Thử nghiệm điều chế auto - Vaccine phõng bệnh tiêu chảy do e. Coli trên heo sau cai sữa

MỤC LỤC CHưƠNG TRANG Trang bìa 1 i Trang bìa 2 .ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt tiếng Việt . iv Tóm tắt tiếng Anh v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt xii Danh sách các hình xiii Danh sách các bảng . xiv Danh sách các biểu đồ xv Danh sách các sơ đồ xvi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích và yêu cầu . 2 1.2.1. Mục đích . 2 1.2.2. Yêu cầu . 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli . 3 2.1.1. Định nghĩa 3 2.1.2. Đặc tính sinh hóa 4 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên . 4 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O 4 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K . 5 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) . 5 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) 6 2.2. Bệnh tiêu chảy . 6 2.2.1. Khái niệm . 6 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy 7 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi . 7 2.2.2.2. Nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật . 7 2.2.2.3. Vi sinh vật . 8 2.3. Sự miễn dịch 9 2.3.1. Khái niệm miễn dịch 9 2.3.2. Phân loại miễn dịch 9 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu . 9 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu 10 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) 11 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) 11 2.3.3.2. Kháng thể (antibody) . 13 2.4. Auto-vaccine . 16 2.4.1. Định nghĩa vaccine . 16 2.4.2. Phân loại vaccine 16 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) 16 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) . 16 2.4.2.3. Các “toxoid” 17 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dưới đơn vị (subunit) . 17 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu 17 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine 18 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vacine 18 2.4.5. ưu điểm và nhược điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine 18 2.4.5.1. ưu điểm . 18 2.4.5.2. Nhược điểm . 19 2.5. Chất bổ trợ . 19 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ 19 2.5.2. Tác dụng của chat bổ trợ 20 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ được sử dụng trong đề tài này) . 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH . 21 3.1. Thời gian và địa điểm 21 3.1.1. Thời gian 21 3.1.2. Địa điểm . 21 3.2. Vật liệu 21 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu . 21 3.2.2. Vật liệu và thiết bị 21 3.3. Nội dung 22 3.4. Phương pháp tiến hành 22 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu . 22 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật . 23 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập 23 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa 23 3.4.3. Điều chế auto-vaccine 28 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine 30 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine . 30 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm 30 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm 30 3.4.6. Phương pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm . 32 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản 32 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên . 33 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng . 34 3.4.6.4. Đọc kết quả . 34 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 35 3.6 Xử lý số liệu . 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 37 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine . 37 4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 38 4.3. Hiệu giá kháng thể 39 4.3.1. Thí nghiệm 1 39 4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất . 40 4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai . 40 4.3.1.3. Lần rút máu thứ ba 41 4.3.2. Thí nghiệm 2 43 4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất . 43 4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai . 44 4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba 44 4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể . 46 4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy 47 4.4.1. Thí nghiệm 1 47 4.4.2. Thí nghiệm 2 48 4.5. Tăng trọng tuyệt đối 50 4.5.1. Thí nghiệm 1 50 4.5.2. Thí nghiệm 2 51 4.5.3. Tổng kết tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 thí nghiệm 52 4.6. Các chỉ số khác 52 4.7. Kết quả chung . 52 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1. Kết luận . 54 5.2. Đề nghị 54 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 7. PHỤ LỤC . 57 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo . 8 Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con 31 Bảng 4.1. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) 39 Bảng 4.2. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) 43 Bảng 4.3. Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm . 46 Bảng 4.4. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 47 Bảng 4.5. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 48 Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm 49 Bảng 4.7. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN1) . 50 Bảng 4.8. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN2) . 51 Bảng 4.9. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 TN . 52

pdf81 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 25/01/2013 | Lượt xem: 2467 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Thử nghiệm điều chế auto - Vaccine phõng bệnh tiêu chảy do e. Coli trên heo sau cai sữa, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO CON SAU CAI SỮA Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Đề tài nghiên cứu này tuy Con làm còn nhiều thiếu sót và chƣa tốt nhƣng Con cũng xin dành tặng ba mẹ. Đây là kết quả mà 22 năm ba mẹ làm lụng để nuôi dạy con. Con hy vọng món quà bé nhỏ này sẽ làm vui và vơi bớt phần nào nỗi khổ cực, lo âu của ba mẹ. Con trai của ba mẹ yêu ba mẹ nhiều lắm. Em xin chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Và ngƣời có ảnh hƣởng rất lớn đến sự hoàn thành đề tài này là thầy Hải (TS. Nguyễn Ngọc Hải). Em cám ơn thầy rất nhiều về những gì mà thầy đã dành cho em. Em đến với thầy trong một hoàn cảnh rất khác với các bạn, nhƣng với sự quan tâm hƣớng dẫn ân cần của thầy đã giúp em có nhiều nghị lực và niềm vui mà vƣợt qua các giai đoạn khó khăn. Khi làm việc với thầy, em không chỉ học hỏi đƣợc ở thầy kiến thức, kỹ năng mà em còn thấy ở thầy nhiều đức tính cao đẹp để em học tập. Thầy có lối sống thật đơn giản, nhƣng thầy rất giàu tình cảm và đức hy sinh. Thầy là một Nhà Giáo mẫu mực đầu tiên mà em đƣợc gặp. Em xin cảm ơn TS. Lê Anh Phụng, ThS. Trần Thị Bích Liên, cô Lê Thị Hà và BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và cho em điều kiện thực hiện đề tài này. Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị ở công ty Gia Nam đã nhiệt tình giúp em hoàn thành đề tài này. Và các bạn của tôi (Uyên, Thái, Phi, Linh, Vy), những ngƣời đã chia sẻ, giúp đỡ tôi khi gặp khó khăn. Cuối cùng, anh cám ơn Em. Em luôn bên cạnh cổ vũ khi anh mệt mỏi và động viên khi anh cảm thấy chán. Em là nguồn tinh thần vô cùng quý báu của anh. CAO VĂN HÒA Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007 iv TÓM TẮT CAO VĂN HÕA. Đề tài: “Thử Nghiệm Điều Chế Auto-Vaccine Phòng Bệnh Tiêu Chảy Do E. coli Trên Heo Con Sau Cai Sữa”. Thời gian: 01/05/2007 - 02/08/2007. Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi – Thú Y, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM và công ty TNHH Gia Nam, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Bƣớc 1, phân lập vi khuẩn E. coli từ các mẫu phân tiêu chảy ở trại heo, các chủng E. coli này sẽ đƣợc kiểm tra sinh hóa bằng nghiệm pháp IMViC và đƣợc định type kháng nguyên F4, F5, F6. Bƣớc 2, lựa chọn 5 chủng E. coli có kết quả phản ứng rõ ràng để sản xuất auto- vaccine. Bƣớc 3, bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine: Lô 1: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 1 lần. Lô 2: 3 bầy heo con, đƣợc tiêm auto-vaccine 2 lần. Lô đối chứng: 2 bầy heo con, đƣợc tiêm chất bổ trợ. Việc đánh giá hiệu quả auto-vaccine dựa vào hiệu giá kháng thể, tỷ lệ heo tiêu chảy, tăng trọng trung bình tuyệt đối và các phản ứng phụ sau tiêm, Kết quả: Auto-vaccine thực nghiệm tạo đáp ứng miễn dịch cao và kéo dài. Auto-vaccine thực nghiệm không gây tác dụng phụ sau tiêm và không ảnh hƣởng đến tăng trọng heo con. Chƣa thể đánh giá chính xác đƣợc hiệu quả bảo hộ tiêu chảy do E. coli của auto-vaccine. v SUMMARY CAO VAN HOA, Nong Lam University, HCM city. Graduating thesis topic: “The experiment of auto-vaccine production to protect the post – weaning piglet from the diarrhoea caused by E. coli”. The thesis was carried out at Microbiology lab, Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam University and Gia Nam Ltd. Company, Binh Duong province from 5/2007 to 8/2007. Supervisor: Dr. NGUYEN NGOC HAI First, isolate E. coli from the diarrhoea feces and identify them by IMViC test, then serotype with F4, F5, F6 antiserum. Second, selecte 5 E. coli isolates of serotype F4 or F5 to produce the auto- vaccine. Third, set up the experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the experiment was repeated in 2 times): The first group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection one times. The second group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine injection two times with 10 days interval. The control group: 2 litters (22 piglets, from 14 to 20 days aged), adjuvant injection two times with 10 days interval. The efficacy of auto-vaccine was evaluated by antiody titers, medium daily gain and the side effects. Result: The auto-vaccine made a high antibody titers and long immunization. The auto-vaccine did not bring neither the bad effects to piglets vaccinated health nor the gain weight of piglet. The results could not conclude exactly the efficacy of auto-vaccine on E. Coli diarrhoea control. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 .............................................................................................................. i Trang bìa 2 ............................................................................................................. ii Lời cảm tạ .............................................................................................................. iii Tóm tắt tiếng Việt ................................................................................................. iv Tóm tắt tiếng Anh .................................................................................................. v Mục lục .................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xii Danh sách các hình .............................................................................................. xiii Danh sách các bảng ............................................................................................. xiv Danh sách các biểu đồ .......................................................................................... xv Danh sách các sơ đồ ............................................................................................ xvi 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ....................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ......................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3 vii 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli ............................................................................... 3 2.1.1. Định nghĩa .................................................................................................... 3 2.1.2. Đặc tính sinh hóa .......................................................................................... 4 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên ................................................................................... 4 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O................................................................................ 4 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K ............................................. 5 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) ....................................................................... 5 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) ............................ 6 2.2. Bệnh tiêu chảy ................................................................................................. 6 2.2.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy .......................................................................... 7 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi ..................................................................... 7 2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật ............................................................. 7 2.2.2.3. Vi sinh vật ................................................................................................. 8 2.3. Sự miễn dịch.................................................................................................... 9 2.3.1. Khái niệm miễn dịch .................................................................................... 9 2.3.2. Phân loại miễn dịch ...................................................................................... 9 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu ......................................................................... 9 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu .................................................................................. 10 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) ................ 11 viii 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) .......................................................................... 11 2.3.3.2. Kháng thể (antibody)............................................................................... 13 2.4. Auto-vaccine ................................................................................................. 16 2.4.1. Định nghĩa vaccine ..................................................................................... 16 2.4.2. Phân loại vaccine ........................................................................................ 16 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) .......................................................... 16 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) ................................................................. 16 2.4.2.3. Các “toxoid” ............................................................................................ 17 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) ........................... 17 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu .............................................. 17 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine ............................................................................ 18 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vacine .................................................................. 18 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine ............ 18 2.4.5.1. Ƣu điểm ................................................................................................... 18 2.4.5.2. Nhƣợc điểm ............................................................................................. 19 2.5. Chất bổ trợ ..................................................................................................... 19 2.5.1. Định nghĩa chất bổ trợ ................................................................................ 19 2.5.2. Tác dụng của chat bổ trợ ............................................................................ 20 2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng trong đề tài này)... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................. 21 ix 3.1. Thời gian và địa điểm .................................................................................... 21 3.1.1. Thời gian .................................................................................................... 21 3.1.2. Địa điểm ..................................................................................................... 21 3.2. Vật liệu .......................................................................................................... 21 3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................. 21 3.2.2. Vật liệu và thiết bị ...................................................................................... 21 3.3. Nội dung ........................................................................................................ 22 3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 22 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu ................................................................................. 22 3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật ............................................................................... 23 3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập .................................................................................... 23 3.4.2.2. Kiểm tra sinh hóa .................................................................................... 23 3.4.3. Điều chế auto-vaccine ................................................................................ 28 3.4.4. Kiểm tra độ vô trùng của auto-vaccine ...................................................... 30 3.4.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả auto-vaccine ..................................... 30 3.4.5.1. Yếu tố thí nghiệm .................................................................................... 30 3.4.5.2. Phân phối heo vào các lô thí nghiệm ...................................................... 30 3.4.6. Phƣơng pháp kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ......................................................................................... 32 3.4.6.1. Lấy mẫu máu và bảo quản ...................................................................... 32 3.4.6.2. Chuẩn bị dịch kháng nguyên ................................................................... 33 x 3.4.6.3. Tiến hành phản ứng ................................................................................. 34 3.4.6.4. Đọc kết quả ............................................................................................. 34 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi ...................................................................................... 35 3.6 Xử lý số liệu ................................................................................................... 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 37 4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine ......................................... 37 4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................... 38 4.3. Hiệu giá kháng thể ........................................................................................ 39 4.3.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 39 4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 40 4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 40 4.3.1.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 41 4.3.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 43 4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 43 4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 44 4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 44 4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể ........................................................... 46 4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy ........................................................................................ 47 4.4.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 47 4.4.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 48 xi 4.5. Tăng trọng tuyệt đối ...................................................................................... 50 4.5.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 50 4.5.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 51 4.5.3. Tổng kết tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 thí nghiệm ...... 52 4.6. Các chỉ số khác .............................................................................................. 52 4.7. Kết quả chung ............................................................................................... 52 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 54 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 54 5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 54 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 55 7. PHỤ LỤC ......................................................................................................... 57 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT E. coli: Escherichia coli EMB: Eosin Methylene Blue Lactose KIA: Kligler Iron Agar TSA: Tryptone Soya Agar TSB: Tryptone Soya Broth SCA: Simmons Citrate Agar TN: Thí Nghiệm KT: Kháng Thể IMViC: Indol – Methyl Red – Voges Proskauer – Citrate xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con ....................................................... 22 Hình 3.2. Phân lập E. coli trên môi trƣờng EMB ................................................ 23 Hình 3.3. Vi khuẩn E. coli lên men lên men đƣờng sinh hơi trong môi trƣờng KIA .................................................................................... 24 Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm ................................... 24 Hình 3.5. Phản ứng Indol ..................................................................................... 25 Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red ........................................................................... 25 Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer .................................................................. 26 Hình 3.8. Phản ứng Citrate ................................................................................... 26 Hình 3.9. Rút máu heo con ................................................................................... 33 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo........................................... 8 Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con ................................................................ 31 Bảng 4.1. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) ............ 39 Bảng 4.2. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) ............ 43 Bảng 4.3. Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm ..................................... 46 Bảng 4.4. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 .............................................. 47 Bảng 4.5. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 .............................................. 48 Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm .............................................. 49 Bảng 4.7. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN1) ....... 50 Bảng 4.8. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN2) ....... 51 Bảng 4.9. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 TN ..................... 52 xv DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ nhất (thí nghiệm 1) .......................................................................... 40 Biểu đồ 4.2. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ hai (thí nghiệm 1) ............................................................................ 40 Biểu đồ 4.3. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ ba (thí nghiệm 1) ............................................................................. 41 Biểu đồ 4.4. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (TN1) ........ 42 Biểu đồ 4.5. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ nhất (thí nghiệm 2) .......................................................................... 43 Biểu đồ 4.6. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ hai (thí nghiệm 2) ............................................................................ 44 Biểu đồ 4.7. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô ở lần rút máu thứ ba (thí nghiệm 2) ............................................................................. 44 Biểu đồ 4.8. Hiệu giá kháng thể trung bình của 3 lô qua 3 lần rút máu (TN2) ........ 45 Biểu đồ 4.9. Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 ................................................... 47 Biểu đồ 4.10. Tỷ lệ heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 ................................................. 48 Biểu đồ 4.11. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 1) .................... 50 Biểu đồ 4.12. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (thí nghiệm 2) .................... 51 xvi xvii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1. Quy trình phân lập và định danh vi khuẩn E. coli ................................... 27 Sơ đồ 3.2. Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................... 29 Sơ đồ 3.3. Tóm tắt bố trí thí nghiệm ......................................................................... 31 Sơ đồ 3.4. Lịch trình thực hiện của 1 lần thí nghiệm ................................................ 31 Sơ đồ 3.5. Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................... 34 Sơ đồ 3.6. Cách tiến hành phản ứng ngƣng kết xác định hiệu giá kháng huyết thanh ...................................................................... 35 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong chăn nuôi nói chung và chăn nuôi heo nói riêng, việc phòng chống dịch bệnh là vô cùng cần thiết đối với đàn vật nuôi. Và với mô hình chăn nuôi công nghiệp, nếu không chú ý kiểm soát thì dịch bệnh rất dễ xảy ra và dễ bùng phát thành đại dịch. Tiêu chảy là một trong số các bệnh xảy ra nhiều và rộng, gây tổn thất không nhỏ cho đàn heo. Và một trong những nguyên nhân của bệnh, đặc biệt ở heo con sau cai sữa, là vi khuẩn Escherichia coli, với đặc điểm xảy ra lẻ tẻ quanh năm và bùng phát mạnh lúc giao mùa, khi thời tiết không ổn định (Nguyễn Khả Ngự & ctv, 1998). Bệnh có tử số không cao nhƣng tăng trọng hằng ngày có thể giảm và gây thiệt hại đáng kể cho nhà chăn nuôi (Taylor, 1995). Trong thực tế hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E. coli chủ yếu dựa vào thuốc kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế nhƣ hiện tƣợng đề kháng kháng sinh và có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu tìm kiếm vaccine hiệu quả cho việc phòng tiêu chảy trên heo sau cai sữa do E. coli là hết sức cần thiết. Vi khuẩn E. coli có nhiều type kháng nguyên nên việc nghiên cứu điều chế một loại vaccine phù hợp với trại chăn nuôi luôn mang lại hiệu quả cao. 2 Đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE PHÕNG BỆNH TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN HEO SAU CAI SỮA” 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Thử điều chế auto-vaccine phòng tiêu chảy do E. coli trên heo con sau cai sữa cho trại chăn nuôi. 1.2.2. Yêu cầu - Phân lập thành công chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy cho heo con. - Sản xuất auto-vaccine và tiêm thử nghiệm trên heo con sau cai sữa. - Theo dõi đáp ứng miễn dịch trên heo thí nghiệm đối với auto - vaccine điều chế. - Theo dõi ảnh hƣởng của auto-vaccine lên sức khỏe và tăng trƣởng của heo thí nghiệm trong suốt thời gian thực hiện từ khi bắt đầu thí nghiệm 14 ngày tuổi đến 60 ngày tuổi. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli 2.1.1. Định nghĩa Escherichia thuộc họ Enterobacteriaceae, bao gồm các loại trực khuẩn Gram âm có kích thƣớc khoảng 2-3µm x 0,5µm, di động nhờ các tiêm mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Các nhóm vi khuẩn này có mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già, cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Chúng chiếm đến 80% trong thành phần của hệ vi sinh vật hiếu khí đƣờng ruột (Intervet, 1997). Chi Escherichia bao gồm 5 loài: E. coli, E. fergusonii, E. hermanie, E. vulneris, E. blattae. Nguồn gốc tên gọi: năm 1885, tại Munich, Theodor Escherich - một bác sĩ nhi khoa trẻ phát hiện một loài vi khuẩn từ trong tã lót của trẻ em và đƣợc công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune, bốn năm sau, đƣợc giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công khám phá. Năm 1895, ngƣời ta lại gọi bằng tên Bacillus coli và năm 1896, gọi thành Bacterium coli. Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli. 4 Phân loại Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Protebacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Escherichia Loài: Escherichia coli 2.1.2. Đặc tính sinh hóa Nuôi cấy: vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp là 370C (có thể tăng trƣởng ở 100C– 460C), pH thích hợp 6,4 - 7,5. E. coli mọc tốt trên môi trƣờng thạch dinh dƣỡng; sau 24 giờ hình thành khuẩn lạc S có dạng tròn, ƣớt, trắng đục; nếu để lâu trở thành khuẩn lạc R có dạng khô, rìa hơi nhám. Một số hóa chất ngăn chặn đƣợc sự phát triển của E. coli nhƣ: chlorin và các dẫn xuất, muối mật, sodium deoxycholate, sodium tetrathionat, selenite… Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi đƣờng glucose, galactose, lactose, maltose, xylose, rhamnose, mannitol, fructose. Lên men saccharose không đều, không lên men dextrin và glycogen, không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, malonate, adonitol, inositol, không sinh H2S. Để phân biệt E. coli với các vi khuẩn đƣờng ruột khác, ngƣời ta dùng nghiệm pháp IMViC (++--). 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên 2.1.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysaccharide (LPS), thƣờng đặc trƣng cho từng loài. Chúng bền với nhiệt độ và cồn, khi đun ở nhiệt độ 1200C trong 2 giờ vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng ngƣng kết và kết hợp. Kháng nguyên O giữ một vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và 5 một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Ví dụ nhƣ các type kháng nguyên sau đây:  Ở ngƣời: O2, O4, O75, O9, O18, O22, O1.  Ở bò: O8, O15, O20, O35, O86, O101, O115.  Ở heo: O8, O45, O54, O138, O139, O141, O147.  Ở gia cầm: O1, O2, O8, O11, O78. 2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K Kháng nguyên K là kháng nguyên giáp mô, che phủ hoàn toàn kháng nguyên O nên không cho kháng thể O gắn kết với các epitop trên kháng nguyên O, làm cho hiện tƣơng ngƣng kết không xảy ra (Lê Huy Chính và ctv, 2001). Kháng nguyên K gồm 3 type A, L, B. 2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) Là kháng nguyên tiêm mao, có hình sợi, dài 4 µm, thẳng hay xoắn, đƣờng kính 2,1 - 7 nm. Chúng tạo nên đặc tính kết dính của vi khuẩn đối với tế bào, đặc biệt là đối với tế bào niêm mạc ruột. Kháng nguyên này cũng chính là yếu tố tạo nên khả năng gây bệnh và khả năng ngƣng kết hồng cầu cho những vi khuẩn có mang chúng. Tuy nhiên khả năng ngƣng kết hồng cầu này lại bị ức chế bởi đƣờng mannose. Gần đây, để tránh nhầm lẫn với cách gọi tên của kháng nguyên giáp mô, ngƣời ta đã dùng danh pháp chuẩn hơn cho các yếu tố kết dính, đƣợc ký hiệu F. Trong đó, K88 thành F4 , K99 thành F5, 987P thành F6 (Orskov, 1992; trích dẫn Broes và Fairbrother, 1993). Kháng nguyên F là kháng nguyên mạnh, khi xâm nhập vào trong cơ thể nó sẽ kích thích cơ thể tạo nên kháng thể đặc hiệu và là cơ sở cho việc chẩn đoán huyết thanh học và xác định type huyết thanh của các dòng E. coli, cũng nhƣ xác định các 6 kháng thể bảo vệ. Vì vậy, các kháng nguyên này đƣợc dùng để chế tạo vaccine phòng bệnh E. coli trên heo con. Các tiêm mao liên quan đến E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo con là F4, F5, F6 và F41. 2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) Kháng nguyên H có bản chất protein, bị hủy bởi cồn, có tính chịu nhiệt, tuy nhiên khi đun 1000C trong 2 giờ thì các tính kháng nguyên, tính ngƣng kết đều bị phá hủy. Kháng nguyên này có ở những dòng E. coli di động. Hiện nay, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H. 2.2. Bệnh tiêu chảy trên heo 2.2.1. Khái niệm Tỷ lệ nƣớc trong phân bình thƣờng chiếm 80%, phân táo bón dƣới 70%, phân nhão 85%, phân lỏng trên 85% (tiêu chảy). Roux đã định nghĩa: “tiêu chảy là một hội chứng đặc trưng bởi sự tống phân nhanh và phân nhiều nước” (Nguyễn Thị Minh An và ctv, 2001). Trên thực tế, tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đƣờng tiêu hóa, thú đi phân lỏng, đôi khi có máu, bọt khí, chất nhầy… Hậu quả quan trọng của tiêu chảy là suy dinh dƣỡng và gây thiệt hại về kinh tế, vì khi bị tiêu chảy bệnh súc sẽ ăn ít; đồng thời, khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng cũng giảm và có thể chết thú. Tiêu chảy xảy ra trên mọi lứa tuổi heo. Tuy nhiên, bệnh thƣờng gặp và gây nguy hiểm ở giai đoạn heo con theo mẹ, heo vừa mới cai sữa hoặc tách bầy. Các biểu hiện của tiêu chảy: Tính đàn hồi của da kém, khô niêm mạc hầu họng. Huyết áp hạ. Nƣớc tiểu có ít Cl- và Na+. 7 Giảm thể tích huyết tƣơng. Máu đặc, huyết tƣơng có hàm lƣợng Cl- và Na+ giảm, hàm lƣợng urea tăng. Tiêu chảy có 4 cơ chế chính, đó là: tiêu chảy do phân tiết, tiêu chảy do thẩm thấu, tiêu chảy do rối loạn vận động ruột và tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột. Tiêu chảy do vi khuẩn E. coli thƣờng theo cơ chế phân tiết, phân nhiều và lỏng (Buddle và Bolton, 1992). Thang thẩm thấu do sự tích tụ của Na+ và Cl- trong lòng ruột làm cho một lƣợng lớn nƣớc di chuyển từ máu vào lòng ruột. Phân đẳng trƣơng (isotonic) so với huyết thanh và có khuynh hƣớng kiềm vì chứa nhiều bicarbonate (đây là một trong các cách giúp phân biệt với bệnh tiêu chảy do tiêu hóa/hấp thu kém ở nhiễm trùng Rotavirus). Hậu quả là thú mất nƣớc và toan huyết. 2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy Tiêu chảy là một hiện tƣợng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy phân biệt thật rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy không giản đơn. Đa số các nhà nghiên cứu trong và ngoài nƣớc đề nghị phân chia các nguyên nhân gây tiêu chảy thành 3 nhóm chính nhƣ sau: 2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi Chủ yếu do thời tiết khí hậu quá nóng, quá lạnh hoặc ẩm ƣớt kéo dài. 2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật Thiếu sót đầu tiên là do heo con không đƣợc cho bú sữa đầu. Thức ăn, nƣớc uống kém phẩm chất nhƣ dơ bẩn, ôi mốc, nhiễm trùng, thiếu vitamin (nhất là vitamin A, D) hoặc thiếu chất khoáng (nhất là Fe). 8 2.2.2.3. Vi sinh vật Vi khuẩn: gồm 2 nhóm, đó là vi khuẩn khu trú thƣờng xuyên trong ống tiêu hóa (Enterobacteriaceae) nhƣ E. coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus… và nhóm vi khuẩn tạp nhiễm cùng với thức ăn, nƣớc uống vào đƣờng tiêu hóa nhƣ Staphylococci, Streptococci… loạn khuẩn đƣờng ruột là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở đƣờng tiêu hóa. Virus: ngƣời ta đã chứng minh đƣợc virus là một tác nhân gây tiêu chảy, thƣờng thấy là Rotavirus, Enterovirus, Coronavirus… Ký sinh trùng: tác động thông qua việc tranh chấp chất dinh dƣỡng với ký chủ, tiết độc tố, làm giảm sức đề kháng và làm tổn thƣơng niêm mạc đƣờng tiêu hóa, tạo điều kiện cho các tác nhân khác gây bệnh. Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo (Bergeland, 1980) STT Mầm bệnh Tỉ lệ gặp (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Escherichia coli Isospora Rotavirus T.G.E virus Enterovirus Parvovirus Coronavirus (khác T.G.E) Calicivirus Salmonella Treponema hyodysenteriae Không chẩn đoán được 45,6 23,0 20,9 11,2 2,0 0,7 0,5 0,2 0,1 0,1 14,0 9 Qua đó, chúng ta thấy rằng vi khuẩn E. coli đóng một vai trò quan trọng trong các nguyên nhân gây tiêu chảy trên heo. 2.3. Sự miễn dịch 2.3.1. Khái niệm miễn dịch Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai. Tính miễn dịch đƣợc hình thành trong quá trình tiến hóa của sinh vật (Petrov, 1978). 2.3.2. Phân loại miễn dịch Hệ thống miễn dịch trong cơ thể sinh vật đƣợc chia làm hai nhóm: miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu đƣợc (miễn dịch đặc hiệu). 2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu Là phƣơng tiện bảo vệ của cơ thể không nhằm chống lại một loại kháng nguyên cụ thể nào mà chống lại nhiều tác nhân có tính chất khác nhau. Miễn dịch Miễn dịch không đặc hiệu Miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch thụ động Miễn dịch chủ động Miễn dịch thụ động tự nhiên Miễn dịch thụ động nhân tạo Miễn dịch chủ động tự nhiên Miễn dịch chủ động nhân tạo 10 Miễn dịch không đặc hiệu đƣợc qui định bởi đặc tính của giống, loài sinh vật. Loại miễn dịch này đã có sẵn khi cơ thể đƣợc sinh ra và nó đƣợc di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Hệ thống miễn dịch này bao gồm 2 quá trình: quá trình miễn dịch tế bào và quá trình miễn dịch dịch thể.  Quá trình miễn dịch tế bào gồm: da, niêm mạc, hệ bạch huyết, nội tạng (gan, lách), thực bào.  Quá trình miễn dịch dịch thể gồm: kháng thể tự nhiên, bổ thể, interferon, enzyme lysozyme. 2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu Là sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi xuất hiện kháng nguyên. Kháng nguyên này kích thích cơ thể tạo ra miễn dịch chống lại chính kháng nguyên. Miễn dịch đặc hiệu là quá trình phát sinh và phát triển sự hoạt động của 2 nhóm tế bào lympho T và lympho B với sự phối hợp của đại thực bào. Miễn dịch thu đƣợc hay còn gọi là miễn dịch đặc hiệu là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu đƣợc trong quá trình sống. Miễn dịch thu đƣợc chia ra làm hai loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động. i. Miễn dịch thụ động là loại miễn dịch mà cơ thể tiếp thu từ bên ngoài. Nếu quá trình tiếp thu miễn dịch xảy ra hoàn toàn tự nhiên nhƣ trong trƣờng hợp thú con tiếp nhận kháng thể từ thú mẹ qua sữa đầu, hoặc gia cầm con tiếp nhận kháng thể từ gia cầm mẹ qua lòng đỏ trứng, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động tự nhiên. Còn miễn dịch thụ động có đƣợc do con ngƣời tạo ra nhƣ trƣờng hợp tiêm huyết thanh để phòng và trị bệnh, đƣợc gọi là miễn dịch thụ động nhân tạo. 11 ii. Miễn dịch chủ động là loại miễn dịch mà tự bản thân cơ thể sinh vật tạo ra khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên. Nếu miễn dịch chủ động mà trong đó có sự tham gia của con ngƣời nhƣ trƣờng hợp chủng ngừa vaccine để phòng bệnh, đƣợc là miễn dịch chủ động nhân tạo. Miễn dịch chủ động do cơ thể tiếp thu tự nhiên trong môi trƣờng sống đƣợc gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên. Trƣờng hợp này xảy ra khi thú qua khỏi sau đợt dịch bệnh, có khả năng không mắc lại bệnh đó khi bị tái nhiễm. Cũng nhƣ trong hệ thống miễn dịch tự nhiên, miễn dịch thu đƣợc cũng có miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào: Miễn dịch tế bào (còn gọi là quá trình miễn dịch trung gian tế bào): đƣợc biểu thị bởi sự hoạt hóa lympho bào T thuộc đặc hiệu của kháng nguyên. Nhƣ vậy trong miễn dịch trung gian tế bào, lympho bào T đóng vai trò quan trọng. Miễn dịch dịch thể: kháng thể chủ yếu có trong huyết thanh. Kháng thể đặc hiệu cũng có cấu tạo giống nhƣ kháng thể không đặc hiệu và nằm trong 5 lớp A, D, G, E, M nhƣng nó chỉ đƣợc tạo ra khi có kháng nguyên đặc hiệu tác động và đƣợc sự hỗ trợ của lympho bào T. Lympho bào B chịu trách nhiệm trong miễn dịch dịch thể. 2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) 2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) Là những protein lạ mà khi vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể kết hợp đặc hiệu với nó. Tất cả kháng nguyên đều có hai tính chất: tính sinh miễn dịch của kháng nguyên và tính đặc hiệu của kháng nguyên. i. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên: là khả năng tạo sự miễn dịch của cơ thể đối với kháng nguyên. Tính chất này phụ thuộc các điều kiện sau :  Bản chất hoá học của kháng nguyên: thƣờng là những protein lạ đối với cơ thể vật chủ. Các kháng nguyên bản chất hoá học là protein thƣờng là kháng nguyên hoàn toàn và mạnh vì nó kích thích cơ thể tạo ra nhiều kháng 12 thể. Các kháng nguyên bản chất hoá học là lipid, polysaccharide là kháng nguyên yếu, có loại là “bán kháng nguyên” vì nó kích thích yếu hoặc không kích thích cơ thể sinh kháng thể.  Kích thƣớc phân tử của kháng nguyên: nhìn chung kháng nguyên càng có kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao. Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên. Đó là một trong các yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao.  Đƣờng xâm nhập của kháng nguyên: thƣờng kháng nguyên xâm nhập qua đƣờng tiêu hoá có tính sinh miễn dịch yếu hơn kháng nguyên xâm nhập qua da.  Liều lƣợng kháng nguyên: nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại, nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch.  Quy trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn tới tính sinh miễn dịch của phân tử kháng nguyên: mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng.  Cá nhân đƣợc miễn dịch: các cơ thể khác nhau có sự đề kháng khác nhau với mầm bệnh (kháng nguyên). Thƣờng cơ thể khoẻ, đƣợc chích vaccine có khả năng miễn dịch tốt hơn cơ thể yếu, không đƣợc chích vaccine.  Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên, phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ), chất bổ trợ... ii. Tính đặc hiệu của kháng nguyên: là sự phản ứng đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể mà kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh ra. Tính đặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc vào các điều kiện sau:  Cấu trúc phân tử protein của kháng nguyên: các monopolypeptide không có tính kháng nguyên vì ở đây chuỗi peptide đƣợc lặp lại nhiều lần với 13 cùng một loại acid amin, do đó không chứa yếu tố lạ đặc trƣng. Các dipolypeptide và đặc biệt là tripolypeptide có tính kháng nguyên mạnh.  Các nhóm quyết định kháng nguyên (epitope): nhóm quyết định kháng nguyên là những điểm thụ thể nằm trên bề mặt kháng nguyên mà tại nơi đó kháng thể gắn vào. Trên mỗi phân tử kháng nguyên có khoảng 10.000 nhóm quyết định kháng nguyên.  Trọng lƣợng phân tử của kháng nguyên: phân tử kháng nguyên càng lớn thì trên đó có nhiều “nhóm quyết định kháng nguyên”, chúng là những kháng nguyên mạnh. Bán kháng nguyên có trọng lƣợng phân tử nhỏ do đó có ít nhóm quyết định kháng nguyên. 2.3.3.2. Kháng thể (antibody) Là những globulin miễn dịch (immunoglobulin-Ig) có trong huyết thanh và dịch chiết tại chỗ. Chúng là 1 loại protein có mang thêm 1 glucid nên còn gọi là glycoprotein. Cấu trúc kháng thể: phân tử kháng thể gồm 4 chuỗi protein trong đó gồm 2 chuỗi nặng (gọi là chuỗi H-heavy) và 2 chuỗi nhẹ (gọi là chuỗi L-light). Trọng lƣợng của kháng thể từ 15 KDa trở lên. Các chuỗi H và L nối với nhau bằng cầu nối disulfide (-S-S-). Chuỗi nặng gồm 4 đoạn polypeptide và chuỗi nhẹ gồm 2 đoạn polypeptide, mỗi đoạn có 110 - 120 acid amin. Trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có vùng Fab và Fv kết hợp đƣợc với kháng nguyên, vùng Fc mang tính kết hợp bổ thể. Sự khác nhau giữa các loại kháng thể nằm ở vùng siêu biến V còn vùng hằng định C thì giống nhau. Nhiều kháng nguyên có nhiều yếu tố xác định và do đó phải có 1 bộ kháng thể tƣơng ứng mới tƣơng tác đƣợc với kháng nguyên ấy. Vì vậy, số lƣợng kháng thể hết sức lớn. Phân loại kháng thể: tất cả các kháng thể đƣợc xếp vào 5 lớp Ig. Mỗi lớp phân biệt với các lớp khác nhờ những trình tự acid amine đặc trƣng ở vùng hằng định nằm trên chuỗi nặng tạo nên những đặc tính về cấu trúc và chức năng riêng cho mỗi lớp. 14 i. IgG: có chuỗi nặng là gamma (γ). Là thành phần cơ bản nhất trong huyết thanh. Chiếm khoảng 80% tổng số Ig của huyết tƣơng bình thƣờng. IgG là kháng thể duy nhất truyền từ mẹ sang nhau thai (kháng thể tự nhiên). Khi trẻ lớn lên dần, lƣợng kháng thể này giảm dần. Đến khi trƣởng thành IgG lại gia tăng và đặc biệt tăng cao khi cơ thể bị nhiễm khuẩn. Trong hoạt động đáp ứng miễn dịch, các IgG có 4 chức năng: trung hòa độc tố, ngƣng kết tế bào vi khuẩn và tham gia vào phản ứng Arthus, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, và opsonin hóa. ii. IgM: có chuỗi nặng là muy (μ), là globulin miễn dịch lớn nhất và là lớp miễn dịch chính đƣợc tổng hợp ở bào thai bảo vệ bào thai khỏi bị nhiễm khuẩn. Trong huyết thanh ngƣời bình thƣờng, IgM có nồng độ khoảng 125mg/100ml, đứng thứ hai sau IgG. Khi cơ thể bị kích thích bởi kháng nguyên, IgM là loại kháng thể xuất hiện đầu tiên, tiếp sau đó IgG xuất hiện và thay thế IgM. Thƣờng sau khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng cũng có trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ kháng thể IgM chống lại kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella). Chức năng sinh học của IgM: trung hòa ngoại độc tố, ngƣng kết vi khuẩn, phối hợp với bổ thể làm tan vi khuẩn, hấp thụ lên bề mặt lympho B để tạo nên điểm thụ thể dành cho kháng nguyên tƣơng ứng, ảnh hƣởng đến hoạt động của độc tố bằng cách kết hợp với quyết định kháng nguyên nằm trong hoặc gần vị trí hoạt động của độc tố, do đó nó phong bế phản ứng của độc tố. iii. IgA: có chuỗi nặng là alpha (α), IgA có trong nƣớc bọt, sữa non, dịch ruột, đặc biệt là trong huyết thanh và dịch xuất tại chỗ. IgA giữ vai trò chủ yếu trong miễn dịch tại chỗ chống lại các bệnh đƣờng tiêu hoá hay hô hấp. iv. IgD: chuỗi nặng là delta (δ), có trong máu với hàm lƣợng thấp 30mg/100ml. Chúng dễ dàng bị biến tính bởi nhiệt và bị phân giải bởi enzyme. Có vai trò trong miễn dịch tại chỗ, thƣờng xuất hiện nhiều trong bệnh nhân có bệnh mãn tính. Tốc độ tổng hợp của IgD kém hơn IgG khoảng 100 lần nhƣng dị hóa lại 15 nhanh hơn hàng chục lần. IgD tăng trong các trƣờng hợp nhiễm khuẩn mãn tính, nhƣng không đặc hiệu cho loài. IgD có trong kháng thể kháng tuyến giáp trạng, kháng insulin, kháng penicillin. IgD không kết hợp với bổ thể, không gây phản vệ thụ động trên da chuột lang, không đi qua nhau thai. Chức năng sinh học của IgD còn đƣợc biết rất ít, có lẽ IgD có vai trò nhƣ thụ thể cho kháng nguyên vì nó gắn trên bề mặt tế bào lympho B để tạo điểm thụ thể giữa lympho B với kháng nguyên tƣơng ứng. v. IgE: có chuỗi nặng là epsilon (ε). IgE có nồng độ trong huyết thanh thấp 0,025mg/100ml, dễ biến tính khi xử lý bằng nhiệt ở 560C/30 phút. IgE có khả năng hoạt hóa đại thực bào và bạch cầu ái toan, tăng cƣờng thực bào hay tăng cƣờng độc tính của bạch cầu trung tính đối với giun sán. IgE có ít trong huyết thanh và dễ bị phân huỷ. IgE đóng vai trò trung gian trong phản ứng quá mẫn, trực tiếp gây ra những triệu chứng nhƣ sốt mùa hè, hen suyễn, sốt phát ban, và shock quá mẫn.  Sự hình thành kháng thể: nhờ phƣơng pháp đánh dấu kháng thể bằng đồng vị phóng xạ hay chất huỳnh quang, ngƣời ta thấy các kháng thể đƣợc tổng hợp ở tủy đỏ và ở các nang của lách, ở các nang và dây tuỷ của các hạch bạch huyết, ở tuỷ xƣơng, mảng Peyer và những tổ chức lympho khắp cơ thể (phổi, gan…). Một trong những tổ chức quan trọng nhất tham gia vào việc tổng hợp kháng thể là “trung tâm mầm” của lách và hạch bạch huyết. Trung tâm mầm xuất phát từ những “clone” là những tế bào gốc ở tuỷ xƣơng. Ban đầu khi chƣa tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” ở trạng thái “ngủ”, khi tiếp xúc với kháng nguyên, “clone” bị kích thích và hoạt hoá để tạo ra những tế bào đáp ứng miễn dịch (các lympho bào B và T). Lympho bào B sẽ sản sinh ra dòng lympho B nhớ và tƣơng bào. Tƣơng bào trực tiếp tham gia tạo kháng thể. Nhƣ vậy, tế bào B và “con cháu” của chúng hoạt động theo từng “clone”: chúng biệt hoá, tăng sinh và trƣởng thành theo sự đáp ứng miễn dịch. Trong các tình thế khác nhau, mức độ khác nhau, sự tổng hợp kháng thể phụ thuộc vào tế bào T: nhƣ sự tổng hợp IgE, IgG phụ thuộc rất nhiều vào tế bào T 16 (Ishisaka Bankhurst và cộng sự, 1973). Còn các kháng thể IgM, IgA ít hoặc không phụ thuộc vào tế bào T. Kháng thể đƣợc tổng hợp trong các polyribosome trong tƣơng bào. Các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể đƣợc tổng hợp riêng sau đó chúng kết hợp với nhau ngay trong polyribosome tạo ra 2 chuỗi nặng và 2 chuỗi nhẹ. Ngay sau khi các chuỗi globulin miễn dịch đã hình thành xong thì các đƣờng hydratecacbon sẽ liên kết với nhau và kháng thể ra khỏi tƣơng bào. 2.4. Auto-vaccine 2.4.1. Định nghĩa vaccine Vaccine là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có khả năng tạo cho cơ thể đáp ứng miễn dịch, đƣợc dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác. 2.4.2. Phân loại vaccine 2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) Sử dụng virus hoặc vi khuẩn sống đã đƣợc xử lý để giảm tính độc. Ví dụ: vaccine sabin chống bại liệt, vaccine sởi, vaccine quai bị. 2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) Vi khuẩn hay virus đƣợc giết chết bằng phƣơng pháp vật lý (nhiệt độ cao, bức xạ, tia cực tím…) hay hoá học (formaldehyde, ethylen imine…). Ví dụ: vaccine salk chống bại liệt dạng tiêm, vaccine dại. Vaccine bất hoạt an toàn hơn vaccine sống nhƣng có hiệu lực miễn dịch yếu hơn. Ngƣời ta thƣờng trộn với chất bổ trợ nhằm tăng sức miễn dịch và kéo dài thời gian miễn dịch. 17 2.4.2.3. Các "toxoid” Là các hợp chất độc bất hoạt đƣợc trích từ các vi sinh vật (trong trƣờng hợp chính các độc chất này là phƣơng tiện gây bệnh của vi sinh vật). Chúng đƣợc tiêm cho vật chủ khác (nhƣ ngựa) để tạo kháng thể, rồi chiết lấy kháng thể này để chữa bệnh. Ví dụ: các huyết thanh ngừa uốn ván và bạch hầu. 2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) i. Vaccine tái tổ hợp: gen mã hoá kháng nguyên đƣợc chuyển nạp vào genome của tế bào nấm men, tế bào vi khuẩn hoặc tế bào động vật thích hợp để tạo ra nhiều kháng nguyên tinh khiết nhờ phƣơng thức nhân bản. Quá trình chuyển nạp gen mã hoá kháng nguyên đƣợc thực hiện qua yếu tố trung gian plasmid. ii. Sử dụng protein tinh sạch hay glycoprotein của virus. 2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu i. Vaccine DNA trần (naked DNA vaccine): gen mã hoá cho một kháng nguyên của tác nhân gây bệnh cũng có thể tách rời rồi đƣa vào vật chủ thông qua vectơ là plasmid hay virus. ii. Vaccine peptide: trên đó có epitope bảo vệ. Peptid có thể liên kết với một protein tải để tăng tính phụ thuộc tế bào lympho T. iii. Vaccine liên kết: chất polysaccharid liên kết với protein có phân tử lƣợng cao để tiếp cận dễ dàng với tế bào lympho T. Ví dụ: virosomes … iv. Vaccine khảm hay vaccine lai ghép (hydrid vaccine): là kết quả của sự kết hợp kĩ thuật tái tổ hợp và kĩ thuật di truyền sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tƣợng "phản tác dụng". Chủng vi sinh vật vaccine đƣợc cấy ghép gen mã hoá kháng nguyên lấy từ vi sinh vật gây bệnh. Vi sinh vật đƣợc cấy ghép là vi sinh vật vectơ. Ví dụ: dùng virus Vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại. Vaccine lai ghép một lúc kích thích cơ thể tạo ra hai đáp ứng miễn dịch là đáp ứng bảo vệ đối với vi sinh vật gây bệnh (virus viêm gan B hay virus dại) và đáp ứng đối với vi sinh vật vectơ (Vaccinia). 18 2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine Auto-vaccine là vaccine mang mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) của vật chủ hay vùng dịch nào đó và đƣợc sử dụng để chủng ngừa cho chính vật chủ hay vùng dịch đó. 2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vaccine Việc đầu tiên trong quy trình sản xuất auto-vaccine là cần phân lập mầm bệnh (vi khuẩn hoặc virus) từ mô bệnh hoặc dịch chiết của vật chủ mang bệnh. Tiếp theo, mầm bệnh sẽ đƣợc làm chết hoặc làm yếu bởi các tác nhân hóa học, nhiệt, điện hay phóng xạ… Sau cùng kháng nguyên đƣợc tinh sạch và bổ sung một số chất cần thiết để thành phẩm auto-vaccine. 2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto- vaccine 2.4.5.1. Ƣu điểm Là giải pháp phòng ngừa nhanh chóng trong trƣờng hợp không có vaccine hay với những bệnh hiếm gặp. Hạn chế sử dụng những chủng không cần thiết trong vaccine khi tiêm phòng cho vật chủ. Có tính đặc hiệu cao vì tạo miễn dịch chuyên biệt. Phƣơng pháp hiệu quả chống lại vi khuẩn có tính kháng rộng. Phƣơng pháp phòng ngừa hữu hiệu đối với virus biến chủng nhanh hay vi khuẩn kháng kháng sinh nhanh. Có thể đƣợc sử dụng để phòng ngừa những tác nhân gây bệnh ở dạng phân tử (nhƣ prion…) 2.4.5.2. Nhƣợc điểm Quy trình sản xuất auto-vaccine rất khó khăn vì cần phải tinh sạch kháng nguyên. 19 Hạn chế trong việc sử dụng rộng rãi, chỉ đƣợc sử dụng tại nơi mà mầm bệnh đƣợc phân lập để sản xuất auto-vaccine. Chi phí sản xuất cao, giá thành phẩm cao. Khó để thƣơng mại hóa auto-vaccine thành phẩm. 2.5. Chất bổ trợ Ngày nay các hãng sản xuất vaccine luôn bổ sung chất bổ trợ vào sản phẩm của mình. Sử dụng chất bổ trợ nào để đem lại hiệu quả cho vaccine

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfCAO VAN HOA.pdf