Ứng dụngphơng pháp PCR - Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú

i đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại và DNA thật tinh sạch thì phản ứng PCR mới tối ưu (trích dẫn từ Trần Thị Mỹ Duyên, 2006). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 2.3.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Ngày nay, phương pháp PCR đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khoa học cũng như y học và khoa học hình sự như xác định trình tự các đoạn ADN, tiến hoá phân tử, phục hồi gen, phát hiện mầm bệnh, vi sinh vật, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của các loài động vật và thực vật…Trong Thủy sản PCR đã được áp dụng để phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thuỷ sản có chất lượng tốt trong sản xuất giống và ương nuôi. Đồng thời PCR còn được ứng dụng đánh giá xu hướng an toàn hàng thuỷ sản (xuất khẩu) và góp phần vào qui trình xác định trình tự nucleotide đột biến của các tác nhân gây bệnh, hay các loài động vật thuỷ sản (trích dẫn từ Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 Chương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ 25/12/2008 – 30/04/2009 Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ: - Que nghiền - Máy ly tâm - Eppendorf 1,5ml, 0,5 ml, 0,2ml - Cân điện tử - Bộ pipette, găng tay - Máy vortex - Đầu col 200µl và 1000µl. - Bếp nhiệt khô - Máy ủ - Máy sấy chân không - Máy PCR - Bộ điện di - Thiết bị chụp ảnh gel - Lò vi sóng (microwave),.. Hoá chất: - Ly trích: CTAB Solution, Dissolve solution, ethanol 95%, Chloroform, dung dịch TE. - Khuếch đại: nước cất tiệt trùng, dung dịch Buffer 10X, MgCl2 25mM, dNTP mix 10 mM, Taq ADN Polymerase, mồi ORF 94 - F, mồi ORF 94 - R và mồi ORF 125 flank (Forward, Reverse). - Điện di: Agarose, Ethidium bromide, 6X loading Dye, thang ADN 1 kb plus (Invitrogen) và thang ADN 100 bp plus. 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu axit nucleic trữ năm 2006 (67 mẫu - Cà Mau và 87 mẫu - Bạc Liêu) - Mẫu tôm sú thu ở tỉnh Cà Mau vào năm 2008 (231 mẫu, Cà Mau). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-2000 WSSV (Công ty Farming Intelligene Technology Coperation, Đài Loan), gồm các bước sau: Chuẩn bị mẫu Cho khoảng 20mg mang tôm vào ống eppendorf (1,5ml) chứa 0,6ml dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền. Ly trích ADN Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 700 ml Chloroform, vortex kỹ 20 giây và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm 100ml CTAB Solution và 900 ml nước cất, lắc đều, sau đó ủ ở 75oC trong 5 phút. Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bỏ phần nước trong ở trên, hoà tan phần còn lại bằng 150 ml Dissolve solution, ủ ở 75oC trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên sang eppendorf mới có chứa 300 ml ethanol 95%. Lắc đều, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa ADN với 200 ml ethanol 70%, để lắng xuống. Làm khô ADN và hoà tan trong TE. Bảo quản ADN ly trích ở -80oC. Khuếch đại ADN Thực hiện phản ứng PCR 2 bước + Phản ứng PCR bước 1: 8 ml/phản ứng First PCR PreMix 7,5 ml IQzyme ADN Polymerase 2 U/ml 0,5 ml + Phản ứng PCR bước 2: 15 ml/ phản ứng Nested PCR PreMix 14 ml IQzyme ADN Polymerase 2 U/ml 1 ml PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 PCR bước 1 (First PCR): 94oC trong 2 phút 15 chu kỳ: 94oC trong 20 giây 62oC trong 20 giây 72oC trong 30 giây Sau đó, 72oC trong 30 giây 20oC trong 30 giây. PCR bước 2 (Nested PCR) 30 chu kỳ: 94oC trong 20 giây 62oC trong 20 giây 72oC trong 30 giây Sau đó, 72oC trong 30 giây 20oC trong 30 giây. Điện di Chuẩn bị bản thạch (gel): đun nóng dung dịch đệm TAE 1X với agarose 1,5% (1,5g/100ml) cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó, nhuộm gel với 4µl Ethidium Bromide, lắc đều hoà tan dung dịch. Để nguội khoảng 50oC, rồi đổ dung dịch agarose từ từ vào khay đựng gel. Thường bề dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược khoảng 0,3 - 0,5 cm, bề dày của gel không quá 0,8 cm. Điện di: Cẩn thận cho mẫu, thang ADN, đối chứng âm, đối chứng dương vào trong từng giếng. Sau đó, điện di với dòng điện 90V trong thời gian khoảng 50 phút. Đọc kết quả: kết quả điện di được ghi nhận với thiết bị chụp ảnh gel (Vilber Loumart). - Mẫu dương tính được phát hiện với các trường hợp: (i) hiện vạch tương ứng 296 bp và 848bp (mẫu nhiễm rất nhẹ); (ii) hiện vạch tương ứng 296 bp (mẫu nhiễm nhẹ); (iii) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550 bp (mẫu nhiễm trung bình); (iv) hiện vạch tương ứng 296 bp và 550 bp và vạch trên 848bp (mẫu nhiễm nặng) - Mẫu âm tính hiện vạch tương ứng 848 bp (nội chuẩn của tôm). - Nếu mẫu không hiện vạch nào là do chất lượng ADN ly trích kém. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF94 (Wongteerasupaya et al., 2003, do Trần Thị Mỹ Duyên tối ưu năm 2006). Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng) Hóa chất Nồng độ Nước PCR buffer 1X MgCl2 1,5 mM dNTPs mix 200 µM Taq DNA polymerase 2,5 U ORF94 - F 25 pmol ORF94 - R 25 pmol ADN chiết tách 2 µl Trình tự cặp mồi ORF94: Tên mồi Trình Tự ORF94-F 5’-TCT ACT CGA GGA GGT GAC GAC-3’ ORF94-R 5’-AGC AGG TGT GTA CAC ATT TCA TG-3’ Điều kiện phản ứng: 85oC trong 15 giây 40 chu kỳ: 94oC trong 20 giây 60oC trong 20 giây 72oC trong 1 phút và 72oC trong 10 phút 20oC trong 1 phút. Cách đọc kết quả: Xác định số vùng lặp lại 54 bp với công thức X = x + 54*n Trong đó, X : là chiều dài sản phẩm n : là số lần lặp lại của trình tự 54 bp x : là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Phương pháp PCR-genotyping dùng để xác định số vùng lặp lại thuộc ORF125 (Bui Thị Minh Dieu et al.,2004, do Nguyễn Thị Thuý Hằng tối ưu năm 2008) Thành phần phản ứng: (25µl/phản ứng) Hóa chất Nồng độ Nước PCR buffer 1X MgCl2 2,0 mM dNTP mix 200 µM Taq DNA polymerase 2,5 U ORF125 - flank Forward 20 pmol ORF125 - flank Reverse 20 pmol ADN chiết tách 1 µl Trình tự cặp mồi ORF125: Điều kiện phản ứng: 94oC trong 3 phút 35 chu kỳ: 94oC trong 30 giây 52oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút và 72oC trong 7 phút Cách đọc kết quả: Xác định số vùng lặp lại 69bp với công thức X = x + 69*n Trong đó, X: là chiều dài sản phẩm (bp) n: là số lần lặp lại của trình tự 69 bp x: là khoảng cách từ vị trí con mồi đến vùng lặp lại (bp) Tên mồi Trình Tự ORF125 flank - Forward 5'-CGA AAT CTT GAT ATG TTG TGC-3' ORF125 flank - Reverse 5'-CCA TAT CCA TTG CCC TTC TC-3' PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000 Mẫu phân tích gồm có 23 ao nuôi với mô hình quãng canh cải tiến. Mẫu thu gồm có tôm và một số loài giáp xác tồn tại trong cùng 1 ao nuôi. Trong đó, mẫu phân tích thuộc mẫu tôm thả nuôi Lần 1 (thu ngày 14/11/2008) và mẫu tôm thả nuôi Lần 2 (thu ngày 11-15/12/2008). Thông tin chi tiết thể hiện ở bảng Phụ lục I. Ly trích axit nucleic các mẫu thu và phát hiện bệnh đốm trắng bằng kit IQ-2000 ta được kết quả như sau: Bảng 4.1- Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích Loài Tổng số mẫu âm tính (-) Tổng số mẫu dương tính (+) Tổng số mẫu Phân tích (%) nhiễm Tôm Lần 1 21 62 83 75 Lần 2 49 68 117 58 Cua 18 13 31 42 Tổng 88 143 231 62 Qua kết quả trên, cho thấy các ao thu mẫu mặc dù ít thấy dấu hiệu bệnh lý và tỉ lệ chết rất thấp (theo thông tin thu mẫu) nhưng khi phân tích mức độ nhiễm bệnh lại khá cao chiếm 62% so với tổng số mẫu phân tích. Mẫu dương tính ở đợt thả giống lần 1 (chiếm 75%) cao hơn so với mẫu tôm ở đợt thả giống lần 2 (chiếm 58%) và mẫu cua (chiếm 42%) (Hình 4.1). Ở tôm nuôi lần 1, tôm nhiễm ở cả 3 mức độ nhẹ (+), trung bình (++) và nặng (+++), nhiễm nhẹ xuất hiện nhiều nhất (chiếm 45% so với tổng số mẫu tôm nuôi lần 1) nhưng ở tôm nuôi lần 2 tôm chỉ nhiễm nhẹ hoặc nhiễm nặng (nhiễm vừa chiếm 0%). Đối với các mẫu cua những mẫu dương tính chỉ nhiễm ở mức độ nhẹ (+) không thấy mức độ nhiễm nặng và nhiễm vừa (Thông tin chi tiết bảng Phụ lục II). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5%. M: thang ADN (kit IQ2000) Giếng 1, 6: mẫu nhiễm vừa (++) Giếng 2, 4, 5: mẫu nhiễm nhẹ (+) Giếng 3 : mẫu âm tính (-) Giếng 7, 8, 9, 10, 11, 12: mẫu nhiễm nặng (+++) (-): Đối chứng âm (+): Đối chứng dương. Theo nghiên cứu của Tô Vũ An (2008) khi phân tích những mẫu tôm dương tính ở các ao nuôi với mô hình quãng canh cải tiến ở Cà Mau cũng cho kết quả tương tự. Nghiên cứu cho thấy, các ao thu mẫu cũng ít thấy dấu hiệu bệnh lý, khi phân tích tỉ lệ ao nhiễm bệnh chiếm 50% (12/24 ao). Mức độ nhiễm (+) có tỉ lệ cao nhất chiếm 53% (so với tổng số mẫu dương) và mẫu nhiễm (+++) chỉ chiếm 10%. Nhưng khác với nghiên cứu của Triệu Thanh Tuấn (2006), khi phân tích WSSV nhiễm trên tôm của các ao thu ở mô hình nuôi thâm canh và bán thâm canh ở tỉnh Cà Mau, theo thông tin của tác giả mẫu tôm thu cho nghiên cứu đều có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng và tỉ lệ chết hầu như 100% ở các ao. Khi phân tích bằng Nested - PCR cho kết quả dương tính 100% ở các ao và mẫu nhiễm (+++) ở mức cao nhất chiếm 67%, còn mẫu nhiễm (+) chỉ chiếm 33%. Do đó, cho thấy có sự khác biệt lớn về tỉ lệ chết, mức độ nhiễm bệnh cũng như sự bộc phát bệnh của WSSV ở 2 mô hình nuôi này. Theo Tsai et al., 1999 nghiên cứu khả năng bộc phát bệnh đốm trắng nhiễm trên tôm bằng cách cho tôm này nhiễm WSSV xuyên suốt từ giai đoạn trứng đến Postlaver và sau đó tôm này được nuôi với mật độ 24 con/m2 trong ao có diện tích 200m2 cho đến khi tôm trưởng thành. Kết quả cho thấy rằng đàn tôm M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - + 848 bp 630 bp 333 bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 mang mầm bệnh WSSV nhiễm với cường độ thấp sau 1 thời gian dài thì mầm bệnh mới bộc phát và gây tỉ lệ chết lớn. Tác giả còn đưa ra giả thiết rằng việc bộc phát bệnh là phụ thuộc vào chế độ quản lý ao nuôi. Nếu tôm chỉ nhiễm nhẹ và các điều kiện gây sốc thấp thì bệnh không bộc phát và ngược lại, nếu điều kiện gây sốc đủ lớn bệnh sẽ bộc phát dù chỉ nhiễm ở mức độ nhẹ. Từ kết quả của nghiên cứu trên cho thấy, có thể sự nhiễm bệnh ở 2 mô hình nuôi có khả năng là giống nhau nhưng tuỳ vào chế độ quản lý và các điều kiện gây sốc khác nhau nên dẫn đến tỉ lệ chết và mức độ nhiễm bệnh ở 2 mô hình nuôi là khác nhau. Đối với mẫu cua thu kèm theo 17 ao ở đợt tôm thả giống lần 1. Khi phân tích PCR-WSSV- IQ2000, ở mẫu cua những mẫu dương tính chỉ tìm thấy mức độ nhiễm nhẹ (+) chiếm 42% (13/31 mẫu cua) tương ứng với 12 ao tôm thu mẫu (Bảng 4.2). Như vậy, tỉ lệ cảm nhiễm WSSV trong các mẫu giáp xác thu tại mô hình QCCT cũng tương đối cao. Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tôm và mẫu cua dương tính được phân tích. TT KH Ao Số mẫu tôm thu Lần 1 dương tính với WSSV Mẫu cua Số mẫu dương tính Mức độ nhiễm 1 CN08B 3 1 + 2 CN08C 1 1 + 3 CN08H 4 1 + 4 CN08N 5 1 + 5 CN08P 4 1 + 6 CN08S 5 1 + 7 CN08T 3 1 + 8 CN08W 5 1 + 9 CN08X - 1 + 10 TB08B 4 1 + 11 TB08K 3 1 + 12 TB08M 3 2 + Tổng số mẫu 40 13 Theo Supamattaya & Boonyaratpalin (1996), cho rằng WSSV có vật chủ cảm nhiễm rộng và nhiễm cho tôm nuôi thông qua nguồn nước hoặc từ các loài động vật làm thức ăn cho tôm đã bị nhiễm bệnh. Ngoài ra, phương thức lan truyền cũng có khả năng là do các loài nhiễm bệnh do sống cùng với loài không bị nhiễm xảy ra ở cả tôm nuôi và tôm ngoài tự nhiên (Flegel 1997, Flegel & Alday-Sanz 1998). Các con đường lan truyền trên cho thấy phù hợp với trường hợp mẫu phân tích vì mẫu thu ở mô hình QCCT, tôm thả với mật độ thấp (0,5 - 2 con/m2) và giống được thả liên tiếp qua các đợt nuôi trong cùng 1 ao, cùng nguồn nước PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 mà không qua xử lý và mẫu cua ở 12 ao trong số 23 ao cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Do đó, dẫn đến tôm nhiễm WSSV qua 2 đợt nuôi liên tiếp là dễ dàng. Ngoài ra, khả năng nguồn bệnh xuất phát từ nguồn tôm giống cũng có thể xảy ra vì theo thông tin thu mẫu các chủ hộ mua tôm giống đều không biết nguồn gốc và không xét nghiệm tôm giống. Qua kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000, chỉ biết được mức độ nhiễm bệnh đốm trắng và giải thích nguyên nhân nhiễm bệnh giữa các đợt nuôi là do nguồn giống hay do giáp xác chỉ ở mức độ giả thiết. Do đó, tiếp tục phân tích những mẫu dương tính với WSSV bằng phương pháp PCR- Genotyping để tìm hiểu thêm về nguồn gốc của sự nhiễm WSSV trong các ao nuôi này. 4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping 4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 Qua phân tích những mẫu dương tính với WSSV bằng phương pháp PCR- Genotyping khuếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là 54 bp thuộc ORF94. Kết quả tổng hợp giữa 2 lần thu mẫu tôm và mẫu cua thu kèm theo lần 1 cho thấy, có 11 nhóm vùng lặp lại khác nhau, từ 4 - 16 vùng lặp lại (Bảng 4.3). Trong đó, số vùng lặp lại có tần số xuất hiện cao nhất là 11 vùng lăp lại (VLL) chiếm 35,8% (43/120 tổng số mẫu), không thấy 5 và 7-VLL. Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Loài nhiễm Số Mẫu Số Ao Tần số (%) so với tổng số mẫu 4 Tôm 1 1 0,8 5 6 Tôm 1 1 0,8 7 8 Tôm, Cua (1) 17 7 14,2 9 Tôm, Cua (1) 5 3 4,2 10 Tôm, Cua (4) 25 13 20,8 11 Tôm, Cua (1) 43 11 35,8 12 Tôm, Cua (1) 10 4 8,3 13 Tôm, Cua (1) 4 4 3,3 14 Tôm 24 8 20 15 Tôm 2 1 1,7 16 Tôm 1 1 0,8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 Khác với các nghiên cứu trước đây (Hoa et al., 2005; Diệu et al., 2004; Triệu Thanh Tuấn và Lê Vân Hải Yến năm 2006; Tô Vũ An và Lý Ngọc Hà năm 2008 (ở Việt Nam) và cả Pradeep et al., 2007 (ở Ấn Độ), tìm hiểu về kiểu gen thuộc 1 số ORF của WSSV nhiễm trên tôm bằng phương pháp PCR - genotyping, chưa tìm thấy kiểu gen 11-VLL thuộc ORF94. Nhưng ở Thái Lan năm 2003 đã tìm thấy vùng lặp lại thuộc kiểu gen này với tần số xuất hiện rất thấp 0.02 (1/55ao và chỉ tìm thấy 1 mẫu trên 1 ao này) (Wongteerasupaya et al., 2003). Điều này cho thấy, sự đa dạng về kiểu gen của WSSV tại Việt Nam. Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 Giếng M: Thang ADN 100 bp plus Giếng 1: mẫu có 4-VLL Giếng 2: mẫu có 8-VLL Giếng 3: mẫu có 9-VLL Giếng 4 và 10: mẫu có 10-VLL Giếng 5 và 8: mẫu có 11-VLL Giếng 6 và 7: mẫu có 14-VLL Giếng 9: mẫu có 6- và 13-VLL. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 500 bp 1000 bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 7 3,5 38,6 3,51,8 19,3 5,3 17,5 1,8 5,3 10,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 6 8 9 10 11 12 13 14 15 Số vùng lặp lại thuộc ORF94 T ỉ l ệ (% ) Cái Nước Thới Bình Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống Lần1 193,71,9 75,9 7,47,4 1,9 7,4 1,9 1,9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4 8 9 10 11 13 14 16 Số vùng lặp lại thuộc ORF94 T ỉ l ệ (% ) Cái Nước Thới Bình Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống Lần 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 Theo kết quả của nghiên cứu trên, khi phân tích số liệu theo các đợt thả giống khác nhau, kết quả còn cho thấy có sự khác biệt lớn về kiểu gen ở tôm nuôi lần 1, lần 2 và mẫu cua. Đối với mẫu tôm thả giống lần 1 có 9 nhóm vùng lặp lại là 6-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14- và 15-VLL (Hình 4.3). Trong đó 14-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất là 38,6% (22/65 so với tổng số mẫu lần 1). Tuy nhiên, ở mẫu cua thu kèm theo lần 1 không thấy nhiễm kiểu gen này. Giống với Hoa et al., 2005 nghiên cứu kiểu gen thuộc ORF94 nhiễm trên cua và tôm trong cùng 1 ao, cho thấy, kiểu gen xuất hiện ở mẫu cua và mẫu tôm giống nhau là không phổ biến. Ở mẫu cua, theo nghiên cứu có 4 mẫu cua thuộc 4 ao (CN08H, CN08T, TB08B và TB08K) có kiểu gen nhiễm trên tôm và cua không giống nhau. Ở huyện Cái Nước có 3 ao CN08B, CN08K và CN08P tuy mẫu tôm lần 1 và mẫu cua đều có 10-VLL nhưng ở các ao này 10-VLL không phải là kiểu gen nhiễm chủ yếu trên tôm trong ao. Bên cạnh đó, kiểu gen 10-VLL này xuất hiện hầu hết ở các ao (12/19 ao) nhưng số lượng mẫu chiếm rất thấp (17/57 mẫu, nhiễm khoảng 1-2 mẫu/ao) và đa số kiểu gen này nhiễm kép với các dòng WSSV khác trong cùng 1 mẫu tôm (Bảng 4.4). Có sự khác biệt lớn so với huyện Thới Bình.Ta thấy, tuy kiểu gen 14-VLL chiếm ưu thế ở đợt tôm thả giống lần 1 nhưng kiểu gen này chỉ tìm thấy ở hầu hết các ao thu mẫu ở Cái Nước, còn ở Thới Bình không tìm thấy kiểu gen này. Bên cạnh đó, 2/3 ao thu mẫu ở Thới Bình (ao TB08B và TB08K) tìm thấy kiểu gen 10-VLL nhiễm đồng loạt trên các mẫu tôm (khác so với Cái Nước) nhưng mẫu cua trong 2 ao này lại có kiểu gen khác với mẫu tôm (8- và 13- VLL tương ứng với ao TB08B và TB08K). Do đó, dòng WSSV có kiểu gen 10-VLL xuất hiện ở Cái Nước có khả năng là dòng WSSV tồn tại ngoài tự nhiên và theo nguồn nước phân bố vào hầu hết các ao (phân bố trong) cùng ấp Bào Bèo. Còn dòng WSSV có 10-VLL xuất hiện trên mẫu tôm ở Thới Bình có khả năng là nguồn nhiễm từ tôm giống. So với đợt tôm thả giống lần 1, ở đợt tôm thả giống lần 2, tìm thấy có 8 kiểu gen khác nhau thuộc ORF94, có thêm kiểu gen 4-VLL nhưng không có 6 và 15-VLL như ở tôm lần 1 (Hình 4.6). Điều đáng lưu ý nhất là số vùng lặp lại chiếm ưu thế ở tôm nuôi lần 2 là 11-VLL chiếm 75,9% (khác so với lần 1). Ở lần 1 kiểu gen 11-VLL xuất hiện rất thấp chiếm 7%, chỉ nhiễm trên 4 mẫu ở 2 ao CN08D và CN08L, trên các mẫu này lại nhiễm kép với các dòng WSSV khác. Còn ở lần 2 kiểu gen này phân bố ở hầu hết các ao, trong 1 ao các mẫu tôm lại nhiễm đồng loạt kiểu gen này. Bên cạnh đó, các kiểu gen 14-VLL PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 chiếm ưu thế ở mẫu thu lần 1 hầu như không tìm thấy ở mẫu thu lần 2 (chỉ có 2 mẫu thuộc ao CN08D, kiểu gen 14-VLL này lại nhiễm kép với kiểu gen 11-VLL). Ngoài ra, kiểu gen nhiễm ở mẫu cua thu kèm theo lần 1 cũng được tìm thấy ở mẫu tôm thu lần 2 nhưng cũng ít phổ biến (chỉ tìm 2 ao CN08H và TB08B lần lượt có kiểu gen là 11- và 8-VLL giống với mẫu tôm thu lần 2). Và cũng thấy sự khác biệt đối với mẫu thu lần 2 ở Cái Nước và Thới Bình giống như ở mẫu thu lần 1. Tuy ở lần 2 kiểu gen 11-VLL chiếm ưu thế nhưng kiểu gen này lại không tìm thấy ở mẫu tôm và mẫu cua thu ở huyện Thới Bình (ở huyện Thới Bình chủ yếu nhiễm kiểu gen là 10-, 8- và 9-VLL ở lần 2, còn ở Cái Nước chủ yếu là 11-VLL). Do đó có thể sự nhiễm bệnh giữa lần 1 và lần 2 không do các dòng WSSV tồn tại sẳn (WSSV nhiễm sẳn trên tôm hay cua) trong ao gây ra mà do từ nguồn tôm giống mới. Bởi đặc tính của mô hình này là thu đợt tôm nuôi trước và thả tiếp nối đợt giống mới không qua cải tạo ao. Ở nghiên cứu này, tuy không biết được nguồn gốc tôm giống và phân tích kiểu gen thuộc ORF này trên tôm giống nhưng kết quả nhận định sự nhiễm bệnh ở đợt thả giống lần 1 và lần 2 chủ yếu là xuất phát từ nguồn bệnh nhiễm từ nguồn giống là dựa vào sự khác nhau về kiểu gen ưu thế ở 2 đợt thả giống khác nhau (lần 1 là 14-VLL chiếm ưu thế, lần 2 là 11-VLL chiếm ưu thế) được nuôi cùng 1 ao, cùng nguồn nước và dựa vào sự khác nhau về kiểu gen nhiễm trên tôm thả lần 1, nhiễm trên mẫu cua thu kèm theo lần 1 và kiểu gen nhiễm trên tôm ở đợt thả giống lần 2. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 Bảng 4.4 - Số vùng lặp lại của ORF94 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu. TT Kí Hiệu Ao Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Lần 1 Cua Lần 2 1 CN08A 14 8 2 CN08B 6/8, 10 10 3 CN08C 10 10 4 CN08D 10, 11, 14, 11/14 11, 11/14 5 CN08E 16 6 CN08F 14 11 7 CN08G 8 8 CN08H 8, 10 11 10, 11 9 CN08L 10/11 11 10 CN08K 10/12 11 11 CN08M 14 11 12 CN08N 8 8/10, 10, 11 13 CN08P 10/14, 13, 14 10 11 14 CN08R 10/14, 14 11 15 CN08S 8, 10/15, 14, 15 11, 11/13 16 CN08T 9 10 17 CN08U 10/11, 11 18 CN08W 9, 13, 14 19 CN08Y 4, 11 20 TB08B 10 8 8/10, 10 21 TB08K 10 13 22 TB08M 12 12 (lần 1), 9 (lần 2) 9 6/8: là mẫu nhiễm kép 2 loại kiểu gen 6- và 8-VLL thuộc ORF94 trên cùng một mẫu. Từ nghiên cứu trên ta còn thấy, trong cùng 1 ao tồn tại nhiều kiểu gen khác nhau thuộc ORF94 chiếm 45% (9/20 ao) ở lần 1 và chiếm 46,6 % (7/15 ao) ở đợt tôm nuôi lần 2 (Bảng 4.4). Bên cạnh đó, trong cùng 1 mẫu tôm cũng xuất hiện sự nhiễm kép khá cao chiếm 46,6% ở lần 1 và 33,3% ở lần 2 (7/20 ao và 5/15 ao tương ứng với lần 1 và lần 2) nhưng số lượng mẫu nhiễm kép lại thấp, chiếm 1 - 2 con/tổng số mẫu phân tích trong 1 ao (8mẫu/7ao lần1 và 6mẫu/5ao ở lần2) (Thông tin chi tiết ở Bảng phụ lục III). Từ đó thấy được sự khác biệt về kiểu vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mô hình quãng canh cải tiến (không xảy ra bệnh) so với các nghiên cứu trước đây (mẫu thu tại các ao nuôi bộc phát bệnh Đốm trắng). Theo Triệu Thanh Tuấn và Lê Vân Hải Yến (2006), Tô Vũ An và Lý Ngọc Hà (2008) cho thấy, trong cùng 1 ao nhiễm cùng 1 loại kiểu gen là phổ biến. Ở nghiên cứu này lại cho thấy, kiểu gen trong cùng 1 ao khác nhau là phổ biến. Kết quả trên có thể giải thích theo Lý Ngọc Hà (2008) là trong 1 ao nhiễm nhiều loại kiểu gen có khả năng là do nguồn giống không đồng nhất với nhau. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 Kết quả khuếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là 69 bp thuộc ORF125 cho thấy, có 12 nhóm vùng lặp lại khác nhau, từ 3 - 14 vùng lặp lại (Bảng 4.5). Trong đó, số vùng lặp lại có tần số xuất hiện cao nhất là 7-VLL chiếm 53,8 % (64/119 tổng số mẫu). Kết quả này gần giống với nghiên cứu của Pradeep et al., 2007, tìm thấy 13 nhóm vùng lặp lại từ 2 - 14 vùng lặp lại thuộc ORF này trên mẫu tôm PL, tôm nuôi, mẫu cua và cả trên tôm ngoài tự nhiên ở 4 tỉnh dọc theo bờ biển phía đông và phía tây của Ấn Độ nhưng kiểu gen ưu thế ở 2 nghiên cứu này là khác nhau (ở Ấn Độ có 4-VLL chiếm ưu thế, còn ở nghiên cứu này là 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất). So với các nghiên cứu trước đây (ở trong nước), kiểu vùng lặp lại thuộc ORF125 ở nghiên cứu này tuy thu mẫu ở 2 huyện thuộc tỉnh Cà Mau nhưng nhóm kiểu gen xuất hiện lại phong phú hơn. Ở nghiên cứu của Tô Vũ An (2008) chỉ tìm thấy 5 nhóm vùng lặp lại (4-, 5-, 6-, 7- và 8-VLL) ở 12 ao thuộc 5 huyện khác nhau ở Cà Mau và Lý Ngọc Hà (2008) chỉ tìm thấy 3 nhóm vùng lặp lại (5-, 6- và 7-VLL) ở 11 ao thuộc 4 huyện khác nhau ở tỉnh Bạc Liêu nhưng cả 2 khu vực này kiểu gen chiếm ưu thế đều là 6-VLL (khác so với nghiên cứu hiện hành). Dieu et al., 2004 cũng tìm thấy 3 nhóm kiểu gen là 5-, 6- và 7-VLL thuộc ORF này ở 7 tỉnh nuôi tôm trung tâm dọc theo bờ biển từ miền Trung đến miền Nam VN. Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Loài nhiễm Số Mẫu Số Ao Tần số (%) so với tổng số mẫu 3 Tôm 2 2 1,7 4 Tôm, Cua (3) 17 10 14,3 5 Tôm, Cua (3) 13 6 10,9 6 Tôm 2 1 1,7 7 Tôm, Cua (1) 64 18 53,8 8 Tôm 29 10 24,4 9 Tôm, Cua (1) 5 4 4,2 10 Tôm 2 1 1,7 11 Tôm 2 1 1,7 12 Tôm 6 3 5 13 Tôm 1 1 0,8 14 Cua (1) 1 1 0,8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 Giếng 1, 2: mẫu có 4-VLL Giếng 3: mẫu có 5-VLL Giếng 4, 5: mẫu có 6-VLL Giếng 6: mẫu có 7-VLL Giếng M: Thang ADN 100 bp plus. Hình 4.6 - Sự nhiễm kép của WSSV trong cùng một mẫu thuộc ORF125 Giếng 1: mẫu có 9-VLL Giếng 2: mẫu có 12-VLL Giếng 3: mẫu có 6- và 13-VLL Giếng 4: mẫu có 6-, 8- và 12-VLL Giếng 5, 6, 7, 8 và 9: mẫu có 8-VLL Giếng 10, 11 và 12: mẫu có 7-VLL Giếng M: Thang ADN 100 bp plus. 1 2 3 4 5 6 M 1000 bp 500 bp 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 1000 bp 500 bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 1,7 6,9 3,4 8,6 65,5 3,4 6,9 17,2 1,7 3,43,41,7 10,3 0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 T ỉ l ệ (% ) Cái Nước Thới Bình Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi lần 1 7,7 44,2 38,5 5,8 1,9 1,91,93,8 0 10 20 30 40 50 3 4 5 7 8 9 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 T ỉ l ệ (% ) Cái Nước Thới Bình Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi lần 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 Kiểu gen của ORF125 ở lần 1 và lần 2 cũng có sự khác nhau nhưng sự khác nhau về kiểu gen này là không lớn. Ở mẫu tôm thả giống Lần 1 có 10 nhóm vùng lặp lại, gồm có 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 10-, 11-, 12-, và 13-VLL (Hình 4.7), trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất là 65,5% (38/58 mẫu thu lần 1 ở Cái Nước). Còn mẫu tôm thả giống lần 2 chỉ có 6 nhóm vùng lặp lại từ 3 - 9 vùng lặp lại, trong đó số vùng lặp lại chiếm ưu thế có 2 loại kiểu gen là 7-VLL và 8- VLL chiếm tỉ lệ cao và gần tương đương với nhau (7-VLL chiếm 44,2 % và 8- VLL chiếm 38,5%) (Hình 4.8). Bên cạnh đó, giống với ORF94, kiểu gen thuộc ORF125 ở huyện Cái Nước và Thới Bình cũng không giống nhau cho cả 2 lần thu mẫu. Ở Cái Nước mẫu thu lần 1 và lần 2 chủ yếu kiểu gen 7- và 8-VLL xuất hiện ở hầu hết các ao nhưng 2 loại kiểu gen này hầu như không thấy so với mẫu thu ở huyện Thới Bình (ở lần 1 chỉ có 1 mẫu ở Ao TB08M có kiểu gen 7-VLL nhưng lại nhiễm kép với WSSV có kiểu gen là 5-VLL thuộc ORF125, còn ở lần 2 cũng có 1 mẫu thuộc 1 ao TB08B nhiễm kép có cả 7-và 8-VLL). Ngược lại, kiểu gen 5-VLL chiếm ưu thế ở huyện Thới Bình cũng hầu như không xuất hiện ở mẫu thu ở huyện Cái Nước (5-VLL chỉ tỉm thấy 2 mẫu thuộc 2 ao CN08G và CN08H, trong 2 mẫu này lại nhiễm kép với loài WSSV có kiểu gen là 7-, 8- và 11-VLL thuộc ORF125. Do đó, có thể thấy rằng ở ORF125 cũng có biến đổi về kiểu gen tương tự như ở ORF94 nhưng sự biến đổi về kiểu gen ưu thế giữa lần 1 và lần 2 dao động không lớn so với ORF94. Đối với mẫu cua khi phân tích kiểu gen thuộc ORF125 cũng thấy sự biến đổi tương tự như ORF94 là kiểu gen giống nhau giữa mẫu cua và mẫu tôm trong cùng 1 ao là không phổ biến. Ở mẫu thu lần 1 thuộc huyện Cái Nước chỉ có 2 ao CN08B và CN08C cùng có 4-VLL nhiễm trên tôm và trên cua nhưng kiểu gen 4-VLL này không phải là kiểu gen nhiễm chủ yếu trên các mẫu tôm trong ao. Bên cạnh đó, hầu như kiểu gen này phân bố ở hầu hết các ao thu mẫu lần 1 (7/16 ao ở hyện Cái Nước, Thới Bình không thấy kiểu gen này) và có sự nhiễm kép với kiểu gen 7-VLL. Ở lần 2 kiểu gen nhiễm kép 4-VLL và 7-VLL chỉ xuất hiện ở 1 mẫu ở ao CN08H. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại của ORF125 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu TT Kí Hiệu Ao Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Lần 1 Cua Lần 2 1 CN08A 7 3, 4 2 CN08B 4 4 7 3 CN08C 4/7/8 4 4 CN08D 4/7, 7 9 5 CN08E 7 6 CN08F 4/7, 7 7, 8 7 CN08G 5/7 8 CN08H 4/8/12, 5/8/11, 12, 8 7 4/7 9 CN08L 7 7 10 CN08K 4 9 11 CN08M 7 7, 9 12 CN08N 5, 6/8/12, 6/13, 12 8 13 CN08P 7 7, 8 14 CN08R 4/7, 7 8 15 CN08S 3, 7 4 8 16 CN08T 7 9 7/8 17 CN08U 8, 7 18 CN08W 4/7, 7 14 19 CN08Y 7 20 TB08B 5/10/12 5 5, 7/8 21 TB08K 5 22 TB08M 5/7 5 5 4/7/8: là mẫu nhiễm kép 3 loại kiểu gen 4-, 7- và 8-VLL thuộc ORF125 trên cùng một mẫu. Tương tự với nghiên cứu kiểu gen thuộc ORF94 ở kiểu gen thuộc ORF125 trong cùng 1 ao cũng tồn tại nhiều kiểu gen khác nhau chiếm 57,9% (11/19 ao) ở lần 1 và chiếm 47,1% (8/17 ao) ở đợt tôm nuôi lần 2 (gần tương đương so với sự biến đổi kiểu gen trong cùng 1 ao thuộc ORF94, ở lần 1 chiếm 45%, lần 2 chiếm 46,6%). Sự nhiễm kép của WSSV có các kiểu gen thuộc ORF125 trên cùng 1 mẫu tôm thì phong phú hơn so với ORF94 (ở ao CN08C, CN08H, CN08N, TB08B cùng 1 mẫu tôm nhiễm 3 loại kiểu gen khác nhau thuộc ORF125, nhưng kiểu gen thuộc ORF94 trên 1 mẫu tôm chỉ tồn tại 2 loại kiểu gen khác nhau) (Bảng 4.6). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trữ năm 2006 với PCR- Genotyping (ORF125) Mẫu axít nucleic phân tích gồm 18 ao (9 ao ở Cà Mau và 9 ao thuộc tỉnh Bạc Liêu) do Triệu Thanh Tuấn ly trích vào năm 2006. Qua phân tích tổng số là 67 mẫu ở Cà Mau và 87 mẫu ở Bạc Liêu bằng phương pháp PCR- genotyping khuếch đại vùng lặp lại có trình 69 bp thuộc ORF125 cho thấy, ở mẫu tôm Cà Mau năm 2006 tìm thấy được 5 kiểu gen của WSSV với 4-, 5-, 6-, 7- và 8-VLL. Còn ở Bạc Liêu có 6 nhóm là 3-, 4-, 5-, 6-, 7- và 8-VLL (Bảng 4.6). Trong đó, dòng WSSV có kiểu gen là 6-VLL thuộc ORF125 chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả 2 khu vực. Cà Mau và Bạc Liêu (ở Cà Mau chiếm 59,7% và 24,1 % ở Bạc Liêu) (Hình 4.11). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Tô Vũ An và Lý Ngọc Hà khi phân tích ORF125 trên mẫu tôm ở Cà Mau và Bạc Liêu ở năm 2008 cũng cho kết quả là 6-VLL chiếm ưu thế ở cả 2 khu vực này. Điều này cho thấy, nguồn tôm giống mang bệnh có kiểu gen 6-VLL thuộc ORF125 được phân bố ở cả 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu trong năm 2006 và năm 2008 là rất lớn. Nguồn tôm này có thể xuất phát từ nguồn tôm giống ở miền trung vì phù hợp với nghiên cứu của Dieu el at., 2004 tìm thấy 3 kiểu gen là 5-, 6- và 7-VLL trên tôm ở miền Trung VN. 23 4,57,5 59,7 38,8 25,4 9,2 20,7 24,1 20,7 4,6 0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 Số vùng lặp lại thuộc ORF125 T ỉ l ệ (% ) Cà Mau Bạc Liêu Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, và 9: mẫu có 6-VLL (thuộc ao BL7) Giếng 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 và 18: mẫu có 4-VLL (thuộc ao BL8) Giếng M: Thang ADN 1 kbp plus. Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2006 Giếng 1 và 2: mẫu có 4-VLL Giếng 3, 5, 9 và 10: mẫu có 4- và 6-VLL Giếng 4: mẫu có 4- và 5-VLL; Giếng 7 và 8: mẫu có 4-, 5- và 6-VLL Giếng M: Thang ADN 1 kbp plus 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 6-VLL 4-, 5-VLL 4-VLL 4-, -6 VLL 6-VLL 500 bp 650 bp 650 bp 500 bp PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 Bảng 4.7 - Kết quả phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 Khu Vực Ký hiệu Số vùng lặp lại thuộc ORF125 - 2006 Tổng Ao 3 4 5 6 7 8 Cà Mau CM1 6 6 CM2 3 3 6 CM3 5 5 CM4 1 3 4 CM6 1* 1* 5 6 CM7 3, 1*,3*, 2* 1*, 2* 1, 3* , 2* 10 CM8 5* 5* , 5 10 CM9 3* 1* 6, 1*, 3* 10 CM10 1, 6* 3, 6* 10 Tổng số mẫu 17 26 40 5 3 Bạc Liêu BL1 2 8 10 BL2 2 8 10 BL3 10 10 BL4 8 8 BL5 10 10 BL7 9 9 BL8 10 10 BL9 10 10 BL10 7 3 10 Tổng số mẫu 4 20 18 21 18 8 *: Có nhiều kiểu gen khác nhau tồn tại trong 1 mẫu tôm. Mẫu tôm nhiễm bệnh ở Cà Mau năm 2006 cũng cho thấy, có nhiều loại kiểu gen khác nhau thuộc ORF125 nhiễm trong cùng 1 ao chiếm 77,7% (7/9 ao) và sự nhiễm nhiều loại kiểu gen trên 1 mẫu tôm là phổ biến chiếm 32,8% (22/67 mẫu xuất hiện ở 5 ao CM6, CM7, CM8, CM9 và CM10). (Bảng 4.7 và Hình 4.11). nhưng theo kết quả nghiên cứu của Tô Vũ An 2008 các ao thu từ Cà Mau cho thấy, trong cùng 1 ao mẫu tôm nhiễm chủ yếu là cùng 1 kiểu gen chiếm 75% (9/12 ao) và cũng có sự nhiễm kép trên cùng 1 mẫu tôm nhưng chỉ chiếm 13,3% (8/60 mẫu) thấp hơn so với sự nhiễm kép ở mẫu thu vào năm 2006. Tuy nhiên, khác với Cà Mau, ở Bạc Liêu tỉ lệ ao có kiểu gen khác nhau trong cùng 1 ao chỉ ở mức thấp chiếm 33,3% (3/9 ao, gồm có ao BL1, BL2 và BL10) và sự nhiễm kép không thấy xuất hiện ở mẫu thu tỉnh Bạc liêu vào năm 2006 (Bảng 4.7 và Hình 4.10). Tương ứng với nghiên cứu của Lý Ngọc Hà ở Bạc Liêu năm 2008 cho thấy, trong số 11 ao chỉ có 2 ao (BL14 và BLl6) có mẫu tôm nhiễm 2 loại kiểu gen trong cùng 1 ao và không thấy sự nhiễm kép ở cả 11 ao thu mẫu khi phân tích. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 Từ đó cho thấy, có sự đa dạng và phong phú ở dòng các WSSV xuất hiện ở Cà Mau qua các năm khác nhau cũng như ở Cà Mau so với Bạc Liêu. 4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 Sử dụng số liệu phân tích từ mẫu thu ở Cà Mau năm 2008 và từ mẫu axit nucleic ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 và các số liệu tổng hợp từ các nghiên cứu trước đây của Triệu Thanh Tuấn (2006) và của Tô Vũ An và Lý Ngọc Hà (2008). Ở Cà Mau (Số liệu được tổng hợp ở Bảng 4.7) Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 Cà Mau 2006 (Tuấn, 2006) 2008 (An, 2008) 2008 (ở nghiên cứu này) Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) sovới tổng số mẫu 4 7 10.8 1 0.8 5 60 68.4 14 21.5 6 6 7.6 16 24.6 1 0.8 7 11 14 9 13.8 8 16 24.6 17 12.8 9 8 10 1 1.5 5 3.8 10 2 3.1 25 18.8 11 43 32.3 12 10 7.5 13 4 3 14 24 18 15 2 1.5 16 1 0.8 90/10 ao 65/12 ao 133/22 ao Các nhóm kiểu gen thuộc ORF94 tổng hợp từ 3 nghiên cứu ở năm 2006 và năm 2008 ở tỉnh Cà Mau có 13 nhóm kiểu gen, từ 4 - 16 vùng lặp lại. Ở năm 2006 tìm thấy 4 nhóm kiểu gen là 5-, 6-, 7- và 9-VLL (nghiên cứu ở 10 ao, trên mẫu tôm), đến năm 2008 (An, 2008) tìm thấy 6 nhóm kiểu gen khác nhau (nghiên cứu ở 12 ao, trên mẫu tôm) có thêm 4-, 8- và 10-VLL so với năm 2006 và cùng năm 2008 (ở nghiên cứu này) tìm thấy đến 11 nhóm vùng lặp lại từ 4 - 16 nhưng không thấy 5- và 7-VLL (nghiên cứu ở 22 ao, trên mẫu tôm và mẫu cua trong cùng 1 ao). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 Từ kết quả trên cho thấy số vùng lặp lại thuộc ORF94 của WSSV tồn tại ở Cà Mau qua các năm có các nhóm vùng lặp lại tăng dần. Kiểu gen chiếm ưu thế giữa các năm cũng khác nhau. Năm 2006 có 5-VLL chiếm ưu thế, đến năm 2008 có 6-, 8- (An,2008) và 11-VLL chiếm ưu thế (năm 2008, ở nghiên cứu này). Ở Bạc Liêu Số liệu tổng hợp ở cả 2 năm 2006 và 2008 cho thấy, có 8 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 được tìm thấy (ít hơn 5 nhóm vùng lặp lại so với ở Cà Mau) (Bảng 4.8). Số vùng lặp lại chiếm ưu thế ở các năm cũng khác nhau, 5-VLL chiếm ưu thế ở Bạc Liêu năm 2006 và 7-VLL chiếm ưu thế ở năm 2008. Tuy nhiên 4 nhóm vùng lặp lại ưu thế là 5-, 6-, 7- và 8-VLL qua các năm khác nhau là khác nhau (Cà Mau có 5-, 6-, 8-VLL và Bạc Liêu có 5- và 7-VLL), nhưng số vùng lặp lại chiếm ưu thế này vẫn giống với các số vùng lặp lại thuộc ORF94 nhiễm trên tôm bố mẹ và trên tôm giống vào năm 2001 (Hoa et al., 2005, nghiên cứu trên tôm giống và ở tôm bố mẹ tìm thấy các kiểu giống nhau có các vùng lặp lại như 4-, 5-, 6-, 7-, 8- và 9-VLL thuộc ORF94). Chỉ duy nhất kiểu gen WSSV có 11-VLL chiếm ưu thế ở Cà Mau năm 2008 là chưa được tìm thấy trước đó. Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 Bạc Liêu 2006 (Tuấn, 2006) 2008 (Hà, 2008) Số vùng lặp lại thuộc ORF94 Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu 4 10 11.1 7 12.1 5 44 48.9 - - 6 - - 7 12.1 7 1 1.1 20 34.5 8 - - 12 20.7 9 20 22.2 7 12.1 10 - - - - 11 - - - - 12 10 11.1 5 8.6 13 - - 14 - - 15 - - 16 5 5.6 90/10 ao 58/11 ao PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 Ở Bạc Liêu (Bảng 4.11) cho thấy, kiểu gen thuộc ORF125 vào năm 2006 tìm thấy nhiều nhóm hơn so với năm 2008 (Lý Ngọc Hà, 2008), nhưng ở 2 năm 2006 và 2008 đều thấy 6-VLL chiếm ưu thế. Bên cạnh đó, ở Cà Mau 2006 và 2008 (Tô Vũ An, 2008) cũng tìm thấy 6-VLL chiếm ưu thế và có thêm 7-VLL chiếm ưu thế vào năm 2008 (ở nghiên cứu hiện tại, 2008). Như vậy kiểu gen thuộc ORF125 ở Bạc Liêu và Cà Mau tuy có nhiều nhóm kiểu gen WSSV gây bệnh khác nhau qua các năm nhưng các kiểu gen có 6- và 7-VLL được tìm thấy là chủ yếu. Kết quả này giống với nghiên cứu của Dieu et al., 2004, tìm thấy kiểu này trên mẫu tôm ở 1 số tỉnh miền Trung Việt Nam. Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 Cà Mau 2006 (mẫu trữ năm 2006) 2008 (An, 2008) 2008 (ở nghiên cứu này) Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu 3 2 1.4 4 17 18.7 13 19.1 16 11.4 5 26 28.6 16 23.5 15 10.7 6 40 44 32 47.1 2 1.4 7 5 5.5 1 1.5 64 45.7 8 3 3.3 6 8.8 25 17.9 9 5 3.6 10 2 1.4 11 2 1.4 12 5 3.6 13 1 0.7 14 1 0.7 91/9 ao 68/12 ao 140/22 ao PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 36 Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 Bạc liêu 2006 ( ở nghiên cứu này, 2008) 2008 (Hà, 2008) Số vùng lặp lại thuộc ORF125 Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu Số mẫu Tần số (%) so với tổng số mẫu 3 4 4.5 4 20 22.5 5 18 20.2 3 5.4 6 21 23.6 38 67.9 7 18 20.2 15 26.8 8 8 9 89/9 ao 56/11 ao Do đó, có thể nói rằng sự khác nhau về số vùng lặp lại chiếm ưu thế giữa các năm khác nhau là do nguồn tôm giống bị nhiễm WSSV có kiểu gen chiếm ưu thế đó được phân bố rộng trong phạm vi khu vực thu mẫu (có thể nhiều hộ nuôi cùng mua giống ở 1 trại giống hay ở các trại giống khác nhau mua cùng nguồn tôm bố mẹ đã bị nhiễm bệnh). Qua nghiên cứu trên có thể thấy giả thiết đặt ra của Triệu Thanh Tuấn năm 2006 cho rằng có nhiều kiểu gen tồn tại ở WSSV khác nhau ở khu vực địa lý khác nhau và ở các thời điểm thu mẫu khác nhau là phù hợp với nghiên cứu. Bên cạnh đó, Triệu Thanh Tuấn (2006), còn đặt ra giả thiết là khả năng gây bệnh cũng như độc lực của các kiểu gen WSSV ở khu vực địa lý khác nhau và ở các thời điểm thu mẫu khác nhau là khác nhau. Dựa vào kết quả phân tích mẫu thu và kết quả so sánh trên, cho thấy ở mô hình quãng canh cải tiến nuôi ở tỉnh Cà Mau năm 2008 so với mô hình nuôi thâm canh của Triêu Thanh Tuấn (2006) cho thấy. Kiểu gen ở 2 mô hình này khác nhau khá lớn (kiểu gen thuộc ORF94 ở mô hình quảng canh cải tiến ở lần 1 có 14-VLL chiếm ưu thế và ở lần 2 có 11-VLL chiếm ưu thế, còn ở mô hình nuôi Thâm Canh (2006) ở Cà Mau và Bạc Liêu là 5-VLL chiếm ưu thế. Đối với ORF125, ở mô hình nuôi quảng canh cải tiến ở lần 1 và lần 2 có 7-VLL chiếm ưu thế và cũng có 7-VLL chiếm ưu thế từ nghiên cứu của Tô Vũ An (2008, mẫu cũng thu chủ yếu ở mô hình quảng canh cải tiến) nhưng ở mô hình nuôi Thâm canh (2006) lại có 6-VLL chiếm ưu thế ở cả 2 khu vực là Cà Mau và Bạc Liêu). Bên cạnh đó, mức độ biểu hiện kiểu gen ở 2 mô hình nuôi này cũng khác nhau (ở quảng canh cải tiến trong cùng 1 ao có khả năng nhiễm nhiều loại kiểu gen hơn so với mô hình nuôi Thâm canh). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 37 Như vậy, có sự khác biệt về mức độ biểu hiện bệnh, tỉ lệ chết ở 2 mô hình nuôi này, nhưng về mức độ biểu hiện kiểu gen và sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc các ORF94 và ORF125 có sự khác biệt giữa hai mô hình này hay không là tùy thuộc vào sự đồng nhất và sự phân bố của nguồn tôm giống có nhiễm dòng WSSV này. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 38 Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận - Các kiểu gen thuộc ORF94 và ORF125 của WSSV gây bệnh trên tôm ở Cà Mau năm 2006 và 2008 phong phú và đa dạng hơn so với ở Bạc Liêu. - Ở Cà Mau và Bạc Liêu số vùng lặp lại chiếm ưu thế thuộc ORF94 và ORF125 năm 2006 và 2008 có giống nhau (ORF94-5 VLL; ORF125-6 VLL) và cả khác nhau (ORF94-6,-7, -8,-11VLL; ORF125-6, -7VLL) - Các kiểu gen của WSSV thuộc ORF94 trong cùng một ao phần lớn giống nhau ở cả 2 mô hình nuôi (Thâm canh, 16/19 ao; quãng canh cải tiến, 11/20 ao). Còn ORF125, phần lớn kiểu gen trong cùng 1 ao là khác nhau (Thâm canh, 10/18 ao; quãng canh c ải tiến, 11/19 ao). - Hiện tượng nhiễm nhiều loại kiểu gen (cả ORF94 và ORF125) trong cùng ao và sự nhiễm kép nhiều loại kiểu gen trên cùng 1 mẫu ở mô hình quãng canh cải tiến xảy ra nhiều hơn so với mô hình nuôi tôm thâm canh. - Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở 2 đợt thả tôm liên tiếp trong cùng một ao chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể thấy khả năng ứng dụng của phương pháp PCR - Genotying (ORF94 và ORF125) trong nghiên cứu đặc điểm dịch tể của tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trong nuôi tôm sú. 4.2 Đề xuất - Gây cảm nhiễm các kiểu gen khác nhau (các kiểu gen chiếm ưu thế qua các đợt nghiêm cứu) thuộc ORF94 và ORF125 của WSSV để xem xét độc lực của các dòng WSSV khác nhau. - Giải trình tự các kiểu gen có số vùng lặp lại giống nhau (các vùng chiếm ưu thế ở các năm) thuộc các ORF94 và ORF125. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bui Thi Minh Dieu, Hendrik Marks, Joukje Siebenga, Rob W. Goldbach, Dowe Zuidema, Tran Phuoc Duong and Just M. Vlak, (2004). Molecular epidemiology of white spot syndrome virus within Vietnam. Journal of General Virology, 85, 3607-3618. 2. Caleb McClennen, (2004), white spot syndromeVirus the economic, environmental and technical implications on the development of latin american shrimp farming. ( 3. Chen, L. L., Wang, H. C., Huang, C. J. & 9 other authors (2002). Transcriptional analysis of the DNA polymerase gene of shrimp white spot syndrome virus. Virology 301, 136–147. 4. Đặng thị Hoàng Oanh, (2007). Nguyên lý và kỷ thuật chẩn đoán Bệnh Thuỷ sản. Trường Đại học Cần Thơ. 5. Flegel TW (1997) Special tropic review: major viral disease of the black tiger prawn Penaeus monodon in Thailand. World J Microbiol Biotechnol 13:433 442. 6. Flegel TW, Alday-Sanz V (1998) The crisis in Asian shrimp aquaculture: current status and future needs. J Appl Ichthyol 14:269-273. 7. Hendrik Marks, Josyanne J.A. van Duijse, Douwe Zuidema, Mariëlle C.W. van Hulten and Just M. Vlak (2004), Fitness and virulence of an ancestral White Spot Syndrome Virus isolate from shrimp 8. Hoa T. T. T., Hodgson R. A., Oanh D. T. H., Phuong N. T., Preston N. J. and Walker P. K., (2005). Genotypic variations in tandem repeat DNA segments between ribonucleotic reductase subunit gense of white spot syndrome virus (WSSV) isolates from Vietnam. In P. Walker, R. Lester and M. G. Bondad-Reantaso (eds). Disease in Asian Aquaculture V.pp.339-351. Fish Healrh Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines. 9. âpnhät 25/10/2008). 10. Lan Y., Lu W. & Xu X. (2002) Genomic instability of prawn white spot bacilliform virus (WSBV) and its association to virus virulence. Virus Research 90, 264–274. 11. Lê Vân Hải Yến, (2006). Tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen của WSSV với bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) nuôi tại Sóc Trăng và Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp đại học. 12. Liu W.J., Chang Y.S., Wang C.H., Kou G.H. & Lo C.F. (2005) Microarray and RT-PCR screening for white spot syndrome virus immediate-early genes in cycloheximide-treated shrimp. Virology 334, 327–341. 13. Lo C.F., Hsu H.C., Tsai M.F., Ho C.H., Peng S.E., Kou G.H. & Lightner D.V. (1999) Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic Organisms 35, 175–185. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 40 14. Lý Ngọc Hà, (2008).Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 của virút gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm tại Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học. 15. Marks H. (2003). Genetic variation among isolates of White spot syndrome virus, Goldbach, J. M. Vlak, and M. C.W. van Hulten, Laboratory of Virology,Wageningen University,Wageningen, The Netherlands, Arch Virol (2004) 149: 673–697. 16. Marks H. (2005) Genomics and Transcriptomics of White Spot Syndrome Virus. PhD dissertation, Department of Plant Sciences,Wageningen University, The Netherlands. 17. Nguyễn Thị Thuý Hằng, (2008). Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping (ORF125) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV). Đề cương luận văn tốt nghiệp đại học. 18. Pradeep. B, Shekar. M, Gudkovs. N, Karunasagar. I, Karunasagar. I, 2007. Genotyping of white spot syndrome virus prevalent in shrimp farms of India. Diseases of Aquatic Organisms 78:189-198. 19. Supamattaya K, Boonyaratpalin S (1996) The study of histopathology and cytopathlogical changes in black tiger shrimp Penaeus monodon caused by yellow head virus and red colour and white spot disease virus. J Sci Technol 18 1:17–33. 20. Tô Vũ An, (2008). Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 của virút gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm tại Cà Mau. Luận văn tốt nghiệp đại học. 21. Trần Thị Mỹ Duyên, (2006). Ứng dụng kỹ thuật PCR-genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV). Luận văn tốt nghiệp đại học. 22. Trần Thị Tuyết Hoa, (2004). Bài giảng Sinh học phân tử. Trường Đại Học Cần Thơ. 23. Triệu Thanh Tuấn, (2006). Tìm hiểu mối quan hệ giữa kiểu gen của WSSV với bệnh đốm trắng trên tôm sú (P. monodon) nuôi tại Cà Mau và Bạc Liêu. Luận văn tốt nghiệp đại học. 24. Tsai MF, Kou GH, Liu HC, Liu KF and Chang CF (1999) Long-term presence of white spot syndrome virus (WSSV) in a cultivated shrimp population without disease outbreaks. Diseases of aquatic organisms. Vol.38: 107-114. 25. van Hulten M.C.W., Witteveldt J., Peters S., Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein-Langhorst R. & Vlak J.M. (2001a) The white spot syndrome virus DNA genome sequence. Virology 286, 7–22. 26. van Hulten M.C.W., Witteveldt J., Snippe M. & Vlak J.M. (2001b) White spot syndrome virus envelope protein VP28 is involved in the systemic infection of shrimp. Virology 285, 228–233. 27. Vlak J.M., Bonami J.R., Flegel T.W., Kou G.H., Lightner D.V., Lo C.F., Loh P.C. & Walker P.J. (2005) Nimaviridae. In: Virus Taxonomy VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ed. by C.M. Fauquet, M.A. Mayo, Elsevier/Academic Press, London. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 41 28. Wang Q., Poulos B.T. & Lightner D.V. (2000) Protein analysis of geographic isolates of shrimp white spot syndrome virus. Archives of Virology 145, 263–274. 29. Wang Q., White B.L., Redman R.M. & Lightner D.V. (1999) Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus. Aquaculture 170, 179–194. 30. Wongteerasupaya. C, Pungchai. P, Withyachumnarnkul. B and Boonsaeng. V, (2003). High variation in repetitive DNA fragment length for white spot syndrome virus (WSSV) isolates in Thailand. Dis Aquat org 54: 253-257. 31. Yang, F., He, J., Lin, X. H., Li, Q., Pan, D., Zhang, X. B. & Xu, X. (2001). Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform virus. J Virol 75, 11811–11820. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 42 PHỤ LỤC I Bảng thông tin thu mẫu Cà Mau năm 2008 TT Kí Hiệu Lần 1 Lần 2 Ao Mật độ Tôm Cua Tôm (con/m2) Tuổi tôm (ngày) Dấu hiệu bệnh lý (con/ao) Tuổi tôm (ngày) Tỉ lệ chết (con/ngày) 1 CN08A 1 150 Không 1 60 1-2 2 CN08B 1 150 Không 4 45 2-5 3 CN08C 1 120 Không 5 30 3-6 4 CN08D 0.5 150 Không 0 60 4-5 5 CN08E 1 120 Không 0 45 5-7 6 CN08F 2 150 Không 1 60 2-4 7 CN08G 1 150 Không 0 30 1-3 8 CN08H 1 150 Không 4 15 >5 9 CN08L 1.5 150 Không 1 60 5-7 10 CN08K 1 170 Không 4 45 2-4 11 CN08M 1 180 Không 1 30 4-5 12 CN08N 1.5 150 Không 1 80 7-9 13 CN08P 2 150 Không 2 60 5-8 14 CN08R 2 170 Không 1 50 6-7 15 CN08S 1 180 Không 1 45 1-2 16 CN08T 1 150 Không 1 60 1-2 17 CN08U 1 150 Không 0 60 2-4 18 CN08W 2 180 Không 1 45 1-3 19 CN08X 1 150 Không 1 45 2-3 20 CN08Y 1 150 Không 1 30 1-2 21 TB08B 2 150 Không 2 15 0 22 TB08K 1 150 Có 3 15 0 23 TB08M 1 135 Có 1 16 0 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 43 PHỤ LỤC II Kết quả phân tích IQ-2000 mẫu thu ở tỉnh Cà Mau năm 2008 KH Ao Mẫu Tôm Mẫu Cua Tổng Số TT Lần 1 Lần 2 (-) (+) (++) (+++) (-) (+) (++) (+++) (-) (+) 1 CN08A 3 2 - - - 3 - - 1 - 9 2 CN08B - 2 - 1 2 2 - - 3 1 11 3 CN08C 3 1 - - - 2 - - - 1 7 4 CN08D - 5 - - - 5 - - - - 10 5 CN08E 4 - - - 2 1 - - - - 7 6 CN08F 1 1 1 - - - - 5 1 - 9 7 CN08G 1 1 - - 5 - - - - - 7 8 CN08H - 2 - 2 3 2 - - 3 1 13 9 CN08L 1 2 - - - 1 - 4 4 - 12 10 CN08K 4 1 - - 3 1 - - - - 9 11 CN08M - 4 1 - - - - 5 1 - 11 12 CN08N - 1 1 3 - - - 5 - 1 11 13 CN08P - 2 1 1 - 4 - - 1 1 10 14 CN08R - 3 - 1 1 4 - - 1 - 10 15 CN08S - 1 2 2 - 5 - - - 1 11 16 CN08T - 1 2 - - 5 - - - 1 9 17 CN08U - - - - - 5 - - - - 5 18 CN08W - 2 1 2 4 - - - - 1 10 19 CN08X 2 - - - 5 - - - - 1 8 20 CN08Y - - - - - 3 - - - - 3 21 TB08B - 1 2 1 5 5 - - 1 1 16 22 TB08K 1 3 - - 10 - - - 2 1 17 23 TB08M 1 2 1 - 9 1 - - - 2 16 Tổng số 21 37 12 13 49 49 0 19 18 13 231 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version