So sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)

ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1]. Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở ruột. Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế của Berberin như: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao . Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như thành phẩm là rất quan trọng. Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III” với những mục tiêu sau:  Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)  Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III  So sánh hai phương pháp định lượng trên để tìm phương pháp thích hợp cho việc định lượng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lượng thuốc trong nước.

doc40 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 02/02/2013 | Lượt xem: 2239 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu So sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
®Æt vÊn ®Ò Berberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã trong nhiÒu lo¹i c©y thuèc ë ViÖt Nam, kho¶ng 150 loµi thuéc nhiÒu hä thùc vËt kh¸c nhau. Berberin chñ yÕu ë trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%[1]. Berberin ®­îc biÕt ®Õn víi t¸c dông næi bËt lµ k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®iÒu trÞ bÖnh lþ. Thuèc ®­îc sö dông phæ biÕn do gi¸ thµnh thÊp vµ kh¸ an toµn, kh«ng ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh th­êng cña vi khuÈn cã Ých ë ruét. HiÖn nay trªn thÞ tr­êng cã c¸c d¹ng bµo chÕ cña Berberin nh­: thuèc nhá m¾t, viªn nÐn, viªn bao…. V× vËy vÊn ®Ò kiÓm tra chÊt l­îng nguyªn liÖu lµm thuèc còng nh­ thµnh phÈm lµ rÊt quan träng. D­îc ®iÓn ViÖt Nam III (D§VN III) cã chuyªn luËn kiÓm nghiÖm nguyªn liÖu vµ chÕ phÈm viªn nÐn Berberin b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô tö ngo¹i UV- VIS, d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) ®Þnh l­îng Berberin b»ng HPLC. §Ó cã c¬ së lùa chän ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin thÝch hîp, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thùc hiÖn ®Ò tµi : “ So s¸nh hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) vµ b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo d­îc ®iÓn ViÖt Nam III” víi nh÷ng môc tiªu sau: §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III So s¸nh hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng trªn ®Ó t×m ph­¬ng ph¸p thÝch hîp cho viÖc ®Þnh l­îng berberin trong c¸c c¬ së kiÓm tra chÊt l­îng thuèc trong n­íc. PHÇN I. TæNG QUAn vµi nÐt VÒ BERBERIN: 1.1.1. CÊu tróc: Beberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã khung protoberberin[1]. Isoquinolin cßn ®­îc gäi lµ benzo[c] pyridin hay 2- benzamin lµ mét hîp chÊt h÷u c¬ th¬m heterocyclic[18] CÊu tróc cña isoquinolin C«ng thøc cÊu t¹o: C«ng thøc ph©n tö: C20H18NO4+ PTL: 336.36 Tªn khoa häc : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2. Nguån gèc: Berberin th­êng cã trong rÔ, th©n rÔ, th©n, vá c©y nh÷ng c©y thuéc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin cã nhiÒu trong th©n vµ rÔ c©y vµng ®¾ng víi tû lÖ 1,5-3%, berberin chiÕm Ýt nhÊt lµ 82% so víi alcaloid toµn phÇn [9]. Berberin th­êng cã lÉn c¸c t¹p chÊt alcaloid kh¸c nh­: palmatin, jatrorrhizin. Giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2%, jatrorrhizin kh«ng qu¸ 5 % [6],[13]. 1.1.3. TÝnh chÊt - Bét kÕt tinh mµu vµng, kh«ng mïi, cã vÞ rÊt ®¾ng. Tan trong n­íc nãng, khã tan trong ethanol vµ n­íc l¹nh, rÊt khã tan trong cloroform, kh«ng tan trong ether.[6] 1.5. T¸c dông d­îc lý: - Berberin cã t¸c dông kh¸ng vi trïng nh­: vi khuÈn ( shigella, tô cÇu vµ liªn cÇu khuÈn), thÓ protozoal, vi nÊm, candida, virus, nÊm men, kÝ sinh trïng g©y bÖnh (kÝ sinh trïng sèt rÐt, kÝ sinh trïng ®­êng ruét) [12], [17]. - Berberin cã t¸c dông k×m khuÈn t¶ vµ E.coli, ®Æc biÖt khi dïng sÏ kh«ng ¶nh h­ëng tíi sù ph¸t triÓn b×nh th­êng cña hÖ vi khuÈn cã Ých ë ruét, khi dïng phèi hîp víi mét sè thuèc kh¸ng sinh sÏ h¹n chÕ t¸c dông phô g©y ra bëi c¸c thuèc kh¸ng sinh ®èi víi hÖ sinh vËt ®­êng ruét [17]. - Berberin cã t¸c dông øc chÕ sù bµi tiÕt ion trong lßng ruét, øc chÕ co c¬, gi¶m cholesterol vµ trigycerid, chèng tiÓu ®­êng, øc chÕ c¬n nhÞp nhanh thÊt, gi¶m viªm cho ng­êi bÞ viªm khíp, t¨ng tiÓu cÇu cña bÖnh nh©n xuÊt huyÕt, gi¶m tiÓu cÇu tiªn ph¸t vµ thø ph¸t, kÝch thÝch sù bµi tiÕt mËt vµ th¶i trõ bilirubin[17]. ChØ ®Þnh: [9],[12],[17] - BÖnh lþ trùc khuÈn, héi chøng lþ, viªm ruét, tiªu ch¶y, viªm èng mËt vµ ®Æc biÖt lµ bÖnh sái mËt, vµng da, sèt, sèt rÐt, môn nhät. - §iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi( do n¾ng, giã, l¹nh, bôi, khãi…) vµ ®iÒu trÞ bÖnh ®au m¾t hét. - §iÒu trÞ bÖnh Leishmania, Trichomonas. 1.1.6. Chèng chØ ®Þnh: [17] - Phô n÷ cã thai v× kh¶ n¨ng g©y co bãp tö cung cña berberin - Ng­êi dÞ øng víi berberin ( rÊt hiÕm gÆp) 1.1.7. D¹ng thuèc vµ hµm l­îng: [11] - D¹ng viªn nÐn, viªn bao, viªn nang víi hµm l­îng 10 mg, hoÆc 50-100 mg/ viªn - D¹ng thuèc nhá m¾t ®iÒu trÞ viªm kÕt m¹c, ®au m¾t ®á do kÝch thÝch bªn ngoµi (giã, n¾ng, l¹nh, bôi, khãi) 1.2. Mét sè ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin: 1.2.1. Ph­¬ng ph¸p thÓ tÝch: [5], [13] Hßa tan 0,3g chÕ phÈm (chÝnh x¸c) vµo trong cèc víi 150ml n­íc ®ang s«i. Lµm nguéi, chuyÓn dung dÞch vµo b×nh ®Þnh møc 250ml. LÊy chÝnh x¸c 50ml dung dÞch kali dicromat 0,1N råi thªm n­íc tíi v¹ch. L¾c ®Òu trong 5 phót, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 100ml dÞch läc cho vµo b×nh nãn nót mµi 250 ml, thªm 2g kali iodid, l¾c cho tan, sau ®ã thªm 10 ml dung dÞch acid hydrochloric 16%, ®Ëy kÝn, l¾c ®Òu, ®Ó vµo bãng tèi trong 10 phót. ChuÈn ®é b»ng dung dÞch natri thiosulfat 0,1N, gÇn ®iÓm t­¬ng ®­¬ng thªm 2ml dung dÞch hå tinh bét vµ tiÕp tôc chuÈn ®é cho ®Õn khi mµu xanh biÕn mÊt th× dõng. Song song tiÕn hµnh lµm mÉu tr¾ng trong cïng ®iÒu kiÖn. 1ml dung dÞch kali dicromat 0,1N t­¬ng øng víi 12,39 mg C20 H18NO4Cl. 1.2.2. Ph­¬ng ph¸p ®o UV-vis Ph­¬ng ph¸p 1:[6]. * Dung dÞch thö: C©n 0.200 g chÕ phÈm vµ hßa tan trong 200ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000ml. LÊy 10ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi n­íc ®Õn 100ml. * Dung dÞch chuÈn: C©n chÝnh x¸c kho¶ng 0,200 g Kali dicromat thuèc thö chuÈn ®· sÊy kh« ë 1100C trong 4 giê, hßa tan trong n­íc. Thªm 10ml dung dÞch acid sulfuric 1N vµ thªm n­íc võa ®ñ 1000ml. * §o ®é hÊp thô: §o At vµ As cña dunh dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn ë b­íc sãng 421 nm. * C¸ch tÝnh: L­îng ( mg) cña C20H18NO4Cl ®­îc tÝnh b»ng c«ng thøc sau: a: khèi l­îng ( mg) kali dichromat. Ph­¬ng ph¸p 2 [6] X¸c ®Þnh hµm l­îng berberin clorid trong viªn nÐn. * Dung dÞch thö: C©n 20 viªn, tÝnh khèi l­îng trung b×nh vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét l­îng bét viªn t­¬ng ®­¬ng víi kho¶ng 80 mg berberin clorid, thªm 10ml n­íc ®Ó thÊm ®Òu bét viªn, sau ®ã thªm kho¶ng 200ml n­íc s«i, khuÊy kÜ 5 phót, ®Ó nguéi råi chuyÓn vµo b×nh ®Þnh møc 500ml, thªm n­íc tíi v¹ch, l¾c ®Òu. §Ó l¾ng tù nhiªn hoÆc ®em ly t©m. LÊy chÝnh x¸c 5ml dung dÞch trong ë trªn ®em pha lo·ng víi n­íc cÊt võa ®ñ 100ml. * Dung dÞch chuÈn : pha t­¬ng tù dung dÞch thö, dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid. * MÉu tr¾ng: n­íc cÊt. * TiÕn hµnh ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i b­íc sãng cùc ®¹i 345 nm, cèc ®o dÇy 1 cm. 1.2.3. Ph­¬ng ph¸p c©n [5] ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng viªn nÐn berberin clorid, dùa trªn kh¶ n¨ng t¹o tña cña berberin víi acid picric. C©n 20 viªn vµ nghiÒn thµnh bét mÞn. C©n chÝnh x¸c mét l­îng bét viªn t­¬ng øng víi kho¶ng 0.50g berberin clorid, cho vµo b×nh ®Þnh møc 250ml, thªm kho¶ng 200 ml methanol (TT), l¾c kü ®Ó hßa tan berberin, råi thªm methanol ®Õn ngÊn. L¾c ®Òu, läc qua giÊy läc kh«, bá 20ml dÞch läc ban ®Çu. LÊy ®óng 100ml dÞch läc. Lµm bay h¬i cho ®Õn kh« trªn c¸ch thñy, thªm 150ml dung dÞch NaOH 0,1N vµ 90ml n­íc, ®un nãng. L¾c kü ®Ó hßa tan. §Ó nguéi råi läc qua giÊy läc ®· thÊm ­ít. Röa phÔu vµ giÊy läc 3 lÇn, mçi lÇn 10ml n­íc. Gép dÞch läc vµ n­íc röa, thªm 10ml dung dÞch acid hydroclorid 0,1N råi tiÕp tôc cho ngay vµ tõ tõ 30ml dung dÞch b·o hßa acid picric ( TT). L¾c ®Òu. §Ó yªn qua mét ®ªm, läc qua phÔu thñy tinh xèp cã ®­êng kÝnh lç xèp 10 – 16 mm ( ®· c©n b×) ®Ó lÊy tña. Röa tña 3 lÇn víi n­íc cÊt ë kho¶ng 150C, mçi lÇn 15ml n­íc, hót kiÖt n­íc råi sÊy kh« phÔu vµ tña ë 1000C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi. Khèi l­îng tña x¸c ®Þnh lµ P (g). 1 g tña t­¬ng øng víi 0,6586 g C20H18NO4Cl. 1.2.4. Ph­¬ng ph¸p HPLC Ph­¬ng ph¸p 1:[14], [15]. * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét thÐp kh«ng gØ ( 25cm x 4 mm) ®­îc nhåi bëi h¹t silicagel ®· ®­îc octadecylsilan hãa cã ®­êng kÝnh 5 mm. - NhiÖt ®é cét: 400C. - Pha ®éng: Hßa tan 3,4g kali dihydrophosphat vµ 1,7g natri laurylsulfat trong 1000 ml hçn hîp dung m«i n­íc vµ acetonitril (1:1). - Tèc ®é dßng: §iÒu chØnh tèc ®é dßng sao cho thêi gian l­u cña berberin kho¶ng 10 phót. - Detector UV ë b­íc sãng 345 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 10 ml. - Nång ®é dung dÞch thö vµ chuÈn: 0,1mg/ml vµ c¸ch tiÕn hµnh pha 2 dung dÞch nµy gièng nhau. * TiÕn hµnh: LÇn l­ît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong c¸c dung dÞch thö , chuÈn vµ hµm l­îng dung dÞch chuÈn, tÝnh l­îng berberin trong chÕ phÈm. * C¸ch tÝnh: L­îng Wt (mg) cña berberin clorid (C20H18ClNO4). Wt = Ws x (At / As) Ws = L­îng (mg) cña berberin chuÈn, tÝnh theo l­îng khan. Ph­¬ng ph¸p 2: [13] * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét ®­îc nhåi bëi c¸c h¹t silicagel ®· ®­îc octadecylsilan hãa. - Pha ®éng: Hçn hîp dung dÞch ®Öm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat víi 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh tíi pH 3,0 b»ng acid phosphoric] vµ acetonitril (60:40). - Tèc ®é dßng: 1,5 ml/ phót. - Detector UV ë b­íc sãng 263 nm. - ThÓ tÝch tiªm: 20 ml - Nång ®é dung dÞch chuÈn vµ thö: 32 mg/ml * TiÕn hµnh: LÇn l­ît tiªm c¸c dung dÞch thö vµ chuÈn. Dùa vµo ®¸p øng cña pic berberin trong dung dÞch thö, chuÈn vµ hµm l­îng dung dÞch chuÈn, tÝnh l­îng berberin cã trong chÕ phÈm. Ph­¬ng ph¸p 3: [16] * §iÒu kiÖn s¾c ký: - Cét s¾c ký: Cét Hypersil C18 ( 5 mm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha ®éng: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42). - Tèc ®é dßng: 1ml/phót. - Detector UV ë b­íc sãng 349 nm. * TiÕn hµnh: T­¬ng tù nh­ 2 ph­¬ng ph¸p HPLC ®· tr×nh bµy ë trªn. 1.3. Tæng quan Ph­¬ng ph¸p hplc 1.3.1. Nguyªn t¾c Ph­¬ng ph¸p HPLC lµ 1 ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hãa lý, dïng ®Ó t¸ch vµ ®Þnh l­îng c¸c thµnh phÇn trong hçn hîp dùa trªn ¸i lùc kh¸c nhau gi÷a c¸c chÊt víi 2 pha lu«n tiÕp xóc nh­ng kh«ng hßa lÉn vµo nhau: Pha tÜnh (trong cét hiÖu n¨ng cao) vµ pha ®éng (dung m«i röa gi¶i). Khi dung dÞch cña hçn hîp c¸c chÊt cÇn ph©n tÝch ®­a vµo cét, chóng sÏ ®­îc hÊp phô hoÆc ph©n bè vµo pha tÜnh tïy thuéc vµo b¶n chÊt cña cét vµ cña chÊt cÇn ph©n tÝch. Khi ta b¬m dung m«i pha ®éng b»ng b¬m víi ¸p suÊt cao th× tïy thuéc vµo ¸i lùc cña c¸c chÊt víi hai pha, chóng sÏ di chuyÓn qua cét víi vËn tèc kh¸c nhau dÉn ®Õn sù ph©n t¸ch. C¸c chÊt sau khi ra khái cét sÏ ®­îc ph¸t hiÖn bëi bé phËn ph¸t hiÖn gäi lµ detector vµ ®­îc chuyÓn qua bé xö lý kÕt qu¶. KÕt qu¶ cuèi cïng ®­îc hiÓn thÞ trªn mµn h×nh hoÆc ®­a ra m¸y in. [8] 1.3.2. C¬ së lý thuyÕt Qu¸ tr×nh ph©n t¸ch trong kü thuËt HPLC lµ do qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vµ ph©n bè cña c¸c chÊt tan gi÷a 2 pha kh¸c nhau. Khi pha ®éng di chuyÓn víi mét tèc ®é nhÊt ®Þnh qua cét s¾c ký sÏ ®Èy c¸c chÊt tan bÞ pha tÜnh l­u gi÷ ra khái cét. Tïy theo b¶n chÊt pha tÜnh, chÊt tan vµ dung m«i mµ qu¸ tr×nh röa gi¶i t¸ch ®­îc c¸c chÊt khi ra khái cét s¾c ký. NÕu ghi qu¸ tr×nh t¸ch s¾c ký, chóng ta cã s¾c ®å. [8], [11] 1.3.3. C¸c th«ng sè ®Æc tr­ng cña qu¸ tr×nh s¾c ký: KÕt qu¶ cña qu¸ tr×nh s¾c kÝ ®­îc detector ph¸t hiÖn, phãng ®¹i vµ ghi thµnh s¾c ký ®å( h×nh 1): H×nh 1: s¾c ký ®å cña 2 chÊt vµ c¸c th«ng sè ®Æc tr­ng Trong ®ã : to (thêi gian chÕt): Lµ thêi gian cÇn thiÕt ®Ó pha ®éng ch¶y qua cét t¸ch tR (thêi gian l­u): thêi gian kÓ tõ khi chÊt cÇn ph©n tÝch ®­îc b¬m vµo cét cho ®Õn khi xuÊt hiÖn ®Ønh cña pic chÊt cÇn ph©n tÝch. tR’ (thêi gian l­u thùc ) = tR- to. W0,5: §é réng pic ë nöa chiÒu cao Wb: §é réng ®¸y pic. 1.3.2.1. HÖ sè dung l­îng k’ [8] NÕu k' nhá th× tR còng nhá vµ sù t¸ch kÐm. Trong thùc tÕ k' n»m trong kho¶ng 2 - 5 lµ tèt nhÊt. Hai chÊt chØ ®­îc t¸ch ra khái nhau nÕu chóng cã gi¸ trÞ kh¸c nhau. 1.3.2.2 §é chän läc a (selectivity - factor) a= (k2' > k1' ) [4], [8] a kh¸c 1 cµng nhiÒu th× kh¶ n¨ng t¸ch cµng râ rµng, tèi ­u tõ 1,5 ®Õn 2. 1.3.2.3. §é ph©n gi¶i (resolution) §Æc tr­ng cho møc ®é t¸ch hai chÊt ra khái nhau trªn mét ®iÒu kiÖn s¾c ký. §é ph©n gi¶i cña 2 pic ë c¹nh nhau ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [4], [8] §é ph©n gi¶i c¬ b¶n ®¹t ®­îc khi R = 1,5 1.3.2.4. HÖ sè bÊt ®èi AF Cho biÕt møc ®é c©n ®èi cña pic s¾c ký, nã ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: [4], [8] Trong ®ã: W1/20: lµ chiÒu réng cña pic ®­îc ®o ë 1/20 chiÒu cao cña pic a: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng vu«ng gãc h¹ tõ ®Ønh pic ®Õn mÐp ®­êng cong phÝa tr­íc t¹i vÞ trÝ 1/20 chiÒu cao cña pic. Khi AF n»m trong kho¶ng 0,5-2,5 th× phÐp ®Þnh l­îng ®­îc chÊp nhËn, nÕu AF cµng t¨ng lªn th× hiÖn t­îng kÐo ®u«i cµng râ. HiÖn t­îng ®Ønh kÐo ®u«i (tailing peak) cã thÓ lµ do t­¬ng t¸c gi÷a chÊt cÇn ph©n tÝch vµ pha tÜnh hoÆc cét s¾c ký bÈn. §Ønh kÐo tuyÕn tr­íc (fronting peak) cã thÓ do l­îng mÉu ®­a vµo qu¸ lín so víi n¨ng lùc cét [7]. 1.3.2.5. Sè ®Üa lý thuyÕt N §Æc tr­ng cho hiÖu lùc cét. N = 16 hay N=5,54 [4], [8] NÕu gäi L lµ chiÒu cao cét s¾c ký, th× chiÒu cao cña ®Üa lý thuyÕt H ®­îc tÝnh b»ng c«ng thøc: 1.3.4. Nguyªn t¾c cÊu t¹o hÖ thèng HPLC [4],[8] HÖ thèng HPLC ®¬n gi¶n vµ ®ñ ®Ó lµm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm 6 bé phËn chÝnh sau: a/HÖ thèng b¬m §Ó b¬m pha ®éng vµo cét t¸ch. B¬m nµy ph¶i ®iÒu chØnh ®­îc ¸p suÊt (0 - 400 bar) a/ B×nh chøa dung m«i vµ hÖ thèng xö lý dung m«i B×nh chøa dung m«i th­êng b»ng thñy tinh hoÆc thÐp kh«ng gØ. Dung m«i ch¹y s¾c ký ®­îc läc qua mµng läc (th­êng mµng läc cì lç 0,45 mm ) vµ ®uæi khÝ hßa tan. c/ HÖ tiªm mÉu §Ó ®­a mÉu ph©n tÝch vµo cét. Cã nhiÒu ph­¬ng ph¸p tiªm mÉu kh¸c nhau, ®¬n gi¶n nhÊt lµ sö dông mét van tiªm. Trong c¸c hÖ thèng s¾c ký hiÖn ®¹i lµ hÖ tiªm mÉu tù ®éng. Trong s¾c ký láng, mÉu láng cã thÓ ®­îc tiªm ngay sau khi läc lo¹i t¹p qua mµng läc 0,45 mm, cßn mÉu r¾n cÇn hßa tan trong 1 dung m«i thÝch hîp. d/ Cét s¾c ký láng HPLC Cét ®­îc chÕ t¹o b»ng thÐp ®Æc biÖt tr¬ víi hãa chÊt, chÞu ®­îc víi ¸p suÊt cao ®Õn vµi tr¨m bar. - ChiÒu dµi cét: 10, 15, hoÆc 25 cm; thÝch hîp víi c¸c tiÓu ph©n pha tÜnh cã ®­êng kÝnh rÊt nhá (3, 5, 10 mm). - §­êng kÝnh cét: 4 hoÆc 4,6 mm. e/ Detector trong HPLC Lµ bé phËn ph¸t hiÖn chÊt ph©n tÝch, tïy theo b¶n chÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch mµ sö dông detector thÝch hîp. Detector hay sö dông lµ detector hÊp thô UV - VIS. Ngoµi ra cßn cã detector khóc x¹, huúnh quang, ®iÖn hãa. f/ ThiÕt bÞ hiÓn thÞ kÕt qu¶ Cã nhiÒu lo¹i nh­ng ®¬n gi¶n vµ phæ biÕn nhÊt lµ m¸y tù ghi ®Ó tÝn hiÖu ®o d­íi d¹ng pic. S¬ ®å khèi hÖ thèng HPLC ®­îc tæng qu¸t ë h×nh 2 B¬m Van tiªm mÉu Binh chøa pha ®éng Cét Bé phËn tù ghi Detector H×nh 2: S¬ ®å khèi tæng qu¸t hÖ thèng HPLC 1.3.5. C¸ch ®¸nh gi¸ pic[7] * §¸nh gi¸ diÖn tÝch pic: DiÖn tÝch cña mét chÊt t­¬ng øng víi tæng l­îng chÊt ®ã. §Ó tÝnh diÖn tÝch pic, hiÖn nay ng­êi ta th­êng dïng m¸y tÝch ph©n ®iÖn tö g¾n víi m¸y vi tÝnh (sai sè kho¶ng 0,5 %) hoÆc m¸y ph©n tÝch c¬ häc (sai sè 1,3 %). Ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ dïng cho c¸c pic kh«ng bÞ tr«i ®­êng nÒn vµ c¶ pic cã ®­êng nÒn bÞ tr«i. Ph­¬ng ph¸p nµy chØ cÇn ®iÓm ®Çu ®iÓm cuèi cña pic ®­îc nhËn ra chÝnh x¸c vµ cho kÕt qu¶ tèt víi nång ®é võa, trung b×nh vµ cao. * §¸nh gi¸ chiÒu cao pic: Khi pic cã d¹ng kh«ng ®æi th× chiÒu cao pic (kho¶ng c¸ch gi÷a ®­êng nÒn vµ ®Ønh pic) lµ mét ®¹i l­îng tû lÖ víi diÖn tÝch pic vµ nã còng cã thÓ dïng ®Ó ®¸nh gi¸ phæ. Ph­¬ng ph¸p chØ ¸p dông khi c¸c chØ sè k' lµ h»ng ®Þnh. * Víi pic cã ®­êng nÒn bÞ nhiÔu hoÆc bÞ hÑp th× viÖc x¸c ®Þnh chiÒu cao pic sÏ dÔ dµng vµ chÝnh x¸c h¬n viÖc x¸c ®Þnh diÖn tÝch pic. 1.4.Tæng quan PH¦¥NG PH¸P QUANG PHæ HÊP THô UV-VIS 1.4.1. C¬ së lý thuyÕt[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. §Þnh luËt Lambert-Beer ChiÕu mét chïm tia s¸ng ®¬n s¾c cã b­íc sãng λ vµ c­êng ®é Io qua dung dÞch ®ång nhÊt cã nång ®é C, bÒ dµy líp dung dÞch lµ l. Khi ®i qua dung dÞch ,mét phÇn ¸nh s¸ng bÞ hÊp thô, mét phÇn bÞ ph¶n x¹, phÇn cßn l¹i (I) th× ®i qua dung dÞch . Mèi quan hÖ gi÷a I vµ Io ®­îc thÓ hiÖn b»ng ®Þnh luËt Lambert-Beer. I = Io 10 -εCl Víi ε lµ hÖ sè hÊp thô riªng cña dung dÞch. HÖ sè nµy kh«ng phô thuéc vµo nång ®é, chØ phô thuéc vµo b¶n chÊt chÊt tan, vµo b­íc sãng cña ¸nh s¸ng chiÕu vµo dung dÞch. 1.4.1.2. §iÒu kiÖn øng dông ®Þnh luËt Lambert – beer + Chïm tia s¸ng ph¶i ®¬n s¾c + Dung dÞch ph¶i lo·ng (n»m trong kho¶ng nång ®é thÝch hîp) + Dung dÞch ph¶i trong suèt (trõ chuÈn ®é ®o quang). + ChÊt thö ph¶i bÒn trong dung dÞch vµ ph¶i bÒn duíi t¸c dông cña ¸nh s¸ng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sù sai lÖch ®èi víi ®Þnh lËt Lambert-beer + Sù sai lÖch do m¸y:(do bé phËn ®¬n s¾c ,bé phËn khuÕch ®¹i kÐm) nh­ do tÕ bµo quang ®iÖn, nh©n quang qu¸ giµ, ®é nh¹y kÐm. + Sai lÖch do ho¸ häc: - Do sù ph©n ly (ion ho¸): th­êng gÆp khi pha lo·ng dung dÞch, ph©n tö chÊt tan bÞ ph©n ly, mµ ®é hÊp thô cña d¹ng ph©n tö vµ d¹ng ion ph©n ly kh«ng nh­ nhau. - Do t¹o dimer, trimer: s¶n phÈm trïng hîp nµy l¹i cã ®é hÊp thô kh¸c d¹ng ®¬n ph©n tö. + Do ph¶n øng c¸c chÊt l¹: - ChÊt l¹ cã thÓ t¹o phøc víi c¸c ion trong dung dÞch: ®Ó ®Ò phßng hiÖn t­îng nµy x¶y ra, ng­êi ta dïng mÉu tr¾ng cã thµnh phÇn nh­ dung dÞch, chØ thiÕu chÊt cÇn ®Þnh l­îng. - Sù hÊp thô cña chÊt l¹, thuèc thö còng cã thÓ ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng. V× vËy trong qu¸ tr×nh lµm ph¶n øng ²t¹o mµu², ph¶i chó ý tíi ®iÒu kiÖn ph¶n øng vµ c¸c thµnh phÇn tham gia ph¶n øng. 1.4.1.4. Mét sè ®¹i l­îng th«ng dông[ a/ §é truyÒn qua (T-Transmittance): §é truyÒn qua (hay cßn gäi lµ ®é thÊu quang) ®Æc tr­ng cho ®é trong suèt (vÒ mÆt quang häc) cña dung dÞch, ®­îc ®Þnh nghÜa: T = = 10-εCl Th­êng T tÝnh ra phÇn tr¨m (%). Mét chÊt cã T=1(hay100%), nghÜa lµ hoµn toµn kh«ng cã hÊp thô ¸nh s¸ng, ng­êi ta nãi chÊt ®ã hoµn toµn trong suèt. b/ §é hÊp thô (A-Absorbance): §é hÊp thô (hay cßn gäi lµ mËt ®é quang) ®­îc ®Þnh nghÜa : A = lg = ε.C.l §èi víi mét chÊt x¸c ®Þnh (cã ε x¸c ®Þnh), th­êng ®o trªn mét lo¹i cèc ®o (cã bÒ dµy th«ng th­êng lµ l=1 cm), nh­ vËy ®é hÊp thô tû lÖ thuËn víi nång ®é dung dÞch: A=K.C (K=ε.l) c/ HÖ sè h©p thô phÇn tr¨m (): Theo c«ng thøc A =ε.C.l, nÕu l=1 cm, C=1% th× : A = ε = VËy chÝnh lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1%, dïng cèc ®o cã bÒ dµy 1cm. Víi mét chÊt tan x¸c ®Þnh, t¹i mét λ x¸c ®Þnh, lµ mét h»ng sè. d/ HÖ sè hÊp thô ph©n tö (εμ): HÖ sè hÊp thô ph©n tö, hay cßn gäi lµ hÖ sè t¾t mol lµ ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é 1M/l, dïng cèc ®o cã bÒ dµy1cm. Còng nh­ , víi mét chÊt x¸c ®Þnh, trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®o x¸c ®Þnh (λ, dung m«i, nhiÖt ®é,...) εμ lµ mét h»ng sè. Gi÷a vµ εμ cã mèi liªn hÖ εμ = M ë ®©y M lµ ph©n tö gam cña chÊt tan. 1.4.2. Mét sè kü thuËt ®Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p quang phæ UV-VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Ph­¬ng ph¸p ®o phæ trùc tiÕp: §o ®é hÊp thô cña dung dÞch, tÝnh nång ®é C cña dung dÞch dùa vµo gi¸ trÞ biÕt tr­íc (tra cøu). A = .C.l → C = (víi l =1 cm) Trong ph­¬ng ph¸p nµy, ph¶i chó ý kiÓm tra m¸y ®o vÒ b­íc sãng (λ) vµ mËt ®é quang A b»ng c¸ch: Dïng ®Ìn thuû ng©n, ®Ìn D2 (cho mét v¹ch s¸ng cã b­íc sãng x¸c ®Þnh). Dïng mét mÉu chuÈn, ®o vµ ®iÒu chØnh ®Ó t×m sai sè. Dïng mét kÝnh läc Holmium (cã c¸c gi¸ trÞ λmax x¸c ®Þnh cho trong tµi liÖu )®Ó kiÓm tra l¹i m¸y. Dïng dung dÞch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiÕt quang phæ pha thµnh dung dÞch cã nång ®é chÝnh x¸c. §o phæ t×m c¸c gi¸ trÞ λmax vµ t×m Amax . 1.4.2.2. Ph­¬ng ph¸p so s¸nh §o ®é hÊp thô Ax, Ac cña dung dÞch thö cã nång ®é Cx (ch­a biÕt) vµ cña dung dÞch chuÈn cã nång ®é Ac (®· biÕt). Ta cã: = → Cx = x Cc Chó ý: nång ®é cña dung dÞch thö Cx vµ cña dung dÞch chuÈn Cc kh«ng ®­îc chªnh lÖch nhau qu¸ nhiÒu. Nång ®é dung dÞch nµy cµng gÇn nhau, kÕt qu¶ cµng chÝnh x¸c. Ngoµi ra cßn cã c¸c kü thuËt ®Þnh l­îng kh¸c nh­: ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn, ph­¬ng ph¸p thªm ®­êng chuÈn, ph­¬ng ph¸p chuÈn ®é ®o quang, ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng hçn hîp theo nguyªn t¾c céng phæ . PhÇn 2: thùc nghiÖm vµ kÕt qu¶ 2.1. Nguyªn vËt liÖu vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1.1. Nguyªn liÖu, ho¸ chÊt, thuèc thö: 2.1.1.1. §èi t­îng nghiªn cøu: . Berberin clorid: ChÊt chuÈn hµm l­îng 83,3% do ViÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp . Berberin clorid d¹ng nguyªn liÖu do bé m«n Ho¸ D­îc cung cÊp . Palmatin: do viÖn kiÓm nghiÖm thuèc TW cung cÊp 2.1.1.2. Ho¸ chÊt, thuèc thö: . Muèi potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dïng cho HPLC (Merk) . N­íc cÊt 2 lÇn (cÊt trùc tiÕp t¹i Bé m«n Hãa v« c¬ tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi) dïng cho m¸y HPLC . Mét vµi hãa chÊt kh¸c 2.1.1.3. ThiÕt bÞ: + M¸y s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + C©n ph©n tÝch AY 220 , Max = 220 g, ®é chÝnh x¸c 0,1 mg + M¸y ®o pH JENWAY cña Anh + M¸y cÊt n­íc 2 lÇn + M¸y l¾c siªu ©m EBRO ARMATUREN cña §øc + M¸y läc hót ch©n kh«ng Satorius + B×nh ®Þnh møc c¸c lo¹i: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ... + Cèc cã má: c¸c lo¹i 100; 200; 500 + Pipet chÝnh x¸c, pipet th­êng, ®òa thñy tinh. + B¬m tiªm, lä ®ùng mÉu, mµng läc 0,45 mm... 2.1.2. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu: 2.1.2.1. ChØ tiªu nghiªn cøu: . Ph©n tÝch mÉu thö b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC vµ ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV- VIS . §¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c, tÝnh ®óng, tÝnh tuyÕn tÝnh, tÝnh ®Æc hiÖu cña hai ph­¬ng ph¸p trªn . So s¸nh 2 ph­¬ng ph¸p trªn 2.1.2.2. Ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh c¸c chØ tiªu nghiªn cøu: Nghiªn cøu trªn lý thuyÕt vµ tµi liÖu tham kh¶o ®Ó lùa chän ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch B»ng thùc nghiÖm, dùa vµo kÕt qu¶ thu ®­îc, xö lý thèng kª vµ rót ra kÕt luËn Ph­¬ng ph¸p sö dông trong thùc nghiÖm: HPLC, §o quang phæ hÊp thô UV-VIS 2.1.2.3.Ph­¬ng ph¸p xö lý sè liÖu thèng kª: . D÷ liÖu thu ®­îc ®­îc xö lý b»ng ph­¬ng ph¸p thèng kª - sö dông c«ng cô hç trî lµ phÇn mÒm Microsoft Excel . Mét sè ®Æc tr­ng thèng kª ®­îc sö dông: - Gi¸ trÞ trung b×nh: - §é lÖch chuÈn: - §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi (RSD): RSD% = 100 - Sai sè chuÈn : - Sai sè t­¬ng ®èi: - Kho¶ng tin cËy: = ± taSx Trong ®ã : xi lµ kÕt qu¶ x¸c ®Þnh lÇn thø i ; n lµ sè lÇn x¸c ®Þnh + Tiªu chuÈn Fischer ®Ó ®¸nh gi¸ ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña 2 ph­¬ng ph¸p thÝ nghiÖm kh¸c nhau : Ftn = ; trong ®ã S1 > S2 Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª Ftn>Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª Ftn<Flt : ®é chÝnh x¸c hay ®é lÆp l¹i cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª Flt tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n – 1 + Test T ®Ó so s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau : T = () víi = T < : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª T > : gi¸ trÞ trung b×nh kÕt qu¶ ®Þnh l­îng cña hai ph­¬ng ph¸p kh¸c nhau cã ý nghÜa thèng kª tra b¶ng ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K = n1+n2-2 2.2. KÕt qu¶ thùc nghiÖm : 2.2.1. §Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III * Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn. C¸ch tiÕn hµnh : + Dung dÞch thö : C©n 0,200 g chÕ phÈm vµ hoµ tan trong 200 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy pha lo·ng víi n­íc ®Õn 100 ml (C = 20g/ml) + Dung dÞch chuÈn ®­îc pha t­¬ng tù dung dÞch thö , dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid + §o ®é hÊp thô cña dung dÞch thö vµ dung dÞch chuÈn trong cïng ®iÒu kiÖn t¹i b­íc sãng cùc ®¹i 421 nm víi mÉu tr¾ng lµ n­íc cÊt, cèc ®o dµy 1 cm. * C¸ch tÝnh kÕt qu¶ : Theo ph­¬ng ph¸p so s¸nh, hµm l­îng phÇn tr¨m ®­îc tÝnh theo c«ng thøc : C% = C Trong ®ã : C% : Hµm l­îng % Berberin clorid cã trong mÉu thö. C : Hµm l­îng % Berberin clorid cã trong mÉu chuÈn At : §é hÊp thô cña dung dÞch thö. Ac : §é hÊp thô cña dung dÞch chuÈn. mt : Khèi l­îng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu ®· c©n ®Ó pha dung dÞch thö. mc : Khèi l­îng tÝnh b»ng gam cña Berberin clorid chuÈn ®· c©n ®Ó pha dung dÞch chuÈn. TiÕn hµnh ®Þnh l­îng 5 mÉu. KÕt qu¶ ghi trong b¶ng 1 . B¶ng1 : KÕt qu¶ ®Þnh l­îng Beberin clorid trong nguyªn liÖu STT Khèi l­îng c©n(g) §é hÊp thô(A) C% 1 0,1971 0,269 86,50 2 0,2010 0,272 85,76 3 0,2062 0,280 86,06 4 0,2090 0,285 86,42 5 0,2030 0,277 86,48 ChuÈn 0,2001 0,263 83,30 Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 1, ta cã: Gi¸ trÞ trung b×nh: = 86,24% §é lÖch chuÈn : S = 0,324 Kho¶ng tin cËy cña gi¸ trÞ trung b×nh (ë møc tin cËy 95%): ∆X(%) = 0,40 §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi: RSD = 0,37% KÕt luËn: Hµm l­îng Beberin clorid trong bét nguyªn liÖu lµ 86,24%0,40%. 2.2.2. §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III 2.2.2.1./TÝnh chÝnh x¸c : Nguyªn t¾c: §é chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p ®­îc ®¸nh gi¸ b»ng ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c phÐp thö song song. C¸ch tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy nh­ trong phÇn 2.2.1.1 KÕt qu¶ thö ®é chÝnh x¸c cña ph­¬ng ph¸p cho thÊy ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c kÕt qu¶ (RSD = 0,37% < 2%). Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p lµ chÝnh x¸c 2.2.2.2 TÝnh tuyÕn tÝnh: TiÕn hµnh kh¶o s¸t sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é vµ ®é hÊp thô trªn chÊt chuÈn Berberin. C©n 5 mÉu chÊt chuÈn Berberin clorid cã khèi l­îng tõ 0,1600g→ 0,2400g ( t¹i c¸c ®iÓm 80%,90%,100%,110%,120% nång ®é dïng khi ®Þnh l­îng) C¸ch tiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.1 B¶ng 2: Sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo nång ®é dung dÞch STT 1 2 3 4 5 C (mg/ml) 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240 A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 H×nh 6 .§å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc cña mËt ®é quang vµo nång ®é dung dÞch - Ph­¬ng tr×nh håi quy biÓu thÞ mèi t­¬ng quan gi÷a mËt ®é quang vµ nång ®é dung dÞch lµ: y = 12,5 x + 0,013; - HÖ sè t­¬ng quan: 0,998 - §é lÖch chuÈn cña y_ intercept: Sb = 0,009 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042 Tõ kÕt qu¶ trªn cho thÊy hÖ sè t­¬ng quan cña ®­êng håi quy v­ît qu¸ 0,99…TÊt c¶ c¸c gi¸ trÞ n»m trªn ®­êng håi quy hoÆc ph©n bè ®ång ®Òu c¶ hai phÝa cña ®­êng håi quy. Kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. VËy ph­¬ng ph¸p lµ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng nång ®é tõ 80% ®Õn 120% nång ®é lµm viÖc. 2.2.2.3. §é ®óng: . C©n 3 mÉu chÊt ®èi chiÕu Beberin clorid ( hµm l­îng 83,3%) víi khèi l­îng tõ 0,1600g → 0,2400g (t¹i c¸c ®iÓm 80, 100, 120% so víi l­îng c©n dïng khi ®Þnh l­îng) . TiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.1. Mçi mÉu ®o 3 lÇn, lÊy kÕt qu¶ trung b×nh . TÝnh to¸n kÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng dùa vµo ®é hÊp thô cña mÉu chuÈn lµ 0,263 øng víi khèi l­îng c©n 0,2001g KÕt qu¶ thu ®­îc ghi ë b¶ng 3 B¶ng 3: KÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é ®óng cña ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS STT Khèi l­îng c©n (g) L­îng ho¹t chÊt cã thùc a (g) §é hÊp thô trung b×nh (A) L­îng t×m l¹i trung b×nh b (g) PhÇn tr¨m t×m l¹i (b/a.100%) 1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88 2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77 3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86 Tõ kÕt qu¶ b¶ng 3 ta cã: - Trung b×nh % t×m l¹i: 100,17% - Ph­¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt ban ®Çu vµ l­îng ho¹t chÊt t×m l¹i lµ: y = 1,052x – 0,008 - HÖ sè t­¬ng quan: r = 0,999 - §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,003 - §é lÖch chuÈn cña ®é dèc: Sa = 0,019 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã: Kho¶ng tin cËy cña ®é dèc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112 Kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009 hay - 0,017 < y_intercept < 0,001 H×nh 7: §å thÞ biÓu diÔn ph­¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt t×m l¹i vµ l­îng ho¹t chÊt cã thùc KÕt luËn: - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng h»ng ®Þnh v× kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng tû lÖ v× kho¶ng tin cËy ®é dèc chøa 1. - Gi¸ trÞ trung b×nh cña tû lÖ thu l¹i lµ 100,17% nghÜa lµ n»m trong kho¶ng tõ 98% ®Õn 102%. Nh­ vËy, ph­¬ng ph¸p ®­a ra lµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t. 2.2.2.4. TÝnh ®Æc hiÖu: Nh­ trong phÇn 1.1.2 ®· tr×nh bµy, c¸c t¹p chÊt cÇn x¸c ®Þnh trong Berberin nguyªn liÖu lµ Palmatin vµ Jatrorrhizin. Nh­ng trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt chuÈn Jatrorrhizin, chóng t«i chØ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt Palmatin ®èi víi ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng TiÕn hµnh: + C©n 0,200 g chÊt chuÈn berberin clorid vµ hßa tan trong 200 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 1000 ml, thu ®­îc dunhg dÞch berberin chuÈn 0,2 mg/ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo 4 b×nh ®Þnh møc 100 ml. + Pha dung dÞch Palmatin 10%, 5% vµ 2,5% so víi nång ®é cña berberin clorid ®em ®o . C©n 0,02 g Palmatin chuÈn vµ hßa tan trong 20 ml n­íc b»ng c¸ch ®un nãng. Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc ®Õn 100 ml. LÊy 10 ml dung dÞch nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ®­îc dung dÞch palmatin chuÈn 0,02 mg/ml . LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ta ®­îc dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml. . LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch, ®­îc dugn dÞch palmatin 0,005 mg/ml. . LÇn l­ît thªm 10 ml dung dÞch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vµo 3 b×nh ®Þnh møc 100 ml ®· chøa berberin clorid chuÈn trªn vµ thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch. Mét b×nh ®Þnh møc 100 ml kh«ng thªm palmatin vµ thªm n­íc tíi v¹ch. §em ®o ®é hÊp thô quang cña dung dÞch 4 b×nh nµy t¹i b­íc sãng 421 nm B¶ng 4: KÕt qu¶ thu ®­îc vÒ sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt palmatin tíi ®é hÊp thô quang cña berberin clorid B×nh 1 B×nh 2 B×nh 3 B×nh 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml) 10 10 10 10 Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10 §é hÊp thô A 0,263 0,282 0,271 0.266 NhËn xÐt: Tõ kÕt qu¶ b¶ng trªn, ta thÊy ®é hÊp thô quang cña dung dÞch t¨ng theo sù t¨ng cña nång ®é dung dÞch palmatin. Khi thªm 2,5% palmatin, hµm l­îng berberin trong bét nguyªn liÖu ®Þnh l­îng theo ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS cña D§VN III t¨ng 1,14%. NÕu cã 2% palmatin nh­ trong giíi h¹n vÒ palmatin mµ D§VN III yªu cÇu th× kÕt qu¶ ®Þnh l­îng t¨ng 0,91% VËy ph­¬ng ph¸p kh«ng cã tÝnh ®Æc hiÖu. 2.2.3. §Þnh l­îng berberin clorid nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005): §iÒu kiÖn s¾c ký ®Ó ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu - Cét s¾c ký: h¹t nhåi silicagel ®­îc octadecylsilan hãa - Detector UV: 263 nm - Pha ®éng: ®Öm phosphate [ hçn hîp KH2PO4 0,05M vµ heptan Na sulfonate(1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iÒu chØnh pH=3,0 b»ng H3PO4] – acetonitril (60:40). - NhiÖt ®é cét: nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm - ThÓ tÝch tiªm: 20μl - Tèc ®é dßng: 1,5 ml/phót * TiÕn hµnh: + Dung dÞch thö: C©n 0,04 g berberin clorid hßa tan trong n­íc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml.Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc tíi v¹ch. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 2 ml dÞch läc trªn cho vµo b×nh ®Þnh møc 25 ml , thªm n­íc tíi v¹ch. + Dung dÞch chuÈn : pha t­¬ng tù dung dÞch thö, dïng chÊt ®èi chiÕu berberin clorid + Tiªm lÇn l­ît 10 μl dung dÞch chuÈn vµ c¸c dung dÞch thö vµo hÖ thèng s¾c ký, ch¹y s¾c ký theo c¸c ®iÒu kiÖn ®· lùa chän. Dùa vµo diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic trªn s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn vµ dung dÞch thö, nång ®é cña dung dÞch chuÈn, tÝnh hµm l­îng (%) Berberin clorid cã trong mÉu thö theo c«ng thøc sau: HL% = Trong ®ã: : DiÖn tÝch pic mÉu thö : DiÖn tÝch pic mÉu chuÈn (= 12,2646) : Khèi l­îng c©n mÉu chuÈn (0,0405 g) : Khèi l­îng c©n mÉu thö 83,30: Hµm l­îng thùc cña mÉu chuÈn B¶ng 5: KÕt qu¶ ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu STT Khèi l­îng c©n (g) DiÖn tÝch pic (mAU.min) Hµm l­îng (%) 1 0,0407 12,6917 85,78 2 0,0402 12,6120 86,30 3 0,0398 12,4224 85,86 4 0,0405 12,7101 86,32 5 0,0400 12,5350 86,20 ChuÈn 0,0405 12,2646 83.30 Theo kÕt qu¶ ë b¶ng 5, ta cã: - Gi¸ trÞ trung b×nh: = 86,09 % - §é lÖch chuÈn: S = 0,254 - Kho¶ng tin cËy cña gi¸ trÞ trung b×nh (ë møc tin cËy 95%): X (%) = 86,09% 0,315% - §é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi: RSD (%) = 0,295 VËy theo ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng trªn, hµm l­îng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu lµ: 86,09% 0,315% 2.2.4. §¸nh gi¸ ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng berberin clorid nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005): 2.2.4.1. TÝnh chÝnh x¸c: C¸ch tiÕn hµnh vµ kÕt qu¶ ®­îc tr×nh bµy nh­ trong phÇn 2.2.3 KÕt qu¶ thö ®é chÝnh x¸c cho thÊy ®é lÖch chuÈn cña c¸c kÕt qu¶ RSD =0,295 % < 2%. VËy ph­¬ng ph¸p lµ chÝnh x¸c. 2.2.4.2. TÝnh tuyÕn tÝnh: TiÕn hµnh kh¶o s¸t sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a nång ®é vµ diÖn tÝch pic trªn chÊt chuÈn Berberin. C©n 5 mÉu chÊt chuÈn Berberin clorid cã khèi l­îng tõ 0,1600g→ 0,2400g ( t¹i c¸c ®iÓm 80%,90%,100%,110%,120% nång ®é dïng khi ®Þnh l­îng) TiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.3 KÕt qu¶ thu ®­îc ë b¶ng 6 B¶ng 6: Sù phô thuéc cña diÖn tÝch pic vµo nång ®é dung dÞch STT 1 2 3 4 5 C (μg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48 DiÖn tÝch pic (mAU.min) 9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069 H×nh 10: §å thÞ biÔu diÔn sù phô thuéc gi÷a diÖn tÝch pic vµo nång ®é cña dung dÞch - Ph­¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a diÖn tÝch pic vµ nång ®é dung dÞch lµ:y = 0,377x + 0,002 - HÖ sè t­¬ng quan: R = 0,9999 - §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,003 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cña y_intercept: b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept <0,011 NhËn xÐt: HÖ sè t­¬ng quan cña ®­êng håi quy v­ît qu¸ 0,99…TÊt c¶ c¸c gi¸ trÞ ®o ®­îc n»m trªn ®­êng håi quy hoÆc ph©n bè ®ång ®Òu c¶ hai phÝa cña ®­êng håi quy. Kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. VËy ph­¬ng ph¸p nµy lµ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng nång ®é tõ 80% ®Õn 120% nång ®é lµm viÖc. 2.2.4.3. TÝnh ®óng: . C©n 3 mÉu chÊt ®èi chiÕu berberin clorid (hµm l­îng 83,3%) víi khèi l­îng tõ 0,032g → 0,048g (t¹i c¸c ®iÓm 80%,100%,120% so víi l­îng c©n dïng khi ®Þnh l­îng). . Mçi mÉu ch¹y s¾c ký 3 lÇn, lÊy gi¸ trÞ trung b×nh. TiÕn hµnh t­¬ng tù 2.2.3 . TÝnh to¸n kÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh ®óng dùa trªn diÖn tÝch pic cña mÉu chuÈn lµ 12,2646 mAU.min øng víi khèi l­îng c©n 0,0405 g. KÐt qu¶ thu ®­îc ghi ë b¶ng 7 B¶ng 7: KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh ®óng cña ph­¬ng ph¸p HPLC STT Khèi l­îng c©n(g) L­îng Beberin clorid cã thùc a (g) DiÖn tÝch pic trung b×nh (mAU.min) L­îng t×m l¹i trung b×nh b (g) PhÇn tr¨m t×m l¹i %=b/a100% 1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75 2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70 3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75 H×nh 11: §å thÞ biÓu diÔn ph­¬ng tr×nh håi quy tuyÕn tÝnh vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt cã thùc vµ l­îng t×m l¹i - Ph­¬ng tr×nh håi quy vÒ mèi t­¬ng quan gi÷a l­îng ho¹t chÊt ban ®Çu vµ l­îng ho¹t chÊt t×m l¹i lµ: y = 0,997x + 0,001 - HÖ sè t­¬ng quan: R = 0,999 - Trung b×nh % t×m l¹i :100,07% - §é lÖch chuÈn cña y_intercept: Sb = 0,001 - §é lÖch chuÈn cña ®é dèc: Sa = 0,013 - Víi ®é tin cËy 95% ta cã: Kho¶ng tin cËy cña ®é dèc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038 Kho¶ng tin cËy cña y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 < y_intercept <0,004 KÕt luËn : - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng h»ng ®Þnh v× kho¶ng tin cËy cña y_intercept chøa 0. - Kh«ng cã sai sè hÖ thèng tû lÖ v× kho¶ng tin cËy cña ®é dèc chøa 1. - Gi¸ trÞ trung b×nh cña tû lÖ thu l¹i lµ 100,07% n»m trong kho¶ng tõ 98% ®Õn 102%. Nh­ vËy ph­¬ng ph¸p lµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t. 2.2.4.4. TÝnh ®Æc hiÖu: Nh­ trong phÇn 1.1.2 ®· tr×nh bµy, c¸c t¹p chÊt cÇn x¸c ®Þnh trong Berberin nguyªn liÖu lµ Palmatin vµ Jatrorrhizin. Nh­ng trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm kh«ng cã chÊt chuÈn Jatrorrhizin, chóng t«i chØ tiÕn hµnh x¸c ®Þnh sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt Palmatin ®èi víi ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng TiÕn hµnh: . C©n 0,04 g berberin clorid chuÈn hßa tan trong n­íc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml.Sau ®ã lµm l¹nh vµ thªm n­íc tíi v¹ch, thu ®­îc dung dÞch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy chÝnh x¸c 2 ml dÞch läc trªn cho vµo 4 b×nh ®Þnh møc 25 ml , thªm n­íc tíi v¹ch. . Pha dung dÞch palmatin chuÈn cã nång ®é 10%; 5%; 2,5% so víi nång ®é berberin clorid ®em ch¹y s¾c ký. + C©n 0,04 g palmatin chuÈn hßa tan trong n­íc nãng, cho vµo b×nh ®Þnh møc 100 ml, thªm n­íc tíi v¹ch. Läc qua mµng läc 0,45 μm, bá 8 ml dÞch läc ®Çu. LÊy 5 ml dÞch läc nµy cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm n­íc tíi v¹ch, thu ®­îc dung dÞch palmatin 0,04mg/ml. + LÊy chÝnh x¸c 25 ml dung dÞch palmatin 0,04 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm n­íc tíi v¹ch., thu ®­îc dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml. + LÊy chÝnh x¸c 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vµo b×nh ®Þnh møc 50 ml, thªm n­íc tíi v¹ch, thu ®­îc dung dÞch palmatin 0,01 mg/ml. . LÇn l­ît thªm 2 ml dung dÞch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vµo 3 b×nh ®Þnh møc 25 ml trªn, thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch. B×nh ®Þnh møc 25ml kh«ng thªm palmatin ®­îc thªm n­íc võa ®ñ tíi v¹ch. . Ch¹y s¾c ký dung dÞch 4 b×nh nµy. KÕt qu¶ thu ®­îc ghi trong b¶ng 8 B¶ng 8: KÕt qu¶ thu ®­îc vÒ sù ¶nh h­ëng cña t¹p chÊt palmatin tíi diÖn tÝch pic cña Berberin clorid B×nh 1 B×nh 2 B×nh 3 B×nh 4 Berberin clorid 0,4 mg/ml 2 2 2 2 Palmatin 0,04 mg/ml 2 Palmatin 0,02 mg/ml 2 Palmatin 0,01 mg/ml 2 DiÖn tÝch pic (mAU.min) 12,2650 12,3011 12,3229 12,2530 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -0.10 1.0 ] UV_VIS_1 mAU min WVL:263 nm H×nh 12: S¾c ký ®å mÉu tr¾ng 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1 -5.0 35.0 BERBERIN CH UV_VIS_1 mAU min 1 - 7.353 WVL:263 nm H×nh 13: S¾c ký ®å mÉu chuÈn H×nh 14: S¾c ký ®å mÉu chuÈn cã thªm Palmatin NhËn xÐt: DiÖn tÝch pic hÇu nh­ kh«ng thay ®æi khi cã mÆt tíi 10% palmatin. VËy ph­¬ng ph¸p cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt cña t¹p chÊt nµy. 2.2.5. So s¸nh hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc 2005 vµ ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo d­îc ®iÓn ViÖt Nam III: 2.2.5.1. So s¸nh kÕt qu¶ ®é chÝnh x¸c cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng: C¸c tÝnh to¸n ®­îc thùc hiÖn trªn c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc khi ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu do bé m«n Hãa D­îc tr­êng §¹i Häc D­îc Hµ Néi cung cÊp. Tãm t¾t kÕt qu¶ thu ®­îc khi ®Þnh l­îng nguyªn liÖu Berberin clorid b»ng hai ph­¬ng ph¸p ë b¶ng 9 B¶ng 9: Tãm t¾t c¸c kÕt qu¶ thùc nghiÖm thu ®­îc khi ®Þnh l­îng nguyªn liÖu Berberin clorid Ph­¬ng ph¸p Hµm l­îng trung b×nh (%) Ph­¬ng sai (S2) §é lªch chuÈn (S) Sè lÇn thÝ nghiÖm HPLC 86,09 0,0645 0,254 5 §o quang UV-VIS 86,24 0,1050 0,324 5 Dïng chuÈn F (Fisher): Ftn = S12/S22 (S1>S2) Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3 S1: ®é lÖch chuÈn cña ph­¬ng ph¸p ®o quang UV-VIS S2: ®é lÖch chuÈn cña ph­¬ng ph¸p HPLC Flt ( ë møc tin cËy 95% khi bËc tù do K1 = 5 - 1 = 4; K2 = 5 - 1 = 4) lµ: 6,39 Nh­ vËy Ftn<Flt do ®ã ®é lÆp l¹i cña 2 ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. 2.2.3.2. So s¸nh kÕt qu¶ gi¸ trÞ trung b×nh cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng : Do ®é lÆp l¹i cña 2 ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª nªn ®Ó so s¸nh kÕt qu¶ gi¸ trÞ trung b×nh cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng, ta dïng Test T. T = víi = T ph©n phèi Student víi n1 + n2 – 2 bËc tù do ë møc tin cËy 95% hay α =0,05, ta cã: =2,306 = = 0,291 Do ®ã Tqs = = 0,815 Nh­ vËy 0,815 < 2,306 nªn víi møc ý nghÜa 0,05 gi¸ trÞ trung b×nh hµm l­îng Berberin trong nguyªn liÖu cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. 2.2.3.2. §¸nh gi¸ ­u nh­îc ®iÓm cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin clorid trong bét nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) vµ b»ng ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III Ph­¬ng ph¸p HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005): + ¦u ®iÓm: . Ph­¬ng ph¸p cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt t¹p chÊt palmatin + Nh­îc ®iÓm: . Yªu cÇu ph¶i cã c¸c hãa chÊt dung m«i tinh khiÕt dïng cho HPLC . Chi phÝ cao khi ph¶i ch¹y pha ®éng cã acetonitril vµ ®Æc biÖt lµ hãa chÊt heptan natri sulfonat rÊt ®¾t tiÒn . Qu¸ tr×nh chuÈn bÞ ch¹y s¾c ký vµ ch¹y ®­êng nÒn tèn thêi gian Ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS theo D§VN III: + ¦u ®iÓm: . Kh«ng tèn hãa chÊt dung m«i . Thêi gian ph©n tÝch nhanh chãng, chØ cÇn 5-10 phót cã thÓ cho biÕt ngay kÕt qu¶ . Kü thuËt thao t¸c ®¬n gi¶n, m¸y mãc dÔ t×m, gän nhÑ + Nh­îc ®iÓm: Ph­¬ng ph¸p kh«ng cã tÝnh ®Æc hiÖu (palmatin ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng) 2.3. Bµn luËn: Ph­¬ng ph¸p HPLC lµ mét ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hiÖn ®¹i, ®ang tõng b­íc ®­îc ®­a vµo phßng kiÓm nghiÖm vµ trung t©m kiÓm nghiÖm ë ViÖt Nam. Ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng Berberin nguyªn liÖu b»ng HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005) cho biÕt hµm l­îng Berberin trong nguyªn liÖu lµ 86,09% ± 0,315%; ph­¬ng ph¸p chÝnh x¸c víi RSD = 0,295% < 2%, tuyÕn tÝnh trong kho¶ng 80%-120% nång ®é ®Þnh l­îng vµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t. ¦u ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ cã tÝnh ®Æc hiÖu khi cã mÆt t¹p chÊt palmatin trong nguyªn liÖu Berberin. Tuy nhiªn ph­¬ng ph¸p nµy l¹i rÊt tèn kÐm khi ph¶i dïng nh÷ng dung m«i vµ hãa chÊt ®¾t tiÒn nh­: natri heptan sulfonat, acetonitril… Hµm l­îng Berberin trong nguyªn liÖu khi ®Þnh l­îng b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS theo d®vn iii lµ 86,24% ± 0,40%; ph­¬ng ph¸p chÝnh x¸c víi RSD = 0,37% < 2%, tuyÕn tÝnh trong kho¶ng 80%-120% nång ®é ®Þnh l­îng vµ ®óng trong kho¶ng kh¶o s¸t nh­ng kh«ng ®Æc hiÖu ( t¹p chÊt palmatin ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng). Tuy nhiªn. D§VN III cã quy ®Þnh giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2% [6]. Theo kÕt qu¶ ë môc 2.2.2.4 th× nÕu palmatin cã mÆt 2%, kÕt qu¶ ®Þnh l­îng t¨ng 0,91%. Nªn víi berberin nguyªn liÖu thâa m·n yªu cÇu vÒ giíi h¹n t¹p chÊt palmatin th× sù cã mÆt cña palmatin kh«ng ¶nh h­ëng lín ®Õn kÕt qu¶ ®Þnh l­îng. Ngoµi ra, khi so s¸nh kÕt qu¶ cña hai ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ta thÊy ®é chÝnh x¸c vµ gi¸ trÞ trung b×nh kh¸c nhau kh«ng cã ý nghÜa thèng kª. Nh­ vËy, nÕu kh«ng yªu cÇu ®é chÝnh x¸c cao, cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô UV-VIS theo D§VN III ®Ó ®Þnh l­îng berberin nguyªn liÖu (®¹t yªu cÇu vÒ giíi h¹n t¹p chÊt palmatin kh«ng qu¸ 2%) v× ph­¬ng ph¸p nµy kh«ng tèn kÐm, tiÕn hµnh nhanh, thao t¸c ®¬n gi¶n, dÔ thùc hiÖn. Víi thµnh phÈm do kh«ng quy ®Þnh hµm l­îng palmatin vµ nh÷ng t¹p kh¸c còng cã thÓ hÊp thô UV nªn ®Ó cã kÕt qu¶ ®Þnh l­îng chÝnh x¸c th× nªn dïng ph­¬ng ph¸p HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc (2005). KÕt luËn * KÕt luËn Trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn khãa luËn tèt nghiÖp, chóng t«i ®· thu ®­îc mét sè kÕt qu¶: + X¸c ®Þnh ®­îc hµm l­îng cña berberin trong nguyªn liÖu b»ng ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS ( theo D§VN III) vµ b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC( theo d­îc ®iÓn Trung Quèc 2005). KÕt qu¶ cho thÊy c¶ hai ph­¬ng ph¸p ®Òu ®¸p øng c¸c chØ tiªu : ®é chÝnh x¸c, ®é ®óng, tÝnh tuyÕn tÝnh. Nh­ng chóng kh¸c nhau vÒ tÝnh ®Æc hiÖu: ph­¬ng ph¸p HPLC víi sù cã mÆt palmatin kh«ng ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng, trong khi ®ã palmatin ¶nh h­ëng tíi kÕt qu¶ ®Þnh l­îng trong ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ UV-VIS + HiÓu ®­îc c¬ së lý thuyÕt cña ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, mét ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch hiÖn ®¹i cã nhiÒu øng dông trong kiÓm nghiÖm thuèc, biÕt sö dông thµnh th¹o c¸c thao t¸c c¬ b¶n cña m¸y HPLC. + Häc ®­îc c¸ch t×m tµi liÖu, lµm thùc nghiÖm vµ tr×nh bµy v¨n b¶n mét c¸ch khoa häc vÒ mét vÊn ®Ò nghiªn cøu; + T×m hiÓu ph­¬ng ph¸p HPLC, lµm quen vµ sö dông thµnh th¹o ®­îc m¸y HPLC ®Ó ®Þnh l­îng mét s¶n phÈm; biÕt c¸ch ®¸nh gi¸ mét ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng. * §Ò xuÊt: Do ®iÒu kiÖn thêi gian vµ hãa chÊt cã h¹n nªn chóng t«i chØ míi tiÕn hµnh ®Þnh l­îng Berberin clorid nguyªn liÖu. Tuy nhiªn tõ kÕt qu¶ thu ®­îc trong khãa luËn, chóng t«i cã nh÷ng ®Ò xuÊt sau: + ¸p dông ph­¬ng ph¸p HPLC theo d­îc ®iÓn Trung Quèc(2005) ®Ó ®Þnh l­îng Berberin clorid trong mét sè chÕ phÈm thuèc nhá m¾t + Nghiªn cøu, kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ®Þnh l­îng berberin b»ng HPLC kh«ng ph¶i dïng Natri heptan sulfonat ®Ó ¸p dông ®Þnh l­îng ë c¸c c¬ së kiÓm nghiÖm trong n­íc. Tµi liÖu tham kh¶o I. TiÕng viÖt 1. Bé m«n D­îc liÖu (1998), Bµi gi¶ng d­îc liÖu, Tr­êng §H D­îc Hµ Néi, tËp 2, tr. 89- 91. 2. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2006), Hãa ph©n tÝch, Tr­êng §H D­îc Hµ Néi, tËp 2, tr. 41- 62. 3. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2002), Hãa ph©n tÝch, Tr­êng §H D­îc Hµ Néi, tËp 1, tr. 27- 44. 4. Bé m«n Hãa Ph©n tÝch (2004), KiÓm nghiÖm thuèc, Tr­êng §H D­îc Hµ Néi, tr. 68- 79,83-98. 5. Bé Y tÕ (1994), D­îc ®iÓn ViÖt Nam II, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tËp 3, tr.71- 74. 6. Bé Y tÕ (2002), D­îc ®iÓn ViÖt Nam III, Nhµ xuÊt b¶n Y häc Hµ Néi, tr.33- 35, 178- 179 phô lôc 3 (PL- 75, 76). 7. NguyÔn Minh §øc (2006), S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao vµ mét sè øng dông vµo nghiªn cøu, kiÓm nghiÖm d­îc phÈm, d­îc liÖu vµ hîp chÊt tù nhiªn, Nhµ xuÊt b¶n y häc thµnh phè Hå ChÝ Minh, tr.138,148-149. 8. Ph¹m Gia HuÖ, TrÇn Tö An (1998), Hãa ph©n tÝch tËp 2, §¹i häc dùîc Hµ Néi, tr.55-98. 9. §ç TÊt Lîi (1999), Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, XuÊt b¶n lÇn thø VIII- Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tr.195. 10. Tõ V¨n M¹c (1995), Ph©n tÝch hãa lý, NXB khoa häc vµ kü thuËt Hµ Néi, tr.313-319. 11. DS. Ph¹m ThiÖp- DS.Vò Ngäc Thóy( t¸i b¶n lÇn thø 13), Thuèc biÖt d­îc vµ c¸ch sö dông, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tr.106. II. TiÕng Anh 12. Martindal 34 (2005), volume II, p.1659. 13. Pharmacopoeia of the people¢s republic of China (2005), volum III, p.94- 96. 14. The Korean Pharmacopoeia, 8th edition (2002), p.81-82. 15. The Japanese Pharmacopoeia fifteenth edition (2006), p.351- 352. 16. Wang, S. D; Song, B.S . (2000), Determination of berberin in decoted liquid from Shensu granules with water by reversed- phase liquid chromatography, Sepu, p. 261- 262. III. Trang web 17. C©y thuèc quý (2007), berberin, www. c©y thuèc quý. Info.vn. 18. Wikipedia (2007), berberin, .

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docSo sánh 2 phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và ….DOC