Phương pháp thu nhận và ứng dụng hợp chất curcumin trong củ nghệ

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----
---- BÁO CÁO CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỀ TÀI:PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG HỢP CHẤT CURCUMIN TRONG CỦ NGHỆ GVHD: NGUYỄN THỊ THỦY TIÊN SV : TRƯƠNG THỤY TRÀ MY 60801296 NGUYỄN THỤY ANH THƯ 60802186 2 MỤC LỤC MỤC LỤC...................................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH. .................................................................................................. 3 I. Tổng quan. ................................................................................................................................. 3 I.1. Giới thiệu cây nghệ. .............................................................................................................. 4 I.1.1. Nguồn gốc – Phân bố. .................................................................................................... 4 I.1.2. Phân loại. ........................................................................................................................ 5 I.1.3. Đặc điểm. ....................................................................................................................... 5 I.1.4. Sinh trưởng. .................................................................................................................... 5 I.1.5. Thành phần hóa học của củ nghệ. .................................................................................. 6 I.2. Giới thiệu về curcumin. ........................................................................................................ 6 I.2.1. Cấu trúc hóa học và các đặc tính hóa lý của curcumin. ................................................. 7 I.2.2. Tính chất vật lý. .............................................................................................................. 9 I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng. ......................................................................................... 10 II.Nhân giống cây nghệ (curcuma) bằng phương pháp in vitro. ............................................ 10 II.1.Sơ lược về phương pháp vi nhân giống. ............................................................................. 10 II.2.Phương pháp thực hiện. ...................................................................................................... 11 II.3.Các yếu tố ảnh hưởng. ........................................................................................................ 11 III.Thu nhận curcumin. .............................................................................................................. 12 III.1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. ....................................................................... 13 III.2.Phương pháp dùng dung môi dễ bay hơi. .......................................................................... 15 III.3.Phương pháp dùng bình Soxhlet. ...................................................................................... 17 III.4.Phương pháp dùng dung dịch chất lưỡng cực (aqueous hydrotrope solution). ................. 17 III. Ứng dụng của curcumin. ..................................................................................................... 21 III.1. Hoạt tính chống oxy hóa. ................................................................................................. 21 III.2. Hoạt tính kháng viêm. ...................................................................................................... 22 III.3. Hoạt tính chống đông máu. .............................................................................................. 23 III.4. Ngăn cản và điều trị ung thư. ........................................................................................... 23 III.5. Tính kháng virus, vi khuẩn, nấm và kí sinh trùng. ........................................................... 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO. ......................................................................................................... 24 3 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH. Hình I.1: Cây nghệ. Hình I.2: Một số loài nghệ. Hình I.3: Cấu trúc hóa học của curcuminoid. Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid. Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin. Hình I.6: Dạng keto và enol của curcumin. Hình II.1: Bình Soxhlet. Hình II.2: Các lớp tế bào của củ nghệ. Hình II.3: Sự phá vỡ cấu trúc của các lớp tế bào củ nghệ sau khi bị chất lưỡng cực thâm nhập 4 I. Tổng quan. I.1. Giới thiệu cây nghệ. Hình I.1: Cây nghệ. I.1.1. Nguồn gốc – Phân bố. Nghệ - curcuma là một chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae).Curcuma là tên Latin xuất phát từ từ “Kourkoum”, một từ mang gốc Ả Rập nghĩa là “có màu vàng”. Ngày nay nghệ vàng được trồng ở Ấn Độ, Pakistan, Malaysia, Myanmar, Việt Nam, Thái Lan, Philippines, Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Sri Lanka, Nepal, những hòn đảo ở Nam Thái Bình Dương, Đông và Tây Phi, các đảo ở biển Caribbean, châu Mỹ, nhưng Ấn Độ vẫn là nơi sản xuất và xuất khẩu nghệ vàng chủ yếu hiện tại [1]. Nghệ mọc hoang dại và phân bố khắp những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam, cây mọc hoang dại và được trồng khắp nơi. Ở Ấn Độ, nghệ vàng được sử dụng từ lâu đời: dùng làm gia vị, dùng trong các phương thuốc truyền thống của người Ấn Độ. Ngày nay, nó còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm (chủ yếu là chất màu), công nghiệp dược phẩm (chống oxi hóa, chữa bệnh, …) và mỹ phẩm (sản phẩm dưỡng, làm đẹp da). 5 I.1.2. Phân loại. Chi nghệ gồm khoảng 1400 loài. (a) (b) (c) (d) Hình I.2: Một số loài nghệ. (a) Curcuma aromaticum (b) Curcuma aeruginosa (c) Curcuma singularis (d) Curcuma purpurascens I.1.3. Đặc điểm. Nghệ là cây thân thảo, cao 0.6 – 1 m. Lá có hình dải trái xoan, dài 45cm, rộng 18cm, hai mặt nhẵn. Cuống lá có bẹ mang lông. Hoa mọc từ giữa các lá, hợp thành bông hình trụ, mang cán dài. Lá bắc có màu trắng hay hơi lục. Các lá bắc trên phớt tím nhạt. Đài không đều. Tràng hoa hình ống không đều, thùy giữa lớn hơn và có mũi nhọn. Bầu có lông, vòi nhẵn. Quả nang 3 ô mở bằng van. Thân rễ gọi là khương hoàng, rễ củ gọi là uất kim. Củ chắc và nặng, dài 2 - 5 cm, đường kính 1 – 3 cm. Mặt ngoài xám nâu, nhăn nheo. Đôi khi cón lại vết tích của các nhánh và rễ phụ. Củ có mùi thơm hắc, vị cay. Cắt ngang củ thấy rõ hai vùng : vỏ và trụ giữa. Trụ giữa chiếm chừng 2/3 bán kính củ. I.1.4. Sinh trưởng. Nghệ có thể phát triển ở các điều kiện nhiệt đới khác nhau, từ đồng bằng cho đến độ cao 1500m, thích nghi tốt trong khoảng nhiệt độ 20-30°C. Đặc biệt, nghệ phát triển tốt nhất ở những 6 vùng có lượng mưa trung bình trên 1500mm, ở các vùng khác thì phải bù thêm nước bằng việc tưới tiêu với lượng nước tương đương. Trồng trọt: Đất phải được cày xới 6-8 lần để đất được tơi xốp và hình thành mùn. Sau đó, đất được đánh luống để đảm bảo việc tưới tiêu và thoát nước được tốt. Thời gian gieo hạt là từ tháng 6 đến giữa tháng 7. Giống là những củ to, chắc, chiếm khoảng 15-20% lượng thu hoạch của mùa vụ trước. Trong thời gian trồng, cần làm cỏ và bón phân đầy đủ. Đồng thời, phải có những biện pháp phòng và chống các bệnh thường gặp như bệnh vết lá, đốm lá do vi sinh vật và bệnh cuốn lá do sâu bệnh gây ra. Thu hoạch: Nghệ ra bông vào khoảng tháng 8 và được thu hoạch vào mùa thu. Khi thu hoạch, rễ để riêng và thân để riêng. Để thuận tiện cho việc thu hoạch, người ta thường cắt bỏ phần trên của cây nghệ bao gồm phần thân, lá và hoa; sau đó cày hay cuốc cho đất vỡ ra và từng cụm rễ nghệ được kéo lên một cách cẩn thận. Nghệ sau thu hoạch được ngâm nước để làm sạch đất, rễ và vảy; sau đó được cất vào kho. Muốn để nghệ được lâu, người ta thường phải đồ hoặc hấp trong 6-12 giờ, sau đó để ráo nước rồi đem phơi nắng hay sấy khô. I.1.5. Thành phần hóa học của củ nghệ. Thành phần trong củ nghệ vàng gồm có: chất màu curcumin (curcuminoids), tinh dầu nghệ dễ bay hơi, chất xơ, chất khoáng, protein, chất béo, lượng ẩm, và carbohydrate. Thành phần của củ nghệ vàng Turmeric Curcumin (Curcuminoids) 2 – 8 % Tinh dầu (Volatile essential oil) 3 – 7 % Chất xơ (Fiber) 2 – 7 % Chất khóang (Mineral matter) 3 – 7 % Protein 6 – 8 % Chất béo (Fat) 5 – 10 % Lượng ẩm (Moisture) 6 – 13 % Carbohydrates 60-70 % Theo Ishita Chattopadhyay (2004), trong tinh dầu (5.8%) thu được bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước của củ nghệ gồm có α-phellandren (1%), sabinene (0.6%), cineol (1%), borneol (0.5%), zingiberene (25%) và sesquiterpines (53%) [2]. I.2. Giới thiệu về curcumin. Curcuminoid là các hợp chất có tác dụng tạo nên màu vàng cho củ nghệ. Cùng với tinh dầu, các hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay và mùi hăng đặc trưng cho củ nghệ. Ngoài ra curcuminoid còn bảo vệ nghệ chống lại sự xâm nhập của nấm và vi sinh vật. 7 Curcumin là thành phần quan trọng nhất và linh động nhất trong củ nghệ. Nó có hoạt tính sinh học quan trọng như hoạt tính kháng viêm; chống oxy hóa, dị ứng; liền vết thương; chống co thắt; kháng khuẩn, nấm và khối u; … . Ở Mỹ, curcumin được dùng như một chất tạo màu trong phó mát, mustard, ngũ cốc, hoa quả dầm, bột khoai tây, trong súp, kem và cả yogurts. I.2.1. Cấu trúc hóa học và các đặc tính hóa lý của curcumin. Năm 1815, cấu trúc của curcumin (C21H20O6) lần đầu tiên được miêu tả bởi Volger và Pelletier. Và năm 1913, cấu trúc hóa học của curcumin được Lampe xác định qua một loạt các phản ứng: • Khi đun curcumin với kiềm tạo thành vanilic acid và ferulic acid • Curcumin nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid ((OH)2C6H3COOH) • Oxy hóa bằng permanganat tạo thành vanilin • Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol • Hydro hóa dẫn xuất diacetyl của curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahydro và tetrahydro. Từ những phản ứng trên, cấu trúc của curcumin được xác định là diferuloymethan.  Cấu trúc hóa học của các hợp chất curcumin trong nghệ (curcuminoids) Curcuminoid là các hợp chất của phenol có trong củ nghệ. Curcuminoid gồm chủ yếu là ba hợp chất tạo màu cơ bản cho củ nghệ, tồn tại trong củ nghệ với những tỉ lệ khác nhau và đều là những dẫn xuất dicinnamoylmethane: 1) 1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = diferuloylmethane = curcumin (CTHH: C21H20O6: C.A.S. number: 458-37-7, M = 368) 2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p-hydroxycinnamoylferuloylmethane = demethoxycurcumin (CTHH: C20H18O5: C.A.S. number: 33171-16-3, M = 338) 3) 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p,p-dihidroxydicinnamoylmethane = bisdemethoxycurcumin (CTHH: C19H16O4: C.A.S. number: 33171-05-0, M = 308) 8 Hình I.3: Cấu trúc hóa học của curcuminoid. 1) Curcumin: R1 = R2 = OCH3 2) Demethoxycurcumin: R1 = OCH3, R2 = H 3) Bisdemethoxycurcumin: R1 = R2 = H Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid. Trong ba hợp chất trên, curcumin thường chiếm tỉ lệ chủ yếu, sau đó là demethoxycurcumin, và bisdemethoxycurcumin thường ít linh động hơn. 9 Bên cạnh ba thành phần chủ yếu, người ta cũng tách ra được ba thành phần phụ được cho là các đồng phân hình học của ba hợp chất trên. Một trong ba thành phần phụ này được cho là đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin dựa trên phổ UV của nó (curcumin có cấu hình trans-trans). Đồng phân này có điểm nóng chảy thấp hơn và ít ổn định hơn trong dung dịch cũng như trong ánh sáng so với curcumin . Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin. Hình I.6: Dạng keto và enol của curcumin. I.2.2. Tính chất vật lý. • Curcumin trích từ củ nghệ có dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 184 – 185 °C. • Curcumin không tan trong nước, tan trong cồn, aceton, metanol, dicloromethan, dicloetylen, benzen, acid acetic, … 10 • Trong môi trường trung tính, dung dịch curcumin có màu vàng. Môi trường acid, dung dịch có màu vàng ánh lục (vàng chanh). Dung dịch có màu từ cam tới đỏ tím trong môi trường kiềm. • Màu của curcumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự hiện diện của SO2 với nồng độ ≥ 10 ppm. • Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng 420 – 430 nm. I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng. • Curcumin dễ dàng bị phân hủy dưới tác dung của ánh sáng hoặc trong môi trường pH thích hợp. • Phản ứng cộng với Hydro • Phản ứng tạo phức với kim loại. • Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzene. • Phản ứng amin hóa. II.Nhân giống cây nghệ (curcuma) bằng phương pháp in vitro. II.1.Sơ lược về phương pháp vi nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: • Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành. • Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. • Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành. • Nuôi cấy mô sẹo (callus). • Nuôi cấy tế bào đơn. • Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần .  Thuận lợi của phương pháp vi nhân giống: Rút ngắn thời gian sản xuất. Hệ số nhân giống cao. Cây giống đồng nhất. Tiết kiệm không gian. Không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Chất lượng cây giống được nâng cao. Đa dạng về sản phẩm. Dễ vận chuyển. Có thể sản xuất quanh năm. 11 II.2.Phương pháp thực hiện.  Nguyên liệu: Chồi non của củ nghệ, cắt đoạn dài 1cm.  Môi trường nuôi cấy: môi trường MS cơ bản. Bổ sung 6µM BA, 0.3µM NAA, 3% sucrose, 0.8% agar. Chỉnh pH đến 5.8. Môi trường được khử trùng bằng autoclave ở 121°C trong 20 phút.  Khử trùng mẫu cấy: Chồi non được rửa dưới vòi nước chảy, rửa với Tween-20 trong 5 phút và rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Mẫu cấy sau đó được nhúng ngập trong ethanol 70% trong 30-40 giây và ngâm tiếp theo trong dung dịch chất tẩy rửa (0.1% HgCl2 có thêm 2-3 giọt Tween-20/100ml). Trong điều kiện vô trùng, dung dịch HgCl2 được gạn ra và mẫu cấy được rửa 5-6 lần với nước cất vô trùng. Mẫu sau khi khử trùng được tách vỏ trong điều kiện vô trùng và được cắt nhỏ. Sau đó cấy mẫu vào 25ml môi trường. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường kích thích tạo chồi trên trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, nhằm thu mẫu cấy vô trùng, sạch bệnh.Sau 6 tuần, thực hiện cấy chuyền mẫu cấy và giữ trong 6 tuần tiếp theo để tạo chồi. Các chồi này được cắt và chuyển vào môi trường mới (thành phần tương tự môi trường ban đầu nhưng không có chất kích thích sinh trưởng) và nuôi cấy trong 4 tuần tiếp theo. II.3.Các yếu tố ảnh hưởng.  Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Phương pháp khử trùng làm đẩy mạnh việc tạo mẫu vô trùng và quá trình tạo chồi. Bằng việc kết hợp Tween-20 với 0.1% HgCl2 như một chất làm ẩm nhằm làm giảm sức căng bề mặt và gia tăng bề mặt tiếp xúc. Dưới điều kiện này, hơn 70% mẫu là vô trùng. Và dường như việc sử dụng Tween-20 giúp tăng % mẫu cấy vô trùng vì nó giúp sự khử trùng bề mặt được tốt hơn.  Sucrose. Ở nồng độ 9%, số lượng chồi là cao nhất (8.3 ± 0.32). Chồi lớn nhất (0.88 ± 0.03) g thu được trong tối, trong khi ánh sáng làm giảm nhẹ về số lượng (8.3 ± 0.35) và kích thước (0.82g ± 0.03). Ở nồng độ 7% thì giảm về cả số lượng và kích thước, nhưng không đáng kể về mặt thống kê. Tuy nhiên, nồng độ sucrose thấp hơn (0 - 5%) và cao hơn (11%) có tác dụng hạn chế sự tạo chồi. Kết quả này phù hợp với những báo cáo của Shirgurkar (2001), Sunitibala (2001) và Nayak (2000) [3]. Số lượng chồi thu được cao nhất (5.6 ± 0.8 – 7.0 ± 1.1) ở 6% sucrose, trong khi ở 8% sucrose thì có sự giảm về số lượng (5.6 ± 0.8 – 5.8 ± 1.1) nhưng lại tăng nhẹ về kích thước [4]. Ở nồng độ 3% sucrose, mẫu cấy không thể phát sinh chồi dù tăng nồng độ BA từ 1-7 mg/l hay tăng thời gian chiếu sáng.  Chất kích thích sinh trưởng BA, Kn và NAA. BA, Kn và NAA có ảnh hưởng đáng kể đến sự tạo chồi. 12 Theo Islam (2004), 12 µM BA cùng với 0.3 µM NAA có ảnh hưởng ứng tốt hơn trong tạo chồi về số lượng (8.1 ± 0.36) và khối lượng (0.67 ± 0.03g). Và Kn một mình hay kết hợp với NAA không cho một kết quả hứa hẹn, chỉ tạo ra đến tối đa 4.5 ± 0.14 chồi với khối lượng chồi 0.39 ± 0.02 g. Đồng thời, Islam cho thấy 0.3 µM NAA là thích hợp để đạt số lượng chồi nhiều nhất (8.7 ± 0.36) và khối lượng lớn nhất (0.82 ± 0.03) g [3]. Shirgurkar (2001) khẳng định BA có tác dụng kìm hãm sự sinh chồi ở mẫu cấy củ nghệ. Mặc dù ở nồng độ thấp nhất 4.4 µM, BA không có nhiều ảnh hưởng, nhưng ở nồng độ cao nhất 35.2 µM, nó hoàn toàn kìm hãm sự sinh chồi [4]. Tuy nhiên, Sunitibala (2001) báo cáo rằng Kn (1mg/l) thích hợp cho sự tạo chồi trong nuôi cấy in vitro Curcuma longa L.  Môi trường MS. Theo Islam (2004), môi trường MS nồng độ 0.75 là thích hợp cho sự tạo chồi với số lượng (8.3 ± 0.55) và khối lượng (0.81 ± 0.04) g. Cả nửa nồng độ và nồng độ MS toàn phần đều làm giảm số lượng (6.5 ± 0.53 và 7.1 ± 0.54) và khối lượng (0.65 ± 0.04g và 0.69 ± 0.04) g. Nồng độ MS càng thấp thì càng cho số lượng và khối lượng chồi càng nhỏ, trong khi toàn nồng độ MS cho số lượng chồi ít hơn nhưng có khối lượng lớn hơn [3]. Theo Shirgurkar (2001), nửa nồng độ MS là thích hợp cho sự tạo chồi ở nghệ, với sản lượng trung bình là 5.8 ± 0.7 và kích thước lớn nhất 0.55 ± 0.06 g [4].  Thidiazuron (TDZ). TDZ, một hợp chất giống cytokinin và không chứa purine, cho ảnh hưởng mạnh mẽ hơn cyctokinin đối với nhiều loài thực vật. TDZ kích thích hiệu quả sự phát triển của chồi nách và sự phát sinh các chồi bất định (Huetteman và Preece, 1993). Theo Prathanturarug (2003), việc cho nuôi cấy mẫu cấy với môi trường có bổ sung TDZ với thời gian thích hợp kết hợp việc sau đó chuyển mẫu cấy qua môi trường mới không có chất kích thích sinh trưởng giúp quá trình tạo chồi có hiệu quả cao [5]. TDZ nồng độ 18.17 µM cho số lượng chồi tạo thành lớn nhất: 13.25 ± 0.7 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu nguyên vẹn và 11.33 ± 0.86 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu bị cắt (mẫu ban đầu sau đó được cắt thành bốn mẫu bằng nhau trước khi đem cấy vào môi trường chứa TDZ). III.Thu nhận curcumin. Để thu nhận hợp chất tự nhiên curcumin trực tiếp từ củ nghệ,người ta dùng các phương pháp trích ly. 13 III.1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.  Xử lý nguyên liệu củ nghệ. Củ nghệ sau thu hoạch được phơi khô dưới ánh sáng mặt trời, đến khi độ ẩm đạt 69%. Phương pháp phơi khô được chọn vì không có sự thay đổi nào trong nguyên liệu thô so với phương pháp sấy khô bằng lò. Nghiền 1kg củ nghệ thành bột và trộn lẫn với hạt thủy tinh, nhằm ngăn chặn sự kết khối đặc của nguyên liệu trong thiết bị chưng cất. Sau đó, cho toàn bộ vào máy chưng cất.  Chưng lôi cuốn hơi nước. Thực chất quá trình là chưng tinh dầu trước để loại tinh dầu, sau đó mới thu curcuminoid. Hơi nước Củ nghệ Xử lý i Nước nóng Chưng cất lôi cuốn hơi nước Cặn rắn Lắng, gạn Cặn rắn Sấy Curcuminoid Tinh dầu Sơ đồ quá trình thực hiện. 14 Hơi nước được sinh ra trong một nồi hấp với áp suất được kiểm soát, được cho đi vào thiết bị chưng cất có chứa bình chứa nguyên liệu và bình ngưng. Sau khi đi qua mẫu bột nghệ, hơi được ngưng lại bằng nước lạnh ở nhiệt độ phòng, được gom lại trong phễu tách cùng với tinh dầu đã được hơi nước mang theo ra. Hỗn hợp được để lắng trong một ngày; sau đó, tinh dầu được cho vào bình thót cổ nút chặt bằng nút cao su có quấn Teflon, bảo quản trong tủ lạnh. Sau khi trích xong tinh dầu, van phía dưới thiết bị chưng được mở ra để thu chất màu (curcuminoid) và các chất rắn lơ lủng khác bằng nước nóng (ống dẫn). Nước nóng sau đó được gom lại và để bảo quản lạnh trong một tuần, cho các chất rắn lơ lửng lắng xuống. Sau một tuần, nước được gạn đi, và phần cặn rắn được sấy khô trong lò ở 40°C. Sau khi sấy khô, phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) được dùng để xác định lượng curcuminoid thu được trong phần rắn khô. Lượng curcuminoid tan trong nước gạn được xác định bằng phép ghi âm phổ (spectrophotometry) ở 425nm.  Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và phương pháp đảm bảo hoạt tính. Quá trình chưng sử dụng hai biến số:  Thời gian chưng: 1-2 giờ  Áp suất nồi hấp: 1.0 × 105, 1.3 × 105 và 1.5 × 105 Pa Phân tích thống kê cho thấy thời gian và áp suất nồi hấp không có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng tinh dầu thu được. Điều này cũng tương tự với sự tương tác giữa thời gian chưng và áp suất nồi hấp. Vì sự gelatin hóa tinh bột diễn ra ở nhiệt độ trên 60°C và nhiệt độ trong máy chưng cất theo áp suất nồi hấp trên theo thứ tự là 101, 107 và 110°C, tinh bột có trong củ nghệ đã gelatin hóa, làm cho sản lượng tinh dầu thu được giảm khi áp suất tăng. Ngoài ra, còn có sự mất mát các chất dễ bay hơi trong quá trình chưng cất do nhiệt độ cao. Đối với lượng chất màu, mặc dù có sự khác nhau về khối lượng thu được (theo áp suất trên, khối lượng chất màu thu được lần lượt là 26.78, 0.39 và 1.29g), phần trăm curcuminoid thu được ∼ 0.16%. Điều này xảy ra do khả năng tan rất ít của chất màu trong nước nóng. Theo nghiên cứu của Manzan (2003) về điều kiện tối ưu để trích ly tinh dầu và curcuminoid của củ nghệ, sản lượng tinh dầu thu được cao nhất là 0.46 % khối lượng và sản lượng curcuminoid cao nhất thu được là 0.16% khối lượng tương ứng với điều kiện chưng ở áp suất 1.0 × 105 Pa với thời gian chưng 2 giờ. 15 III.2.Phương pháp dùng dung môi dễ bay hơi.  Xử lý củ nghệ. Củ nghệ sau thu hoạch được sấy khô trong lò với không khí tuần hoàn ở nhiệt độ 50°C, đến khi đạt độ ẩm cuối cùng là 12%. Củ nghệ khô được nghiền bột. Kích thước hạt bột được quyết định bằng sàng rây Tyler. Sau đó, tiến hành quá trình phân hủy tinh bột bằng enzym. Bột nghệ tiếp theo được sấy khô lần nữa bằng lò ở 50°C, độ ẩm đạt 10%.  Trích ly bằng dung môi dễ bay hơi. Thực chất của quá trình là trích ly tinh dầu trước bằng ether dầu hỏa nhằm loại tinh dầu, sau đó mới tiếp tục trích ly curcuminoid. Quá trình trích ly được thực hiện với máy lắc MA 830. Bình thót cổ, bít kín bằng nút bần cao su, chứa 4g bột nghệ và 50ml ether dầu hỏa, được đem cân trước và sau quá trình trích ly nhằm xác định có sự mất mát dung môi trong khi trích hay không. Hỗn hợp chất rắn và dung môi này Dung dịch lỏng Curcuminoid Củ nghệ Xử lý Tinh dầu Trích ly Cặn rắn Bã rắn Ether dầu hỏa Ethanol Trích ly Sơ đồ quá trình thực hiện. 16 được khuấy trộn trong suốt quá trình trích ly. Sau đó, hỗn hợp được lọc chân không. Pha micelle (dung môi và tinh dầu) được chứa trong bình tối, đặt trong lò ở 40°C để làm bay hơi dung môi và thu tinh dầu. Lượng tinh dầu thu được tính bằng gram trong một gram nghệ khô. Để thu chất màu, lấy pha rắn thu được sau khi trích tinh dầu cho vào bình thót cổ với 40ml ethanol.. Pha lỏng sau trích ly được cho vào đĩa Petri và để trong lò ở 40°C nhằm làm bay hơi ethanol thu chất màu. Lượng curcuminoid thu được tính bằng gram trong một gram nghệ khô đã tách tinh dầu.  Các yếu tố ảnh hưởng và phương pháp đảm bảo hoạt tính. Quá trình trích ly bằng dung môi chịu ảnh hưởng của ba yếu tố:  Kích thước hạt bột nghệ  Nhiệt độ quá trình trích ly tinh dầu (20-40°C) và chất màu (30-60°C)  Thời gian trích ly tinh dầu (1-6 giờ) và chất màu (1-6 giờ) Đối với quá trình trích ly tinh dầu bằng ether dầu hỏa, kích thước, nhiệt độ và thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng tinh dầu. Tuy nhiên, sự tương tác giữa kích thước, thời gian và nhiệt độ thì không đáng kể. Ngoài ra, sản lượng tinh dầu tăng khi nhiệt độ tăng (20-40°C) và kích thước hạt bột giảm. Cũng lưu ý là hạt có kích thước nhỏ thì thời gian trích ly cũng giảm. Bên cạnh đó, nếu giảm thời gian trích ly xuống còn 5 giờ thì sản lượng tinh dầu chỉ giảm đi khoảng 25%. Đối với quá trình trích ly chất màu với ethanol, kích thước, nhiệt độ và thời gian có ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng chất màu. Sản lượng cũng chịu ảnh hưởng bởi sự tương tác giữa kích thước và nhiệt độ, trong khi sự tương tác giữa thời gian với hai yếu tố còn lại thì không đáng kể. Sản lượng chất màu tăng khi kích thước nhỏ lại, và tăng nhiệt độ từ 30 đến 60°C làm tăng sản lượng khoảng 6.8%. Ngoài ra, sự trích ly chất màu có thể thực hiện trong 1 giờ, với kích thước hạt nhỏ hơn, ở 60°C, và sản lượng thu được chỉ giảm đi khoảng 7%. Ngoài ra, phương pháp này cũng cho lượng curcumin thu được cao nhất trong ba loại curcuminoid, tiếp theo là demethoxy curcumin và bisdemethoxy curcumin. Với phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi, sản lượng tinh dầu đạt cao nhất là 5.49% khối lượng và sản lượng curcuminoid cao nhất là 7.98% khối lượng ứng với điều kiện kích thước hạt là 0.175, 0.124, 0.088 mm (kích thước số 80, 115, 170) ở nhiệt độ và thời gian là 40°C, 6 giờ (tinh dầu) và 30°C, 6 giờ (chất màu). 17 III.3.Phương pháp dùng bình Soxhlet. Hình II.1: Bình Soxhlet. Phương pháp này cũng là phương pháp dùng dung môi hữu cơ để trích ly curcuminoid từ củ nghệ bằng thiết bị Soxhlet. Phương pháp thường dùng trong phòng thí nghiệm. Củ nghệ được cắt nhỏ hay nghiền thành bột, cho vào bình trích ly nằm trên bình thót cổ chứa dung môi ethanol và dưới bình ngưng. Dung môi được đun nóng và ethanol bay hơi và di chuyển vào bình ngưng, tại đây hơi ethanol ngưng tụ thành lỏng và chảy nhỏ giọt vào bình trích ly có chứa nghệ nguyên liệu. Bình trích ly được thiết kế sao cho khi dung môi quanh mẫu đạt đến một mức nhất định, dung môi sẽ chảy tràn và nhỏ giọt trở lại vào bình thót cổ chứa dung môi đang sôi. Kết thúc quá trình trích ly, bình thót cổ có chứa dịch trích ethanol được đem đi bốc hơi dung môi ethanol. Phần rắn còn lại được đem cân và xác định phần trăm sản lượng curcuminoid thu được. III.4.Phương pháp dùng dung dịch chất lưỡng cực (aqueous hydrotrope solution).  Dung dịch chất lưỡng cực. Chất lưỡng cực (hydrotrope): là những hợp chất alkyl mạch ngắn tan được trong nước, có tính amphipathic – có chứa cả phần tử háo nước (water-loving) và phần tử kị nước (fat-loving). Các chất lưỡng cực có thể sử dụng trong phương pháp: các muối Na, K, Ca, Mg, ammonium của alkyl benzene sulfonate, như benzene sulfonate, toluen sulfonate, xylene sulfonate, ethyl benzene sulfonate, styrene sulfonate, …; của alkyl polyglycol sulfate và phosphate như methyl cellosolve sulfate, ethyl cellosolve sulfate, … . 18 Tính chọn lọc của chất lưỡng cực đối với curcuminoid trong tế bào có thể là do cấu trúc phenolic của chúng. Mức độ xáo trộn lớp tế bào hóa bần của củ nghệ cũng phụ thuộc vào tính chất của chất lưỡng cực; cumene sulfonate thì hầu như làm phá hủy hoàn toàn lớp tế bào hóa bần, butyl mono glycol sulfate (BMGS) thì phá hủy ít hơn nhưng làm xoắn nhiểu hơn, trong khi với Natri salicylate hay para-toluen sulfonate acid (PTSA) hay Natri saccharine thì ảnh hưởng không nổi bật. Khả năng xâm nhập hiệu quả cũng phụ thuộc vào bản chất chất lưỡng cực; cumene sulfonate thâm nhập tế bào nghệ với phạm vi lớn nhất, sau đó là BMGS, Natri salicylate, PTSA và Natri saccharine. Cumene sulfonate thâm nhập tốt nhất nhưng lại ít tính chọn lọc, trong khi BMGS cho thấy khả năng xâm nhập cao và tính chọn lọc với curcumin cao hơn. Điều này giải thích sự khác nhau về hiệu quả trích ly của các chất lưỡng cực khác nhau; BMGS cho lượng curcuminoid tái thu hồi cao nhất với độ tinh khiết cao nhất, tiếp theo là Natri salicylate và cumene sulfonate. PTSA và Natri saccharine cho mức thâm nhập và tính chọn lọc vừa phải, cho lượng sản phẩm thấp hơn.  Tác dụng của dung dịch chất lưỡng cực. Cấu tạo của củ nghệ gồm: - Lớp ngoài cùng là lớp biểu bì (epidermis), cấu tạo từ các tế bào thuôn hình chữ nhật; - Tiếp theo là lớp tế bào dưới (hypodermis), gồm hai hay ba lớp tế bào nhu mô không đều nhau; - Lớp thứ ba gồm khoảng sáu lớp tế bào hóa bần (cork cells) sắp xếp thành hàng xuyên tâm. Lớp tế bào này che chở lớp vỏ (cortex) và các thành phần bên trong; - Lớp cortex gồm các tế bào nhu mô vách mỏng chứa tinh bột, và các tế bào nhựa chứa curcuminoid và bó mạch; - Tiếp theo cortex là lớp vỏ trong (endodermis), gồm các tế bào thuôn chữ nhật chứa các giọt dầu; - Trụ bì (pericycle), sau vỏ trong, được cấu tạo từ một lớp các tế bào thuôn chữ nhật; - Phần trong cùng, hay trụ trung tâm, gồm bó mạch nối tiếp trụ bì, tế bào nhu mô chứa tinh bột, tế bào nhựa và bó mạch nằm rải rác trong vùng mô trung tâm. Như vậy, curcuminoid hiện diện trong tế bào nhựa có mặt ở lớp cortex và trụ trung tâm. Trong phương pháp này, quá trình nghiền củ nghệ làm xáo lộn lớp biểu bì, lớp dưới biểu bì và lớp tế bào hóa bần, giúp lớp tế bào nhựa chứa curcuminoid có thể lộ trực tiếp ra dung dịch chất lưỡng cực. Ngoài ra, vì màng tế bào là lớp đôi phospholipid, chất lưỡng cực sẽ phá hủy lớp đôi này và thâm nhập vào nội bào, làm curcuminoid có khả năng tan nhanh hơn trong dung dịch chất lưỡng cực. Lớp tế bào hóa bần được cấu tạo gồm lớp cellulose ngoài, lớp chất khô ở giữa và lớp cellulose trong. Chính lớp chất khô giữa làm tế bào bần hầu như hoàn toàn không có khả năng thấm nước. Dung dịch chất lưỡng cực phá thủng lớp chất khô giữa này và sau đó tới tế bào bần. Lớp tế bào bần bị xáo trộn, bị xoắn lại và chất lưỡng cực xâm nhập vào các phần bên trong củ 19 nghệ. Khi đó, chất lưỡng cực không chỉ làm tế bào căng lên, mà còn giải phóng tế bào khỏi các cấu trúc kết nối của nó, giúp việc trích curcuminoid trong vùng trụ trung tâm dễ dàng hơn. Hình II.2: Các lớp tế bào của củ nghệ. Hình II.3: Sự phá vỡ cấu trúc của các lớp tế bào củ nghệ sau khi bị chất lưỡng cực thâm nhập. Các chất lưỡng cực khác nhau dùng để trích ly Chất lưỡng cực (muối của Natri) Curcuminoid % Trích ly % Độ tinh khiết Butyl mono glycol sulfate (Na-BMGS) 51.5 97.0 Cumene sulfonate (Na-CS) 38.56 90.7 Salicylate (Na-S) 50.79 89.2 p-Toluen sulfonate acid (Na-PTSA) 13.79 79.3 20 Sơ đồ quá trình thực hiện. Trích ly Xử lý Gạn, lọc hay li tâm Dung dịch chất lưỡng cực Nước Curcuminoid Dịch lỏng Kết tinh Gạn, lọc hay li tâm Rắn Rắn Sấy Rửa Nước rửa Nước Củ nghệ 21  Xử lý củ nghệ. Rễ củ của cây nghệ được nghiền thành dạng bột, và được cho tiếp xúc trực tiếp với dung dịch chất lưỡng cực với dung môi nước, tạo một hỗn hợp dạng sệt trong thùng có hệ thống khuấy.  Trích ly bằng dung dịch chất lượng cực. Sau khi các thành phần trên được trộn đều với nhau, hỗn hợp dạng sệt được khuấy, lắc mạnh trong một khoảng thời gian đủ để quá trình trích curcuminoid diễn ra. Khoảng thời gian khuấy trộn phụ thuộc vào nồng độ chất lưỡng cực và tốc độ khuấy. Quá trình khuấy trộn ở một nhiệt độ cụ thể trong khoảng 0°C - 100°C, và ở áp suất khí quyển. Sau khi khuấy trộn, phần cặn lắng rắn được tách riêng khỏi dung dịch bằng cách gạn, lọc hay li tâm. Phần cặn này được rửa với nước và phần nước rửa kết hợp với dung dịch sau lọc được tiếp tục đi tái thu hồi curcuminoid. Dung dịch sau lọc được pha loãng với nước, nhằm đưa nồng độ chất lưỡng cực đến đủ thấp để kết tủa curcuminoid từ dung dịch. Quá trình pha loãng được thực hiện ở khoảng nhiệt độ 0 - 80°C. Curcuminoid kết tủa được tách khỏi dung dịch bằng cách gạn, lọc hay li tâm. Sau đó curcuminoid được rửa với nước và sấy khô. Còn dung dịch chất lưỡng cực thu hồi trong bước này sẽ được cô đặc và tái chế để tiếp tục sử dụng. Ở biến thể của phương pháp này, sau khi lọc thu được hỗn hợp lỏng dung dịch chất lưỡng cực và curcuminoid, có thể tiếp tục tiến hành việc pha loãng với nước hoặc không. Sau đó, curcuminoid được tái thu hồi bằng việc trích ly tiếp tục với dung môi hữu cơ. Các dung môi hữu cơ này thuộc nhóm hydrocarbon thơm và béo như benzene, alkylated benzene, heptane, hexane, octane, cyclohexane, halogenated hydrocarbon, ketone, methyl isobutyl ketone; ester như ethylacetate, propylacetate; ether như diethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether; cồn như butanol, hexanol; amide như phosphoamide, trioctyl phosphene; hay hỗn hợp của các chất trên.  Các yếu tố ảnh hưởng. • Nồng độ chất lưỡng cực: trong khoảng 0.1 mol/l đến 5.0 mol/l. • Kích thước của hạt bột nghệ: tốt nhất là các kích thước từ số 5 đến 300. • Nhiệt độ thực hiện quá trình trộn bột nghệ với dung dịch chất lưỡng cực: trong khoảng 0- 100°C, tốt nhất là ở nhiệt độ phòng 30°C. • Thời gian trộn và trích ly curcuminoid: 15 phút đến 24 giờ, tùy vào nồng độ chất lưõng cực và tốc độ khuấy trộn. • Nhiệt độ thực hiện pha loãng thu hồi curcuminoid: trong khoảng 0-80°C, tốt nhất là 20- 30°C. III. Ứng dụng của curcumin. III.1. Hoạt tính chống oxy hóa. Trong quá trình hít thở, oxy sẽ oxy hóa thành phần tế bào và các phân tử sinh học. Quá trình oxi hoá này nếu diễn ra quá mạnh và bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài như năng lượng hay yếu tố bên trong như bệnh tật, sẽ tạo ra các sản phẩm oxy hóa là các gốc tự do. Các gốc tự do có khả năng phản ứng rất cao với các hợp chất sinh học gây tổn thương mô. Quá trình lão hóa là một minh họa cho sự tích lũy các tế bào, mô, cơ quan bị thoái hóa gây ra bởi gốc tự do. Trong cơ thể con người tồn tại những cơ quan sản sinh ra cơ chế chống lại tác 22 động của gốc tự do. Theo quá trình lão hóa hay bệnh tật, cơ quan này bị yếu dần đi. Một số vitamin, khoáng chất và hợp chất tự nhiên như các phenol, flavonoid, và carotenoid có khả năng chuyển hóa các gốc tự do bằng cách quét sạch hay trung hòa gốc tự do. Curcuminoid là hợp chất tự nhiên có khả năng chống oxy hóa. Cà dịch trích lẫn curcumin đều có khả năng ngăn cản sự tạo các gốc tự do như superoxide, hydroxyl. Tính chống oxy hóa của curcumin là ngăn cản sự peroxide hóa các lipid trong cơ thể. Phản ứng peroxide hóa lipid là phản ứng gốc tự do dây chuyền, gồm các bước sau: Nguyên tử H bị tách ra khỏi acid béo chưa bão hòa (-CH) nhờ gốc tự do: -CH + R° → -C° + RH -C + O2 → -C-O-O Phản ứng dây chuyền: gốc tự do peroxyl vừa hình thành tấn công acid béo kế cận: -C-O-O + -CH → -C-O-O-H + -C Quá trình tiếp diễn dẫn đến sự tích lũy các peroxide béo trong màng tế bào, làm màng tế bào không ổn định và cho phép sự xâm nhập của các ion có hại. Gốc tự do peroxyl tấn công các ion cũng như protein màng tế bào. Một chất chống oxy hóa sẽ kết thúc chuỗi phản ứng dây chuyền bằng cách kết hợp và dập tắt các gốc tự do hay làm giảm sự tạo gốc tự do ngay từ đầu. Phân tích cấu trúc của curcumin thì nhóm OH trên vòng benzen giữ vai trò quan trọng cho khả năng chống oxi hóa của curcumin. Cơ chế chống oxy hóa của curcumin gồm một hay nhiều bước sau:  Dập tắt hay trung hòa các gốc tự do.  Tương tác với các tác nhân oxy hóa và ngăn cản chúng phát triển.  Kết hợp với oxi và làm giảm khả năng phản ứng oxi hóa.  Ngăn cản các enzym oxy hóa như cyctochromer P_450.  Tạo phức hay phá hủy tính oxy hóa của các ion kim loại như Fe. Curcumin còn ngăn ngừa bệnh tim mạch gây ra do sự co hẹp thành động mạch. Sự co hẹp này là do sự lắng đọng các mảng cholesterol bị oxi hóa cao tương ứng với mức độ các peroxode cao. Với người khỏe mạnh, dùng 500mg curcumin mỗi ngày, trong vòng 7 ngày lượng peroxide béo trong máu giảm 33%, tương ứng lượng cholesterol trong máu giảm 29%. Một ứng dụng khác về khả năng chống oxy hóa của curcumin: dùng curcumin làm chất phụ gia trong thực phẩm, giúp thực phẩm không bị ôi thiu do sự oxy hóa dầu mỡ trong suốt quá trình lưu trữ và bảo quản. III.2. Hoạt tính kháng viêm. Viêm nhiễm là một chuỗi phản ứng của cơ thể nhằm chống lại sự tổn thương mô. Phản ứng này cần thiết cho quá trình lành vết thương, nhưng đồng thời củng tạo ra sự đau đớn kết hợp với nổi đỏ và phồng vết thương. Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra một chất giống hormon là arachidonic acid. Arachidonic acid dưới tác dụng của enzym cyclooxygenase se chuyển hóa thành các prostaglandin (PG) và thromboxan (TX), và thành hydroxyeicosatetraenoid acid (HETE) và leukotrien (LT). Một số PG làm giãn mạch máu, trong khi LT làm tăng khả năng thấm qua mạch 23 làm trương phồng mô, dẫn đến quá trình viêm. Lượng PG tăng lên gây mẫn đỏ, trương phồng, đau nhức vết thương; cón TX, LT có thể ngăn cản quá trình cung cấp máu và năng lượng cho tế bào. Nghiên cứu về cấu trúc hóa học của curcumin kết hợp với hoạt tính sinh học cho thấy rằng sự hiện diện của liên kết đôi ở C3,4 và C3’,4’ và nhóm OH ở C8,8’ trên vòng benzene tạo ra hoạt tính kháng viêm cho curcumin. Chất kháng viêm có khả năng ngăn cản enzym cyclooxygenase và lipoxygenase – nhóm enzym kết hợp với phản ứng chuyển hóa của arachidonic acid trong cơ thể. Sự ngăn cản hoạt động của enzym sẽ làm giảm sản phẩm gây viêm từ sự chuyển hóa của arachidonic acid. III.3. Hoạt tính chống đông máu. Sự kết tụ các tiểu huyết cầu trong máu sẽ gây ra hiện tượng đông máu. Curcumin có khả năng ngăn cản hoạt động của enzym cyclooxygenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên curcumin có tác dụng chống đông máu. III.4. Ngăn cản và điều trị ung thư. • Curcumin ngăn các các tế bào ung thư đi vào pha S (pha tổng hợp của chu kỳ tế bào. • Curcumin thúc đẩy các tế bào ung thư đi vào chết tế bào theo chương trình. • Curcumin là chất ức chế tạo mạch máu mới mạnh. • Curcumin làm hạ cholesterol huyết và chống bệnh Alzheimer (mất trí nhớ ở người già Curcumin có trong nghệ vàng có tác dụng hủy diệt tế bào ung thư theo cơ chế từng bước, ức chế hoạt hóa tín hiệu NF-Kappa B. Ngoài ra, Curcumin còn có tác dụng loại bỏ, săn lùng các men, gốc tự do gây ung thư, giúp cơ thể vừa phòng ngừa và chống ung thư tích cực. III.5. Tính kháng virus, vi khuẩn, nấm và kí sinh trùng. Curcumin được dùng trong điều trị HIV nhờ khả năng chống lại virus. Dịch trích cồn của nghệ còn có tác dụng kháng khuẩn. Curcumin với nồng độ 2.5 – 50 mg/100ml ngăn cản được sự phát triển của Staphylococcus aureus. Natri curcuminat kháng khuẩn Micrococcus pyogen chỉ với hàm lượng 1ppm. Dịch trích cloroform và eter của nghệ có khả năng kháng nấm gây viêm da. Dịch trích cồn của nghệ còn ngăn cản sự sản xuất aflatoxin từ nấm Aspergillus parasiticus và kháng amip Entamoeba histolynca. Hỗn hợp các curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin còn cho thấy tính kháng giun. 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO. [1] Peter, K.V., Handbook of Herbs and Spices, Woodhead Publishing, 2001, p 300. [2] Ishita Chattopadhyay, Kaushik Biswas, Uday Bandyopadhyay và Ranajit K. Banerjee, Turmeric and curcumin: Biological actions and medicinal applications, Current Science 87, 1, 44 - 53, 2004. [3] M. A. Islam, K. Kloppstech and H. -J. Jacobsen, Efficient Procedure for In vitro Microrhizome Induction in Curcuma longa L. (Zingiberaceae) – A Medicinal Plant of Tropical Asia, Plant Tissue Cult. 14(2), 2004, p 123-134. [4] Mrudul V. Shirgurkar, C. K. John & Rajani S. Nadgauda, Factors affecting in vitro microrhizome production in turmeric, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64, 2001, p 5–11. [5] S. Prathanturarug, N. Soonthornchareonnon, W. Chuakul, Y. Phaidee, P. Saralamp, High- frequency shoot multiplication in Curcuma longa L. using thidiazuron, Plant Cell Rep 21, 2003, p 1054–1059. www.curcumin.net/. www.phytochemicals.info/.../curcumin.php. ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pd.