những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong trong nghiên cứu khoa học mà thầy còn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc sống. Những lời thầy nói, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi. Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phòng Bảo Vệ Thực Vật (Phòng 118, 105) khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài. Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phòng Hóa Lý và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. Toàn thể lớp CNSH 29 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007 Diệp Tuyết Châu ii TÓM TẮT LUẬN VĂN DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 08/2007. “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, tại Phòng bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM và Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Cây lúa là cây gắn liền với lịch sử hình thành và phát triển nước ta. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng hình thành và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Đặc biệt bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong hai năm gần đây trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long làm giảm năng suất đáng kể. Để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tôi tiến hành các nghiên cứu sau: Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. Các kết quả đạt được: Phân lập được 20 dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von. Khuếch đại thành công vùng tef của 14 dòng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2 bằng kỹ thuật PCR. Trong 20 dòng nấm, chưa phát hiện được dòng nào sản xuất GA3 trong môi trường 20% ICI bằng TLC. iii SUMMARY The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to 08/2007 at Nong Lam university. In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields. In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14 isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to identify GA3 but our experiment did not go as well as planned. iv MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................. i Tóm tắt luận văn ....................................................................................................... ii Summary ................................................................................................................. iii Mục lục .................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng, hình, sơ đồ ........................................................................... viii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von ................................................................................. 3 2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3 2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3 2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5 2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6 2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7 2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8 2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8 2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9 2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10 2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11 2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa ....................................................................... 13 v 2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13 2.4.2.2 GAs điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14 2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14 2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14 2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15 2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15 2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15 2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16 2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16 2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16 2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20 2.5.3 Một số ứng dụng thông thường của TLC ...................................................... 20 2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR............................................................................. 20 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................... 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 22 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 23 3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ................................................................ 23 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm ........................................... 23 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ................................................................. 24 3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm ....................................................................... 25 3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử ...................................................................... 25 3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối ..................................................................... 25 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm ............................................................ 26 3.3.2.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 26 3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA ....................................................................... 26 vi 3.3.2.3 Định tính DNA ........................................................................................... 27 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích ...................................................................... 28 3.3.3 Khuếch đại vùng tef ...................................................................................... 28 3.3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................. 28 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng ................................................................................... 29 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR ............................................................................ 29 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 ........................................................... 29 3.4.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 29 3.4.2 Phương pháp sản xuất GA3 .......................................................................... 30 3.4.3 Phương pháp trích GA3 ................................................................................. 30 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC ............................................................................. 31 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33 4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35 4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36 4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC .................................................................... 39 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH: acid acetic. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. BVTV: bảo vệ thực vật. bp: base pair. CHCl3 : chloroform. dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate. ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long. EtOAc: ethyl acetate. HPLC: high performance liquid chromatography. ITS: Internal Transcribed Spacer. GAs: giberelins. GA3: acid giberelic. Gf: Gibberella fujikuroi MP: mating population. PCR: polymerase chain reaction. PDA: potato dextrose agar. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. Rf: ratio of fronts. STT: số thứ tự. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. tef : translation elongation factor. TLC: thin-layer chromatography. Tm: melting temperature. UV: ultra violet. WA: water agar. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5 Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5 Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11 Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11 Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12 Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13 Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson ................. 15 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19 Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33 Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên môi trường WA ............................................ 33 Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34 Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35 Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35 Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dòng nấm theo qui trình 2 ........................... 37 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39 Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40 Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi .............................. 9 Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium ................................................................. 10 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 ................................................................................... 30 Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3 ................................................................... 31 Bảng 3.1 Các dòng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL ........ 23 Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR................................................................. 29 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những nước Đông Nam Á có lịch sử lâu đời về sản xuất lúa. Cây lúa không những đã gắn bó với con người, đất nước ta từ hàng ngàn năm mà cây lúa còn tạo nên lịch sử, văn hóa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hòa bình. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đó đã trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nó được xem là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu của người Châu Á nói chung cũng như là người Việt Nam nói riêng. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này có thể do nhiều tác nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra. Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa có thể kể như lúa von, đạo ôn, khô vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ Đông Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 toàn tỉnh có hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm đòng ( và đã làm giảm năng suất đáng kể. Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mô tả cách đây hơn 100 năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các loài Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi này bao gồm nhiều loài khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ loài 2 Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các loài sinh học trong nhóm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đó, để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin”. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dòng nấm gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đó là cơ sở để chọn ra các dòng nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuôi cấy, lên men sản xuất giberelin. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuôi cấy các dòng nấm Fusarium moniliforme trong môi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von 2.1.1 Phân bố và thiệt hại Bệnh đã được biết đến ở Nhật từ năm 1828, nhưng mãi đến năm 1898 mới được Hori mô tả lần đầu tiên. Bệnh khá phổ biến trên thế giới. Ở Trung Quốc bệnh được gọi là „white stalk‟; còn ở Philippines và Guyana bệnh được gọi là „lúa đực‟ (palay lalake hay man rice). Thất thu do bệnh có thể rất đáng kể ở nhiều nơi, 20% ở Hokkaido, 40 – 50% ở Kinki Chugoku, Nhật (Ito, Kimura, 1931; Kinki – Chugoku Regional Agriculture Committee, 1975), 15% ở Đông Uttar Pradesh, Ấn Độ (Pavgi, Singh, 1964), 3,7 – 14,7% ở Trung và Bắc Thái Lan (Kanjanasoon, 1965). Bệnh cũng phổ biến ở nhiều nước Đông Nam Á nhưng thiệt hại không lớn. Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long bệnh cũng có mặt ở nhiều nơi, nhất là vụ Đông Xuân, mức độ thiệt hại tùy giống và tùy năm. Trên giống IR-42 ở Huyện Mỹ Xuyên, Sóc Trăng, tỉ lệ chồi nhiễm có thể đến 10 – 20%. Bệnh có khi thành dịch trên diện rộng, như vào năm 1980 ở Đồng Tháp. 2.1.2 Triệu chứng Bệnh có thể xuất hiện ngay từ giai đoạn mạ. Triệu chứng dễ thấy và thông thường nhất là cây mạ bị bệnh có chiều cao hơn cây bình thường, mảnh và có màu xanh vàng nhạt. Cây mạ bị bệnh có thể chết trước khi nhổ cấy hay sau khi cấy. Những cây này nổi bật lên rất dễ thấy, nó phân bố khắp cánh đồng. Tuy vậy cũng có một số cây mạ bị bệnh không có triệu chứng von mà lại thấp lùn còi cọc, phụ thuộc vào dòng nấm gây bệnh và các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ và ẩm độ. 4 Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh. Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra có 5 loại triệu chứng. Vươn dài. Vươn dài sau đó phát triển bình thường. Vươn dài sau đó bị còi cọc. Cây bị còi cọc. Cây không phát triển. Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến có đòng. Những cây bị bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đôi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đó là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này lan dần lên trên khi cây chết. Nấm có thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu điều kiện thuận lợi. Hình 2.1 Ruộng lúa ở Càng Long -Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von tại thời điểm 01/05/2007. 5 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh. (Nguồn ) 2.1.3 Tác nhân Bệnh do nấm Fusarium moniliforme, có giai đoạn hữu tính sinh sản bằng nang nên còn được gọi là Gibberella fujikuroi. (Nguồn ) Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme. 6 2.1.4 Hình dạng và kích thƣớc Giai đoạn quả tử nang của Gibberella fujikuroi có hình khối cầu hay bầu dục, mặt ngoài xù xì, có màu xanh đậm trong chứa các bào tử nang có một vách ngăn, 250 – 330 x 220 – 280 (190 – 390 x 160 – 420) m; nang có dạng hình trụ, phần trên hơi rộng hơn, 90 – 102 x 7 – 9 (66 – 129 x 7 – 14) m, chứa 4,6 và có khi đến 8 bào tử, một dãy hay hai hàng không rõ; nang bào tử có 1 vách ngăn, khoảng 15 x 5,2 m (đa số là 14 – 18 x 4,4 – 7 m) có khi lớn 27 – 45 x 6 – 7 m (nếu nang chỉ chứa một bào tử) (S.H.Ou, 1985). Giai đoạn phân sinh bào tử của Gibberella fujikuroi có hai dạng bào tử là tiểu bào tử và đại bào tử. Tiểu bào tử có hình trứng dẹt, không có hay có một vách ngăn, thường xếp thành chuỗi, sau đó rời nhau và phân tán thành lớp bột trắng trên nền khuẩn ty trắng vàng hay trắng hồng. Còn đại bào tử thanh mảnh, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng có một cái móc ở đỉnh, màu xanh vàng nhạt có 3 – 5 vách ngăn (S.H.Ou, 1985). Nấm không có bào tử chống chịu, có hay không có hạch nấm hình cầu, màu xanh đậm, kích thước 80 – 100 m. Số vách ngăn của bào tử, việc thành lập tiểu bào tử, đại bào tử và hạch nấm của nấm gây bệnh cũng rất thay đổi. 2.1.5 Đặc tính sinh lý Theo S.H.Ou (1985) nấm dễ nuôi cấy trên nhiều loại môi trường, thường dùng dung dịch của Richard và Knop. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của sợi nấm được nhiều người nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là 27 – 30 C, tối đa 36 – 40 C và tối thiểu 7 – 8 C. Những nguyên tố vi lượng như borax, kẽm, mangan làm gia tăng sự phát triển của nấm. Quá trình phân lập nấm được thực hiện dễ dàng trên những môi trường chọn lọc như môi trường có chứa quintozene (PCNB). Việc sinh tiểu bào tử hay đại bào tử cũng tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường, bào tử được sinh nhiều nếu có ánh sáng liên tục. Rice straw-soybean meal agar và Sach‟s agar plus 7 rice straw giúp cho tạo tiểu bào tử trong khi glucose casamino acid agar và rice straw casamino acid agar giúp cho việc hình thành đại bào tử. Xylose là nguồn cacbon hydrat thích hợp nhất để tạo đại bào tử. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm sản sinh ra 2 chất là axít fusaric và giberelin. Axít fusaric hạn chế sinh trưởng làm cây còi cọc, còn giberelin có tác dụng kích thích làm cây phát triển theo chiều cao, cao vống lên. Sự sản sinh ra hai chất này phụ thuộc vào dòng nấm và môi trường sinh sống của nấm. Trên môi trường có KH2PO4 hay MgSO4 hay có nhiều kali, nấm sẽ tạo ra nhiều giberelin trong khi glucose lại rất tốt để nấm tạo ra axít fusaric. Axít fusaric sản sinh nhiều ở nhiệt độ cao (33 C) và môi trường kiềm (pH~9), còn giberelin sản sinh ở nhiệt độ thấp hơn (từ 27 – 30 C) và môi trường chua. Mật độ nấm bệnh càng cao, nấm có khuynh hướng tạo axít fusaric. Muốn sinh sản hữu tính, nấm phải cần có khuẩn ty khác nhóm để phối hợp. Ngoài ra, nang bào tử nấm cũng có tính đực, tính cái và lưỡng tính. 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển Bệnh lúa von chủ yếu truyền qua hạt giống. Hạt lúa bị nhiễm bệnh ở thời kì trổ hoa và kéo dài trong ba tuần sau đó, nhưng tỉ lệ hạt bị nhiễm cũng giảm dần đi. Nếu nhiễm nặng hạt sẽ có màu đỏ và mạ mọc lên sẽ bị lùn. Các hạt nảy mầm sẽ sinh ra cây mạ bị von. Từ những cây mạ bị bệnh, bào tử nhờ gió và nước lan truyền xâm nhiễm cho cây khác. Nấm phát triển trong cây phá hủy tế bào cây, đồng thời những chất do chúng tiết ra tạo nên triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh. Một số hạt giống không bị biến màu vỏ cũng có thể mang nguồn nấm. Trên hạt giống bảo quản khô ráo nấm tồn tại tới 3 năm. Ngoài ra nấm còn tồn tại trong đất, tuy thời gian không lâu. Một thí nghiệm ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây bệnh là 93%, sau đó tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ còn 0,7% và sẽ không có cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985). Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm có thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phòng, nếu trữ lạnh ở 7 C nấm có thể sống hơn 3 năm. 8 2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme) 2.2.1 Phân loại học Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Lớp phụ: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Nectriaceae Giống: Gibberella Loài: Gibberella fujikuroi complex 2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh lúa von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999) Theo Stefan Malonek và ctv (2005), phức hệ loài Gibberella fujikuroi bao gồm nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng trên nhiều cây trồng khác nhau như ngô, lúa, lúa mạch, mía, thông, xoài, dứa, lúa miến… Giai đoạn vô tính trong phức hệ này thuộc giống Fusarium nhóm Liseola. Phức hệ loài này được chia thành ít nhất 9 loài hữu tính (sexually fertile biological species) (được biết như những quần thể giao phối, MP-A đến MP-I) và có 32 loài vô tính. Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu nhằm xác định loài trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự DNA từ những loci không liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA, nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ loài Gibberella fujikuroi. Ngoài ra những thành viên trong quần thể giao phối có nhiều kí chủ khác nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít 9 Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi. fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dòng của những quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những loài của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin, beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ có loài F.fujikuroi (MP-C) có khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005). 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp giberelin có thể chia thành 3 bước như sau: Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate thông qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA12-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các enzyme cytochrome P450 monoxygenases. Bước 3: qua nhiều bước GA12-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA3. (Nguồn www.aseanbiodiversity.info) 10 2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- ) Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 . EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nó cũng có chức năng tương đồng với EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp aminoacyl tRNAs và GTP. Gen mã hóa EF-1 của nhiều loài đã được tạo dòng và được đọc trình tự. Đó là của các loài nấm men, tôm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất cả những gen này mã hóa các protein có độ tương đồng cao so với những protein khác. Điều hòa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nó là một protein đa dạng và có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mô phát triển do có nhiều protein được tổng hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989). Dựa vào vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Lại Hà Tố Hoa, 2006). (David M.Geiser và ctv., 2004) Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID. 11 2.4 Tổng quát về giberelins 2.4.1 Đại cƣơng về các chất giberelins Giberelins (GAs) là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin. Năm 1950 trong lúc nghiên cứu bệnh “foolish seedling” hay “bakanae disease” các nhà khoa học Nhật Bản thấy rằng bệnh gây ra bởi một chất hóa học do nấm tiết ra. Chất này được gọi là giberelin. Năm 1930, những nhà khoa học Nhật đã thành công trong việc thu tinh thể của hai hợp chất có hoạt tính tăng trưởng tiết ra từ nấm, chúng là giberelin A và B, nhưng do sự giới hạn về giao tiếp và chiến tranh thế thứ hai nên mãi đến giữa năm 1950 cấu trúc của chất này mới được xác định và được đặt là axít giberelic: (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Sau đó, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành công được giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đó đến nay, người ta đã tách được những giberelin khác nhau trên nhiều loài cây. Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngô chứa 12 giberelins và lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005). Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins có điểm chung là chúng được chuyển hóa từ ent-kaurene: Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic. Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 12 Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu khảo nghiệm nó trên nhiều loài cây khác nhau. Có những phản ứng kì lạ được thấy ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngô lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị. Ngược lại, ở những cây đã có đặc tính di truyền cao thì sẽ không có đáp ứng cao hơn nữa khi dùng giberelins. Gần đây những thí nghiệm trên cây đậu Hà Lan lùn và cây ngô lùn chứng tỏ sự tăng trưởng tự nhiên của cây được điều hòa bởi giberelins. (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Không lâu sau khi phát hiện hiệu quả kích thích tăng trưởng của axít giberelic, những hợp chất giống giberelin được tách từ nhiều loài cây khác nhau. Hợp chất này có hoạt tính sinh học giống giberelin nhưng cấu trúc hóa học thì chưa được xác định. Khi ngày càng nhiều GAs từ nấm và thực vật được xác định, chúng được đánh số thứ tự là giberelin Ax (hay GAx) với x là thứ tự phát hiện ra chúng. Tất cả GAs dựa trên cấu trúc của ent-gibbrellane skeleton nhưng đối với từng chất lại có những thay đổi tinh vi làm cho hoạt tính của từng chất trở nên khác nhau. Axít giberelic (GA3) được sản sinh từ nấm Gibberella fujikuroi là giberelin được xác định cấu trúc đầu tiên và là giberelin quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Hiện nay có khoảng 136 loại giberelins được tách và xác định cấu trúc từ thực vật, nấm và vi khuẩn ( Mặc dù có nhiều Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 13 loại GAs trong cây nhưng chỉ có một vài GAs có hoạt tính như một hormon, tất cả những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt. 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây. Ngoài sự kéo dài của thân, GAs còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin có thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn còn non sang giai đoạn trưởng thành cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa. 2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều loài cây. Tuy nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette plant) cũng như những cây họ hòa thảo. GA3 ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây lùn bên cạnh đó chúng làm thân cây ốm yếu, giảm kích thước lá và lá có màu xanh nhạt. Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị phát triển trong những ngày ngắn và sự phát triển thân bình thường được điều hòa bởi giberelin nội sinh. Ngoài ra nhiều cây hoa thị ngày dài đòi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển của than, ra hoa và đòi hỏi này được khắc phục bởi việc dùng giberelin. GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở những cây hòa thảo (lúa nước là một ví dụ dễ thấy). Mặc dù GAs có tác động mạnh đến sự tăng trưởng của thân nhưng nó ít ảnh hưởng trực tiếp lên sự phát triển của rễ. Gần đây, người ta chưa biết rõ ảnh hưởng của Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 14 giberelin lên sự tăng trưởng của rễ một cách gián tiếp hay trực tiếp. 2.4.2.2 Giberelins điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đoạn trƣởng thành Các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiều cây lâu năm không ra hoa cho đến khi chúng đạt đến giai đoạn trưởng thành. Giai đoạn non và trưởng thành thường khác nhau về hình dạng lá như cây Thường Xuân ở Anh (Hedera helix), do đó việc dùng GAs cả hai hướng này phụ thuộc vào loài. GA3 có thể gây chuyển hóa từ giai đọan trưởng thành sang giai đoạn còn non ở cây Thường Xuân và việc dùng những GAs không phân cực như GA4 + GA7 có thể làm cho nhiều cây Tùng Bách non chuyển sang giai đoạn sinh sản. 2.4.2.3 Giberelins ảnh hƣởng đến giai đoạn bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính Giberelins có thể thay thế nhu cầu dài ngày hay khí hậu lạnh để ra hoa ở nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở một vài cây. Ở cây có hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hòa bởi giberelin. Tuy nhiên, nó cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố môi trường như quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này có thể được trung hòa bởi giberelin. 2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set” Dùng GAs có thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin không có tác dụng. Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris). 2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào nước giberelin được giải phóng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngoài ra giberelin còn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đó nó tác động lên men di truyền. Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại giberelin cũng như loài cây. 15 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 2.4.3.1 Trong trồng trọt Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho không hạt. Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn và đẩy mạnh sự kéo dài của quả. Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA4 + GA7 làm cho quả táo phát triển dài ra và được dùng để cải thiện hình dáng của quả táo loại ngon trong một vài điều kiện. Mặc dù việc xử lý này không làm tăng năng suất hay mùi vị, nó cũng được mong đợi để thương mại. Ở cây có múi, GAs làm chậm sự già yếu. 2.4.3.2 Sản xuất bia Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng để tăng sản lượng mạch nha từ lúa mạch dùng làm rượu bia. GAs được sử dụng để làm nẩy mầm hạt lúa mạch gia tăng tạo ra enzym thủy giải những chất dự trữ trong hạt thành acid amin và đường để thành mạch nha. 2.4.3.3 Tăng sản lƣợng mía Mía (Saccharum officinarum) là một trong số ít cây dự trữ đường thay vì tinh bột (cây dự trữ đường quan trọng khác là củ cải đường). Có nguồn gốc từ New Hình 2.8 Ảnh hƣởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Có xử lý GA3 Không xử lý GA3 16 Guinea, mía có thể cao từ 4 – 6 m. Đường được dự trữ ở trung tâm không bào của tế bào mô đốt. Phun giberelin có thể tăng sản lượng mía lên 20 tấn trên mẫu và sản lượng đường 2 tấn trên mẫu. Kết quả này là do kích thích sự kéo dài của đốt trong suốt mùa đông. 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật Phun GA4 + GA7 làm giảm mạnh thời gian tạo hạt. Ngoài ra đẩy mạnh hoa đực ở cây họ bầu bí và kích thích kéo dài thân cây củ cải đường (Beta vulgaris) và bắp cải (Brassica oleracea). Do tác dụng đa dạng của giberelin, người ta có thể căn cứ vào mục đích của từng trường hợp để sử dụng cho hiệu quả. Bản thân các chất giberelin không gây dị ứng cho da khi tiếp xúc, không nằm trong danh mục các chất gây ung thư hay chất độc do các tổ chức thế giới qui định. Vì vậy chúng được khuyến cáo sử dụng trong nông nghiệp. Ngày nay trên thế giới có rất nhiều chế phẩm thương mại của giberelin đang sử dụng như Activol, Berelex, Giberelin, Gibrel, Pro-gibb, Pro-gibb plus, regulex. Ở Việt Nam các giberelin cũng đã được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng cây trồng: lúa, các loại rau quả, kích thích mủ cao su (Đào Văn Hoằng, 2005). 2.5 Sắc ký lớp mỏng 2.5.1Tổng quát về sắc ký lớp mỏng Sắc lý lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi qua một chất hấp thu trơ (ví dụ silicagel hay oxít nhôm), chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một lớp phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Theo Nguyễn Xuân Dũng và ctv (1985) quá trình thực hiện sắc ký gồm các bước sau: Chuẩn bị bản mỏng Bản mỏng có thể là tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic có tráng một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxít nhôm). Thông thường bản có kích thước 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm. Đôi khi dùng vật kính cỡ 2,5 x 7,5 cm để phân tích nhanh. 17 Theo tiêu chuẩn Stahl bản có kích thước 10 x 20 cm và 20 x 20 cm. Bề dày của kính từ 2 – 4 mm. Nếu đế bản kim loại thì mỏng hơn nhiều. Dùng kính tốt nhất vì có thể rửa dễ dàng, sử dụng lại và đặc biệt có thể dùng các thuốc hiện ăn mòn mạnh hoặc tác dụng phá hủy mạnh. Nếu cần hiện sắc ký đồ ở nhiệt độ lớn hơn 150oC cần dùng để làm bằng loại thủy tinh bosilic. Đưa mẫu lên bản sắc ký Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch sẵn đường “mức xuất phát‟ cách đáy bản 1 cm và đường “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu trên của bản 0,5 cm. Với bản bán sẵn, dùng viết chì vót nhọn vạch nhẹ; với bản tự tráng trong phòng thí nghiệm rất dễ tróc nên vạch cẩn thận và nhẹ nhàng bằng đầu nhọn của vi quản. Lượng chất và hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn làm cho vệt sắc ký lớn và thường kéo dài, các vệt của các chất có giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạt của thuốc thử không cho phép. Nếu mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp còn nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu bằng loại dung môi phù hợp (ví dụ như ete, cloroform, nước) để mẫu phải tan hoàn toàn. Dung môi dùng hòa tan mẫu để chấm lên bản là loại dung môi càng dễ bay hơi; càng ít phân cực càng tốt. Nếu dung môi dùng để hòa tan mẫu được hấp thu mạnh lên lớp mỏng thì khi dung môi giải ly đi ngang qua vết chấm tại mức xuất phát, dung môi giải ly sẽ gây nên những vết bất thường dẫn đến các vết tách được sẽ bị biến dạng nghiêm trọng. Nhúng nhẹ phần đầu nhọn vi quản vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản. Chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng, tại một điểm, ở mức xuất phát (đối với các dung dịch nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trước khi đưa lên bản hoặc có thể làm giàu trực tiếp lên bản bằng cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau). Nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm vào bề mặt của lớp mỏng, tránh không làm thủng lỗ trên bề mặt này. Chạm vào và lấy vi quản ra thật nhanh để dung 18 dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi hoặc dùng máy sấy tóc để sấy nhẹ giúp dung môi bay hơi mau, không lan thành vết to. Nếu cần chấm nhiều dung dịch khác nhau lên cùng một tấm bản, các vết cách đáy bản 1 cm; vết này cách vết kia 1 cm; các vết nên cách bờ cạnh của bản 1 – 1,5 cm (để tránh hiệu ứng bờ). Vi quản được sử dụng trở lại sau khi rửa bằng aceton. Sau khi chấm xong nên dùng máy sấy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi mới nhúng bản vào dung dịch ly giải. Khai triển sắc ký đồ là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng. Trước khi đặt bản vào trong bình, bình cần được bảo hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách khi ta rót dung môi vào bình cần để một tờ giấy lọc áp sát thành bình và sát đáy bình được tẩm dung môi. Kích thước của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể. Nếu bình không được bão hòa dung môi thì khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm do dung môi đi ở bên cạnh nhanh hơn ở giữa bản. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai có kích thước phù hợp (bản phải thẳng đứng hoặc hơi nghiêng một góc nhỏ hơn 15 độ so với đường thẳng đứng), dung môi trong bình phải ngập bản 0,5 cm, tối đa 0,7 cm, nghĩa là cách điểm xuất phát 0,8 – 1 cm. Một hệ dung môi dung ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho vết chính có giá trị Rf từ 0,3 đến 0,7. Tùy theo hướng chuyển động, cách chuyển động, thành phần dung môi có thể có các cách khai triển sắc ký đồ sau: + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển lên. + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. + Khai triển hai chiều. Hiện sắc đồ: đối với những chất được sắc ký không màu hoặc màu rất nhạt, thì sau khai triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hóa học hoặc quang học, phóng xạ đối với các đồng vị phóng xạ. 19 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC Dụng cụ chuẩn bị TLC Chấm mẫu lên bảnTLC Chuẩn bị quá trình ly giải Quá trình ly giải Phát hiện vết trên đèn UV Phun thuốc thử thích hợp lên bản, rồi sấy 120o/5’ Hình 2.9 Sơ đồ các bƣớc thực hiện TLC. 20 2.5.2 Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng Cần ít mẫu. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và lài nên khó phân biệt được đó là một mũi để chỉ sự hiện diện của một chất hay chỉ là tạp bẩn. Sau quá trình giải ly dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hay hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải nghĩ đến vấn đề hậu sắc ký như ở HPLC. 2.5.3 Một số ứng dụng thông thƣờng của TLC Xác định thành phần các chất trong hỗn hợp. Xác định tính đồng nhất của hai chất. Theo dõi quá trình phản ứng. Xác định hiệu quả của một qui trình tinh sạch của một chất. Xác định điều kiện thích hợp cho sự phân phân tách của sắc ký cột. Theo dõi quá trình sắc ký cột. 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “oligonucleotide” để khuếch đại một đoạn DNA đặc biệt nào đó trong một qui trình có tính chất tự động hóa. Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu khoa học cũng như trong thương mại. Trong đó kỹ thuật PCR đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với các nhà Bảo vệ Thực vật vì kỹ thuật này giúp họ định danh đúng tên loài sinh vật gây bệnh một cách chính xác mà điều này khó thực hiện được nếu dựa vào hình thái và khả năng tạo độc tố của nấm. Bên cạnh đó phản ứng PCR thì nhanh và nhạy hơn các kỹ thuật vi sinh khác. Phản ứng vẫn tiến hành tốt với một lượng mẫu rất ít và không cần đến sự có mặt của vi sinh vật. Điều đó được 21 Kamel A. Abd-Elsalam và ctv (2003) chứng minh khi thực hiện phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS-Fu-f và ITS-Fu-r và phản ứng này vẫn nhạy khi nồng độ DNA của F. oxysporum trong khoảng 10 ng – 100 fg. Ví dụ: Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen tef của các loài nấm thuộc giống Fusarium bằng cặp mồi ef1-ef2 để tạo nền tảng cho việc định danh đúng các loài thuộc giống này đặc biệt là các loài thuộc phức hệ Gibberella fujikuroi, phức hệ F.solani, F.oxysporum và những loài tạo trichothecene loại A và B (David M. Geiser và ctv., 2004). 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến 08/2007. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng bệnh cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Nhân sinh khối nấm Fusarium moniliforme tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Ly trích DNA tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến hành PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến Hành Sắc Ký Lớp Mỏng tại Phòng Hóa Lý – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 23 3.2 Vật liệu nghiên cứu Bảng 3.1 Các dòng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007. STT Kí hiệu các dòng nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu 1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ 2 FM2 Jasmine 85 Ô Môn – Cần Thơ 3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ 4 FM4 OM 2518 Ô Môn – Cần Thơ 5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang 6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang 7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang 8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang 9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh 10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh 11 FM11 OM 504 dòng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp 17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang 18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang 19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang 20 FM20 OM 2517 Châu Thành – Kiên Giang 24 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bông gòn không thấm, bút lông, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ. Môi trường