Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường

MỤC LỤC Mở đầu PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY 1. Lịch sử ra đời 2. Kỹ thuật DNA array 2.1 Cấu trúc và chức năng của DNA array 2.2 Quá trình thực hiện DNA array 2.2.1 Chế tạo mảng 2.2.2 Tiến hành thí nghiệm 3. Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG 1. Các cải tiến loại một 1.1 Cải tiến mẫu dò 1.2 Cải tiến mảng 2. Các cải tiến loại hai 2.1 PNA array 2.2 Nanowire array 2.3 Peptide array 2.4 Glycan array 2.5 Array hoá học (Chemical array) 2.6 Protein array PHẦN III_ KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO

doc30 trang | Chia sẻ: lvcdongnoi | Ngày: 10/01/2013 | Lượt xem: 1981 | Lượt tải: 1download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường Nguyễn Xuân Hưng  MỤC LỤC Mở đầu PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY                                               1.     Lịch sử ra đời                                                    2.     Kỹ thuật DNA array                                               2.1     Cấu trúc và chức năng của DNA array                                    2.2     Quá trình thực hiện DNA array                                         2.2.1     Chế tạo mảng                                              2.2.2     Tiến hành thí nghiệm                                          3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG 1. Các cải tiến loại một                                          1.1 Cải tiến mẫu dò                                              1.2 Cải tiến mảng                                               2. Các cải tiến loại hai                                              2.1 PNA array                                                    2.2 Nanowire array                                              2.3 Peptide array                                              2.4 Glycan array                                              2.5 Array hoá học (Chemical array)                               2.6 Protein array                                               PHẦN III_ KẾT LUẬN                                               TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY 1.     Lịch sử ra đời Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Các nghiên cứu này gợi ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên hệ trình tự giữa chúng và các phương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng. [1] Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson tìm ra phương pháp lai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH). Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. [1] Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu dò với phương pháp FISH. Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh mRNA từ những nguồn khác nhau. [1] Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí. [1]  Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Kỹ thuật này phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay. 2.     Kỹ thuật DNA array 2.     Kỹ thuật DNA array     DNA microarray đầu tiên được thiết kế khám phá các loại thuốc mới [2], phân tích biểu hiện gen [3], tái giải trình tự DNA [4]. Kỹ thuật này mới được ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh môi trường trong vài năm gần đây [5] nhưng đã cho thấy những tiềm năng vô cùng to lớn trong phân tích quần xã vi sinh vật, xác định sinh vật gây bệnh cũng như kiểm soát các quá trình trong cả khoa học cơ bản và khoa học ứng dụng về môi trường [6].   2.1     Cấu trúc và chức năng của DNA array Trong kỹ thuật DNA array, người ta cố định các axit nucleic có trình tự xác định (mẫu dò) trên giá thể (mảng) thích hợp theo thứ tự. Axit nucleic cần nghiên cứu (đích) được đánh dấu sau đó lai với mẫu dò trên mảng. Ở những điều kiện lý tưởng, các axit nucleic có trình tự bổ sung bắt cặp chính xác với nhau. Hơn nữa dưới các điều kiện này, cường độ phát hiện tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với lượng mẫu dò nên có thể định lượng các loại axit nucleic trong mẫu ban đầu [7]. Đường kính chấm (mỗi chấm đại diện cho một loại mẫu dò) trên macroarray thường ≥ 300 µm và có thể được hiện hình bằng kỹ thuật gel thông thường hoặc máy quét dùng trong những kỹ thuật blot trước đây. Ngược lại, các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) [8; 9]. Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 µm [8]. Microarray mật độ thấp    Trong ứng dụng này, axit nucleic gắn chặt với màng nylon hoặc phiến kính đã biến đổi hoá học. Nếu cần, có thể sử dụng tia cực tím để tạo liên kết đồng hoá trị giữa mẫu dò với màng nilon. Plasmid và các sản phẩm của phản ứng PCR thường được đặt trên màng hoặc phiến kính với mật độ 80 - 200 chấm/cm2 với microarray mật độ thấp và 500 - 10.000 chấm/cm2 với microarray mật độ trung bình [10].      Microarray mật độ cao Đó là microarray có trên 10.000 mẫu dò/cm2. Ngày nay người ta đã tạo ra các DNA microarray với hơn 250.000 mẫu dò/cm2 gọi là DNA chip. Giá thể thường dùng là thuỷ tinh hoặc silicon. Trên chip có thể chứa các oligonucleotide dài từ 25 đến 60 base, sản phẩm PCR hoặc đôi khi là các plasmid lớn từ 500 đến 5.000 base [7]. 2.2     Quá trình thực hiện DNA array Về cơ bản, quá trình thực hiện thí nghiệm DNA array gồm hai bước: (i) chế tạo mảng và (ii) tiến hành thí nghiệm [1].  ▲Hình 1: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray. 2.2.1     Chế tạo mảng Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao [11]. Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon [1], trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất [11]. Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá [3] để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò [12]. Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) [11]. Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide). Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7]. In kim (Contact-tip deposition printing) Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 2). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13].  ▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo 7]. Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 [7]. In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing) Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3). Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao [7].  ▲Hình 3: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing [Theo 7]. In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network) µFN là kỹ thuật µCP cải tiến. Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 4).  ▲Hình 4: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN [Theo 7]. Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng minh [7]. In mạ (Electro capture) Các array này giống như một con chip silicon. Giá thể ở đây là silicon có lớp bề mặt bị ôxi hoá bởi nhiệt. Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500 nm. Sau đó tiến hành một loạt các biến đổi hoá học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chip trừ phần không gian của điện cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2 mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4. Trên cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hoá (Hình 5).  ▲Hình 5: In mạ [Theo 7]. Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hoá [7]. Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 6). Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền (  ▲Hình 6: Sơ đồ chip electric silicon. (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều dài mỗi cạnh 1 cm. Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu sáng) để nối chip với nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện cực [Theo 7]. In quang hoạt (Photolithography) Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn [14]. Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn [15]. Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn. Dùng mặt nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 7). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác định trên cơ chất [14]. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm ( In áp điện (Piezoelectric printing) In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16]. Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 8). Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2. Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 9) [16].  ▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16].  ▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp [Theo 7].  ▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá [Theo 7]. In vi lỏng (µWP - Micro wet printing) Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ (hình 10). Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể.  ▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng [Theo 7]. 2.2.2     Tiến hành thí nghiệm Về cơ bản, các bước tiến hành thí nghiệm với microarray là như nhau và gồm 3 bước: (i) chuẩn bị mẫu; (ii) tiến hành lai; (iii) xác định tín hiệu và chuẩn hoá dữ liệu. Chuẩn bị mẫu Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu. Mẫu để lai (đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm vàng/bạc [7]. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất [17]. Tiến hành lai Sau khi đánh dấu, tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mang rắn nên phương pháp microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích. Nếu dùng chất mang thuỷ tinh, có thể đặt úp một phiến kính thuỷ tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giữa chúng bởi lực mao dẫn [1]. Một cách đơn giản khác là đặt trực tiếp mảng trong bể nhỏ chứa dung dịch lai. Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm [17]. Hiệu quả lai có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trong trạng thái động so với bề mặt mảng [1].  ▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002]. Xác định và phân tích tín hiệu lai Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò [9]. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra. Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12). Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác. Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng.  ▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng. Mảng chứa mẫu dò cDNA Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 13). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu [18]. Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo [19]. (iii) Không phân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide. (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ). Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu [20]. (v) Không có khả năng định lượng. (vi) Cần lượng lớn đích [9]. Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo. (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự [9]. (iii) Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu [21]. (iv) Tính đặc hiệu cao [21].  ▲Hình 13: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA. Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau [22]. Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo (MM/PM). Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính giữa (hình 15). So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu gắn. Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không được dùng để đánh giá. Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu. Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích. Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có thể so sánh hiệu quả. (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần. (iii) Có khả năng định lượng. (iv) Cần lượng nhỏ đích [9]. (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một array [21]. (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot [14].  ▲Hình 14: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ. Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh sửa. (ii) Mẫu dò ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu. (iii) Không thể so sánh đồng thời sự biểu hiện gene của hai mẫu thí nghiệm liên quan trên cùng một mảng [21; 23].  ▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14]. 3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường 3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song khi ứng dụng trong môi trường nó gặp phải một số vấn đề. Vấn đề kỹ thuật Tồn tại cố hữu của phương pháp microarray là các điều kiện lai (nhiệt độ, nồng độ muối…) không bao giờ tối ưu cho mọi phân tử, dẫn đến hiệu quả lai không đặc hiệu hoặc không hoàn toàn và kết quả sẽ thiếu chính xác. Vấn đề quan trọng khi áp dụng kỹ thuật microarray với mẫu môi trường liên quan đến các biến đổi khác nhau của dấu hiệu lai do mật độ và trình tự khác nhau [24]. Tính đa dạng di truyền rất lớn trong môi trường tác động đến cả việc chế tạo mảng và giải thích dữ liệu. Tính đa dạng trình tự gene cấu trúc trong các quần thể liên quan về mặt chức năng (như vi khuẩn cố định nitơ, khử sulfate hay nitrat hoá) lớn làm khả năng tính toán của máy tính hiện khó đáp ứng nổi, đặc biệt khi sử dụng các mẫu dò oligonucleotide ngắn [25]. Hơn nữa, hiệu quả của microarray với các mẫu môi trường khác nhau có tương tự với mẫu chủng đơn hay không là một vấn đề khó đánh giá [6; 26]. Một điều đặc biệt quan trọng là khi lai cùng lúc hàng trăm hoặc hàng ngàn mẫu dò trên mảng sẽ làm tăng khả năng lai chéo giữa các trình tự không liên quan [27]. Tín hiệu lai khác nhau phản ánh khá xác thực độ khác nhau giữa các mẫu tuy nhiên, khi kết quả lai giống nhau không có nghĩa là những mẫu này giống nhau. Vì có thể tồn tại các trình tự khác biệt nhưng chúng không được đặt thành mẫu dò trên mảng [24]. Tính nhạy và đặc hiệu cũng là một tham số rất quan trọng khi sử dụng microarray để nghiên cứu với các mẫu môi trường. Ở đó, sinh khối hay nồng độ đích thấp và nhiều chất ô nhiễm làm giảm giới hạn phát hiện [6; 26; 25]. Do đó, một số nhà nghiên cứu đã làm giàu mẫu hoặc sử dụng PCR để thu được đủ đích đã đánh dấu [27]. Điều này chắc chắn làm thay đổi các điều kiện môi trường in situ và có thể tác động sâu xa tới biểu hiện gene, thành phần quần xã và cản trở việc định lượng các quần thể tự nhiên [28]. Tính đặc hiệu và độ nhạy cả hai phụ thuộc vào các yếu tố thí nghiệm liên quan đến việc chế tạo mảng và lai. Tất cả các yếu tố như bề mặt hoá học của phiến kính, hình thái chấm, khả năng gắn mẫu dò và các điều kiện lai cũng như rửa đều ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và độ nhạy [29]. Ngoài ra, các cấu trúc bậc hai nội phân tử như cấu trúc kẹp tóc ảnh hưởng lớn đến hiệu quả lai và gây ra sai số [4]. Vấn đề phân tích Các vấn đề phân tích liên quan đến việc thu nhận và giải thích dữ liệu từ các thí nghiệm mảng rất đáng chú ý. Việc giải thích dữ liệu rất khó do luôn tồn tại các khác nhau cố hữu trong thí nghiệm mảng, một phần do các yếu tố thực nghiệm đã đề cập ở trên. Ngoài ra, do thiếu sự lặp lại và định lượng của một số lớn dữ liệu thu được nên làm cản trở việc phân tách các dữ liệu thích đáng. Trừ một số ngoại lệ [30-32], thậm chí hầu hết sự chú ý nhỏ nhất với các tiêu chuẩn phân tích bị bỏ qua trong những nghiên cứu môi trường. Điều này làm phần lớn các kỹ thuật mảng dùng cho môi trường hiện vẫn đang trong giai đoạn phát triển [25]. Tuy còn khá nhiều vấn đề song nếu so sánh với các kỹ thuật trước đây thì những hạn chế của microarray không đáng kể và hoàn toàn có thể bù đắp bởi lợi ích của nó mang lại. Hơn nữa, các hạn chế này đa phần đều có thể khắc phục bằng những cải tiến, phát triển mới trong kỹ thuật. PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG Vi sinh vật đóng vai trò độc nhất vô nhị trong chức năng cũng như trong việc duy trì hệ sinh thái. Mới đây, đã có bằng chứng cho thấy rằng hoạt tính của vi sinh vật là thiết yếu cho tính ổn định của sinh quyển [33]. Trạng thái tồn tại, phân bố của vi sinh vật hoặc quần xã vi sinh vật chỉ thị có thể báo trước các hiệu ứng môi trường trong một thời gian dài. Hầu như mọi thay đổi môi trường đều làm thay đổi thành phần quần xã vi khuẩn. Do đó, có thể phát hiện sớm các yếu tố biến đổi không biết trước bằng cách phân tích biến thiên quần thể hay nói cách khác, có thể sử dụng vi sinh vật để giám sát trạng thái và các biến đổi môi trường [34]. Tuy nhiên, để có thể quản lý môi trường trên diện rộng, cần phân tích một lượng mẫu sinh học khổng lồ, điều này không thể đạt được với các kỹ thuật trước đây [35]. Ngày nay, trong lĩnh vực quản lý môi trường cần phát triển những phương pháp mới để đánh giá tốc độ phân huỷ sinh học, quá trình chuyển hoá sinh học và động học quần xã vi sinh với mục tiêu xác định quần xã, giám sát quá trình và xác định điểm kết thúc phân huỷ sinh học... Trong thực nghiệm, để đạt được những điều trên đòi hỏi phải: (i) xác định đồng thời nhiều loại vi sinh vật, (ii) sử dụng phương pháp phân tích có thể tự động hoá, (iii) giám sát RNA như chỉ thị định tính hoạt tính vi sinh vật và (iv) định lượng mức độ RNA và/hoặc hoạt tính vi sinh vật. Microarray là kỹ thuật thoả mãn các yêu cầu này [6]. Nó mang lại những hứa hẹn trong sinh thái vi sinh vật như phát hiện và định lượng các họ gen liên quan đến các chu trình sinh địa hoá học, phân huỷ sinh học và vi sinh vật gây bệnh với hiệu suất cực cao [31]. Với tập hợp mẫu dò được thiết kế thích hợp, chỉ cần một thí nghiệm để phát hiện vài ngàn chủng vi khuẩn thuộc các loài, giống hoặc phân ngành khác nhau. Điều này có nghĩa là trong các lĩnh vực y học, vi sinh thực vật, vi sinh động vật động vật, quản lý chất lượng thực phẩm, nước chỉ cần một kiểm tra để phát hiện tất cả các vi khuẩn gây bệnh/có lợi/nhiễm tạp có thể có trong mẫu nghiên cứu [36]. Kỹ thuật microarray mới ra đời vào đầu những năm 1990, thực sự phát triển từ năm 1995 và mới được ứng dụng trong lĩnh vực môi trường chỉ vài năm gần đây [6] nhưng đã phát triển rất mạnh mẽ. Một trong các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong quản lý môi trường là xác định vi sinh vật (bảng 1). Các microarray này chứa hàng trăm mẫu dò oligonucleotide, mỗi mẫu dò đại diện cho các chủng/loài/giống vi sinh vật khác nhau cho phép phát hiện nhanh với hiệu suất cao nhiều vi sinh vật từ hầu như bất cứ loại mẫu nào. Khả năng sử dụng các mảng chuẩn đoán vi sinh vật bao phủ hầu như toàn bộ các lĩnh vực khoa học sự sống bao gồm các chuẩn đoán người, thú y, thực vật và động vật, vi sinh môi trường, kiểm tra chất lượng nước… Có thể xác định vi sinh vật gây bệnh cho người từ các mẫu thử nghiệm một cách hoàn hảo với khả năng thiết kế mảng xác định nhanh, không qua nuôi cấy, chỉ trong vài giờ và hầu như bảo trì được thông tin tự nhiên của nó. Cũng có thể dùng microarray để phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, vi sinh vật gây bệnh cho động, thực vật trên quy mô lớn. Ngoài ra còn có thể sử dụng để nghiên cứu mức đa dạng vi sinh vật đất đối với tính chống chịu và độ màu mỡ của đất cũng như biến thiên độ đa dạng theo hoạt động nông nghiệp [33]. Bảng 1: Các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong xác định vi sinh vật   Bên cạnh việc xác định vi khuẩn, DNA array còn có tác dụng đánh giá phân bố gene chức năng trong môi trường tự nhiên. Gene mã hoá các enzyme chức năng trong chu trình sinh địa hoá học (như C, S, N, các kim loại) là dấu hiệu rất hữu ích để giám sát trạng thái sinh lý và hoạt tính chức năng của các quần thể và quần xã vi sinh vật trong môi trường tự nhiên [59]. Bảng 2: Ứng dụng microarray để xác định các tập hợp gene chức năng trong môi trường.  Hầu hết các nghiên cứu đều hướng tới việc giải quyết độ nhạy và tính đặc hiệu của microarray để áp dụng trực tiếp với mẫu môi trường. Một vấn đề khác là khả năng di động của thiết bị để có thể mang tới hiện trường phân tích [62]. Các mối quan tâm này đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng quản lý, giám sát (theo thời gian thực) hoạt tính vi sinh vật trong môi trường cũng như động học quần xã của quá trình phân huỷ sinh học [6]. Các nhà khoa học khắp nơi trên thế giới đã phát triển rất nhiều kỹ thuật khác nhau nhằm giải quyết những hạn chế này. Trong đó những phát kiến về thiết bị hiện ảnh [63; 64], cải tiến thiết bị in mẫu dò [65; 66], cải tiến phân tích, chuẩn hoá dữ liệu [67; 68; 20; 69], phát triển các loại chất phát huỳnh quang mới sẽ không được đề cập đến trong khuôn khổ bài viết này. Ở đây, tôi chỉ tập trung vào hai mảng chính. Thứ nhất là phát triển các phương pháp thực nghiệm mới nhưng vẫn dựa trên mảng cDNA hoặc oligonucleotide (cải tiến loại một). Thứ hai là phát triển các loại array mới, ở đó mẫu dò không phải DNA hay RNA mà là protein, hoá chất, peptide, glycan và PNA (cải tiến loại hai). 1. Các cải tiến loại một 1.1 Cải tiến mẫu dò Sử dụng mẫu dò phụ trợ Small và cộng sự (2001) đã phát triển một phương pháp mới sử dụng bộ mẫu dò phát hiện/bắt giữ (chaperone/detector) [6].  ▲Hình 16: Phương pháp ứng dụng mẫu dò phát hiện chaperone [Theo 6]. Mẫu dò phát hiện ngăn chặn việc tạo thành các cấu trúc nội phân tử giúp tăng hiệu quả lai. Chúng được thiết kế dựa trên đoạn trình tự 16S rRNA đặc trưng loài còn mẫu dò bắt giữ đại diện cho các trình tự bảo thủ giữa các loài. Mỗi mẫu dò phát hiện không lai chéo với RNA không phải đích cũng như không lai với mẫu dò bắt giữ trên mảng (Hình 16). Kết quả cho thấy, bằng cách sử dụng mẫu dò phát hiện đánh dấu biotin gắn với RNA ngay gần mẫu dò bắt giữ cố định trên mảng, Small và cộng sự (2001) có thể xác định trực tiếp (không PCR cũng như làm giàu) 16S rRNA của G.chapellei từ dịch chiết đất có ít nhất 0,5 µg rRNA tổng số (tương đương với 7,5 x 106 tế bào) [6]. Như vậy, phương pháp này có độ nhạy cao, và có thể ứng dụng trực tiếp với các mẫu môi trường mà không cần các bước khuếch đại, làm giàu hay đánh dấu đích. Kết hợp đánh dấu phát huỳnh quang và đánh dấu phóng xạ (Isotope array) Adamczyk và cộng sự (2003) đã kết hợp hai phương pháp đánh dấu phát huỳnh quang và đánh dấu phóng xạ để nghiên cứu đồng thời sự phân bố về mặt chức năng cũng như hoạt tính vi sinh vật trong các mẫu bùn hoạt tính mà không sử dụng phương pháp PCR cũng như nuôi cấy [70]. 1.2 Cải tiến mảng Flow-Thru ChipTM (FTC) Kỹ thuật này tạo ra mảng 3 chiều nhằm tăng cường bề mặt tiếp xúc giữa đích và mẫu dò, do đó tăng cường tốc độ lai [71]. Các cơ chất xốp như mao quản thuỷ tinh, silicon có lỗ thủng do ăn mòn điện hoá (electrochemically etched porous silicon) và màng lọc bằng oxit kim loại thường được sử dụng. Các phân tử mẫu dò gắn trên thành trong của vi kênh (microchanel). Một chấm trên mảng có thể chứa nhiều vi kênh nhưng chỉ có một loại mẫu dò cố định tại đây (Hình 17).  ▲Hình 17: Sơ đồ chế tạo Flow-ThruChipTM []. Kessler và cộng sự (2004) đã tạo ra một FTC chứa trên 700.000 vi kênh đồng nhất/1cm2. Mỗi vi kênh có đường kính 10 µm, dài 450 µm. Mỗi chấm chứa một loại mẫu dò gồm 100 vi kênh. Như vậy, khả năng gắn lớn gấp 100 lần so với phương pháp array truyền thống. Hơn nữa, phản ứng lai được tăng cường do hiệu quả gắn trong vi kênh lớn hơn so với mảng hai chiều. Trong vi kênh, mẫu dò khuếch tán tới đích nhanh hơn, khoảng vài giây trong vi kênh dài 10 µm, trong khi khoảng cách khuếch tán trên chip phẳng khoảng vài mm. Do đó, công nghệ FTC mang lại khả năng gắn lớn hơn, giảm thời gian lai và giảm lượng mẫu cần cho thí nghiệm. Bằng kỹ thuật này, Kessler và cộng sự (2004) đã xác các virus cúm gồm influenza A virus (H1N1, H3N2, H1N2 và H5N1) và influenza B virus với độ nhạy cao (1x102 đến 5x102 hạt virus), trong vòng chưa tới 5h (từ khi nhỏ mẫu vào chip đến khi phân tích kết quả) . MAGIChip (Micro Arrays of Gel-Immobilized Compounds on a Chip) MAGIChip (hay còn gọi là gel array) là microarray dùng phiến kính thuỷ tinh làm giá thể, bên trên gắn các miếng đệm gel polyacry-lamide (gel-pad). Mẫu dò được cố định trên gel pad [72]. Kích thước của miếng đệm này từ 10µm x 10µm x 5µm đến 100µm x 100µm x 20µm với thể tích từ picolit đến nanolit. Mỗi miếng đệm gel đóng vai trò một ống nghiệm chứa mẫu dò DNA vì bề mặt kính kỵ nước xung quanh ngăn cản sự trao đổi dung dịch mẫu giữa các miếng đệm [73]. Việc chế tạo bao gồm các bước sau: tạo mảng với các thành phần gen (pad) trên phiến kính thuỷ tinh, cố định hoá học các mẫu dò trên gel (Hình 18). Các oligonucleotide tổng hợp được tinh chế bằng điện di hoặc HPLC trước khi cố định trên mảng giúp kiểm soát độ sạch và đảm bảo tính đặc hiệu cao. Gel polyacry-lamide giúp tăng khả năng chứa các oligonucleotide cố định trên mảng [5]. Guschin và cộng sự (1997) đã áp dụng kỹ thuật này để nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong các mẫu môi trường. Năm 2001, Mikhailovich và cộng sự dùng MAGI chip với mẫu dò là các oligonucleotide được thiết kế đặc hiệu cho gen rpoB mã hoá tiểu đơn vị β của RNA polymerase để xác định các chủng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc. Lapa và cộng sự (2002) cũng dùng phương pháp này để xác định các loại virus Orthopoxvirus gây bệnh với độ nhạy 102 đến 103 virion [45]. Trong một nghiên cứu khác, phương pháp này được sử dụng để xác định quần xã vi khuẩn khử sulphate phân huỷ toluene và ethylbenzene [46] mang lại hiệu quả rất cao.  ▲Hình 18: Sơ đồ MAGIChip [Theo 72] Chip răng lược (cantilever chip) Với những phát triển thần kỳ của công nghệ nano gần đây, các loại chip mới với vật liệu nano đang thu hút rất nhiều quan tâm của giới khoa học. Mới đây, McKendry và cộng sự (2002) đã chế tạo một loại array mới, dùng giá thể silicon có hình chiếc lược (cantilever). Bên trên, từng loại mẫu dò đã thiol hoá được gắn với các răng lược qua ống vi mao quản trong dung dịch đệm thích hợp (Hình 19). Khi có tương tác phối tử - thụ thể (đích - mẫu dò) sẽ làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm phosphate tích điện âm của DNA mạch kép và tăng mật độ chuỗi gắn trên bề mặt răng lược tạo ra áp lực bề mặt làm răng lược bị cong xuống. Độ cong của răng lược có thể xác định in situ bằng phương pháp quang [74]. Kỹ thuật này tương thích với cả DNA và protein vì cách phát hiện cơ nano (nanome-chanical) này không cần dấnh dấu, các chất phát quang hay các mẫu dò bổ trợ. Hơn nữa thủ tục tiến hành nhanh, có tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng di động cao. Với công nghệ này, cho phép xác định nhanh và chính xác các phân tử đích không đánh dấu ở nồng độ vài nanomole chỉ trong ít phút. Nếu sử dụng các hạt vàng nano thì có thể phát hiện chúng bằng ánh sáng cộng hưởng (resonance light) ở giới hạn chỉ 10 ng. Tính nhạy còn có thể tăng hơn nữa bằng cách sử dụng các lược mỏng hơn. Đáp ứng cơ nano nhạy với nồng độ oligonucleotide cho phép định lượng các phân tử sinh học tồn tại và có hoạt tính trong dung dịch. Ngoài ra còn có thể nghiên cứu nhiệt động học của các tương tác này. Vì vậy, công nghệ mới này đầy hứa hẹn trong phân tích bộ gen, proteomics, chuẩn đoán sinh học và khám phá thuốc. Với độ nhạy cao như vậy cũng mở ra tiềm năng vô cùng lớn trong quản lý môi trường, ở đó nồng đích rất thấp. Hiện tại, có thể tạo ra chip với trên 1000 răng lược [75].  ▲Hình 19: Sơ đồ chip răng lược [Theo 74]. 2. Cải tiến loại hai 2. Cải tiến loại hai 2.1 PNA array Một trong những khía cạnh quan trọng ảnh hưởng đến độ nhạy và tính đặc hiệu của kỹ thuật microarray là khả năng gắn của mẫu dò với đích. Trong các kỹ thuật microarray truyền thống luôn tồn tại mâu thuẫn là: mẫu dò dài thì tính đặc hiệu cao và mẫu dò gắn ổn định với đích nhưng độ nhạy giảm. Còn khi dùng mẫu dò ngắn (oligonucleotide) thì độ nhạy cao nhưng tính đặc hiệu và mức độ ổn định của cấu trúc đích-mẫu dò lại giảm. Như đã biết, mạch khung của axit nucleic là một chuỗi các nhóm phosphate tích điện âm nối với nhau qua liên kết phosphodiester. Vì vậy, khi tạo thành mạch kép hai chuỗi khung luôn có xu hướng đẩy nhau do tích điện cùng dấu làm giảm độ ổn định của cấu trúc đích-mẫu dò. Có thể dùng muối để trung hoà lực đẩy này. Muối làm ổn định cấu trúc xoắn kép nhưng cũng ổn định hoá cấu trúc bậc hai và bậc ba nội phân tử làm giảm hiệu quả lai [76]. Các vấn đề trên dẫn tới nhu cầu phát triển một loại mẫu dò mới vừa nhạy, vừa đặc hiệu. Các oligomer peptide nucleic acid (PNA) có thể đáp ứng yêu cầu này. PNA có cấu trúc giống như DNA, chỉ khác ở chỗ nhóm phosphate và liên kết phosphodiester của DNA được thay bằng nhóm N-(2-aminoethyl)-glycine và liên kết amide. Các nucleobase gắn với khung bởi liên kết ethylene carbonyl (Hình 20). Chúng ta đã có 50 năm khám phá ra chuỗi xoắn kép DNA, nhưng mới chỉ có 10 năm khám phá ra PNA [77]. Tuy nhiên PNA đã và đang được phát triển cho nhiều ứng dụng khác nhau. Một trong số đó là PNA array. Sử dụng PNA làm mẫu dò có một số thuận lợi lớn. Thứ nhất, bộ khung của PNA không tích điện do đó triệt tiêu lực đẩy giữa hai mạch cấu trúc PNA-DNA. Vì vậy, tính ổn định của các phân tử mạch kép PNA-DNA trong điều kiện sinh lý tăng xấp xỉ 1,5oC so với liên kết DNA-DNA [78]. Thứ hai, có thể tiến hành phản ứng lai trong điều kiện nồng độ muối đệm thấp hoặc thậm chí không cần. Thứ ba, liên kết bổ sung giữa hai mạch PNA và DNA đặc hiệu hơn [79]. Thứ tư, PNA không bị phân cắt bởi protease hoặc nuclease do đó có thể thiết kế mẫu dò ngắn hơn [80]. Cuối cùng, ưu điểm quan trọng nhất là có thể phát triển các phương pháp phát hiện ảnh tốt hơn so các phương pháp truyền thống nhắm vào cấu trúc khác biệt giữa DNA và PNA [76; 80].  ◄Hình 20: Cấu trúc phân tử PNA. Ở đó nhóm phosphate và liên kết phospho-diester của DNA được thay bằng nhóm N-(2-amino-ethyl)-glycine và liên kết amide. Các nucleobase gắn với khung bởi liên kết ethylene carbonyl [Theo 76]. Có hai cách chế tạo mảng PNA là tổng hợp in situ và gắn các mẫu dò được tổng hợp từ trước lên mảng [80]. Ngoài việc thay mẫu dò oligonucleotide bằng mẫu dò PNA, các bước khác vẫn tiến hành giống như DNA array truyền thống. Gần đây, bằng cách kết hợp PNA array với phương pháp phát hiện TOF-SIMS (time-of-flight secondary ion mass spectrometry), Brandt và cộng sự (2003) đã tạo ra một phương pháp có độ nhạy cao để phát hiện trực tiếp các đích RNA hoặc DNA không cần đánh dấu. Những tiến bộ về mặt kỹ thuật này đã mở ra hướng ứng dụng vô cùng to lớn của PNA array trong quản lý môi trường [80]. 2.2 Nanowire array Một trong những vấn đề rất quan trọng trong lĩnh vực quản lý môi trường là cần phát hiện nhanh, nhạy và có chọn lọc các loại virus gây bệnh. Các dây nano silicon được tổng hợp và gắn trên bề mặt giá thể silicon bằng phương pháp in quang hoạt. Sau đó gắn cộng hoá trị các thụ thể kháng thể trên dây nano bằng xử lý hoá học. Mẫu virus được phân phối tới thiết bị qua các kênh dẫn lỏng, kênh polymer dẻo hoặc khe tạo thành giữa lớp thuỷ tinh đặt trên trên bề mặt và chip.  ►Hình 21: Sơ đồ thiết bị mảng dây nano dùng để phát hiện các virus đơn lẻ. Bên trái là sơ đồ thiết bị gồm 2 dây nano. Hai dây nano 1 và 2 gắn trên đó các thụ thể kháng thể khác nhau. Sự gắn đặc hiệu của một virus trên các thụ thể của dây nano 2 tạo ra sự biến đổi độ dẫn (bên trái) do điện tích bề mặt của dây nano bị biến đổi. Khi tách virus khỏi bề mặt, độ dẫn trở lại giá trị đường thẳng như ban đầu [Theo 81]. Ưu điểm của loại array này là có thể xác định tín hiệu lai bằng hai cách. Cách thứ nhất là đo độ dẫn điện thay đổi qua thời gian thí nghiệm. Khi virus gắn đặc hiệu trên các thụ thể của dây nano làm cường độ dòng điện qua nó biến đổi vì điện tích bề mặt của dây nano đã bị biến đổi. Khi tách virus ra khỏi bề mặt, độ dẫn trở lại đường thẳng như ban đầu (hình 21). Độ dẫn khác nhau khi số lượng cũng như chủng loại virus gắn với thụ thể trên dây nano khác nhau. Cách thứ hai là đo quang. Khi cho dòng điện chạy qua, dây nano phát quang. Có thể dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang để đánh dấu các hạt virus. Dùng hai loại kính hiển vi khác nhau xác định đồng thời tín hiệu phát quang của dây nano và thuốc nhuộm. Trong thực nghiệm, ảnh phát sáng, phát huỳnh quang cùng dữ liệu độ dẫn được xác định đồng thời. Dữ liệu phát sáng cho biết vị trí của dây nano cùng với màu phát huỳnh quang kết hợp với nhau cho thấy vị trí tương đối của dây nano và sự di động của các hạt virus. Độ dẫn giúp xác định loại virus và định lượng chúng [81]. Bằng cách này Patolsky và cộng sự (2004) đã xác định hai loại virus khác nhau là influenza A (kháng thể của chúng nằm trên dây 1) và adenovirus (kháng thể của chúng nằm trên dây 2). Độ dẫn điện thu được khi hai loại virus gắn với hai dây nano sẽ khác nhau do mật độ điện tích bề mặt của hai virus khác nhau [81]. Như vậy, có thể xác định trực tiếp các virus với tính đặc hiệu cao bằng mảng dây nano mà không cần bất cứ bước tinh sạch hay khuếch đại nào. Loại mảng này có thể xác định được một virus hoặc nhiều virus đồng thời. Bằng các phương pháp kết hợp để tạo ra những mảng dây nano lớn hơn, có tính tái sử dụng cao hơn [82], phương pháp này hứa hẹn nhiều chiển vọng có thể xác định đồng thời trên 100 loại virus khác nhau [81]. 2.3 Peptide array Khái niệm peptide array được đưa ra đầu tiên ngay từ năm 1984 khi các phương pháp tổng hợp hoá học kết hợp phát triển cao [83]. Protein đóng vai trò quan trọng trong tất cả các quá trình của tế bào. Vai trò này của chúng bao gồm các thụ thể bề mặt tế bào, làm trung gian bám dính tế bào, các yếu tố nhận biết phân tử bởi đó protein adaptor xác định hoạt tính hoá sinh và hoạt tính enzyme trải qua chức năng trao đổi chất và chuyển hoá dấu hiệu. Trong một số trường hợp, hoạt tính sinh học của protein có thể khu trú thành các peptide ngắn hơn. Các peptide này có trình tự bậc một (mặc dù thường mất một phần hoạt tính). Hơn nữa, trong khi protein thường bị biến tính và mất hoạt tính sinh học, peptide lại có chức năng tương đối ổn định, chúng có thể giữ hoạt tính dưới hầu hết các điều kiện phản ứng. Do đó peptide được ưu tiên phát triển cho các thí nghiệm sàng lọc, đặc biệt trong các kỹ thuật microarray. Vào thập kỷ trước, các tiến bộ trong hoá học và sinh học phân tử cho phép tổng hợp nhiều loại peptide có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau [84]. Những điều trên là tiền đề ra đời peptide array. Có thể sử dụng peptide array để sàng lọc nhiều tương tác khác nhau như sự gắn của protein, hoạt tính enzyme, bám dính của tế bào [85], sự gắn của kim loại [86] …  ▲Hình 22: Sơ đồ nguyên lý peptide array [Theo [87]. Có nhiều phương pháp được sử dụng để chế tạo peptide array. Trong đó tổng hợp peptide in situ hoặc gắn các peptide chức năng trên chip là hai phương pháp thường dùng nhất [87; 84]. Hiện nay, hầu hết peptide array được tạo ra để nghiên cứu kinase vì sự phosphoryl hoá protein bởi kinase là một trong những cơ chế điều hoà chức năng tế bào quan trọng nhất. Một ứng dụng quan trọng khác của peptide array là phát hiện cơ chất/sự kìm hãm của các hydrolase bao gồm protease và các loại enzyme thuỷ phân khác như lipase, esterase… [84]. Duburcq và cộng sự (2004) đã sử dụng peptide/protein microarray để xác định kháng thể gắn với mảng qua tín hiệu phát huỳnh quang và ứng dụng phương pháp này để nghiên cứu kháng thể kháng virus viêm gan B/C, virus suy giảm miễn dịch của người, Epstein-Barr virus và các kháng nguyên bệnh giang mai (syphilis antigens) với độ nhạy và tính đặc hiệu cao [88]. Trong một ví dụ thú vị khác, Gao và cộng sự (2003) đã sử dụng peptide array để xác định các phối tử gắn chọn lọc với muối Pb(II), mở ra hướng sử dụng peptide array làm điện cực kiểm soát các kim loại độc trong môi trường [86]. 2.4 Glycan array Với trên 50% protein mang các chuỗi glycan (olygosaccharide), glycomics và proteomics cùng nổi lên với vai trò là hai lĩnh vực nghiên cứu phát triển sau kỷ nguyên genomics. Các tương tác carbonhydrate-protein trong oligosaccharide liên kết protein đặc hiệu và các protein gắn bổ sung của chúng thường liên quan trực tiếp đến rất nhiều quá trình sinh học khác nhau. Các tương tác này xảy ra trong tế bào, trên bề mặt tế bào, trong chất nền (matrix) ngoại bào hoặc trong các chất tiết (secrection) [89]. Chúng tham gia vào quá trình gấp nếp của protein mới sinh trong lưới nội chất, quá trình enzyme lysosomal mới tổng hợp hướng tới nơi đến chính xác của chúng và quá trình hoạt hoá tế bào trong cơ chế viêm cũng như sự bám dính của vi khuẩn với các tế bào chủ. Chính vì glycan đóng cai trò rất quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như vậy mà người ta đã phát triển một loại mảng mới là glycan array. Ở đó, sử dụng chất sử dụng cơ chất là phiến kính thuỷ tinh bọc nitrocellulose, nhựa plastic, phiến kính phủ vàng [90], phiến kính thuỷ tinh hoạt hoá thiol-, đĩa silica-gel hay giếng chuẩn nhỏ thuỷ tinh (plastic microtitre well). Mẫu dò có thể là glycoprotein, polysacchride, mono hay oligosaccharide [89]. Dùng các phương pháp hoá học để gắn mẫu dò đã tổng hợp từ trước với với mảng. Sau đó cho dung dịch chứa protein đích đi qua và xác định dấu hiệu lai bằng các phương pháp thích hợp (hình 23).  ▲Hình 23: Sơ đồ quá trình chế tạo và sử dụng glycan array [Theo 89]. Blixta và cộng sự (2004) đã sử dụng glyco array để phân tích hầu hết các nhóm GBP (glycan binding protein) quan trọng bao gồm lectin động vật (lectin loại C, galectin, và siglec), lectin thực vật, lectin của vi khuẩn và virus, và các virus nguyên vẹn [90]. Kết quả cho thấy có thể dùng glyco array để xác định virus HIV-1, virus cúm (influenza virus). 2.5 Protein array Gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã phát triển protein microarray để phân tích đồng thời nhiều protein. Protein microarray chứa một lượng nhỏ protein tinh khiết trên một mảng với mật độ lớn. Các protein có thể được sàng lọc với hiệu suất cao cho hoạt tính hoá sinh, các tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA và protein-phối tử [91]. Trong kỹ thuật protein array, phiến kính thuỷ tinh là cơ chất, trên đó gắn hàng ngàn mẫu dò protein. Sau đó cho mẫu sinh học đi qua chip và đánh giá hiệu quả gắn [92]. Mặc dù kỹ thuật protein chip không phát triển mạnh như DNA array, sự cải thiện của chúng chắc chắn sẽ xảy ra vì protein là trung gian của hầu hết các chức năng của tế bào. Do đó protein chip là các công cụ được dành để xác định các cơ sở phân tử của bệnh, cơ chế cơ bản của hoạt tính thuốc và độc tính [92]. Bảng 3: Các loại protein microarray [93].  Một số thách thức quan trọng của kỹ thuật protein chip là: -     Tìm kiếm bề mặt hoá học thích hợp để cố định các protein có cấu trúc và chức năng khác nhau lớn mà vẫn giữ được cấu trúc bậc hai và bậc ba có hoạt tính sinh học của chúng [92]. -     Xác định và phân lập các chất bắt giữ thích hợp (như kháng thể) của protein quan tâm [92]. -     Phương pháp phát hiện đủ nhạy và sự giám sát đánh giá rộng mức độ gắn protein [94; 92]. -     Khả năng thu lại protein đã phát hiện từ chip và phân tích nó tiếp theo nếu cần [92]. -     Dải động học phát hiện lớn để bao phủ dải rộng được thể hiện bởi các nồng độ protein khác nhau [92]. -     Không có phương pháp khuếch đại như kiểu PCR để khuếch đại protein [94; 92]. Gắn protein trên mảng Giống như DNA microarray, protein array được tạo ra trên cơ chất thuỷ tinh hoặc silicon cái được xử lý với aldehyde hoặc các chất khác để cố định protein bắt giữ như kháng thể bằng các biến đổi hoá học. Một số cách khác dùng để tạo ra mảng protein là sử dụng các lớp nhôm hoặc vàng, các polyme ưa nước và polyacrylamide gel để cố định các chất bắt giữ [92]. Các chất bắt giữ Các kháng thể được cố định thường được sử dụng như các chất bắt giữ. Protein chip gồm một mảng chứa các kháng thể (đơn dòng, đa dòng, các đoạn kháng thể). Các chất bắt giữ khác được sử dụng là các aptamer (các axit nucleic mạch đơn tạo phức với protein) và các oligonucleotide gắn đặc hiệu với protein [92]. Phát hiện Phương pháp phát hiện huỳnh quang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên điều này cần đánh dấu các protein bằng fluorochrome. Rủi ro là sự gắn với chất này có thể thay đổi tính ổn định gắn của protein với chất bắt giữ được cố định [92].  ▲Hình 25: Gắn protein lên giá thể [Theo 11]. Nettikadan và cộng sự (2003) đã tạo ra ViriChip để xác định bacteriophage fd, các loại canine parvovirus và coxsackievirus B3 Nancy [95]. Trong đó, các miền kháng thể bắt giữ đặc hiệu những vị trí xác định của virus được đặt trên mảng. Phát hiện virus gắn trên mảng bằng kính hiển vi năng lượng nguyên tử (atomic force microscopy, ATM). Kỹ thuật này cho phép xác định nhanh, không cần đánh dấu hay khuếch đại đích. ViriChip có tính đặc hiệu rất cao do dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, độ nhạy cũng cao với dải nồng độ phát hiện virus là 108 đến 1012 pfu/ml. ViriChip có thể xác định đồng thời 5 loại virus trong thời gian chưa đến 1 giờ [95]. PHẦN III_ KẾT LUẬN PHẦN III_ KẾT LUẬN Như vậy, có thể thấy rằng hiện ngày càng có nhiều kỹ thuật array mới được phát triển nhằm giải quyết các vấn đề phức tạp trong sinh học phân tử, y học, di truyền học... Và việc áp dụng những tiến bộ đó vào quản lý môi trường cũng không nằm ngoài vòng xoáy phát triển. Trong bài viết này, tôi đã cố gắng trình bày những kỹ thuật array mới nhất. Mặc dù một số kỹ thuật tôi trình bày ở đây vì quá mới nên cho đến nay chưa được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực môi trường. Tuy nhiên, khả năng giải quyết các vấn đề môi trường phức tạp và đa dạng của nó trong tương lai là không thể phủ nhận. Có thể nhận định rằng, chỉ vài năm nữa thôi, tốc độ phát triển và tính khả dụng của microarray sẽ không thua kém sự phát triển và khả năng ứng dụng thần kỹ của kỹ thuật PCR trước đây. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Rampal, J. B. 2001. DNA Arrays: Methods and Protocols. 1 ed. Totowa, NJ: Humana Press. 2.     Debouck, C., and P. N. Goodfellow. 1999. DNA microarrays in drug discovery and development. Nature genetics supplement. 21:48-50. 3.     Schena, M., D. Shalon, R. Heller, A. Chai, P. O. Brown, and R. W. Davis. 1996. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:10614-10619. 4.     Hacia, J. G. 1999. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nature genetics supplement. 21:42-47. 5.     Guschin, D. Y., B. K. Mobarry, D. Proudnikov, D. A. Stahl, B. E. Rittmann, and A. D. Mirzabekov. 1997. Oligonucleotide Microchips as Genosensors for Determinative and Environmental Studies in Microbiology. Appl. Environ. Microbiol. 63:2397-2402. 6.     Small, J., D. R. Call, F. J. Brockman, T. M. Straub, and D. P. Chandler. 2001. Direct detection of 16S rRNA in soil extracts by using oligonucleotide microarrays. Appl. Environ. Microbiol. 67:4708-4716. 7.     Lorkowski, S., and P. Cullen. 2004. Analysing Gene Expression: Possibilities and Pitfalls. 1 ed. New York: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. 950 p. 8.     Hasseman, J., and D. Gers

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docỨng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường.doc
Luận văn liên quan