Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ HẰNG Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện KS. DƢƠNG THÀNH LAM PHẠM THỊ HẰNG TS. LÊ ĐÌNH DÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha Mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả Thầy Cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn và thầy Dƣơng Thành Lam đã hết lòng giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các Anh Chị làm việc tại phòng thí nghiệm 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học cùng các Anh Chị làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh tháng 9 năm 2007 Phạm Thị Hằng iii TÓM TẮT PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trƣờng Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM. Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007. Giáo viên hƣờng dẫn: KS. Dƣơng Thành Lam. TS. Lê Đình Đôn.  Nội dung nghiên cứu  Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ các vƣờn điều tra. Từ đó phân lập, nhân và thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập đƣợc.  Ly trích thu DNA. Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập đƣợc.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh.  Kết quả đạt đƣợc  Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: Bệnh do vi khuẩn: 7,43%. Bệnh do nấm: 18,2%. Bệnh do virus: 0,16%.  Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ các mẫu xƣơng rồng bị bệnh với 2 hình thái có màu khuẩn lạc đặc trƣng: Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. iv  Ly trích đƣợc DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập đƣợc. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa vào thang ladder).  Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp. gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10. Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu.  Chủng bệnh nấm trên xƣơng rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng). v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................. ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC ................................................................................................................... v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ................................................................... x DANH SÁCH ĐỒ THỊ ............................................................................................... x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 1.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng .......................................... 3 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) ................ 4 2.2.1. Phân loại thực vật .................................................................................. 4 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ ................................ 4 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới .......................................................................................................... 5 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh ..................................................................... 5 2.2.3.2. Trên thế giới .................................................................................. 6 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) ................................................................................................... 6 2.2.4.1. Đặc tính thực vật............................................................................ 6 2.4.2.2. Điều kiện sinh thái .................................................................... 10 vi 2.2.5. Bệnh hại trên cây xƣơng rồng ............................................................. 11 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng ........................................................... 11 2.2.5.2. Bệnh đốm than ............................................................................. 11 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng ........................................................ 12 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng ............................................................... 12 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium .................................................................. 12 2.3.1. Sự phân loại ........................................................................................ 12 2.3.2. Sự phân bố .......................................................................................... 14 2.3.3. Phạm vi kí chủ .................................................................................... 14 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium .............................. 14 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. gây ra và biện pháp phòng trừ 14 2.4.1. Khả năng gây hại ................................................................................ 14 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp. ............... 16 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh ................................................... 16 2.4.2.2. Biện pháp canh tác ....................................................................... 16 2.4.2.3. Biện pháp hóa học ....................................................................... 17 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium ............................ 17 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm ............................................ 18 2.6.1. Khái niệm ............................................................................................ 18 2.6.2. Nguyên tắc .......................................................................................... 19 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR ............................. 20 2.6.4. Ứng dụng của PCR ............................................................................. 22 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing ....................................... 22 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. .. 22 2.8.1. Trên thế giới ........................................................................................ 22 2.8.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 25 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam ...................... 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27 vii 3.1. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 27 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu ........................................................ 27 3.1.2. Vật liệu ................................................................................................ 27 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh...... ... 29 3.2.2. Phân lập mẫu nấm ............................................................................... 29 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối .......................... 31 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm ........................................................... 32 Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. ............... 32 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số .................................................................. 32 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. .................................................................................................... 33 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR ................................................................ 35 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng .......................................................... 36 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng....................................... 36 3.2.8.2. Đánh giá kết quả .......................................................................... 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh ................................ 37 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng ....................................................... 37 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007). ........................................................... 39 4.3. Phân lập mẫu nấm ...................................................................................... 40 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp. ............. 41 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef .............................................. 43 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef ..................................................................... 43 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng ...................................................................... 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 52 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 53 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 54 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 58 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR :Polymerase chain reaction. DNA :Deoxyrybonucleotide acid. TE :Tris EDTA. TAE :Tris Acetate EDTA. dNTP :Deoxynucleotide triphosphate. Taq :Thermus aquaticus. UV :Ulta violet. PGA :Potato glucose agar. WA :Water agar. EtBr :Ethidium bromide. l :micro lít. g :micro gam. M :micro gam/ lít. mM :mili gam/ lít. ctv :cộng tác viên. ng :nano gam. bp :base pair. rDNA : ribosomal DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. Tm : Melting Tempereture. TEF : Translation elongation factor. ITS : Internal Transcribed Spacer. ix NCBI : National Center for Biotechnology Informatic. DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. ................................. 13 Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM-ID ........................................ 17 Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc ................................ 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc ......... 39 Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân ............................... 39 Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài .................................... 39 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA ......................................................... 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm .......................... 43 Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2. ................................................ 44 Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh .................. 51 Hình 4.9. Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau khi chủng ................ 51 Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA. .......... 52 x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996). .................................. 26 Bảng3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR .................................... 33 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng ........................................ 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10. ................... 46 Bảng 4.3. So sánh phần trăm độ tƣơng đồng (%) giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank........ 49 DANH SÁCH ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con ngƣời đƣợc nâng cao nên vấn đề thƣ giãn tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng. Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xƣơng rồng. Xƣơng rồng đang dần đƣợc khẳng định trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh vì chúng tƣơng đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc. Xƣơng rồng dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt. Do nhu cầu của ngƣời sử dụng thích những loại xƣơng rồng lạ nên nhà vƣờn thƣờng lai tạo ra các loại cây ghép với sự đa dạng về chủng loại từ đó làm cho bệnh hại xƣơng rồng cũng phát triển theo. Xƣơng rồng cũng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công và hậu quả của nó là làm cho nhiều loại quí hiếm của ngƣời sƣu tầm giống bị hƣ hại dẫn đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vƣờn và ngƣời sử dụng. Các bệnh thƣờng gặp trên xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp., bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ đó có những định hƣớng đúng đắn trong việc phòng trừ bệnh, nhằm làm giảm thiệt hại và mang lại hiệu quả cho ngƣời sản xuất. Đƣợc sự chấp thuận của bộ Môn Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dƣới sự hƣớng dẫn của KS. Dƣơng Thành Lam và TS. Lê Đình Đôn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)”. 2 1.2. Mục đích - yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định tên loài Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng nhằm tìm ra quy trình phòng trừ hữu hiệu cho xƣơng rồng. 1.2.2. Yêu cầu  Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập và phân lập mẫu nấm trên xƣơng rồng bệnh. Nhân sinh khối các dòng nấm Fusarium spp.  Ly trích DNA các dòng nấm phân lập đƣợc. Thiết lập quy trình phản ứng PCR để khảo sát các yếu tố nhƣ chu kì nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh trên xƣơng rồng khỏe. 1.3 Giới hạn của đề tài  Đề tài đƣợc thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007.  Chỉ thực hiện đƣợc trên một số mẫu. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đặc tính để phát triển xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) Trƣớc đây không chỉ ở nƣớc ta mà nhiều nƣớc trên thế giới cũng vậy, số ngƣời thích chơi kiểng xƣơng rồng rất ít. Ngƣời nào thích “sƣu tập” thì số lƣợng cũng không nhiều. Nhƣng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xƣơng rồng càng ngày càng nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này đƣợc các nhà thực vật học không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ. Xƣơng rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ cũng nhiều. Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vƣờn, ngoài sân, trƣớc hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không ai nghĩ kiểng lại đem chƣng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào cũng hầm hập. Với xƣơng rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tƣơi tốt trong nhà một vài tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tƣơi… chính sự kì diệu này đã đƣa kiểng xƣơng rồng đến với mọi ngƣời, mọi nhà, trong đó có đông đủ cƣ dân thành thị. Đƣợc biết, tại nhiều nƣớc Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, ngƣời ta mới khám phá ra đƣợc điều này. Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ mật độ thị dân tăng cao đột ngột. Từ đó, đƣờng sá đƣợc mở rộng thêm, nhà cửa đƣợc cao tầng hơn, đất thổ cƣ trong thành phố còn lại bao nhiêu điều đƣợc trƣng dụng vào việc cất thêm nhà cửa…. Nhƣ vậy, không ai còn một khoảng đất thừa nào để trồng cây cảnh nhƣ trƣớc đây nữa! 4 Vì vậy, muốn trực tiếp đƣợc sống gần gũi với thiên nhiên, muốn có cây cảnh để giải trí, giảm stress, các thị dân mới nghĩ đến… kiểng xƣơng rồng, và đổ xô tìm mua về trồng. Ai cũng biết, chỉ có xƣơng rồng mới có khả năng sống lâu đƣợc trong nhà, lúc nào khí hậu cũng nóng và khô. Mặt khác, kiểng xƣơng rồng dùng chƣng trong nhà, thấp, choáng mặt bằng không nhiều nên dùng làm vật trang trí rất thích hợp và đẹp. Xƣơng rồng thƣờng đƣợc trồng trong loại chậu kiểng bằng gốm sứ với nhiều kiểu dáng khác nhau. So với nhiều giống cây kiểng khác, kiểng xƣơng rồng có giá cả thƣờng thấp hơn. Vị trí đặt chậu xƣơng rồng trong nhà cũng không cần phải cân nhắc quá kỹ. Nó có thể dùng móc kẽm cột vào chậu rồi treo lên nhƣ cách treo lan… Còn ở nƣớc ta trong thời gian gần đây dân từ các vùng quê cũng rủ nhau lên thành phố để tìm kế sinh nhai. Từ đó đẩy mật độ dân ở các thành thị tăng cao, có nơi tăng gấp hai ba lần! Việc đó dẫn đến phố phƣờng chật hẹp ngƣời đông đúc, nhà nào còn thửa đất nhỏ để trồng cây? Trƣớc tình trạng đó, chắc chắn dân thành thị cũng chỉ còn cách trồng kiểng… trên bao lơn, trên sân thƣợng và chƣng… kiểng xƣơng rồng trong nhà mà thôi! Nhƣ vậy, ngành nghề trồng kiểng xƣơng rồng tại nƣớc ta sẽ có cơ hội tốt để phát triển mạnh, do đó thị trƣờng rộng hơn. 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) 2.2.1. Phân loại thực vật Giới (Kingdom) Thực vật Ngành (Division) Thực vật có hoa Lớp (Class) Thực vật hai lá mầm Bộ (Ordo) Caryophyllales Họ (Familia) Cactaceae (Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae). 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ Trích theo (nguồn: http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae). 5 Cây xƣơng rồng thƣờng là loại cây mọng nƣớc thuộc họ Cactaceae (có cây ra hoa hai lá mầm). Họ Cactaceae có từ 24 đến 220 chi, tùy theo nguồn (90 chi phổ biến nhất), trong đó có từ 1.500 đến 1.800 loài. Những cây xƣơng rồng đƣợc biết đến nhƣ là có nguồn gốc từ Châu Mỹ, nhất là ở những vùng sa mạc. Cũng có một số loại biểu sinh trong rừng nhiệt đới, những loại đó mọc trên những cành cây, vì ở đó mƣa rơi xuống đất nhanh, cho nên ở đó thƣờng xuyên bị khô.  Loài cây quen thuộc có chung họ xƣơng rồng Quỳnh (Epiphyllum oxypetallum): Đây là loại hoa kiểng rất đƣợc nhiều ngƣời yêu chuộng vì đặc tính hoa đẹp. Hiện nay, ngƣời ta đã lai tạo đƣợc loại hoa Nhật quỳnh, loại hoa quỳnh nở cả ngày. Thanh long (Hylocereus undatus): Đây là một loại cây ăn trái. Trái có mùi vị đặc trƣng, hơi chua, ngọt. Vỏ trái màu từ đỏ hồng đến đỏ tía. 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh Theo Trƣơng Duy Lam (2006), từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc, các loại cây xƣơng rồng đã đƣợc du nhập vào Việt Nam nhƣ Bolivia, Eriocacfus warasii… Và cho đến ngày nay, chúng là loại cây không thể thiếu trong bộ sƣu tập của những ngƣời chơi xƣơng rồng. Đất Tp. Hồ Chí Minh vẫn còn nổi tiếng với một bậc lão thành chuyên về các giống xƣơng rồng đó là Bác Năm Trƣờng ở Thủ Đức. Ông đã lai tạo, nhân giống liên tục để đến hôm nay trên thị trƣờng Việt Nam nói chung và thị trƣờng Tp. Hồ Chí Minh nói riêng có rất nhiều giống xƣơng rồng có màu sắc hoa rất lạ và đẹp. Trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh hiện nay phần lớn xƣơng rồng nhập từ Trung Quốc trong đó đặc biệt là các cây dùng để ghép. Thực tế cho thấy càng ngày trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh càng có nhiều hộ dân kinh doanh về xƣơng rồng. Cụ thể là theo điều tra thì cách đây hơn 10 năm số hộ trồng xƣơng rồng để kinh doanh chỉ đếm trên đầu ngón tay nhƣng ngày nay con số đó đã lên đến hàng chục hộ. Phần lớn các hộ trồng xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh không xuất khẩu vì không đủ tiêu thụ trong nƣớc. Hiện nay các hộ trồng xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí 6 Minh đa số phân phối cho các tỉnh trong nƣớc đặc biệt là các tỉnh miền trung và nhiều nhất là vào các dịp lễ tết. Trung tâm Sinh học thực nghiệm (Viện ứng dụng công nghệ) đã nhân giống thành công cây xƣơng rồng Nopal có nguồn gốc từ Châu Mỹ, sinh trƣởng nhanh và rất thích hợp với điều kiện của vùng đất khô hạn. 2.2.3.2. Trên thế giới Theo Minh Sơn (2004), hiện nay Mỹ là một trong những nƣớc sản xuất và có thị trƣờng xƣơng rồng lớn nhất thế giới. Phần lớn ngƣời trồng cũng nhƣ thu hoạch tập trung ở vùng Tây Nam của quốc gia này. Ba thị trƣờng chính tiêu thụ xƣơng rồng đƣợc sản xuất tại Mỹ là vƣờn ƣơm, siêu thị và các nhà sƣu tập tƣ nhân. Các quốc gia tiêu thụ nhiều xƣơng rồng nhất từ sa mạc Chihuahua là Mỹ, Anh, Đức, Thụy Điển, Tây Ban Nha, Mexico, Italia và Canada. Christopher Robbins cho biết: ''Ở một số vùng của sa mạc Chihuahua, thu hoạch thực vật hoang dã là hoạt động mang lại hàng triệu USD mỗi năm. Một trong những động lực thúc đẩy hoạt động thu hoạch xƣơng rồng hoang dã này, cả hợp pháp và bất hợp pháp, bắt nguồn từ nhu cầu tạo cảnh quan tại các thành phố sa mạc". Trong những năm gần đây, Châu Âu và Nhật Bản là những điểm đến phổ biến của cây, hạt và quả xƣơng rồng hiếm, có giá trị cao. Các loại xƣơng rồng hiếm, đặc biệt là loại đƣợc tìm thấy ở vùng sa mạc thuộc chủ quyền của Mexico, có thể mang lại hàng nghìn USD. Hạt xƣơng rồng hiếm đƣợc bán với giá 7,5 USD/hạt tại Châu Âu. Hiện nay số lƣợng xƣơng rồng quý hiếm ở các sa mạc đã cạn kiệt do sự thiếu kiến thức của ngƣời dân và bọn buôn lậu đã nhổ cây từ các sa mạc lớn. 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) 2.2.4.1. Đặc tính thực vật Xƣơng rồng không đẹp mã bằng nhiều giống cây kiểng khác, vì chúng chỉ có một đoạn thân cây mập mạp, trơ trụi và giản dị tƣởng chừng nhƣ đời sống của nó 7 không có gì đáng để cho mọi ngƣời quan tâm chú ý đến. Thật ra, xƣơng rồng vẫn hội đủ những đặt tính thực vật đáng để đƣợc tìm hiểu cặn kẽ.  Thân cây Xƣơng rồng có thân mập, căng bong mọng nƣớc, vì bên trong chứa rất nhiều nƣớc gọi là mủ. Thân xƣơng rồng rất đa dạng: hình trụ (thƣờng gọi là mộc trụ hoặc độc trụ), hình cầu và dẹp. Đa số giống là hình trụ và hình cầu, số ít giống hình dẹp, nhƣ cây lƣỡi long (gốc dẹp, thân dẹp và cành nhƣ những chiếc lá dày). Hoặc loại xƣơng rồng “tai thở”… Thân cây xƣơng rồng, tùy giống mà có loại cao loại thấp, loại to, loại nhỏ. Thân có khía hoặc có múi. Có giống ít khía nhƣ giống ta dùng làm hàng rào (chỉ có ba khía), nhƣng cũng có giống 25 khía nhƣ giống Ferocactus wedzenii. Có giống khía rất cạn, nhƣng cũng có giống khía sâu. Giống không khía thì có múi. Múi là những nốt sần lớn từa tựa nhƣ vỏ trái thơm (dứa) mà đa số các giống xƣơng rồng hình cầu đều có dạng này.  Lông Đa số giống xƣơng rồng có thân trơn láng, nhƣng cũng có một số giống thân có lớp lông mịn phủ đầy, nhƣ Cephalocerus. Có giống trên ngọn đƣợc phủ chụp lớp lông dài trắng xóa, gọi là giống Borzicactus.  Gai Đa số xƣơng rồng đều có gai nhọn và là gai chùm, cái nào cũng nhọn hoắt. Nhiều giống xƣơng rồng có nhiều gai cứng mọc tua tủa, nhƣng cũng có giống gai nhỏ và mềm dịu. Đƣợc biết, mới đây một chuyên viên ngành hoa kiểng ở California là ông Luther Burbank đã lai tạo ra đƣợc giống xƣơng rồng mới không gai. Gai xƣơng rồng thƣờng màu đen, nhƣng cũng có giống gai màu vàng. Gai xƣơng rồng là biến thể của lá kèm mà thành, đây là đặc tính của đa số giống cây mọc ở vùng sa mạc quanh năm nóng cháy. Và nhờ vào tiết diện gai quá nhỏ đó nên xƣơng rồng không bị thoát nƣớc nhanh nhƣ các giống cây kiểng có nhiều lá khác. Tiêu biểu dạng gai, ví dụ: - Xƣơng rồng Ephorbia có nhiều gai, vừa dài vừa to, lại nhọn và cứng. 8 - Xƣơng rồng Echinocactus Grusonii thân có nhiều gai chằng chịt cơ hồ bao kín mít khắp thân cây. - Xƣơng rồng Cephalocerus có lông rất cứng nhƣng ít và nhỏ, lông giấu mình trong những nùi lông tơ trắng  Lá xƣơng rồng Khi nói đến xƣơng rồng ai cũng nghĩ đến thân nó trơ trụi, không lá. Thế nhƣng thực tế cũng có một ít giống xƣơng rồng có lá. Có giống lá nhỏ có giống lá to, nhƣng đa số lá đều có giống cuống ngắn và bản dày vì bên trong mọng nƣớc. - Xƣơng rồng Aeonium Holochrysum xuất xứ ở vùng Bắc Phi có nhiều lớp lá xếp khít nhau thành vòng tròn đồng tâm. - Một số giống xƣơng rồng khác, trong đó có giống Euphorbia có lá nhỏ xuất hiện ở phần ngọn và từ cạnh mép của cành.  Rễ xƣơng rồng Do xƣơng rồng (đa số) chỉ có thân đơn độc, trơ trụi, nhƣng trong thân lúc nào cũng chứa nhiều nƣớc (mủ), lại không bị thoát nƣớc nhanh nhƣ những giống cây có lá khác, nên nó không cần có bộ rễ hoàn chỉnh để hút đƣợc nhiều nƣớc nuôi cây, xƣơng rồng không có rễ cái (rễ trụ) mà chỉ có chùm rễ con lƣa thƣa. Chùm rễ con này có nhiệm vụ giữ cho thân cây mọc đứng thăng bằng không bị ngã đổ, và hút chất bổ dƣỡng trong đất để nuôi cây. Mặc dầu có bộ rễ yếu, nhƣng xƣơng rồng lại có sức sống khỏe, dẻo dai. Dù có bị nhổ lên trồng lại vẫn sống mạnh , khó chết.  Hoa xƣơng rồng Xƣơng rồng trổ hoa quanh năm. Số lƣợng hoa mỗi lần trổ có thể từ một đến năm bảy hoa, thậm chí nhiều đến chín mƣời hoa. Tùy từng giống mà hoa đậu trên cây ít hay nhiều ngày: có giống chỉ nở một ngày rồi tàn, nhƣng cũng có giống hoa khoe sắc trên cây đến vài ba ngày mới héo. Màu sắc của hoa xƣơng rồng cũng rất đa dạng, gồm có màu trứng, đỏ son, tím lợt, vàng chanh, vàng cam… Xin đơn cử một số giống xƣơng rồng với sắc hoa đặc trƣng của nó: 9 - Hoa màu trắng với nhiều chấm đỏ tía điểm xuyết, có giống Turbicarpus, xuất xứ tại Mexico. - Hoa màu bang và đỏ sậm có các giống Thelocactus (xuất xứ tại Mexico), và giống xƣơng rồng ở vùng Texas là Homalocephala. Về vị trí hoa trổ ra trên cây. Tùy giống mà có sự khác nhau. Thông thƣờng hoa mọc ra từ kẽ múi, nếu thân có dạng múi. Ngƣợc lại, nếu thân dạng khía thìhoa mọc ra ở cạnh gai (gai mọc ở mép khía). Ngay chồi con cũng vậy, thân dạng múi chồi con nẩy ra từ kẻ múi, còn thân dạng khía thì chồi con nẩy ra ở dạng gai. Cũng có giống xƣơng rồng hoa mọc thành từng cụm ở nách lá, nhƣ các giống EuphorbiaMilii, Euphorbia ligularia… Có giống hoa mọc trên sẹo của lá nhƣ xƣơng rồng Euphorbia Antiquorum  Trái xƣơng rồng Xƣơng rồng có trái hình cầu bên trong không chia thành ngăn hoặc múi và chứa nhiều hột. Từ lúc xƣơng rồng trổ hoa cho đến ngày trái chín. Tùy giống, ngắn là một tháng, dài là vài ba tháng.  Hột xƣơng rồng Trái xƣơng rồng chứa rất nhiều hột. Cây còn nhỏ thƣờng cho trái nhỏ, những cây trƣởng thành ra trái to hơn. Trong trái nhỏ chứa chừng vài chục hột, còn trái lớn chứa từ 500 hột trở lên. Kích thƣớc hột rất nhỏ, nhƣ hột é, nhỏ hơn hột mè (vừng). Tùy giống, khi chín trái già tự động tách vỏ ra để hột bên trong bắn hết ra ngoài. Nhƣng cũng có giống khi chín, trái cứ đeo dính trên cây, nếu không đƣợc hái thì chờ đến lúc vỏ trái bị mục hột mới phân tán ra ngoài. Hột vừa chín có thể đem gieo ngay, và tỷ lệ nảy mầm rất cao. 2.2.4.2. Điều kiện sinh thái Xƣơng rồng có nguồn gốc nguyên thủy ở vùng sa mạc, nơi có thời tiết vô cùng khắt nghiệt, ngày rất nóng và đêm rất lạnh, đất đai lại cằn cỗi. Vì vậy, xƣơng rồng không kén đất trồng, thích nghi đƣợc với các nƣớc vùng nhiệt đới, quanh năm có khí hậu nóng ẩm. Tại nƣớc ta, vùng nào cũng có thể trồng 10 đƣợc kiểng xƣơng rồng nhƣng, thích hợp nhất là các tỉnh Nam Bộ trong đó có Tp. Hồ Chí Minh, nơi có khí hậu khô, nóng và lƣợng mƣa trong năm không nhiều. Xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc với vùng có khí hậu lạnh khoảng 100C, nhƣng chúng sinh trƣởng yếu và phát triển chậm. Còn ở những vùng có khí hậu nóng ẩm thì sự sinh trƣởng và phát triển của chúng bình thƣờng. Trong điều kiện khô hạn, xƣơng rồng có thể chịu đựng đƣợc vài ba tháng liền mà sức khỏe của cây không bị suy giảm. Đó là ƣu điểm của nó khi đem trồng trong nhà.  Lƣợng mƣa Những vùng nào có lƣợng mƣa ít trong năm đều thích hợp cho việc trồng xƣơng rồng, nghĩa là nó chỉ cần lƣợng mƣa từ 1.000 mm trở xuống mới tốt. Vùng nào mƣa nhiều, nhất là mùa mƣa thƣờng kéo dài thì nên trồng xƣơng rồng trong nhà kính hoặc dƣới giàn che. Có thể nói trồng xƣơng rồng trong vùng ít mƣa vẫn tốt, miễn là thỉnh thoảng đƣợc tƣới để đất trồng đủ độ ẩm cần thiết là đƣợc. Xƣơng rồng không thích hợp với mƣa to gió lớn. Do bộ rễ quá yếu nên cây dễ ngã đổ hoặc nghiêng ngã khi gặp ngọn gió to. Vì vậy, với giống xƣơng rồng có thân cao to nhƣ các giống Euphorbia, Ercobaria, hoặc các giống Opuntia Dillenii Opuntia ficus Undia, khi cây trƣởng thành nên làm trụ chống đỡ cho khỏi đổ ngã. Ngay các giống xƣơng rồng có thân dài leo cao nhƣ Rhodcactus Scuelata và Rhodcactus grandifolius cũng có cây chống đỡ mới mọc thẳng lên đƣợc. Xƣơng rồng chịu đƣợc ánh sáng trực xạ. Trồng vào nơi có nắng nhiều cây càng sinh trƣởng tốt, kích thích sự ra hoa nhiều hơn và màu sắc hoa đƣợc tƣơi tắn hơn. Do xƣơng rồng là giống cây có nguồn gốc vùng sa mạc, quanh năm có thời tiết khắc nghiệt nhất, nên dù có gặp mùa nắng hạn vùng nhiệt đới kéo dài, cây vẫn đủ sức chống chọi. Nên tƣới nƣớc để giữ đƣợc độ ẩm cần thiết giúp cây sinh trƣởng tốt hơn.  Nhiệt độ Xƣơng rồng chịu đựng đƣợc nhiệt độ cao, vì vậy trồng xƣơng rồng trong nhà nhiều ngày liền, lúc nào nhiệt độ cũng khô, nóng nhƣng chúng vẫn sống tƣơi tốt. Với vùng nhiệt độ thấp, xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc, mặc dầu sự sinh trƣởng có phần chậm lại. 11  Độ ẩm Độ ẩm không khí cũng rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của xƣơng rồng, tuy nhiên độ ẩm quá thấp lại không tốt. 2.2.5. Bệnh hại trên xƣơng rồng 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng Là bệnh khá phổ biến và nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Bệnh gây hại chủ yếu là thối gốc hoặc một số vết thƣơng của cây ghép. Ban đầu là các đốm thối chứa nhiều nƣớc màu xám hoặc nâu đen, các chấm mốc màu đỏ tím hoặc màu trắng ở nơi tiếp giáp phần bệnh và phần khỏe. Đó là thể quả nấm và chất tiết của nấm. Khi bệnh lan rộng đến xung quanh thân, cây có thể bị khô mà chết. Nguyên nhân gây bệnh thối gốc xƣơng rồng là do nấm lƣỡi liềm (Fusarium oxysporum Schlecht) thuộc lớp nấm bào tử sợi gây ra. Bào tử không màu hình lƣỡi liềm có 3 – 4 vách ngăn, kích thƣớc 19 – 50 x 2,5 – 5 µm. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trƣởng là 25 – 30°C. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). Theo Ik Hwa Hyun, Sang Dok Lee và ctv (1998), một loài Fusarium đƣợc phân lập từ xƣơng rồng có triệu chứng thối rửa ở tỉnh Koyang, Kyonggi năm 1997. Mầm bệnh này đƣợc xác định là Fusarium oxysporum dựa trên đặc điểm nấm học. Triệu chứng thối xuất hiện dƣới đất và vòng thƣơng tổn chiếm khoảng 1 – 3 cm đƣờng kính, xuất hiện trên gốc xƣơng rồng. Hình dạng nấm bệnh có cả dạng tiểu bào tử và đại bào tử. Dạng tiểu bào tử chiếm nhiều hơn cả, từ dạng oval đến dạng bầu dục. Đại bào tử có hình lƣỡi liềm, có 3 – 5 vách ngăn. Màu sắc khuẩn lạc trên môi trƣờng PGA là màu trắng, màu đào hoặc màu tía. Mầm bệnh có thể là nguyên nhân gây nên triệu chứng thối trên gốc xƣơng rồng ghép cũng nhƣ xƣơng rồng không ghép. 2.2.5.2. Bệnh đốm than Bệnh đốm than (bệnh thán thƣ) trên xƣơng rồng phát sinh khá phổ biến, bệnh nặng có thể làm cây chết khô. Cây bị bệnh thƣờng có đốm nhiều nƣớc màu nâu nhạt. Đốm bệnh dần dần lõm xuống lúc ẩm ƣớt trên đốm bệnh xuất hiện các chấm 12 đen nhỏ lồi lên đó là thể quả nấm. Bệnh do nấm đĩa gai (Colletotrichum sp) thuộc lớp bào tử xoang, bộ bào tử đĩa đen gây ra. Đĩa bào tử nhỏ, có lông cứng mọc rãi rác, bào tử đơn bào không màu hình bầu dục dài, kích thƣớc 10,8 – 14,4 x 3,5 – 4,3 µm. Bệnh này thƣờng gặp vào đầu mùa hạ và đầu mùa đông. Những loại xƣơng rồng cầu màu vàng rất nhạy cảm với bệnh này. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng Theo Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã (2002), bệnh tuyến trùng hại xƣơng rồng chủ yếu trên xƣơng rồng 6 cạnh. Ngoài ra còn phát sinh trên hải đƣờng, mào gà, hƣớng dƣơng, hoa hồng. Trên rễ chính và rễ bên hình thành nhiều u bƣớu nhỏ, lúc đầu nhỏ về sau thô dần, cắt u thấy có nhiều hạt nhỏ màu trắng đó là tuyến trùng cái. Bệnh có thể làm cho cây chết khô. Bệnh tuyến trùng hại xƣơng rồng do Meloidogyne incognita chitwood. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng phát triển là 20 – 250C. Đất ẩm có lợi cho sự di chuyển của tuyến trùng đi tìm thức ăn và xâm nhập vào rễ cây. Nƣớc mƣa, nƣớc mƣơng dẫn, hoạt động con ngƣời có thể mang tuyến trùng lây lan. 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng Rệp sáp hại xƣơng rồng (Diaspis echinocacti Bouche) thuộc bộ cánh đều họ rệp sáp hình thuẫn. Chúng dùng miệng chích hút để hút nhựa cây xƣơng rồng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây. Mỗi năm phát sinh 2 – 3 lứa, tháng 5 – 7 và tháng 10 năm sau đều có rệp gây hại. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 2.3.1. Sự phân loại Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Sordariomycetes 13 Bộ (Order) Hypocreales Họ (genus) Fusarium (Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium). Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. a. Nấm có dạng hình lƣỡi liềm. b. Vách ngăn. (Nguồn: Moulds/Illustrations/Fusarium_drawing.jpg) Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Có tế bào sinh bào tử trần. Fusarium đặc trƣng bởi hệ sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu khác nhƣng thƣờng có màu trắng. Nấm Fusarium có cành bào tử phân sinh, giá trần bào tử đơn độc hoặc tụ họp trong các đệm giá (Sporodochia) hoặc thành đệm cho giá nhầy (Pionnetes) đơn hoặc phân nhánh, các tế bào sinh bào tử trần là các thể bình đơn độc hoặc thành cụm trên đỉnh giá bào tử trần, đỉnh các nhánh của giá hoặc trực tiếp trên thân giá, trên các sợi nấm không phân hóa hình thái. Bào tử trần thƣờng ẩm ƣớt tụ họp thành khối cầu ở đỉnh thể bình hoặc hình chuối. Nấm có 2 dạng bào tử: bào tử trần lớn (Macroconidia) và bào tử trần nhỏ (Microconidia). Bào tử trần lớn có một đến nhiều vách ngăn, hình lƣỡi liềm có hoặc không có gót ở ngăn gốc. Bào tử trần nhỏ không có hoặc có 1 – 2 vách ngăn, hình elip, hình trứng, hình trụ, hình gần cầu, thƣờng không màu hoặc màu trắng nhạt. a b 14 2.3.2. Sự phân bố Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới, nấm Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hƣởng rất lớn đến kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nƣớc nhƣ: Australia, Panama, Hawaii, Philippines, Taiwan và các nƣớc Đông Nam Á. Bệnh do nấm Fusarium đƣợc phát hiện vào năm 1809 do nhà bác học Link, H.F. Sau đó vào năm 1821 đƣợc nhà bác học Fries, E. bổ sung thêm. 2.3.3. Phạm vi kí chủ Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm Fusarium có rất nhiều dòng khác nhau nên khả năng ký chủ rất rộng trên nhiều loại cây trồng nhƣ: cây ăn trái, cây rau màu và một số cây hoa cảnh, có thể sống trong các điều kiện khác nhau và có thể tồn tại trong đất một thời gian dài, trong các xác bã thực vật dƣới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và lây lan. Nấm gây hại nặng trên một số cây trồng đặc biệt là trên cây ăn trái nhƣ: chuối, xoài, nhãn, nho, ổi, cam quýt, đu đủ, bơ…. Ngoài ra, có một số dòng nấm Fusarium gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ: gây ung thƣ họng ở ngƣời và ung thƣ bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991). 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium Theo Bugnicourt F. (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 400C. 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. và biện pháp phòng trừ 2.4.1. Khả năng gây hại Lester W. Burgess và ctv, (1988), đại học Sydney (Australila) xác định 13 nhóm, 20 loài gây hại trên một số cây trồng sau: 15 Loài F. latertium: đƣợc phân lập trên cây dâu bị bệnh khô đen nhánh, trên cây Celosia bị bệnh thối thân. Một vài phân lập đƣợc ghi nhận chúng hiện diện trên cây cà phê ở Papua, New Guinea. Loài F. decemcellulare: loài này thƣờng hiện diện ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng đƣợc phân lập từ những cây bị bệnh loét, khô cành. Từ các cây ca cao bị bƣớu ở Nam Mỹ. Loài F. moniliforme: loài này thƣờng xuất hiện ở vùng khí hậu ấm. Chúng thƣờng đƣợc phân lập từ những cây có triệu chứng bệnh thối thân, thối bắp, thối rễ cây Sorghum (Burgess, 1986), thối ngọn ở cây mía, gây hƣ hỏng hạt lúa. Loài này có khả năng nhiễm vào hạt giống của một vài cây kí chủ nhƣ: ngô, lúa…. Chúng có khả năng tạo ra độc tố moniliformin (Vesonder và Hesseltine, 1981). Loài F. solani: là loài có khả năng sống trong đất, phân bố trên phạm vi toàn thế giới, xuất hiện ở các vùng mƣa nhiều và đất thoát nƣớc kém. Là loài phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng gây thối rễ, cổ rễ của nhiều loại cây trồng: đậu, cà chua. Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng ( Nelson, 1981). Loài F. oxysporum: loài này phổ biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và nhiệt đới. Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo mạch dẫn (Beckman, 1987), gây thối rạp cây con ( Nelson, 1981), gây thối rễ và cổ rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978). Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo là một vấn đề quan trọng. Loài F. sambucinum: loài này thƣờng đƣợc phân lập từ rễ cây thông và nhiều cây khác bị bệnh rễ. Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến trong đất nông nghiệp, ở các vùng nhiệt đới và ôn đới. Chúng đƣợc phân lập từ các bộ phận dƣới đất: thân, rễ, củ và các bộ phận trên mặt đất. Theo Booth (1973), phân lập và nghiên cứu loài Fusarium. Một số loài đƣợc trích dẫn dƣới đây: 16 Loài F. solani: loài này đƣợc phân lập từ các cây bị vết thƣơng hoặc từ các cây bị nhiễm các loài nấm Phythium, Phytophthora, Rhizoctolani và các loài Fusarium khác. Loài này cũng gây hƣ hại nhiều loại thực phẩm. Loài F. solani f. sp. batatas: gây hại trên cây khoai lang. Loài F. solani f. sp. cucuritae: gây hại trên cây mía. Loài F. solani f. sp. phaceoli: gây hại trên cây đậu hà lan. Loài F. decemcecllulare: loài này đƣợc phân lập trên nhiều loại cây trồng ở nhiều nƣớc khác nhau: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Indonesia… Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Đƣợc phân lập trên cây cà chua, ngô, chuối, đậu phộng… Loài F. moniliforme: loài này gây thối cây con, gây mốc hạt gạo, gây thối rễ cây bông vải, gây thối các cơ quan cây ngô, thối ngọn mía, xâm nhập vào hoa, quả cây chuối. Loài này có hơn 110 dòng khác nhau và có tính độc khác nhau. Một số dòng có tính độc đƣợc phân lập từ cây ngô ở Mỹ, khả năng gây bệnh phụ thuộc vào chu kỳ sống của nấm và điều kiện ngoại cảnh. Chúng có khả năng tạo ra gibberellia kích thích sự phát triển cây trồng. 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh Theo Bùi Xuân Đồng (1986), khi trồng phải xem xét điều kiện sinh thái đất đai mà chọn các giống thích hợp cho từng điều kiện của vùng và cần xem xét thƣờng xuyên về những thay đổi tính chống chịu của giống. 2.4.2.2. Biện pháp canh tác Theo Bùi Xuân Đồng (1986), biện pháp này rất quan trọng để phòng trừ nấm Fusarium. Trƣớc khi trồng phải làm đất kỹ, xử lý đất, bón phân hợp lý, luôn vệ sinh vƣờn sạch, thoáng mát. Nếu phát hiện bệnh phải thu gom các bộ phận bị bệnh đi tiêu hủy tránh sự lây lan trong vƣờn, chăm sóc kỹ cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây. Cần ngăn chặn di chuyển những cây bị bệnh từ vùng này sang vùng khác 17 tránh đƣợc mầm bệnh ban đầu. Khi cây bị bệnh có thể đào bỏ, xử lý đất bằng vôi hay một số loại thuốc trừ nấm khác. 2.4.2.3. Biện pháp hóa học Theo Bùi Xuân Đồng (1986), trên một số cây trồng có thể sử dụng một số thuốc hóa học trừ nấm khi cây bị nhiễm bệnh nhƣ: Metazeb, Benomyl, Rovral, Ridomil, Copper và một số thuốc khác, liều dùng nhƣ khuyến cáo. Sử dụng thuốc trên bằng cách phun hoặc tƣới vào gốc cây bị bệnh một vài lần cách nhau 7 – 10 ngày. 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium Hình 2.2. Bản đồ vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM- ID Theo David M. Geiser và cộng sự (2004), gen tef giải mã một số protein thiết yếu cho bộ máy dịch mã, có tính hữu ích cao trong nghiên cứu sự phát sinh loài vì nó mang thông tin cao ở mức độ loài của Fusarium. Gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ một marker trong nghiên cứu phát sinh loài để suy ra mối tƣơng quan và mức độ di truyền giữa các loài (Cho và ctv, 1995; Mitchell và ctv, 1997). Primer lần đầu tiên đƣợc phát triển trên nấm để khám phá và kiểm tra chuỗi thế hệ của các dòng Fusarium oxysporum (O` Donnell và ctv., 1998). Primer ef1 và ef2 đƣợc thiết kế dựa trên một phần vị trí exons giữa Trichoderma reesei và Histoplasma capsulatum. Các primer này có thể khuếch đại vùng 700 bp của gen tef flanking với 3 intron mà tổng số hơn nữa chiều dài của đơn vị siêu sao chép trong tất cả các loài đã biết (hình 2.2). Gen này xuất hiện phù hợp với số lƣợng copy đơn trên nấm Fusariium, và nó thể hiện mức độ cao của các trình tự đa hình giữa các loài có quan hệ mật thiết, ngay cả trong so sánh các phần của gen giải mã protein nhƣ là 18 calmodulin, beta-tubulin và histon H3. Vì các lý do đó, tef đã trở thành marker chọn lọc nhƣ là công cụ xác định single - locus trên nấm Fusarium. Ngoài nấm Fusarium thì trên các loại nấm khác chẳng hạn nhƣ nấm Trichoderma cũng có vùng tef. Trên nấm này vùng tef cho kết quả chính xác hơn là dựa vào vùng rDNA-ITS vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng về trình tự trong vùng rDNA-ITS. Tef hữu ích trong việc xác định vùng gen chuyên biệt nhƣ vùng gen mã hoá actin, calmodulin, endochitinase, nó còn cho phép phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Trong phòng thí nghiệm, vùng tef đƣợc quan tâm và khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc khoảng 600 bp (Gary J. Semuels). (trích dẫn bởi Lại Hà Tố Hoa, 2006). Một nhóm nghiên cứu gồm Bogale, Mesfin và ctv (2007), đã sử dụng trình tự gen tef để thiết kế primer chuyên biệt cho các loài Fusarium redolens và trong kỹ thuật PCR- RFLP để phân biệt giữa 3 loài Fusarium oxysporum cùng một tổ tiên chung. Gần đây hình thái học và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử về nấm Fusarium redolens và 3 dòng Fusarium oxysporum phát sinh loài từ một tổ tiên chung còn mơ hồ. Do đó trình tự gen tef từ những loài này và các loài có mối quan hệ mật thiết với chúng đƣợc sử dụng để thiết kế primer chuyên biệt cho loài F. redolens, và để xác định vị trí giới hạn phân biệt giữa 3 loài F. oxysporum có chung một tổ tiên. 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đƣợc mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1985). 2.6.1. Khái niệm Đây là phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA cần đƣợc khuếch đại. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. 19 Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002). 2.6.2. Nguyên tắc Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thƣờng là 94 – 950C trong 30 – 60 giây. Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C. Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720C, ở nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ƣu. Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thƣớc cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lƣợt đƣợc gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lƣợng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau: Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n . 20 Trong đó: n là số chu kỳ thực hiện. m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai đƣợc DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR ngƣời ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer nhƣ sau: Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T) 0 C. 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR  DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu đƣợc trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả.  Enzyme DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao: Taq polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nƣớc nóng). Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả, còn nếu nồng độ