Thiết lập qui trình Southern blot

phate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thước. Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, tức là dưới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base. Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng. Thực hiện nạp mẫu điện di Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu nucleic acid đã được trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dưới UV. 11 2.6.3 Định lƣợng DNA bằng phân tử Mass Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của phân tử Mass. Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần. Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của mẫu pha loãng với band của Mass. Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng, đồng thời ta có hệ số pha loãng so với mẫu gốc tính được nồng độ của mẫu gốc. Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng) 10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp 7 µg 700 bp 70 ng 700 bp 5 µg 500 bp 50 ng 500 bp 2 µg 200 bp 20 ng 200 bp 1 µg 100 bp 10 ng 100 bp Một số điểm chú ý khi sử dụng phân tử Mass. Mỗi tube phân tử Mass chuẩn chứa thể tích là 250 µl nên có thể được sử dụng cho 100 giếng khi sử dụng thể tích là 2,5 µl / giếng. Nồng độ của dung dịch chuẩn là 100 µg / ml trong đệm TE. Hình 2.1 Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass (Bio- Rad) 2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl loading buffer và TE được bơm vào gel agarose 1,8 %. Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X. Gel được ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg / ml EtBr) trong 15 phút và được giữ trong nước 30 phút. 12 Phân tử Mass chuẩn có thể được giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng nên giữ ở nhiệt độ 4 o C là tốt nhất (ở nhiệt độ này nó có thể được dùng ổn định trong 1 năm). Tuy nhiên, nó có thể được giữ trong thời gian dài trong tủ - 20oC. Phân tử Mass được điện di với gel agarose có nồng độ 1,8 % và gel polyacryamide với nồng độ 8 %. Nồng độ của Mass được xác định dựa vào sự hấp thu bước sóng 260 nm của phân tử Mass, với mức độ sai số là 1 %. 2.7 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME) Tế bào vi khuẩn bị nhiễm thực khuẩn thể (phage) thường bị phage phá huỷ. Có một số chủng vi khuẩn bị nhiễm phage không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị cắt thành từng đoạn nhỏ nhờ một số loại enzyme trong tế bào. Những enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA của phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn (Khuất Hữu Thanh, 2001). Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae. Chủng Rd đặt tên là Hind II. Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme - RE) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết trong phân tử DNA. Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất. 2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn Qui ước quốc tế các enzyme giới hạn kí hiệu như sau: chữ đầu viết chữ in hoa chỉ tên chi hoặc loài vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được tách chiết; hai chữ tiếp theo viết chữ in thường chỉ giống của vi khuẩn; tiếp đến là một chữ viết hoa chỉ chủng vi khuẩn, cuối cùng là chữ số la mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn có enzyme giới hạn được phát hiện. 13 Ví dụ: Chi, loài Giống Chủng Thứ tự dòng Escherichia Coli Ry13 Eco RI E co R I Eco RV E co R V 2.7.2 Các loại enzyme giới hạn Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người ta chia enzyme giới hạn làm ba loại (Khuất Hữu Thanh, 2001). Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide. Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp. Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước. 2.7.3 Các kiểu cắt của enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau). Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44 = 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định. Có theo hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le (Khuất Hữu Thanh, 2001). Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends). Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau. Để nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase, hoặc các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme. 14 Ví dụ: Enzyme SmaI cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp 5’ … CCCGGG … 3’ 3’ … GGGCCC … 5’ 5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’ 3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’ Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn, tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase, nhờ đặc tính này enzyme giới hạn cắt đầu sole được sử dụng nhiều trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Eco RI 5’ … GAATTC … 3’ 5’ … G ~OH + P ~ AATTC … 3’ 3’ … CTTAAG … 5’ 3’ … CTTAA ~ P HO ~ G … 5’ 2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng Thường trong nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như trong một phòng thí nghiệm về sinh học phân tử luôn luôn phải có một bộ enzyme thông dụng. Trong đó, enzyme giới hạn đặc biệt không thể thiếu trong các phân tích về genome như nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể, tạo dòng. Sau đây, liệt kê một số enzyme thường hay sử dụng trong các thí nghiệm về phân tử (bảng 2.3). EcoRI 15 Bảng 2.3 Một số enzyme thƣờng sử dụng và các trình tự đặc hiệu Enzyme Trình tự đặc hiệu Số vị trí cắt Nguồn gốc (tên vi sinh vật) Ở thực khuẩn thể 1 Ở pB 322 Alu I Bam HI Bst I Eco RI Hae I Hind III Hpa I Pst I Sac I Sal I Sau 3A Sma I Taq I AG  CT G  GATCC G  GATCC G  ATTC ( A T ) GG  CC ( A T ) A  AGCTT GTT  AAC CTGCA  G GAGCT  C G  TCGAC  GATC CCC  GGG T  CGA > 50 5 5 5 7 7 13 18 2 2 >50 3 >50 16 1 1 1 7 1 0 1 0 1 22 0 7 Arthrobacter luteus Bacillus Amuloliquefaciens H Bacillus Amyloliquefaciens Escherichia coli RY13 Haemophilus aegyptius Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Providencia Stuartii 164 Streptomyces achromogenes Streptomyces Albus G Staphylococcus aureus 3A Serratia marcescens Sb Thermus aquaticus YTI 2.8 PHƢƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) PCR là kỹ thuật khuếch đại một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985. Phản ứng PCR dựa vào đặc tính của enzyme DNA polymerase. Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau. Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước: - Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mạch đôi được tách thành hai mạch đơn ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA đó. Nhiệt độ để biến tính hoàn toàn DNA thường sử dụng là 94 – 95oC trong 30 – 60 giây. - Giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ này tùy thuộc vào mỗi loại primer được sử dụng. 16 - Giai đoạn tổng hợp kéo dài: Nhiệt độ tăng lên 72oC, nhiệt độ hoạt động tối ưu của Taq DNA polymerase, trong khoảng 30 giây đến nhiều phút tùy theo kích thước cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn. Độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn. Taq DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng PCR là một enzyme chịu nhiệt, không bị mất hoạt tính trong bước biến tính DNA mạch khuôn (Nguyễn Cát Túc, 2003). Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR sẽ được điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát bằng mắt thường dưới tia UV có bước sóng 312 nm hoặc xem qua máy chụp gel bằng phần mềm Quantity One 2000 (Bio - Rad) . 2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích hút / 50 µl phản ứng DNA khuôn 10 pg - 1µg tùy phản ứng 10X PCR buffer 1X 5 µl dNTP mix 2mM 0,2 mM/mỗi loại 5 µl MgCl2 25mM 1 – 4 mM tùy phản ứng Primer 1 0.1 – 1 µM tùy phản ứng Primer 2 0.1 – 1 µM tùy phản ứng Taq DNA polymerase 1,25 UI / 50 µl tùy phản ứng Nước cất vô trùng - tùy phản ứng Công thức tính: Nồng độ đầu x Thể tích cần hút = Nồng độ cuối x Thể tích phản ứng 2.8.2 Sử dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense định cƣ trong đất và trong vùng rễ cây trồng Để phát hiện Pseudomonas spp. định cư trong đất và ở vùng rễ cây trồng bằng phương pháp PCR, trước tiên cần tìm một trình tự đặc hiệu của Pseudomonas spp.. Trình tự này phải hiện diện trên tất cả các Pseudomonas nhưng không có trên tất cả các loài vi sinh vật khác. Từ trình tự này sẽ thiết lập một cặp primer đặc trưng cho Pseudomonas spp. Qui trình phát hiện Pseudomonas spp. sẽ được xây dựng với cặp primer được thiết kế. 17 Trong khoá luận này, hai cặp primer đặc hiệu được sử dụng để phát hiện Pseudomonas fluorescens là phl - 2a, phl - 2b và B2BF, BRR4 được thiết kế dựa trên trình tự của gen phlD có vai trò trong việc tổng hợp chất 2,4 – DAPG (2,4 - Diacetylphloroglucinol). Đây là một chất kháng sinh sinh học, giúp cây trồng kháng với một số nấm bệnh 2.9 PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH DNA Trong dung dịch DNA còn chứa nhiều thành phần khác như protein, RNA. Vì vậy cần thiết phải loại bỏ chúng nhằm thu được lượng DNA thuần nhất. Có nhiều phương pháp tinh sạch DNA. Tùy vào mức độ tạp nhiễm của DNA mà chọn lựa phương pháp thích hợp để tiến hành tinh sạch. 2.9.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng phenol (Sambrook, 1999) 1. Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5ml. 2. Dùng pipet hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1) cho vào eppendorf chứa mẫu DNA. 3. Lắc nhẹ bằng tay 10 giây. Ly tâm 12000 vòng /1phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. 4. Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên trên bằng pipet cho vào eppendorf sạch. 5. Cho isopropanol vào eppendorf chứa DNA, ủ ở nhiệt độ - 20oC trong 20 phút. 6. Ly tâm tốc độ 12000 vòng / 1 phút, loại bỏ isopropanol, thu DNA kết tủa. 7. Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / 1phút trong 20 phút, loại bỏ ethanol, thu lấy DNA kết tủa. 8. Làm khô và hòa tan DNA trong dung dịch TE. Phenol hay phenol / chloroform có thể làm kết tủa protein trong dung dịch. Lượng kết tủa này có thể loại bỏ bằng cách ly tâm, thu nhận dung dịch không có protein. Tuy nhiên có thể thực hiện phản ứng tủa nhiều lần nếu lượng protein quá lớn. Khuyết điểm của phương pháp này là có thể làm đứt gãy DNA, lượng DNA thu lại sau khi tinh sạch khoảng 60% so với lượng DNA ban đầu. 2.9.2 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX (Amersham) Phương pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch DNA từ gel. Lượng DNA thu lại khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là 18 60% so với lượng DNA ban đầu. Đối với sản phẩm PCR những thành phần còn dư như primer hay dNTP có thể được loại bỏ hoàn toàn sau khi tinh sạch. Theo phương pháp này, các giai đoạn của quá trình tinh sạch như sau: - Biến tính protein: “Capture buffer” có tác dụng biến tính protein và tăng cường khả năng liên kết chuỗi DNA với cột GFX - Thu giữ DNA: DNA bám dính trên cột GFX - Rửa: DNA được rửa bằng dung dịch rửa để loại bỏ muối và các thành phần khác - Hòa tan DNA: DNA tinh sạch được hòa tan trong TE. Qui trình tinh sạch từ dung dịch DNA (Amersham) 1. Đặt cột GFX vào một eppendorf 1,5ml. 2. Hút 500 μl dung dịch capture buffer cho vào cột GFX. Sau đó, cho dung dịch DNA cần tinh sạch vào cột GFX chứa capture buffer. 3. Trộn nhẹ hỗn hợp bằng micropipette khoảng 4 – 6 lần. 4. Ly tâm hỗn hợp khoảng 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây, lấy cột ra và đặt vào eppendorf 1,5 ml sạch. 5. Cho 500 μl dung dịch rửa vào cột, sau đó ly tâm 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây. Chuyển cột GFX vào eppendorf sạch. 6. Hút 50 μl elution buffer cho vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. 7. Ly tâm ở tốc độ 10000 vòng / 1 phút trong 1 phút, thu lấy dung dịch DNA. Qui trình tinh sạch DNA từ gel (Amersham) 1. Dùng dao cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml. Sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng gel vừa cắt ở trên. 2. Dùng micropipette hút capture buffer theo mg / v (10 mg gel ≈ 10 µl capture buffer), đậy nắp eppendorf, vortex nhẹ, ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết . 3. Sau khi agarose tan hoàn toàn, ly tâm tốc độ 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf. 4. Hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. 5. Ly tâm 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây, lấy cột ra và đặt vào eppendorf 1,5 ml mới 6. Hút 500 µl wash buffer cho vào cột, ly tâm 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây. 7. Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1,5 ml mới. 19 8. Hút 50 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. 9. Ly tâm tốc độ 10000 vòng / 1 phút trong 1 phút, lấy cột GFX ra, thu lấy dung dịch DNA. 2.10 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN DNA LÊN MÀNG 2.10.1 Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (Upward Capillary Transfer) Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel. Gel này được đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật thể rắn, phẳng (Southern, 1975). Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm (Sambrook và ctv, 2001). Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ gel agarose được sử dụng. Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb thì hầu hết nó được vận chuyển qua gel agarose 0,7 % sau 1 giờ. Đối với những đoạn DNA có kích thước lớn thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có hiệu quả (Wahl và ctv, 1979; Meinkoth và Wahl, 1984). Quá trình chuyển lên màng cần sử dụng các dung dịch sau (Kurt Weismg và ctv, 1995): - Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M - Đệm trung tính: Tris- HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển: SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X Phương pháp tiến hành: Đặt các vật theo thứ tự sau đây từ dưới lên: một tấm kính phẳng được đặt trên dung dịch đệm SSC 6X; tấm giấy lọc làm cầu mao dẫn; gel đã biến tính; màng ; hai tấm Biến tính gel 30 phút bằng dung dịch đệm biến tính Chuyển lên màng Trung tính gel 30 phút bằng dung dịch đệm trung tính 20 giấy lọc; chồng giấy thấm; tấm kính phẳng; vật nặng. Thời gian chuyển lên màng kéo dài qua đêm. Theo Roger (1999), quá trình chuyển lên màng được thực hiện như sau: gel được làm biến tính trong dung dịch đệm alkaline (NaOH 1N) trong 30 phút; sau đó gel được ngâm dung dịch đệm trung tính Tris (Tris buffer). Thực hiện việc chuyển lên màng theo thứ tự sau: một tấm kính phẳng đặt trên dung dịch SSC 10X; giấy wick; gel được làm biến tính; màng nylon; giấy thấm; tấm kính phẳng; vật có trọng lượng. Thời gian chuyển kéo dài 12 giờ. Ngoài ra, theo Sambrook và Russell (2001), quá trình chuyển lên màng gồm các bước sau: Biến tính gel bằng đệm biến tính (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) Ngâm gel trong HCl 0,2 N Trung hòa gel bằng đệm trung tính I (Tris 1M (pH 7,4), NaCl 1,5M) Trung hòa gel bằng đệm trung tính II (Tris-Cl 0,5M (pH 7,2), NaCl 1M) Thực hiện chuyển lên màng bằng đệm chuyển SSC 10X Hình 2.2 Hệ thống mao dẫn hƣớng lên 21 Do yêu cầu hóa chất phòng thí nghiệm và trang thiết bị sử dụng, chúng tôi đã chọn quá trình chuyển lên màng theo Kurt Weismg và ctv (1995). 2.10.2 Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng xuống (Downward Capillary Transfer) Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng. Khi đó, dòng dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở dưới (Koetsier và ctv, 1993). Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi được chuyển bằng hệ thống hướng lên. Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel (Sambrook và ctv, 2001). 2.10.3 Phƣơng pháp mao dẫn hai chiều (Simultaneous Transfer to Two Membranes) Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon (Hình trên). Đệm chuyển là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém. Không dùng phương pháp này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương Hình 2.3 Hệ thống mao dẫn hƣớng xuống 22 pháp này có thể được sử dụng để phân tích plasmid, bacteriophages, hoặc cosmid 235 (Sambrook và ctv, 2001). 2.10.4 Phƣơng pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer) Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện (Sambrook và ctv, 2001). Phương pháp này chỉ thực hiện với màng nylon và gel polyacrylamide (Stellwag và Dahlber, 1980; Church và Gilbert, 1984). Một số thiết bị chuyển bằng điện như Trans-blot SD (Bio – Rad), Mini Trans-blot (Bio – Rad) đã được thương mại hóa trên thị truờng. Hình 2.4 Hệ thống mao dẫn hai chiều 23 2.10.5 Phƣơng pháp chuyển bằng chân không (Vaccum transfer) Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh và hiệu quả hơn (Sambrook và ctv, 2001). Hình 2.5 Hệ thống chuyển bằng điện (Bio- Rad) Hình 2.6 Hệ thống chuyển bằng chân không 24 2.11 ĐÁNH DẤU PROBE Trong sinh học phân tử, khái niệm lai phân tử luôn luôn gắn liền với khái niệm probe. Vậy probe là gì ? Cơ sở của probe chính là đặc tính bắt cặp bổ sung của nucleic acid. Để phát hiện một trình tự xác định, ban đầu ta chỉ cần một bản sao trung thực của trình tự ấy, bản sao này được đánh dấu để dễ nhận biết và được gọi là probe. Qua sự lai của probe với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện, định vị được trình tự ấy trong bất kỳ hỗn hợp nucleic acid nào. Tóm lại, probe có các đặc tính sau đây: - Tính chuyên biệt: probe là một bản sao của một gen nhất định nên chỉ lai với gen đó. - Tính nhạy: probe là một phân tử được đánh dấu nên dễ phát hiện và định lượng. Do các yêu cầu có tính kỹ thuật, người ta không dùng bản sao nguyên vẹn của một gen để tạo probe mà chỉ sử dụng một đoạn nhỏ của gen (Nguyễn Đình Huyên, 1998). 2.11.1 Tác nhân đánh dấu Có hai hệ thống được dùng để đánh dấu probe là : hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ và hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ Phương pháp này rất phổ biến trong phân tích genome với RFLP trong những năm 1980 và các năm đầu của thập niên 1990. Probe nucleic acid có thể được đánh dấu bởi các đồng vị phóng xạ như: 32P, 35S, 125I, 3H, được phát hiện bằng hiện tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller. Probe phóng xạ có thể được dùng trong hầu hết các kiểu thông thường nhưng ngày nay nó ít được phổ biến vì mức độ an toàn của nó. Tuy nhiên, probe phóng xạ có độ nhạy rất cao, thí dụ như probe đánh dấu bằng 32P có thể phát hiện được những bản sao của gen đơn ở hàm lượng là 0,5 µg DNA. Độ nhạy cao thật sự có ý nghĩa trong việc phát hiện sự lai giữa probe và trình tự đích ở nồng độ thấp. * Nguyên tắc chung của hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ Người ta sử dụng một loại phim để phát hiện thể probe được đánh dấu bằng 32P có đặc tính là một nhũ tương, rất nhạy cảm với bức xạ, làm bằng tinh thể helide có bạc (Ag), thí dụ như bromide, chloride, hoặc iodide, chúng được treo trong geletin 25 (Hahn,1983). Geletin này có nhiệm vụ tạo ra một matrix ổn định mà thông qua đó, quá trình hòa tan thành dung dịch có thể được thực hiện. Nhũ tương trong geletin được phủ trên giá phim một cách linh hoạt. Thông thường phim được phủ lớp nhũ kép, trên cả hai mặt. Muốn tạo ra thể hạt helide có bạc, mang tính chất có thể phát triển được trên phim, người ta phải làm thế nào để năng lượng tỏa ra sẽ được những hạt helide này hấp thụ, tạo nên hiệu ứng electron. Một điện tử di động có thể sẽ khử Ag+ thành nguyên tử Ag. Những hiện tượng như vậy cứ lặp đi lặp lại, tạo ra nhiều Ag bị khử. Trong các loại phim nhạy cảm nhất, người ta cần 3 đến 6 nguyên tử Ag để hình thành một trung tâm ổn định, nó có thể được phát hiện khi rửa phim. 2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ Hệ thống đánh dấu các nucleic acid không dùng phóng xạ đã được áp dụng với những probe cho kỹ thuật lai DNA. Hệ thống này có nhiều ưu điểm so với hệ thống sử dụng đồng vị phóng xạ đánh dấu nucleic acid. Phương pháp đánh dấu không dùng phóng xạ làm giảm lượng chất thải khó xử lý, an toàn, thể probe ổn định hơn so với probe được đánh dấu bằng P32. Mức độ nhạy cảm của probe có đánh dấu và không đánh dấu phóng xạ đã được nghiên cứu * Một số chất đánh dấu không phóng xạ Biotin: Cách này được phát hiện với cơ chất là avidin hoặc streptavidin mà nó có sự tương đồng về cấu trúc với biotin. Enzyme: Enzyme tạo sự gắn kết với probe và phát hiện sự hiện diện của nó bằng phản ứng đổi màu. Enzyme dùng trong trường hợp này thường là một nhóm enzyme như alkaline phosphatase và horseradish peroxidase. Chemiluminescence: Ở phương pháp này người ta dùng hóa chất để tạo sự gắn kết với probe và cách thức phát hiện dựa vào ánh sáng phát ra từ luminol. Fluorescence: hóa chất gắn kết với probe và phát sáng dưới ánh sáng UV. Kĩ thuật này có tên gọi là fluorescent in situ hybridazation (FISH). Kháng thể (Antibodies): một nhóm kháng nguyên nối kết với probe và chúng được phát hiện nhờ vào một loại kháng thể đặc hiệu. Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể probe lai có thể sẽ được phát hiện 26 với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống. Horseradish peroxydase và chemiluminescence Trong hệ thống không dùng phóng xạ này, người ta lợi dụng phản ứng hoá học để đánh dấu DNA (Stone và Durant 1991). Horseradish peroxydase (HRP) liên kết đồng hoá trị với polyethyeneimine. Trong phản ứng đánh dấu, dây đơn DNA được trộn với HRP – polyethyleneimine cộng với 1% glutaraldehyde dưới điều kiện nhiệt độ trong phòng. Glutaraldehyde là một hoá chất có tính chất liên kết chéo với hai chức năng, mà sự liên kết chéo (crosslink) đồng hoá trị như vậy sẽ làm cho marker enzym HRP tương tác với DNA probe. Phản ứng liên kết chéo xảy ra trong vòng một giờ. Những phản ứng tiếp sau đó của probe DNA được đánh dấu bởi HRP xảy ra trong điều kiện HRP ở dạng hoạt động. Người ta dùng urea (6M) để hạ thấp nhiệt độ Tm sao cho nhiệt độ của phản ứng lai DNA là 42oC. Cả hai cơ chất chromogenic và chemiluminogenic đối với HRP cũng được sử dụng. HRP còn làm nhiệm vụ xúc tác trong phản ứng oxid hóa luminol, một cơ chất chemiluminogenic đối với HRP. Luminol ở dạng oxid hóa rơi vào trạng thái kích hoạt làm phát sáng ở độ dài sóng 428 nm. Phản ứng chemiluminescence với luminol và các enhancer tương ứng sẽ đạt được một kết quả tối đa trong một thời gian rất ngắn, khoảng 1 – 5 phút. Việc phát sinh ra ánh sáng như vậy sẽ bị mất đi trong vòng ba giờ. Hình 2.7 Phản ứng khởi động của chemiluminescence 27 Hệ thống digoxigenin Hệ thống digoxigenin-antidigoxigenin hoạt động trên cơ sở sử dụng digoxigenin (DIG), một cardenolide steroid được phân lập từ cây Digistalis (Martin và ctv, 1990). Một dạng đồng phân của nucleotide triphosphate được gài vào phân tử DNA nhờ phản ứng giải mã có thuật ngữ “nick translation”, hoặc nhờ đánh dấu primer ngẫu nhiên. Thể probe được đánh dấu DIG này, có thể được phát hiện nhờ một xét nghiệm tính miễn dịch có liên kết với một enzyme, sử dụng trong kháng thể đối với digoxigenin (anti - DIG). Một cơ chất có tính chất chromogenic hay chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase có thể được sử dụng để phát hiện thể probe có đánh dấu DIG. Hệ thống biotin – streptavidin Sự tương tác giữa biotin và avidin được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực miễn dịch học. Avidin là một glycoprotein cơ bản có độ lớn 68.000 Da, được phân lập trong tròng trắng trứng gà. Avidin kết dính với biotin rất chặt, không đồng hóa trị. Mỗi phân tử avidin gắn với bốn phân tử biotin. Phản ứng kết gắn avidin – biotin tạo ra một vật chất có khối lượng lớn, bởi vì điểm đẳng điện của avidin mạnh hơn tương tác có tính tĩnh điện, và carbohydrate của avidin có xu hướng gắn với lectin như những protein. Vấn đề đặt ra cho vật chất có khối lượng lớn này là khi sử dụng hệ thống biotin – streptavidin, nó có thể bị mất. Streptavidin là một protein bên ngoài tế bào, của vi sinh vật Streptomyces avidinii, rất giống với avidin. Streptavidin có trọng lượng phân tử là 60.000 Da, với bốn tiểu đơn vị (subunit) đồng nhất, mỗi tiểu đơn vị đều có thể gắn với một phân tử biotin. Streptavidin, giống như avidin, có tính chất kết gắn với biotin rất mạnh mẽ, nhưng không phát sinh ra vấn đề do vật chất có khối lượng lớn như avidin. Một biotin chứa một đồng phân nucleotide, được gắn vào DNA nhờ hiện tượng giải mã kiểu “nick” (Mackey và Rashtchian, 1992). Sau khi lai, DNA có biotin đánh dấu sẽ được phát hiện nhờ hiện tượng kết gắn chuyên tính của streptavidin. Nhờ đó nó được nối với alkaline phosphatase. Cơ chất chromogenic và chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase được sử dụng cho kết quả này (Klevan và Gebaeyehu, 1990). 28 Hình 2.8 Cấu trúc của biotin và hai thể đồng phân của biotin nucleotide, biotin- 7- dATP và biotin- 14- dATP Hình 2.9 Cấu trúc của digoxigenin- 11- dUTP Thể đồng phân của nucleotide này được gắn vào DNA nhờ giải mã kiểu “nick” hoặc bằng cách đánh dấu oligo 29 2.11.2 Phƣơng pháp đánh dấu 2.11.2.1 Phƣơng pháp nick – translation Nguyên tắc của phương pháp này như sau: DNAse I sẽ cắt phân tử DNA ở nhiều vị trí tạo những lỗ thủng phân bố một cách ngẩu nhiên trên cả hai mạch. Từ những lỗ thủng này, DNA polymerase I một mặt “gặm” dần mạch bị cắt theo chiều 5’ – 3’ (nhờ hoạt tính của enzyme exonuclease 5’ – 3’), mặt khác tổng hợp bù đoạn bị thiếu (nhờ hoạt tính polymerase). Do trong phản ứng có sự hiện diện của một loại nucleotide đánh dấu (thường là dATP) nên đoạn tổng hợp mới sẽ mang nhiều nucleotide đánh dấu. Kết quả cuối cùng DNA được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử (Kurt Weising và ctv, 1995; Hame và ctv, 1995; Lê Đình Lương, 2001). Hình 2.10 Đánh dấu probe bằng phƣơng pháp nick translation (a) Dùng DNAse I tạo một điểm cắt trên sợi đơn trong bộ khung phosphodiester của đoạn DNA. (b) Sau đó DNA polymerase I tổng hợp một bản sao của sợi khuôn khi phân hủy sợi không làm khuôn bằng hoạt tính 5’- 3’ exonuclease của nó. Nếu [α32P] dNTP được cung cấp thì nó sẽ gắn vào sợi mới tổng hợp. 30 2.11.2.2 Phƣơng pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên) Đầu tiên, mẫu dò được biến tính bằng nhiệt rồi làm lạnh đột ngột. Người ta thêm vào phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp (thường là hexa hoặc octanucleotide). Các hexanucleotide này tương ứng với tất cả các trình tự tổ hợp có thể có trên lý thuyết. Như vậy, chắc chắn một vài hexanucleotide trong số đó sẽ bắt cặp được với hai mạch đơn của mẫu dò. Lúc đó, chúng trở thành primer cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung. Vì một trong bốn loại nucleotide thêm vào phản ứng được đánh dấu nên mạch mới tổng hợp cũng sẽ được đánh dấu. DNA polymerase thường sử dụng là đoạn Klenow của DNA polymerase I hoặc T7 DNA polymerase (Kurt Weising và ctv, 1995; Hame và ctv, 1995; Lê Đình Lương, 2001). (hình 2.11). Hình 2.11 Đánh dấu DNA bằng phƣơng pháp random priming (a) DNA được biến tính để cho các phân tử sợi đơn. (b) Sau đó, một đoạn mồi oligonucleotide được bổ sung để tạo ra một đoạn sợi kép ngắn với nhóm 3’- OH tự do. (c) Sau đó đoạn Klenow của DNA polymerase I có thể tổng hợp một bản sao của sợi khuôn từ đoạn mồi, khi nó đính các [α32P] để tạo ra một phân tử đánh dấu. 31 Bảng 2.5 Phƣơng pháp đánh dấu không phóng xạ và hệ thống phát hiện dùng cho oligonucleotide. , = kháng thể chuyên biệt cho DIG hoặc fluorescein SA = Streptavidin AP = Alkaline phosphatase HRP = Horseradish peroxidase Phƣơng thức đánh dấu Cơ chất đánh dấu Phƣơng thức phát hiện Cơ chất phát hiện Hãng sản xuất A.Đánh dấu bằng enzyme Đuôi 3’ Thêm 3’ nucleotde B. Đánh dấu bằng hóa học Đánh dấu 5’ Sự liên kết với allylamin Tổng hợp hóa học Tạo sự liên kết chéo giữa marker và enzyme Tạo probe thứ cấp bổ sung ở những vị trí thuộc primer DIG-[11]-dUTP/dATP Fluor- [11]-dUTP Bio-[14]-dCTP DIG-[11]-ddUTP Fluor-[12]- ddUTP Biotin-[16]-ddURP Aminolinker/DIG-HNS AP 5’- thiol/HRP Allylamin-base/DIG-NHS Fluor-A;G;C;U- phosphoramidites Bio-A;G;C;U- Phosphoramidites AP AP : AP :HRP SA:AP : AP SA: AP :AP :AP :AP :HRP SA: AP SA: HRP BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes Luminol BCIP, NBT, NBT/AMPPD BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes BCIP, NBT, NBT/AMPPD BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes Quantum YieldTM chemiluminescent substrate Luminol BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes 4CN Plus/ELASTTM BCIP, NBT/CSPDR/LumigenTMPPD/ LumiphosTM530/azo dyes 4CN Plus/ELASTTM Lumigen TM PPD/Lumiphos TM530 AMPPD Boehriger Mannhein Amersham LTI Boehriger Mannhein Boehriger Mannhein Boehriger Mannhein LTI Boehriger Mannhein Promega Amersham Boehriger Mannhein Boehriger Mannhein NEN Boehriger Mannhein NEN Cambridge Research Biochemicals Syngene Bio- Rad 32 2.11.2.3 Phƣơng pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi) Dùng cho hệ thống đánh dấu phóng xạ, trong kỹ thuật này enzyme polynucleotide kinase được sử dụng để chuyển nhóm phosphate nằm ở cuối ATP sang đầu 5’- hydroxyl của các phân tử nucleic acid. Nếu như ATP được đánh dấu phóng xạ, thì nó sẽ sản sinh ra nucleic acid được đánh dấu với hoạt tính đặc hiệu tương đối thấp, bởi vì chỉ có đuôi của mỗi phân tử được đánh dấu phóng xạ (Kurt Weising và ctv, 1995; Hame và ctv, 1995; Lê Đình Lương, 2001). 2.11.2.4 Phƣơng pháp photobiotin Photobiotin có tên khoa học N- (4- azido- 2- nitrophenyl)- N’- (N- d- biotynyl- 3- aminopropyl)- N’- methyl- 1,3- propanediamine. Photobiotin là một đồng phân của biotin mẫn cảm với ánh sáng (hinh 2.12). Gốc có hoạt tính với ánh sáng “aryl azide” được gắn vào biotin thông qua một nhánh đã nạp năng lượng gọi là “linker”. Khi photobiotin phát quang với ánh sáng thấy được rất rõ, sự hiện diện của nucleotide đã được đánh dấu (Bùi Chí Bửu vá Nguyễn Thị Lang, 2000). Phương pháp đánh dấu photobiotin là một phản ứng hóa học, không phải là một phản ứng enzyme. Vật liệu trong đánh dấu photobiotin bền hơn và rẻ hơn so với phản Hình 2.12 Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK) (a) DNA được dephosphoryl hóa bằng phosphatase, để tạo các nhóm 5’- OH. (b) Sau đó đuôi phosphate của [γ32P] được chuyển sang đầu 5’ bằng PNK. Đây là phản ứng trao đổi các đầu phosphate. 33 ứng enzyme. Đây là một phương pháp nên được áp dụng trong trường hợp sử dụng một số lượng lớn thể probe mà không cần phải quá nhạy cảm (Karcher, 1996). Cơ chất chemiluminogenic đối với men alkaline phosphatase Cơ chất chemiluminogenic có tính chất dioxetane đã được dùng trong hệ thống digoxigenin hoặc biotin- streptavidin. Một số chất dẫn xuất của 1,2- dioxetane khá ổn định sẽ truyền sáng khi nó phản ứng với enzyme (Beck và Koster, 1992). Người ta thường sử dụng 1,2- dioxetane có một gốc phosphate phản ứng trực tiếp với enzyme “alkaline phosphatase”. Men này có thể liên kết trực tiếp với phân tử DNA, hay nó đóng vai trò như một probe, hoặc liên kết đồng hóa trị với streptavidin, rồi sau đó gắn với thể probe có đánh dấu biotin. Men alkaline phosphatase có thể liên kết đồng hóa trị với một kháng thể nào đó, mà kháng thể này đối nghịch với hapten, thí dụ như digogenin. Những cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase bao gồm PPD (hình) và CSPD. PPD còn được gọi là AMPPD, nó chính là 4- methoxy-4- (3- phosphatephenyl) spiro [1,2- dioxetane- 3,2- adamantane]. CSPD là disodium 3- (4- methoxy- spiro [1,2- dioxetane- 3,2- (5’- chloro)-tricyclo [3.3.1.1 3,7] decan]- 4- yl) phenyl phosphate (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Sự truyền ánh sáng trong phản ứng này qua hai giai đoạn. Giai đoạn 1: phản ứng “phản phosphoryl hóa” của enzyme. Anion tạo ra ngay sau đó những thể phân hủy, không phát sáng. Trong điều kiện có quá nhiều cơ chất, cường độ sáng sẽ phụ thuộc vào hàm lượng alkaline phosphatase. Phản ứng chemiluminescent sẽ có quang phổ rộng nhờ sự tái tạo nhanh của enzyme. Giai đoạn 2: những thành phần khác trong phản ứng sẽ kích thích cường độ tín hiệu, đặc biệt là sự có mặt của đại phân tử bovine serum albumin (BSA), hoặc sự hình thành “micelles” ngậm nước như cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), nó làm kích thích cường độ tín hiệu, và chuyển dịch độ dài sóng ánh sáng được truyền đi. Độ dài sóng tối đa là 470 nm. Sự hiện diện của micelle hoặc một màng nylon làm cho độ dài sóng tối đa khoảng 460 nm. Các thể enhancer khác có trong phản ứng cũng có thể làm thay đổi độ dài sóng của ánh sáng truyền đi. Sự phân rã của phân tử tương đối chậm, cho nên tín hiệu ánh sáng này kéo dài được nhiều giờ hoặc cả ngày. Điều này cho phép chúng ta có đủ thời gian để chụp hình. 34 Hình 2.13 Cấu trúc của photobiotin acetate Dưới điều kiện ánh sáng, nhóm hoạt tính với ánh sáng sẽ tác động trên nucleic acid để đánh dấu chúng bằng biotin. Hình 2.14 Sự tạo liên kết giữa acid nucleic và tác nhân đánh dấu (biotin) tại vị trí N-7 của purine 35 2.12 CÁC PHƢƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ(Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử 2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm. Hiện tượng này được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn. Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp một phần các base khiến chúng không hấp thu Hình 2.15 Cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase Khi alkali phosphatse đẩy ra ngoài một gốc phosphate từ AMPD(4- methoxy-4- (3- phosphatephenyl) spiro [1,2- dioxetane]), tính ổn định không còn nữa và truyền quang với độ dài sóng 480 nm 36 ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn, khác với ở DNA mạch đơn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA - Ảnh hƣởng thành phần các base trong phân tử DNA Do số lượng các liên kết hydro giữa A với T và G với C không bằng nhau (A-T: 2; G- C: 3) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng do sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỉ lệ các base G, C. Trong điều kiện chuẩn Tm thường được đánh giá bằng công thức sau: Tm = 6,93 + 0,41(% [G + C] ) - Ảnh hƣởng của độ dài đoạn DNA Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: Tm = - 500 / số lượng cặp base Công thức trên cho thấy là ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn. - Ảnh hƣởng của các điểm bắt cặp sai lệch Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của phân tử lai. Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 1 oC cho mỗi phần trăm bắt cặp sai lệch. Nhưng cũng như thành phần các base, các lỗi chỉ có ý nghĩa đối với các đoạn DNA ngắn. - Ảnh hƣởng của môi trƣờng phản ứng Ảnh hưởng của nồng độ muối: Sự giảm lực ion của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh nhiệt độ nóng chảy. Tm sẽ giảm khoảng 15 oC cho mỗi logarithme nồng độ đối với các ion hóa trị 1. Các cation hóa trị 2 còn có tác động mạnh hơn. Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA. Ảnh hưởng của formamide: hóa chất này có ảnh hưởng hạ thấp Tm rất nhiều. Đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể ước lượng theo công thức sau: Tm = -0,6 x (% formamide) Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thông dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 30 o C. 37 2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột; lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization), với hai đặc điểm sau: Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA, hay các phân tử lai DNA-RNA. 2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lai phân tử * Nồng độ DNA và thời gian phản ứng Để sự bắt cặp giữa hai mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Như vậy tần số bắt gặp giữa hai trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp. Ở một nhiệt độ xác định, hai chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng. Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng; kết quả là phản ứng lai phân tử tăng lên. Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp. * Nhiệt độ Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25 %. * Độ dài của các trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bình phương của độ dài các trình tự bổ sung. * Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2 M phản ứng lai hoàn toàn không còn tác dụng. 2.12.2 Các kiểu lai phân tử 2.12.2.1 Lai trong pha lỏng 38 Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Trong thực tế , nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15 oC; hơn nữa, người ta còn thêm formmide để làm giảm nhiệt độ lai. Đối với những trình tự ngắn, nhiệt độ lai được tính theo công thức đã nêu ở phần trên. Đối với các trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42oC. 2.12.2.2 Lai trên pha rắn Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích hay trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn. Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là tạo dễ dàng trong thao tác và trong việc tách các trình tự không lai ra khỏi các phân tử lai. Mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử. Bù lại việc phân tích định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả lai thấp. Thật vậy, vận tốc lai trên pha rắn thấp hơn 10 lần so với vận tốc lai trong pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung. Trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn, nổi bật lên ba phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là: phương pháp Southern blot, Northern blot và dot blot. * Southern blot (Xem mục 2.2) * Northern blot Phương pháp này được sử dụng để xác định kích thước và hàm lượng của một mRNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA. Phương pháp cũng bao gồm các bước sau: - RNA (đã được làm biến tính) sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di trên gel agarose có chứa các chất làm biến tính. Các chất làm biến tính có tác dụng khiến các liên kết yếu qui định cấu trúc bậc hai của RNA không thể hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính. Do đó, không cản trở sự di chuyển cũng như sự phân tách các RNA trong gel. - Sau đó RNA được chuyển lên màng lai. - RNA cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. 39 - Các phân tử lai được phát hiện nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. * Dot blot Phương pháp này cho phép định lượng tương đối một RNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này có thể được sử dụng cho DNA. Trong phương pháp này người ta không chuyển nucleic acid từ gel lên màng mà đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai thành một điểm – dot. Quá trình lai và phát hiện phân tử lai giống như đề cập ở trên. 2.12.2.3 Lai tại chỗ (in situ hybridization) Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Các ứng dụng của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kỹ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phương pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô. Các ứng dụng của lai tại chỗ bao gồm các phương pháp sau: - Lai trên khuẩn lạc - Lai trên nhiễm sắc thể - Lai trên tế bào và mô 40 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 3.1.1 Thời gian Đề tài được tiến hành từ ngày 16 - 02 - 2005 đến ngày 25 - 07 – 2005. 3.1.2 Địa điểm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại Học Nông Lâm Tp. HCM Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1. Tăng sinh các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB. 2. Ly trích genomic DNA. 3. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn. 4. Sử dụng phương pháp PCR khuếch đại trình tự gen phlD trên hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl - 2a, ph l- 2b. 5. Tinh sạch sản phẩm PCR. 6. Tạo probe từ sản phẩm PCR được tinh sạch. 7. Tạo mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn. 8. Thiết lập phản ứng lai và phát hiện kết quả lai. 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1.1 Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn dùng để thiết lập qui trình là 51 dòng Pseudomonas fluorescens đã được phân lập và giữ trong tủ -70oC. 3.3.1.2 Môi trƣờng LB Bacto – tryptone 10 g Bacto – yeast extract 5 g NaCl 10 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml 41 3.3.1.3 Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng - Máy điện di (Bio - Rad) - Máy chụp gel (Bio - Rad) - Máy lắc định ôn - Máy vortex - Bồn nước ổn nhiệt (water bath) - Tủ cấy vô trùng (micro flow) - Tủ - 20oC, - 70oC - Tủ sấy dụng cụ - Nồi hấp (Autoclave - Tomy) - Máy ly tâm (Mikio 22) - Máy đo pH - Cân kỹ thuật - Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl) - Ống nghiệm - Eppendorf 1,5 ml, 200 µl - Đầu tip các loại 3.3.1.4 Hóa chất ly trích genomic DNA TE 1X (pH 8,0) SDS 10 % NaCl 5 M CTAB / NaCl Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Ethanol 70 % 3.3.1.5 Vật liệu cần thiết chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) - Máy PCR (Bio - Rad ) - Hóa chất dùng để chạy PCR (Bio - Rad) 10X PCR buffer iTaq polymerase MgCl 2 dNTP Primer B2BF Primer BRR4 Primer phl – 2a Primer phl - 2b Nước 3.3.1.6 Vật liệu cần thiết để tinh sạch sản phẩm PCR - Agarose tan nhiệt độ thấp - Kit tinh sạch của Amersham 3.3.1.7 Vật liệu cần thiết để chuyển DNA lên màng - Màng Hybond - N - Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M - Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X - Máy cross - linker: GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio - Rad) - Giấy thấm, giấy lọc. 3.3.1.8 Vật liệu cần thiết để tạo probe - Sản phẩm PCR đã được tinh sạch - Reaction buffer - Labelling reagent - Cross – linker working 3.3.1.9 Vật liệu cần thiết để lai - Buồng lai: HB – 1000 Hybridizer - Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham) - Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri phosphate 50 mM (pH 7,0); NaCl 50 mM; MgCl2 1 mM; blocking reagent 0,2% (w/v). - Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris - base 1 M; NaCl 2 M, pH 10,0. 3.3.1.10 Vật liệu cần thiết để phát hiện kết quả lai - Saran Wrap - Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham) - Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp) - Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer) - Cassette 30 x 40 Konica 3.3.1.11 Enzyme giới hạn dùng để cắt genomic DNA tạo mẫu lai Tên enzyme Trình tự nhận biết Mã hàng Nhà sản xuất BamHI G /GATCC Cat. No. 220 612 Roche EcoRV GAT/ATG Cat. No. 667 145 Roche HindIII A/AGCTT Cat. No. 656 313 Roche 42 3.3.2 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Sơ đồ tổng quát các bƣớc thực hiện cho một thử nghiệm Southern blot Tạo mẫu lai - Tăng sinh vi khuẩn - Ly trích genomic DNA - Thực hiện phản ứng cắt - Điện di – chuyển lên màng - Làm khô màng và cross - linker Tạo probe - Thực hiện phản ứng PCR - Tinh sạch sản phẩm PCR - Thực hiện phản ứng đánh dấu Lai - Tiền lai - Lai Rửa - Dung dịch rửa 1 - Dung dịch rửa 2 Phát hiện - Chuẩn bị màng với CDP- Star - Ủ màng và phim trong cassette - Rửa phim Hình 3.1 Qui trình cho một thử nghiệm Southern blot 43