Ảnh hưởng của các chất điều hõa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan dendrobium và cymbidium

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA HAI GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ CYMBIDIUM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. TRẦN THỊ DUNG TRẦN QUANG HOÀNG Thành Phố Hồ Chí Minh - 09 / 2005 - 2 LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn tận tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  Cha và Mẹ đã suốt đời tận tụy vì con để có đƣợc ngày hôm nay.  Các Thầy – Cô Khoa Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  TS. TRẦN THỊ DUNG, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  KS. NGUYỄN THỊ THU HẰNG, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  Xin gởi lời cảm ơn đến toàn thể tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian qua. 3 TÓM TẮT KHOÁ LUẬN TRẦN QUANG HOÀNG, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. "ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CỦA 2 GIỐNG LAN DENDROBIUM VÀ CYMBIDIUM" * Giáo viên hƣớng dẫn: Ts. Trần Thị Dung Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 15/03/2005 đến ngày 15/06/2005, tại phòng nuôi cấy mô - Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Đối tƣợng nghiên cứu: - Là 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Đây là những giống lan đƣợc trồng nhiều ở Việt Nam và đem lại lợi nhuận kinh tế cao. Mục đích nghiên cứu: - Sử dụng các chất kích thích sinh trƣởng BA, TDZ, NAA ở các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm xác định tỉ lệ thích hợp nhất để đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Phƣơng pháp nghiên cứu: - Trên mỗi giống lan thực hiện 2 thí nghiệm, các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần gặp lại. Kết quả đạt đƣợc: - Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 1mg/l TDZ và 0.5mg/l NAA cho thấy khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao nhất trên cả 2 giống lan. - Môi trƣờng nuôi cấy có kết hợp giữa chất điều hoà sinh trƣởng BA và NAA hoặc TDZ và NAA cho thấy kết quả hình thành phôi soma, protocorm và chồi cao hơn so với sử dụng riêng lẽ chất điều hoà sinh trƣởng sinh trƣởng BA hoặc TDZ. 4 MỤC LỤC Nội dung ............................................................................................................... Trang Trang tựa ......................................................................................................................... i Lời cảm tạ ....................................................................................................................... ii Tóm tắt nội dung ........................................................................................................... iii Mục lục .......................................................................................................................... iv Danh sách các bảng ...................................................................................................... vii Danh sách các biểu đồ ................................................................................................. viii Danh sách các hình ảnh ................................................................................................. ix Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. xi PHẦN 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan ............................................................................ 3 2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam ........................................ 3 2.1.1.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới .......................................................... 3 2.1.1.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam ........................................................... 3 2.1.2. Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium ..................................................... 5 2.1.2.1. Phân loại .................................................................................................. 5 2.1.2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 5 2.1.2.3. Điều kiện sinh thái .................................................................................... 6 2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium ................................................... 7 2.1.3.1. Phân loại ................................................................................................... 7 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 7 2.1.3.3. Điều kiện sinh thái .................................................................................... 8 2.2. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan ................................................................. 11 2.2.1. Giao phấn ...................................................................................................... 11 2.2.2 Phƣơng pháp chiết tách ................................................................................. 11 5 2.2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro ....................................................................................11 2.2.3.1. Lịch sử .................................................................................................... 11 2.2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro ............................................................. 12 2.2.3.3. Tiến trình nhân giống in vitro ................................................................. 14 2.2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro ....................................... 14 2.2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô ....................................................... 15 2.3. Vai trò các chất điều hòa sinh trƣởng ................................................................. 16 2.3.1. Auxin ............................................................................................................ 16 2.3.1.1. Lịch sử phát hiện ra auxin ....................................................................... 16 2.3.1.2. Giới thiệu về NAA .................................................................................. 17 2.3.1.3. Vai trò của auxins ................................................................................... 17 2.3.2. Cytokinin ...................................................................................................... 18 2.3.2.1. Lịch sử phát hiện ra cytokinin ................................................................ 18 2.3.2.2. Giới thiệu về BA ..................................................................................... 18 2.3.2.3. Giới thiệu về TDZ ................................................................................... 19 2.3.2.4. Vai trò của cytokinin .............................................................................. 19 2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium ................................................................................................................... 19 2.4.1. Giống lan Cymbidium ................................................................................... 19 2.4.2. Giống lan Dendrobium ................................................................................. 20 2.5. Giới thiệu về phôi soma và protocorm ............................................................... 21 2.5.1. Giới thiệu về phôi soma ................................................................................ 21 2.5.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 21 2.5.1.2. Đặc điểm ................................................................................................. 21 2.5.1.3. Phân loại ................................................................................................. 21 2.5.1.4. Các loại phôi ........................................................................................... 21 2.5.1.5. Vai trò ..................................................................................................... 22 2.5.2. Giới thiệu về protocorm ............................................................................... 22 2.5.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 22 2.5.2.2. Đặc điểm ................................................................................................. 22 2.5.2.3. Vai trò ..................................................................................................... 23 6 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 24 3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 24 3.2. Phƣơng pháp ....................................................................................................... 25 3.2.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 25 3.2.1.1. Nội dung 1: Trên giống lan Cymbidium ................................................. 25 3.2.1.2. Nội dung 2: Trên giống lan Dendrobium ............................................... 27 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi .................................................................................. 28 3.3.2.1. Sau 60 ngày nuôi cấy .............................................................................. 28 3.3.2.2. Sau 90 ngày nuôi cấy .............................................................................. 29 3.2.4. Phân tích thống kê ........................................................................................ 29 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 30 4.1. Giống lan Cymbidium ......................................................................................... 30 4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của giống lan Cymbidium ............................................................................................. 30 4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của lan Cymbidium ....................................................................................................... 35 4.2. Lan Dendrobium ................................................................................................. 40 4.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của BA và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium ............................................................................................... 40 4.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA lên quá trình nuôi cấy in vitro của cây lan Dendrobium ............................................................................................... 45 4.3. Nhận xét chung ................................................................................................... 51 4.3.1. So sánh giữa các môi trƣờng nuôi cấy in vitro lên sự hình thành phôi soma, protocorm và chồi trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium .................................. 51 4.3.2. So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi giữa 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium ......................................................................................... 52 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 55 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 55 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 56 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 58 7 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng ...................................................................................................................... Trang Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ........................................................................ 30 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro .............................. 33 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ................................................................................................... 35 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ..................................... 38 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ....................................................................... 40 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của BA và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển chồi lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................... 43 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến khả năng phát sinh phôi soma, tạo protocorm và hình thành chồi của cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ....................................................................... 46 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của TDZ và NAA đến sự sinh trƣởng và phát triển chồi lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................... 49 8 DANH SÁCH BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1: So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi giữa các môi trƣờng nuôi cấy trên giống lan Cymbidium ........................ 51 Biểu đồ 4.2: So sánh khả năng hình thành phôi soma, protocorm và chồi giữa các môi trƣờng nuôi cấy trên giống lan Dendrobium ...................... 51 Biểu đồ 4.3: So sánh khả năng hình thành phôi soma giữa 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ...................... 52 Biểu đồ 4.4: So sánh khả năng hình thành protocorm giữa 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro ...................... 53 Biểu đồ 4.5: So sánh khả năng hình thành chồi giữa 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................................ 53 Biểu đồ 4.6: So sánh sự phát triển chiều cao giữa 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro ................................................ 54 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình ................................................................................................................. Trang Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidium và Dendrobium thực hiện trong đề tài ................. 8 Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium ................................................................... 9 Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium ................................................................... 10 Hình 2.4: Các loại phôi soma ....................................................................................... 21 Hình 2.5: Phôi soma của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium .............................. 22 Hình 2.6: Protocorm của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium .............................. 23 Hình 4.1: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA ................................................................... 32 Hình 4.2: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA .................................................... 32 Hình 4.3: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA ................................................................... 34 Hình 4.4: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA .................................................... 34 Hình 4.5: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 37 Hình 4.6: Chồi lan Cymbidium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 37 Hình 4.7: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 39 Hình 4.8: Chồi lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 39 Hình 4.9: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA ................................................................... 42 Hình 4.10: Chồi lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA .................................................... 43 10 Hình 4.11: Cây lan Cymbidium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA ................................................................... 44 Hình 4.12: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung BA và NAA .................................................... 45 Hình 4.13: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 48 Hình 4.14: Cây lan Dendrobium sau 60 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 48 Hình 4.15: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ ................................................................. 50 Hình 4.16: Cây lan Dendrobium sau 90 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trƣờng có bổ sung TDZ và NAA .................................................. 50 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA 6-benzylaminopurine NAA - naphthaleneacetic acid MS Murashige và Skoog (1962) TDZ 1 - phenyl 1 - 3 - (1,2,3 - thiadiazol - 5 - yl) - urea ABA Acid Abscisic DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid GA3 Gibberellin 12 PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay hoa kiểng không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hƣởng sâu xa đến tâm hồn con ngƣời và làm đẹp cho cảnh quan môi trƣờng, do đó quan tâm phát triển hoa kiểng là vấn đề cần thiết. Bên cạnh đó lan là một trong những loại hoa đƣợc ƣa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thƣớc phong phú và đa dạng nên chúng đƣợc sản xuất khá phổ biến. Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng. Các nƣớc có truyền thống sản xuất hoa lan nhƣ Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan..., hàng năm thu đƣợc hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan. Ở Việt Nam hoa lan là một nghề cho tỷ suất lợi nhuận cao. Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có đủ điều kiện thuận lợi cho cây lan phát triển nhƣ: ẩm độ, nhiệt độ, cƣờng độ ánh sáng…., đặc biệt là thích hợp đối với các nhóm lan: Dendrobium, Cymbidium, Oncidium,…. .Nên vừa qua sở Nông nghiệp-Phát triển Nông thôn Thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức hội thảo về hiện trạng và hƣớng phát triển hoa lan trên địa bàn, nhằm đƣa cây hoa lan thành cây chủ lực trong cơ cấu nông nghiệp của thành phố (ĐCSVN, 27/6/2005). Việc sản xuất hoa lan ở nƣớc ta hiện nay chỉ mới đáp ứng đƣợc nhu cầu thấp chủ yếu phải nhập từ các nƣớc khác nhƣ: Thái Lan, Đài Loan….Trƣớc tình hình trên và cũng nhằm đƣa tiến bộ của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào vào công tác giống, góp phần phát triển nghề trồng lan trên qui mô rộng, việc ứng dụng nhân giống in vitro trên cây lan là điều cần thiết hiện nay ở nƣớc ta. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: "Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến quá trình nuôi cấy in vitro của hai giống lan Dendrobium và Cymbidium" 13 1.2. Mục đích nghiên cứu Mục đích của đề tài là xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao nhất trên 2 giống lan Cymbidium và Dendrobium. 1.3. Yêu cầu Quan sát sự phát sinh phôi soma, protocorm và chồi của 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium. Quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi lan in vitro. 14 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây hoa lan 2.1.1 Tình hình sản xuất lan trên thế giới và ở Việt Nam 2.1.1.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trƣờng thế giới rất lớn, ngày càng tăng và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao: *Ở Châu Âu: - Năm 1994, Mỹ nhập từ Thái Lan 16,4 triệu cành, từ Singapore 289.000 cành lan Dendrobium. - Holland là một quốc gia duy nhất ở Châu Âu có công nghiệp trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Holland có thể xuất khẩu hoa quanh năm nhất là Cymbidium. - Italia là quốc gia nhập khẩu hoa lan lớn nhất Châu Âu. Năm 1993, nhập 75,3 triệu cành, chủ yếu từ các nƣớc: Thái Lan, Holland , Singapore …. - Đức và Pháp là hai quốc gia nhập khẩu lan đứng thứ 2 và thứ 3 Châu Âu. *Ở Châu Á: - Nhật là quốc gia nhập khẩu đứng đầu thế giới. Theo thống kê, tại Thái Lan, Singapore, Malaysia dành 600 ha đất trồng lan để xuất khẩu sang Nhật, chủ yếu là Dendrobium, Oncidium, Cymbidium, Phalaenopsis,….. - Thái Lan là nƣớc xuất khẩu lan đứng đầu thế giới, chủ yếu là lan Dendrobium, xuất khẩu hơn 50 quốc gia trên thế giới với giá 1 - 3 USD / cành, có khi 8 - 10 USD / cành, những giống quý có thể lên đến hàng trăm USD. Ngày nay, bằng nhiều kỹ thuật khác nhau ngƣời ta đã tạo ra đƣợc nhiều giống lan mới nhƣ: Dendrobium ayaka, Dendrobium edians beauty, Dendrobium sungould (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). 2.1.1.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam - Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng loại. Tham gia sản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nƣớc, liên doanh hoặc100% vốn đầu tƣ nƣớc ngoài). Tuy nhiên sản xuất còn chƣa đƣợc áp dụng khoa học kỹ thuật 15 nên mặc dù đa dạng nhƣng không đạt về tiêu chuẩn, số lƣợng và chất lƣợng do đó tính cạnh tranh còn thấp. *Tại TP.HCM: - Trong các chủng loại sản phẩm hoa kiểng, hoa lan xem là nhóm hoa có giá trị kinh tế cao, trong đó lan cắt cành đem lại lợi nhuận khá cao (có thể đạt 500 triệu – 1 tỉ đồng / ha / năm) nhƣng vốn đầu tƣ ban đầu vẫn còn cao (600 – 800 triệu đồng / ha), chủ yếu là phần vốn đầu tƣ cho cây giống. Trong đó nhóm Mokara và Dendrobium đƣợc trồng nhiều nhất. - Theo Trung tâm Nghiên cứu khoa học kỹ thuật và khuyến nông TP.HCM, trong thời gian qua diện tích trồng hoa lan trong thành phố tăng nhanh, từ 20 ha năm 2003 lên 50 ha năm 2004 và khoảng 80 ha năm 2005. - Để đƣa hoa lan trở thành một trong những cây chủ lực trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp trong những năm tới, TP.HCM đề ra mục tiêu phát triển diện tích trồng hoa lan lên 200 ha vào năm 2010 và một số giải pháp chính về giống, khoa học kỹ thuật, thị trƣờng tiêu thụ, đào tạo nguồn nhân lực, chính sách hỗ trợ (ĐCSVN, 27/6/2005). *Tại Đà Lạt: - Cây lan Cymbidium đã đƣợc nuôi trồng tại Đà Lạt từ rất lâu, chủ yếu để tiêu khiển. Tại đây, ngoài những loài tự nhiên, các biến chủng, còn có nhiều giống nhập nội nuôi trồng. - Từ năm 1977, sau khi thành lập tổ Hoa Lan Xuất Khẩu, phong trào trồng lan đã đƣợc phát triển mạnh. - Đến năm 1985, đã xuất khẩu đƣợc trên 15.000 cành hoa Cymbidium. - Hiện nay nhu cầu hoa lan đang tăng nhanh, trong khi đó mức độ phát triển còn hạn chế. Đó là do chƣa có những đầu tƣ nghiên cứu về đối tƣợng này nhƣ: vấn đề khoa học, chọn tạo giống và kỹ thuật nuôi trồng…do đó không thể hiểu rõ và đánh giá đúng đắn tiềm năng và triển vọng nguồn lợi này. - Xu hƣớng hiện nay đang tập trung vào các giống nhập nội, còn lại các loại lan nội địa ít đƣợc chú ý. Mặc dù các loài biến chủng nội địa có giá trị rất cao, có thể đáp ứng đƣợc nhu cầu xuất khẩu. Nhƣ vậy cơ sở để phát triển nghề trồng lan xuất khẩu vẫn phải chú trọng vào cây lan nội địa, nhất là chọn tạo giống mới từ cây lan nội (Trích Dƣơng Ngọc Bích Quyên, 2002). 16 2.1.2. Giới thiệu chung về giống lan Cymbidium 2.1.2.1. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật của thế giới ngày nay, ngƣời ta đã xếp riêng Cymbidium vào một chi (Otto Swartz, 1799). Trong khóa phân loại của Lindley - Bentham - Brieger năm 1983, chi Cymbidium thuộc tông phụ Cymbidinae, tông Dendreae, phân họ Orchidoideae. Theo tài liệu về thực vật ở Đông Dƣơng, từ năm 1932, Henri Lecompte cho rằng chi này có 120 loài. Gần đây, năm 1978 Jean Carmard sắp xếp lại và xác định có khoảng 60 loài. Theo những nhà phân loại học Việt Nam nhƣ Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi... đã giới thiệu ở nƣớc ta có khoảng 12 loài: - Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội). - Cymbidium cyperifolium (thanh lan). - Cymbidium dayanum Reichb. f (xích ngọc). - Cymbidium devonianum Paxt. (gấm ngũ hồ). - Cymbidium eburneum Reichb (bạch lan). - Cymbidium ensifolium Swartz (mặc lan). - Cymbidium erythrostylum Lindl. (bạch hồng). - Cymbidium giganteum Wall. (hoàng lan). - Cymbidium insigne Rolfe (hồng lan). - Cymbidium lancifolium Hook. f. - Cymbidium polanei Gagn (tử cán). - Cymbidium munronianum King. et plant. 2.1.2.2. Đặc điểm hình thái - Lan Cymbidium là loài thân thảo, đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ. - Rễ: mọc bám trên vỏ cây, mặt đất hoặc ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn. Rễ mới thƣờng chỉ mọc ở cây con, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ củ rễ. - Thân (căn hành): thƣờng ngắn, nối những củ lan với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành. Củ già, khi bị tách khỏi căn hành cũ, có thể 17 mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con. Do đó ngƣời ta xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân (sympodial). - Củ lan (giả hành): thƣờng có dạng con quay hay dạng hột xoài, đƣờng kính từ 1 cm đến 15 cm, củ thƣờng tƣơi và đƣợc bọc trong các bẹ lá. - Lá: thƣờng có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thực đính trên giả hành. - Chồi hoa: thƣờng xuất hiện bên dƣới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già, đâm ra bên ngoài. Thông thƣờng, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần. - Cọng phát hoa: không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng. Chiều dài của phát hoa từ 10 đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luôn phiên theo đƣờng xoắn ốc. - Hoa Cymbidium lƣỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một trụ gọi là trục hợp nhụy, hình bán trụ hơi cong về phía trƣớc. Nhị ở trên cùng, mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính nhƣ keo. Khối phấn đƣợc đậy bởi một nắp màu trắng ngà dễ mở rời, cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên do hoa Cymbidium chỉ thụ phấn đƣợc nhờ côn trùng. - Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả. Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt. Khi chín, quả mở theo 3 đƣờng góc và gieo vào không khí những hạt nhƣ bụi phấn màu vàng lụa. Khi rơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới. 2.1.2.3. Điều kiện sinh thái Cymbidium có những tính chất rất đặc biệt: thời gian ra hoa dài (trung bình 12 tháng), khả năng phát triển rất mạnh, có hình dáng, màu sắc, kích thƣớc phong phú và đa dạng. Các loài Cymbidium sống trong môi trƣờng mát cây cần nhiều ánh sáng trong suốt thời gian trong năm, nhƣng cây không chịu đƣợc ánh sáng trực xạ nên phải che bóng để giữ độ chiếu sáng thích hợp. Cymbidium cần nhiều nƣớc trong mùa sinh trƣởng, cần tƣới nƣớc nhẹ nhàng và thƣờng xuyên bón phân đầy đủ, từ lúc cây phát triển cũng nhƣ lúc ra hoa và phân chia các khóm giả hành. 18 Về nhiệt độ: loài lan này sống trong môi trƣờng lạnh nên có chế độ nhiệt rất đặc biệt: 150C vào mùa đông và 200C vào mùa hè, biên độ ngày và đêm từ 6 - 70C cần cho ra hoa. Khi các giả hành phát triển, nhiệt độ về đêm phải từ 6 - 120C liên tục từ 3 - 4 tuần. Về ẩm độ: bộ rễ của Cymbidium khác xa bộ rễ của các loài lan ký sinh (epiphyte). Chúng đòi hỏi rễ luôn luôn ẩm nên phải tƣới trong mọi thời gian trong năm, chỉ cho giá thể vừa kịp khô giữa hai lần tƣới. Ẩm độ thích hợp từ 60-70% (Trích Phan Thị Tuyết Hằng, 2005). 2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 2.1.3.1. Phân loại Phong lan có vùng phân bố rộng lớn, trải dài từ đƣờng xích đạo cho đến Bắc cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núi băng tuyết. Họ phong lan (Orchidaceae) với 750 chi và hơn 25000 loài là họ lớn thứ hai sau họ cúc (Asteraceae) trong ngành hạt kín (Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm. Việc phân loại phong lan khá phức tạp. Theo truyền thống cổ điển các nhà khoa học trƣớc đây phân loại Dendrobium thuộc tông Epidendreae, họ phụ Epiden droideae, phân họ Orchidaceae (Trích Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004). Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) phân loại lan Dendrobium nhƣ sau: - Dendrobium crassinode (Hoàng thảo u lồi). - Dendrobium draconis (Hoàng thảo nhất điểm hồng). - Dendrobium farmeri (Hoàng thảo thủy tiên). - Dendrobium hercoglossum (Hoàng thảo tím huế). - Dendrobium heterocrrpun (Hoàng thảo nhất điểm hoàng). - Dendrobium (Hoàng thảo dẹt). - Dendrobium parciflorum (Hoàng thảo xƣơng cá). - Dendrobium parisshii (Hoàng thảo tím hồng). - Dendrobium parishii (Hoàng thảo hạc vĩ). - Dendrobium primulim (Hoàng thảo long tu). - Dendrobium pumilum (Hoàng thảo phù dung). 2.1.3.2. Đặc điểm hình thái - Rễ: thuộc loại rễ bì sinh, chung quanh rễ thật đƣợc bao bọc bởi một lớp mô xốp (màng) giúp cây dễ dàng hút nƣớc, muối khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời 19 gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây, ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp cây quang hợp. - Thân: lan Dendrobium thuộc loài đa thân có giả hành rất dài, hình trụ, hình múi hay hình dẹt, có nhiều đốt thân. Thân có dạng mọc thẳng hoặc rũ xuống. - Lá: xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá có hình xoang và các gân lá chính chạy song song các khe lõm xuống, lá lan có thể sống dai hay dễ rụng. - Các cụm hoa: mọc từ thân thành từng chùm, trên một cành hoa có những chiếc hoa đơn xếp theo hình xoắn ốc, các hoa đơn liền cành nhờ cuống. Cuống kéo dài cho tới bầu hoa tạo ra ba lá noãn (bầu hoa đƣợc tạo thành bởi 3 lá đài, 3 cánh hoa và 1 trụ hoa). Cột nhị nhụy ngắn. 2.1.3.3. Điều kiện sinh thái Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, ngƣời ta chia làm 2 hai nhóm chính: - Nhóm ƣa lạnh: nhiệt độ lý tƣởng là 150C sống chủ yếu ở vùng cao nguyên trên 1000m. Những loài lan này có thể ra hoa ở nhiệt độ cao. - Nhóm lan ƣa nóng: nhiệt độ thích hợp nhất là 250C. Ngoài ra còn có giống lan thích hợp ở nhiệt độ 200C có thể ra hoa ở vùng nóng và vùng lạnh. - Ẩm độ: thích hợp ở ẩm độ 50 - 70% - Ánh sáng: có thể nói Dendrobium là loài ƣa sáng (60 - 70%), có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%. Hình 2.1: Hai giống lan Cymbidium và Dendrobium thực hiện trong đề tài. 20 Hình 2.2: Một số loại hoa lan Dendrobium. 21 Hình 2.3: Một số loại hoa lan Cymbidium. 22 2.2. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 2.2.1. Giao phấn Nhƣ đã nói, giao phấn trong tự nhiên là hiện tƣợng thông thƣờng, gần nhƣ bắt buộc đối với hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lƣợng chủng loại rất phong phú. Đó cũng là phƣơng thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ƣu thế hơn cả của họ thực vật này trong hƣớng thụ phấn nhờ côn trùng. Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ. 2.2.2 Phƣơng pháp chiết tách - Phƣơng pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lƣợng cây mới. - Các giả hành già đƣợc tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng đƣợc từ 2 - 3 năm. Giả hành già đƣợc ƣơm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con đƣợc nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con. - Phƣơng pháp chiết tách đảm bảo đƣợc tính chất di truyền của cây bố mẹ nhƣng lại cho một thế hệ cây con sinh trƣởng không đồng đều nên khó cung cấp một số lƣợng cây con lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mô lớn. 2.2.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro 2.2.3.1. Lịch sử - Năm 1838, hai nhà sinh học ngƣời Đức Schleiden và Schwann đã đề xƣớng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. - Năm 1902, Haberlandt là ngƣời đầu tiên đƣa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Tuy ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tƣợng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông dùng các tế bào mất khả năng tái sinh). 23 - Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ rễ của một cây hoà thảo trong môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh truởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả chuyển qua môi trƣờng mới. - Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng và glucose và nƣớc chiết nấm men. Sau đó cũng chính White chứng minh có thể thay thế nƣớc chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid. Đồng thời trong thời gian này, R.J. Gautheret (ở Pháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tƣợng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đƣa auxin vào môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên không vƣợt quá 8 tháng. - Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote ). - Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp đƣơc công bố. 2.2.3.2. Các kỹ thuật nhân giống in vitro *Nhân giống bằng chồi nách Chồi nách nhô từ vị trí bình thƣờng trong nách lá mang đỉnh sinh trƣởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống nhƣ thân chính. Khi các mẫu cấy là chồi đƣợc giảm ƣu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách lá. Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thƣờng xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba …. . Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trƣờng mới. Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách đƣợc áp dụng cho bất kỳ cây cây trồng sản xuất chồi nách bình thƣờng và phản ứng với cytokinin nhƣ: BAP, Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee). 24 *Nhân giống bằng chồi đỉnh Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Kích thƣớc đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm – 0.5 mm) thƣờng khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhƣng nó lại quan trọng trong việc phát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh. Những kích thƣớc đỉnh chồi từ 0.5 mm – 2 mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983). Thƣờng nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trƣờng có chứa auxin kết hợp với cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền . *Nhân giống bằng chồi bất định Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thƣờng. Một số các nguyên liệu nuôi cấy gồm: lá, vẩy, cuống lá …… Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy. Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị. *Nhân giống qua nuôi cấy callus Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan hay phôi) là phƣơng pháp nhân giống in vitro có khuynh hƣớng cho giá trị thấp. Nuôi cấy callus và tế bào đơn cho tần số biến dị cao hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh. *Nhân giống bằng các đoạn giả hành Chọn những cây lan in vitro từ 5-6 tháng tuổi, sau đó cắt giả hành thành những đoạn có chiều dài khoảng 5mm và đem nuôi cấy trên những môi trƣờng có bổ sung các chất điều hoà sinh trƣởng. *Nuôi cấy hạt lai: Khi đã dự đoán kết quả của một phép lai, ngƣời ta mạnh dạn nhân giống hỗn hợp giữa vô tính và hữu tính để rút ngắn thời gian và tạo một số lƣợng cây giống lớn. *Dung hợp tế bào trần: Việc tạo giống vô tính theo các phƣơng pháp lai tế bào đã đƣợc tiến hành ở một số phòng thí nghiệm, còn gọi là phƣơng pháp dung hợp tế bào trần. Một hƣớng khác là gây đột biến trong ống nghiệm bằng các tác nhân vật lý và hóa học. Đây cũng là một hƣớng tạo giống hiện đại và tốn kém. 25 Đơn giản hơn, ngƣời ta có thể tạo ra những giống mới nhờ việc nhân cấy đỉnh sinh trƣởng và tạo ra những điều kiện để gây ra những thay đổi đặc điểm di truyền của các tế bào cơ thể bình thƣờng (đột biến soma) nhƣ: các dạng đột biến sinh lý, đa bội. Trong việc nhân giống vô tính, nhƣợc điểm lớn nhất là cây mẹ có thể bị nhiễm các dạng bệnh virus. Nếu không đƣợc tuyển chọn và kiểm tra kỹ lƣỡng sẽ cho ra đời hàng loạt cây con có chứa mầm bệnh. 2.2.3.3. Tiến trình nhân giống in vitro Gồm các giai đoạn sau: *Giai đoạn 1: Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng Giai đoạn này thƣờng kéo dài từ 4 – 6 tuần, mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng 1cm. *Giai đoạn 2: Nhân giống vô tính in vitro Mẫu cấy đƣợc cắt chia ra và cây mầm đƣợc cấy chuyền vào môi trƣờng mới. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào việc tiếp tục sản xuất chồi nách hoặc từ những khối giống nhƣ callus ở gốc chồi. *Giai đoạn 3: Chuyển cây ra vƣờn ƣơm Cây con đƣợc tái sinh hoàn chỉnh chuẩn bị cho việc cấy trồng và môi trƣờng bên ngoài đƣợc thiết lập để thuần hoá cây in vitro. *Giai đoạn 4: trồng cây in vitro ngoài đồng ruộng Cây con đƣợc tiếp tục nhân giống trên luống ƣơm và đƣợc cấy vào bầu đất rồi chuyển ra trồng trên đồng ruộng. 2.2.3.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống in vitro *Sự lựa chọn mẫu cấy Mẫu cấy phải cạnh tranh sinh lý để sống sót trong môi trƣờng nuôi cấy sơ khởi và tạo phản ứng thích hợp. Mẫu cấy còn non sẽ tái sinh tốt hơn mẫu già. Mẫu thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải có tỉ lệ mô phân sinh hiện diện hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. *Môi trƣờng nuôi cấy Thông thƣờng là môi trƣờng Murashige & Skoog là thích hợp cho phần lớn các trƣờng hợp. Để hình thành chồi nách yêu cầu nồng độ thấp của auxin và cytokinin, để 26 phát khởi chồi bất định cần nồng độ cao của cytokinin và thêm một lƣợng auxin cân bằng. Để sản xuất callus cần nồng độ cao của auxin kết hợp với nồng độ thấp cytokinin. Ngoài ra đối với vài loại cây trồng còn bổ sung GA3 ngoại sinh 0.1mg/l cho sự phát triển bình thƣờng và nhân giống in vitro. Sự lựa chọn môi trƣờng agar hay môi trƣờng lỏng là cần thiết, agar làm giá đỡ cho cây nhƣng cây trồng khó hấp thu tốt các dƣỡng chất. *Điều kiện nuôi cấy Ánh sáng Mẫu cấy đƣợc đặt trên môi trƣờng nuôi cấy là đƣờng, đƣờng đi vào quang tổng hợp cho cây trồng. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thu đóng vai trò trong quá trình tạo hình cây nuôi cấy mô. Thƣờng nuôi cấy ở 2000-3000 lux là tốt nhất. Nhiệt độ Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trƣờng khác có ảnh hƣởng rõ ràng là nhiệt độ. Hầu hết nuôi cấy thích hợp ở nhiệt độ 20- 250C. Môi trƣờng in vitro Môi trƣờng in vitro là môi trƣờng trên và dƣới mặt thạch trong bình nuôi cấy có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển hình thái của cây. Một số vấn đề thƣờng gặp trong môi trƣờng in vitro nhƣ: mức độ quang hợp thấp, không cân bằng CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dƣỡng thấp. Vì vậy cây con in vitro chậm phát triển. *Chất kích thích sinh trƣởng - Auxin - Cytokinin - Gibberellins - ABA - Ethylen 2.2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Nhân giống các loại cây cảnh là ứng dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Hiện nay tất cả lan thƣơng mại đều sản xuất bằng cách này. Ngoài ra còn có: 27 Dƣơng Xỉ, Cẩm Chƣớng (Sone, 1968), Cúc (Ever&Holt, 1974), Petunia (Stone, 1968) và Hồng (Hasegana, 1979). Theo Bajai (1968) một số cây trồng sản xuất qua nuôi cấy mô đã đƣợc tiêu thụ trên thị trƣờng với giá hành triệu dollas. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật bậc cao để cải thiện cây trồng bao gồm những ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa qua môi trƣờng nuôi cấy phôi và noãn. - Tạo dòng lai xa soma và lai tế bào trần (protoplast). - Cố định nitrogen. - Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp. - Bảo quản các nguồn gen (Trần Thị Dung, 2001). 2.3. Vai trò các chất điều hoà sinh trƣởng Những hoá chất có khả năng điều khiển đƣợc sinh trƣởng và phát dục của cây trồng đƣợc gọi là chất kích thích sinh trƣởng hay chất điều hòa sinh trƣởng. Với một lƣợng cực kỳ nhỏ nhƣng hiệu quả vô cùng to lớn trong các giai đoạn khác nhau nhƣ: sự phát sinh cơ thể, sự kích dục….Các chất điều hòa sinh trƣởng là một trong những hoá chất không thể thiếu đƣợc trong đời sống thực vật mặc dù cho đến nay cơ chế tác dụng của nó vẫn chƣa đƣợc lý giải rõ ràng. 2.3.1. Auxin 2.3.1.1. Lịch sử phát hiện ra auxin Năm 1880, Darwin phát hiện ra rằng bao lá mầm (coleoptyl) của cây họ lúa rất nhậy cảm với ánh sáng và ông cho rằng đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích của ánh sáng. Paal (1919) đã cắt đỉnh bao lá mầm và đặt trở lại trên chỗ cắt nhƣng lệch qua một bên và để trong tối. Hiện tƣợng uốn cong (hƣớng động) xảy ra nhƣ một trƣờng hợp chiếu sáng một chiều. Ông kết luận rằng đỉnh ngọn đã hình thành một chất kích 28 thích sinh trƣởng nào đó và ánh sáng xác định sự phân bố của chất đó về hai phía của bao lá mầm. Went (1928) đã đặt đỉnh ngọn tách rời của bao lá mầm đó lên các bản agar để các chất sinh trƣởng nào đấy khuyếch đại xuống agar, thì cũng gây ra hiện tƣợng sinh trƣởng uốn cong nhƣ thí nghiệm của Paal. Rõ ràng một chất sinh trƣởng nào đấy đƣợc tổng hợp trong bao lá mầm và đã khuyếch tán xuống agar và gây ra sự sinh trƣởng hƣớng động đó. Went gọi chất đó là chất điều hòa sinh trƣởng hiện nay là auxin. Năm 1934, Kogl và ctv đã tách một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt chất nhƣ chất sinh trƣởng và Thimann (1935) cũng tách đƣợc chất này từ nấm Rhysopus. Ngƣời ta gọi chất đó là - axit indolaxetic (AIA). Tiếp đó Wightman (1977) đã phát hiện ra một hợp chất auxin là axit phenyaxetic (APA). Ngày nay bằng con đƣờng hoá học ngƣời ta đã tổng hợp đƣợc nhiều hợp chất auxin khác nhau bao gồm: IAA (Indolacetic acid), IBA (Indolbultyric acid), NAA (Napthtalene acetic acid), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000) 2.3.1.2. Giới thiệu về NAA Tên khoa học: Naphthaleneacetic acid; Alpha-naphthaleneacetic acid; a- naphthaleneacetic acid; Naphthalene acetic acid; NAA; NAA; Naphthalene-1-acetic acid; 1-Naphthalene acetic acid; 1-Naphthylacetic acid. Trọng lƣợng phân tử: 186.21. Công thức cấu tạo: C12H10O2. 2.3.1.3. Vai trò của auxins - Kích thích sự giãn tế bào. - Kích thích tế bào phân chia (kết hợp với cytokinin). - Kích thích sự phân hoá của libe và mô gỗ. - Kích thích sự phát triển của rễ. 29 - Auxin gây ra tính hƣớng động của cây. - Ức chế sự lớn lên của chồi bên. - Trì hoãn sự hoá già của lá. - Làm chậm sự chín của trái. - Kích thích sự lớn lên các phần của hoa. 2.3.2. Cytokinin 2.3.2.1. Lịch sử phát hiện ra cytokinin Năm 1913, Haberlandt trích từ tế bào nhu mô cây cà, tế bào nhu mô khoai tây một chất có thể làm tăng sự phân chia tế bào nhu mô lõi. Năm 1938, Bonner trích từ trái đậu một chất làm tăng trƣởng tế bào của trái này và đƣợc gọi là cytokinin. Năm 1941, Van Overbeek cấy phôi cà rốt Ratura trong một môi trƣờng nuôi phôi nhƣ nƣớc dừa và có ảnh hƣởng quan trọng để nuôi mô và tạo bƣớu. Năm 1954, Steward và Shantz phân tích đƣợc trong nƣớc dừa một chất quan trọng là diphenylurea. Năm 1955, Skoog ghi nhận khi nuôi cấy mô thuốc lá và đã chứng tỏ rằng nƣớc dừa có sự phân bào. Tiếp đó Miller (1959) đã chiết tách chất này. Đây cũng là chất kích thích chủ yếu trong môi trƣờng nuôi cấy mô ở lan. Ngày nay bằng con đƣờng hoá học ngƣời ta đã tổng hợp nhiều loại cytokinin, cytokinin thƣờng gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurine). Tuy nhiên hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ, chất điều hoà tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin, có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). 2.3.2.2. Giới thiệu BA Tên khoa học: N-benzyl-Adenine, N6-Benzyladenine, benzylaminopurine, N- (phenylmethyl)-1H-purin-6-amine, Benzyladenine, Cytokinin B, Purin-6-amine, N- (phenylmethyl), Verdan senescence inhibitor, 6BA. Trọng lƣợng phân tử: 225.25. Công thức cấu tạo: C12H11N5. 30 2.3.2.3. Giới thiệu về TDZ Tên khoa học: 5-Phenylcarbamoylamino-1,2,3-thiadiazole, Phenyl-3-(1,2,3- thiadiazol-5-yl)urea, N-phenyl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, Dropp Trọng lƣợng phân tử: 220.25. Công thức cấu tạo: C9H8N4OS. 2.3.2.4. Vai trò của cytokinin - Kích thích sự phân chia tế bào. - Kích thích sự hình thành hoa. - Phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và một số cơ quan khác. - Kích thích sự tăng cƣờng tổng hợp ADN và ARN trong tế bào. - Điều tiết quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào. 2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy in vitro trên 2 giống lan Dendrobium và Cymbidium 2.4.1. Giống lan Cymbidium Cymbidium ở Việt Nam đƣợc trồng và nghiên cứu chủ yếu trên Đà Lạt, ngƣời ta đã tạo ra hàng loạt loại Cymbidium lai khác nhau nhƣ: Cymbidium aloifolium Swartz (lan lô hội), Cymbidium cyperifolium (thanh lan), Cymbidium dayanum Reichb. f (xích ngọc), …… và đã mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Việc lai tạo giống không ngừng ở việc thụ phấn, gieo hạt đơn giản mà còn dùng những kỹ thuật sinh học hiện đại để tạo ngiều giống đa bội. Cymbidium cũng là chi 31 đầu tiên của hoa đƣợc áp dụng thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, nhân giống vô tính bằng giả hành, ….. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về quá trình nhân giống in vitro của lan Cymbidium nhờ vào nuôi cấy các bộ phận nhƣ sau: - Thân lan (Vij, S.P., K. Kondo và ctv 1994). - Hạt lan (Nayak, N.R., Chand, P.K. và ctv 1998). - Callus (Chang C và Chang WC 1998). Theo Chang C và Chang WC (1998) đã nhân giống in vitro từ callus trên môi trƣờng có bổ sung 2,4-D, TDZ, BA kết quả cho thấy ngoài sự hình thành callus, chồi trên môi trƣờng có bổ sung (2,4-D = 0; 3.3mg/l; 10mg/l) và (TDZ = 0; 0.1mg/l; 0.33mg/l) còn có sự phát sinh phôi soma trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 5.0mg/l hoặc TDZ = 1mg/l). Tiếp theo đó, Huan, L.V.T và Tanaka, M (2004) đã nhân giống in vitro từ protocorm trên môi trƣờng có bổ sung NAA và TDZ. Những hƣớng nghiên cứu trên đã từng bƣớc khẳng định vai trò quan trọng của Cymbidium và cũng là tiền đề cho những nghiên cứu sau này. 2.4.2. Giống lan Dendrobium Trong quá trình nuôi cấy in vitro ngƣời ta thƣờng bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau: BA, TDZ, NAA, 2-4D, IAA,…..vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm đạt đƣợc kết quả nhân giống in vitro cao. Theo Nayak et al. (1998), Vij et al. (1994), Sheelavantmath et al. (2000), Lee et al. (1999) đã tìm thấy ảnh hƣởng lớn trong quá trình nhân giống in vitro khi bổ sung kết hợp vào môi trƣờng nuôi cấy BA và NAA. Năm 2000, Ed Herman đã nuôi cấy thân giả hành của giống lan Dendrobium moschatum trên môi trƣờng có bổ sung kết hợp BA và NAA tại các nồng độ (BA = 0, 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) với (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l; 3.0mg/l) và kết quả thu đƣợc cao nhất tại môi trƣờng có bổ sung BA = 3.0mg/l và NAA = 2.0mg/l là 8.4 protocorm. Năm 2003, Nasiruddin và ctv đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá của giống lan Dendrobium formosum trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1.25mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.5mg/l; 1.0mg/l; 2.0mg/l) kết quả thu đƣợc sau 60 ngày nuôi cấy tại nồng độ BA = 2.5mg/l và NAA = 1mg/l có số chồi cao nhất 2.68. Cũng vào 32 năm 2003 Talukder, Nasiruddin và ctv đã nuôi cấy từ chồi trên môi trƣờng có bổ sung (BA = 0; 1mg/l; 2.5mg/l; 5.0mg/l) và (NAA = 0; 0.1mg/l; 0.5mg/l; 1.0mg/l) sau 40