Ảnh hưởng của PH và nhiệt độ lên hoạt xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM LÊ KIM THANH ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH XÚC TÁC CỦA ENZYME BROMELAIN TRONG QUẢ DỨA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn TRẦN THANH TRÚC NĂM 2007 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài :” Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain trong quả dứa” do Lê Kim Thanh thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Cán bộ phản biện Trần Thanh Trúc Nguyễn Thị Thu Thủy Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2007 Chủ tịch hội đồng Nguyễn Văn Mười Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i LỜI CẢM TẠ
Em xin chân thành gửi lời cảm tạ và biết ơn sâu sắc đến: Cô Trần Thanh Trúc đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp; Và cô Nguyễn Thị Thu Thủy đã nhiệt tình truyền thụ những kiến thức quý báu, tạo cơ sở khoa học vững chắc cho em trong quá trình thực hiện đề tài; Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực Phẩm đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những tri thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập. Em xin cảm ơn thầy cố vấn Nhan Minh Trí và tập thể các bạn lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 28 đã động viên và giúp đỡ em trong suốt khóa học vừa qua. Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 Sinh viên thực hiện Lê Kim Thanh Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang i TÓM TẮT Trong công nghiệp chế biến thực phẩm từ quả dứa, sự biến đổi của các thành phần và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thường xảy ra trong quá trình tiền xử lý. Bên cạnh đó, sự tương tác giữa các thành phần bên trong nguyên liệu cũng có thể dẫn đến những biến đổi không mong muốn như trên. Một trong những nguyên nhân gây ra điều này đáng được quan tâm là hệ enzyme trong quả dứa mà tiêu biểu là hệ enzyme protease_bromelain quả. Đề tại này được đặt ra với mục đích là tìm ra quy luật hoạt động của hệ enzyme bromelain quả từ dịch chiết quả dứa ở các điều kiện xử lý pH = 4,6 – 9,5 và nhiệt độ từ 10 – 75 0C. Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ quả dứa được sử dụng cho nghiên cứu enzyme bromelain tốt nhất từ ngày bảo quản thứ tư trở đi; và bảo quản dịch chiết chứa enzyme tốt nhất là ở điều kiện lạnh đông. Đồng thời, có sự tương tác giữa pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả trong dịch chiết. Hệ enzyme này thể hiện hoạt tính tối thích trong khoảng nhiệt độ từ 10 – 20 0C ở môi trường pH thấp, 30 – 40 0C ở môi trường pH kiềm (pH = 7,5 – 9,5) và 40 – 60 0C ở môi trường pH trung tính (pH = 6,8 -7,1). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang ii MỤC LỤC TÓM TẮT ........................................................................................................... trang i MỤC LỤC ................................................................................................................... ii DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................. iv DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. iv CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1 1.1 TỔNG QUAN........................................................................................................ 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................... 2 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA................................................................................. 2 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA........................................................... 3 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa ................................................................... 3 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain ............................................................................. 4 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính chung của enzyme bromelain .............................................. 5 i. Cấu tạo............................................................................................................. 5 ii. Hoạt tính enzyme bromelain............................................................................. 6 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain ................................ 7 i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ ....................................................................... 7 ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH............................................................................... 8 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME ............................................................. 9 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản..................................................................... 9 2.3.2 Động học phản ứng enzyme.............................................................................. 10 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN................................................................. 11 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN........................... 12 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 13 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iii 3.1.1 Nguyên liệu...................................................................................................... 15 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 15 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm .......................................................................................... 15 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 16 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu .......................................... 16 3.2.2 Bố trí thí nghiệm............................................................................................... 17 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................... 20 4.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản dịch chiết từ dứa chứa bromelain quả đến đặc tính enzyme ................................................................................................................ 20 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein ........................................................ 22 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 26 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 26 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 27 PHỤ LỤC .................................................................................................................... v Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang iv DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến.................................................................................. 2 Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus).................................................................................... 3 Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain ..................................... 6 Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine ......................................................................... 6 Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pHmôi trường lên hoạt tính enzyme........................... 8 Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly bromelain quả (thô) ............................................................ 16 Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1%........................................................................ 16 Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 21 Hình 9: Mẫu dung dịch chiết chứa enzyme bromelain quả sau 12 ngày bảo quản ................. 22 Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng tương tác của pH và nhiệt độ xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa.................................................................................. 23 Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau............................................................................................................................. 24 Hình 12: Đồ thị biểu diễn hoạt tính của bromelain quả khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau ở pH thấp ................................................................................................................................ 25 Hình 13. Đường chuẩn tyrosine............................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein ................................................................. 12 Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính của enzyme bromelain trong dung dịch dứa tươi theo thời gian bảo quản....................................................................................................................... 20 Bảng 3: Kết quả thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của pH và nhiệt độ môi trường xử lý lên hoạt tính của enzyme bromelain quả .................................................................................... xii Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Khoảng 20 năm gần đây, với hơn 400 đề tài nghiên cứu, giới khoa học Châu Âu đã đưa ra một khuyến cáo rằng “với một quả dứa mỗi ngày, bạn sẽ không cần gặp bác sĩ” (Harvey and Ross, 1985). Câu nói trên đã được khoa học thực tiễn xác minh là phù hợp với dược tính đặc biệt của quả dứa. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy quả dứa loài Ananas có khả năng dược lý cao là do trong thành phần của quả có hệ enzyme bromelain, hay còn gọi là enzyme dứa. Bromelain là tên gọi chung của một nhóm enzyme thực vật, được tìm thấy từ những cây dứa loài Ananas, họ Bromeliaceae. Enzyme này đã mang đến cho giống dứa Ananas sự nổi tiếng về khả năng dược lý trong việc chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa và giảm đau, giảm sưng do viêm nhiễm. Về mặt thực phẩm, dứa là một loại cây ăn quả có nhiều giá trị dinh dưỡng và rất được ưa chuộng. Về mặt khoa học, dứa là một nguồn thực vật chứa loại enzyme đặc biệt có dược tính cao. Trong chế biến thực phẩm từ quả dứa, vấn đề đặt ra là cần quan tâm đến sự biến đổi về thành phần, giá trị dinh dưỡng và hệ enzyme trong quả dứa. Với vai trò không kém phần quan trọng, hệ enzyme trong quả dứa cũng cần được quan tâm đúng mức. Tuy nhiên, để biết được sự biến đổi về hoạt tính của hệ enzyme bromelain quả, cần phải biết quy luật chung về hoạt tính xúc tác của chúng. Giống như các enzyme khác, hoạt tính xúc tác của enzyme “bromelain quả” cũng chịu ảnh hưởng bởi nhiều nhân tố, trong đó nhân tố pH và nhiệt độ, là hai nhân tố được quan tâm nhiều nhất trong quá trình chế biến thực phẩm từ quả dứa. Từ vấn đề đặt ra trên, việc nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của hệ enzyme bromelain trong quả dứa là cần thiết, nhằm tạo tiền đề và cơ sở cho việc nghiên cứu lâu dài về hệ enzyme này. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát tác động của việc xử lý pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên cùng một loại cơ chất. Trên cơ sở đó, tìm hiểu được quy luật biến thiên về hoạt tính của hệ enzyme này theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ chế biến nhằm phục vụ cho công nghệ chế biến các sản phẩm từ dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 2 Ruộng dứa Dứa Queen CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA Dứa là loại cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được đưa tới các đảo khu vực Caribe nhờ những thổ dân Anhdieng Carib. Năm 1493, Christopher Columbus lần đầu tiên đã nhìn thấy các loại cây của chi này tại Guadeloupe. Ông đã đem chúng về Châu Âu và từ đây chúng được người Anh và Tây Ban Nha phát tán tới các đảo trên Thái Bình Dương (Morrison, 1963). Năm 1813, các cánh đồng trồng dứa thương phẩm được thành lập tại Hawaii, Philippines, Đông Nam Á, Florida và Cuba. Dứa đã trở thành một trong 3 loại cây ăn quả phổ biến nhất trên thế giới, sau chuối và các loại quả họ citrus (Anon, 1993). Dứa có tên khoa học là Ananas comosus. Thuộc loài Ananas, họ Bromeliaceae. Một số giống dứa trồng phổ biến nhất hiện nay là giống Queen và Cayenne, tên khoa học là Ananas comosus (Linnaeus) merril (Brasil). Ngoài ra, còn có một số giống dứa ăn quả phổ biến khác như Ananas sativus, Ananas bracteatur (Lindley) (Nam Mỹ).. (Collin et al., 1931). Hình 1: Các giống dứa ăn quả phổ biến Hiện nay, trên thế giới cây dứa được trồng ở hầu hết các nước nhiệt đới như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Brazil, Mexico, Cuba, Nam Phi..và một số nước cận nhiệt đới như đảo Hawaii, Đài Loan.. Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An, Quảng Dứa Cayenne Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 3 Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha. Dứa là một loại quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và giá trị năng lượng cao. Dứa được sử dụng trong chế biến thực phẩm và rất được ưa chuộng. Thành phần hóa học của quả dứa bao gồm nước (81 – 87%), sacharose (4,59 – 12%), glucose, fructose, vitamine nhóm B, vitamine C và các khoáng chất Fe, Na, K, P, Mg.. Ngoài ra trong quả dứa còn có một hệ các acid hữu cơ đa dạng, tạo nên vị chua, thơm hấp dẫn cho quả như acid citric (28 – 66% tổng lượng acid trong quả) (Gortner, 1963), acid ascorbic (từ 200 – 710 mg/l) (Singleton, 1955), acid malic (18 – 30% tổng lượng acid trong quả (Chan et al.,1973), acid oxalic, acid formic..Hàm lượng acid trong quả thay đổi theo độ chín của dứa và chúng được phản ánh bởi thông số pH. Khi trái chín chuyển sang màu vàng, độ pH giảm xuống từ 3,9 – 3,7 (Teisson và Pineau, 1982). 2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME TRONG DỨA 2.2.1 Sơ lược về hệ enzyme trong cây dứa Trong dịch chiết từ thân cây dứa và quả dứa có một hệ enzyme khá đa dạng và phức tạp, chúng thay đổi trong suốt quá trình phát triển của cây và quả dứa. Giống như ở các loại thực vật khác, hệ enzyme trong cây dứa cũng bao gồm nhiều nhóm enzyme với các đặc tính khác nhau, trong đó, nhóm enzyme protease chiếm đa số. Protease trong dứa gồm có cysteine protease, đây là nhóm enzyme chính với đại diện là enzyme bromelain; ngoài ra còn có một lượng ít các enzyme peroxidase, amylase, cellulase, acid phosphatase. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) - Enzyme peroxidase, tồn tại và có hoạt tính không đổi trong suốt quá trình phát triển của quả. Tuy nhiên, trong quả chín lượng enzyme này giảm dần, chỉ còn khoảng 1/3 so với ban đầu (Gortner và Singleton, 1965). - Cysteine protease là nhóm enzyme proteolytic chủ yếu nhất được tìm thấy trong dịch thân và quả dứa. Protease trong quả xuất hiện từ lúc bắt đầu ra hoa, tăng dần về số lượng trong suốt thời kỳ phát triển của quả. Ở giai đoạn quả chín, lượng enzyme này cũng có xu hướng giảm dần (Gortner và Singleton, 1965; Lodh et al., 1972). - Từ cây dứa loài Ananas, người ta đã tìm thấy được có tối thiểu 4 loại cysteine protease khác nhau (Rowan et al., 1988). Protease hiện diện chủ yếu trong dịch từ thân dứa là bromelain thân, ngoài ra còn có ananain (EC 3.4.22.31) và Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 4 comosain. Trong dịch quả dứa, cysteine protease chủ yếu là bromelain quả. - Từ một số nghiên cứu khác, các nhà khoa học còn tìm thấy trong dịch từ thân và quả của một loại dứa Bromelia pinguin (cùng họ Bromeliaceae) cũng chứa enzyme protease tên là pinguinain (EC.3.4.99.18). Loại này chỉ có một số đặc tính đặc biệt và hoạt tính hydrolase kém hơn so với bromelain (Toro-Goyco et al., 1968). - Từ quả xanh của giống Bromelia Hieronymi Mez, họ Bromeliaceae, các nhà khoa học đã tìm thấy được một loại peptidase mới tên là Hieronymain I. Loại enzyme này cũng đã được xác lập vào nhóm cysteine protease (Bruno M.A.; Pardo M.F.; Caffini N.O.; López L.M.I, 2003). Trong quá trình phát triển của cây và trái dứa, dịch chiết thân và trái còn chứa một số các enzyme dehydrogenase, synthase, pectin methyl esterase, pectin galactoronase nhưng với số lượng rất thấp. 2.2.2 Sơ lược về enzyme bromelain (bromeline) Enzyme bromelain lần đầu tiên được biết đến vào khoảng thế kỷ XIX. Năm 1892, nhà khoa học Chittenden là người đầu tiên đã tìm thấy sự hiện diện của một loại enzyme có khả năng thủy phân protein trong dịch của cây và trái dứa, Ananas Comosus (pineapple). Ông đã gọi nó là “bromeline”. Sau này, thuật ngữ “bromeline” hay “bromelain” đã được dùng để gọi chung các enzyme thủy phân protein (protease), được tìm thấy từ những cây giống cây dứa thuộc cùng họ Bromeliaceae. (Nguồn: truy cập ngày: 15/12/2006) Bromelain hiện diện ở tất cả các phần của cây dứa, loài Ananas. Chúng chiếm trên 50% protein trong thân dứa và quả dứa. Do đó enzyme bromelain còn được gọi là “enzyme dứa”. Tùy theo nguồn gốc, bromelain được phân làm 2 loại là bromelain thân (trích từ dịch thân dứa) và bromelain quả (trích từ dịch quả dứa) Trong công nghiệp, phần thân cây dứa được dùng làm nguyên liệu chính để sản xuất ra enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là sau mùa thu hoạch trái. Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33) - Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2. Hình 2: Quả dứa (Ananase Comosus) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 5 - Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân protein tại vị trí bất kỳ trên mạch polypeptide. - Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như bromelain thân.Tuy nhiên, bromelain quả hoạt động thủy phân tốt nhất trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg+NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân. (Nguồn: truy cập ngày: 13/11/2006) Bromelain quả là một protease acid, có phân tử lượng khoảng từ 23 đến 31 kDa tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích của phòng thí nghiệm. Bromelain quả có điểm đẳng điện pI = 4,6 khác biệt cơ bản với bromelain thân với pI = 9,6 (Yamada et al., 1976; Ota et al., 1985). 2.2.3 Cấu tạo và hoạt tính của enzyme bromelain i. Cấu tạo - Mã số enzyme  Bromelain thân: E.C.3.4.22.32  Bromelain quả : E.C.3.4.22.33 (Nguồn: truy cập ngày: 21/12/2006) - Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain - Tên khoa học và y học : sulfuhydryl proteolytic enzyme, cysteine protease - Tên thương mại : Bromanase (Kramer – Novis), Bromelain 2400 Maximum Strength (Vitalize Corp) Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine. Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có chứa cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH (sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain thân có khoảng 321 – 144 acid amin, còn bromelain quả thì có khoảng 283 – 161 acid amin. Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 6 đầu carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alanine. Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp – - Gly – Cys – Lys – Hình 3: Cách sắp xếp các amino acid trong phân tử bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Hoạt tính enzyme bromelain Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amydase và esterase. Bromelain xúc tác phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp như hemoglobin, casein, gelatin, BAA _ Benzoyl-L-Arginine amide, BAEE _Benzoyl-L- Arginine Ethyl Esther, BAEM _ Benzoyl-L-Arginine Methyl Esther…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). Nhóm sulfuhydryl trong phân tử của enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong các phản ứng của enzyme, là thành phần trực tiếp tham gia các phản ứng xúc tác. Chúng có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme – cơ chất. Chúng tham gia vào nhiều biến đổi hóa học như sự ion hóa, acyl hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa, alkyl hóa, tạo thành các mercaptide, serine mercaptal, liên kết hydrogen và những phức hợp chuyển điện tích. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino acid. - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain trong thân dứa cao hơn bromelain trong quả xanh và quả chín. R R (- NH – CH – CO – NH – CH – CO - )n + H - OH Enzyme bromelain n = k + i R ( - NH – CH – COOH )i + R ( H2N – CH – CO - )k Hình 4: Cấu trúc phân tử proteases cysteine Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 7 - Đối với cơ chất tổng hợp như BAA, ở 50C và pH = 6,0 thì hoạt tính phân giải của bromelain trong quả xanh cao hơn bromelain trong thân và quả chín (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị BTU (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU (đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)… Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị MCU hoặc GDU. 1 GDU tương đương với 1,5 MCU ( Nguồn: truy cập ngày: 12/12/2006) 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, hoạt tính của enzyme bromelain cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố:  Nhân tố môi trường gồm nhiệt độ, pH, ion kim loại..;  Nhân tố bên trong gồm nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme và độ tinh khiết của enzyme. Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa.. Bromelain là một enzyme có nguồn gốc thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý là được quan tâm nhiều nhất bởi các ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt là sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH của môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng. i. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ Nhiệt độ có những ảnh hưởng ở nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme. Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (Lê Ngọc Tú, 2004). Enzyme bromelain có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 45 – 600C. Nhiệt độ quá cao sẽ làm thay đổi cấu trúc của enzyme, phá vỡ các liên kết trong phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động cysteine, làm vị trí không gian của nhóm – SH bị biến đổi nên enzyme không kết hợp được với cơ chất. Nhiệt độ quá thấp hoặc quá cao sẽ làm phân tử protein bị biến tính sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme (Phạm Thu Cúc, 1999). Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 8 pH tối thích Độ hoạt động của enzyme pH pHtối thích Bên cạnh đó, nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy - Ở dịch chiết quả, (pH = 3,5), khi tăng nhiệt độ lên đến 600C thì bromelain vẫn còn hoạt tính. - Bromelain tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ hơn  Ở 5oC, pH = 4 – 10, enzyme bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ;  Ở 55oC, pH = 6,1 ,enzyme bromelain bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. - Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (Nguyễn Đức Lượng, 2004) ii. Ảnh hưởng của nhân tố pH Giá trị pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi loại enzyme thường chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. . Hình 5: Hình vẽ minh họa sự tác động của pH môi trường lên hoạt tính enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Độ pH ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzyme và của cơ chất, phức hợp enzyme-cơ chất. Nếu pH quá cao hoặc quá thấp sẽ làm ảnh hưởng đến điện tích và khả năng tích điện của enzyme và cơ chất, có thể làm giảm hoặc mất khả năng kết hợp với cơ chất của enzyme, do đó hoạt tính enzyme sẽ bị giảm hoặc thậm chí mất hẳn. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 9 Bromelain có biên độ pH hoạt động khá rộng, chúng có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH = 3 – 10. Tuy nhiên, khoảng pH tối thích của enzyme bromelain lại là pH = 5 – 8. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong phân tử enzyme bromelain, trung tâm hoạt động là cysteine, chứa nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH . Khả năng xúc tác của nhóm cysteine là nhờ liên kết đồng hóa trị được tạo thành thioester giữa nhóm acyl của cơ chất và nhóm sulfuhydryl của gốc cysteine. Trong môi trường pH sinh lý (pH = 6 – 8), phần lớn các nhóm – SH ở trạng thái không ion hóa và sự tạo thành liên kết hydro với cơ chất là do sự tham gia proton của nhóm – SH . Chính nhóm proton – SH sẽ làm tăng mật độ điện tích xung quanh nguyên tử lưu huỳnh (Lê Ngọc Tú, 2004). Bên cạnh đó pH còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác, mức độ ảnh hưởng của pH môi trường lên enzyme tùy thuộc vào nhiệt độ, loại cơ chất, thời gian phản ứng, độ tinh khiết của enzyme, bản chất của dung dịch đệm và sự hiện diện của chất tăng hoạt. 2.3 GIỚI THIỆU VỀ PHẢN ỨNG ENZYME Enzyme là một chất xúc tác sinh học đặc hiệu, có vai trò xúc tác các phản ứng sinh hóa diễn ra trong cơ thể sống. Về cấu tạo, enzyme có bản chất là protein, trong phân tử enzyme có một hoặc vài bộ phận mang tính chất đặc hiệu, chỉ có bộ phận này mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trong trung tâm hoạt động, có những nhóm chức hóa học có chức năng trực tiếp trong quá trình xúc tác phản ứng. Tất cả các phần còn lại của enzyme đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác của enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.3.1 Động hóa học của phản ứng cơ bản Tất cả các phản ứng sinh hóa đều có thể diễn ra với sự có mặt hay không có mặt enzyme. Thông thường, các phản ứng hóa học chỉ có thể xảy ra khi phân tử các chất tham gia phản ứng phải tiếp xúc với nhau ở vị trí tham gia phản ứng và chúng phải ở trạng thái hoạt động. Muốn hoạt hóa các phân tử này cần cung cấp cho chúng một mức năng lượng nào đó đủ để đạt đến trạng thái hoạt hóa. Năng lượng đó gọi là năng lượng hoạt hóa. Khi có sự tham gia của enzyme, năng lượng cản trở được hạ thấp, nhờ vậy sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất diễn ra dễ dàng hơn. Tức là đối với phản ứng có enzyme, chỉ cần một mức năng lượng nhỏ cung cấp cho hệ thống thì phản ứng đã xảy ra nhanh chóng. Vai trò xúc tác của enzyme trong phản ứng hóa học là khi có sự tham gia của các Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 10 enzyme, cơ chất được hoạt hóa mạnh, làm thay đổi tính chất và cấu trúc của cơ chất, từ đó sinh ra các sản phẩm mới của phản ứng (Lê Ngọc Tú, 2003). 2.3.2 Động học phản ứng enzyme Năm 1913, hai nhà khoa học Lenom Michealis và Maud Menten đã đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. Theo mô hình này, enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E – S). Phức hợp này sẽ được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme. Enzyme được giải phóng sẽ thực hiện phản ứng mới. Theo Michealis – Menten, cơ chế xúc tác tổng quát của phản ứng có enzyme được trình bày theo sơ đồ: Trong đó: K1, K-1, K2, K-2 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng. K -1 có giá trị nhỏ nhất. Phản ứng chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm là quan trọng nhất K2 tỉ lệ với nồng độ ES: v = K2.[ES] (v: vận tốc phản ứng) Khi nồng độ ES càng lớn, vận tốc phản ứng càng lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004) Theo thuyết Mischaelis và Menten, cơ chế phản ứng có xúc tác của enzyme xảy ra qua ba giai đoạn:  Giai đoạn một: enzyme (E) sẽ kết hợp với cơ chất (S) tại vị trí trung tâm hoạt động của enzyme bằng các liên kết hóa học, tạo thành phức hệ enzyme cơ chất (E-S). Ở giai đoạn này, các liên kết được hình thành thường là những liên kết yếu nên phức hệ E – S thường không bền. Phản ứng tạo phức hệ này thường xảy ra rất nhanh và cần có một ít năng lượng. Giữa E và S có năm loại liên kết tham gia, mỗi loại có đặc tính riêng và năng lượng liên kết khác nhau, gồm liên kết phối trí, liên kết hydro, liên kết ion, liên kết kỵ nước lực Vander-Waals và liên kết do dịch chuyển điện tử.  Giai đoạn hai: khi tạo thành phức hệ E – S, dưới tác dụng của enzyme, cơ chất sẽ bị thay đổi về cấu trúc không gian và mức độ bền vững của các liên kết bên trong phân tử, dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia ES E + P K2 E + S ES E + P K1 K -1 K2 K -2 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 11 phản ứng. Sau đó xảy ra sự thay đổi mật độ điện tích của phức hợp E – S làm biến dạng các liên kết giữa chúng, kết quả là cơ chất được hoạt hóa, dẽ dàng tham gia phản ứng.  Giai đoạn ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm của quá trình phản ứng được tạo thành, enzyme tách ra và trở về trạng tháng ban đầu, chuẩn bị kết hợp với phân tử cơ chất khác. Quá trình phản ứng hoàn thành. (citied by P. R. Mathewson, 1998) 2.4 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CASEIN Để xác định hoạt tính xúc tác của một loại enzyme, điều quan trọng nhất là lựa chọn cơ chất và phương pháp đo hoạt tính phù hợp. Khả năng xúc tác của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào loại cơ chất. Đối tượng nghiên cứu ở đây là bromelain quả, cơ chất được chọn là casein sữa (hoặc có thể là dạng muối caseinate). Casein là protein chủ yếu có trong sữa, chiếm khoảng 80% protein của sữa. Casein là một trong những protein có tính acid vì trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc acid glutamic và acid aspartic. Các casein đều có điểm đẳng điện pI= 4,6. Casein không có cấu trúc bậc ba và bốn nên không bị biến tính theo định nghĩa mà bị biến đổi phần lớn do bị thủy phân bằng enzyme hoặc do xử lý nhiệt, khi đó các liên kết peptide bị cắt đứt và hình thành những nitro phi protein (các mạch peptide ngắn, acid amine tự do, muối amonium..). Các muối caseinate thì bền với nhiệt và tan trong nước tốt hơn. Casein trong sữa gồm bốn dạng chính: α (s1) và α (s2)-casein, β-casein, κ-casein. (Lê Văn Việt Mẫn, 2004)  α (s1)-casein: phân tử lượng khoảng 23000 Da, có 199 gốc acid amine. Do sự phân bố các phần tích điện và các phần ưa béo không đồng đều nên các phân tử loại này có tính chất lưỡng cực, 1 đầu ưa nước, 1 đầu kỵ nước.  α (s2)-casein: phân tử lượng khoảng 25000 Da, có 207 gốc acid amine, có tính ưa nước cao nhất trong các loại casein do phân tử của nó chứa nhiều nhóm phosphoryl và gốc cation nhất.  β-casein: phân tử lượng khoảng 24000 Da, có 209 gốc acid amine, có tính ưa béo cao nhất. Dưới 40C, β-casein hoàn toàn bị khử trùng hợp do có nhiều tương tác ưa béo bị phá hủy.  κ-casein: phân tử lượng khoảng 19000 Da, có 169 gốc acid amine. Loại này chỉ chứa một gốc phosphoryl và cũng có tính lưỡng cực. Đầu amino của phân tử protein thì ưa béo còn đầu carboxyl thì ưa nước. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 12 Casein trong sữa có nguồn gốc từ những chủng bò khác nhau thì có thể có cấu trúc bậc một khác nhau. Tuy nhiên cấu trúc bậc một của cùng một loại casein chỉ khác nhau bởi vài gốc acid amine trong phân tử protein của chúng (Lê Ngọc Tú, 2003). Bảng 1: Thành phần các acid amine trong casein Acid amine Tỉ lệ (%) Glutamic Acid Proline Leucine Lysine Valine Aspartic Acid Serine Tyrosine Isoleucine Phenylalanine Threonine Arginine Histidine Alanine Methionine Glycine Tryptophan Cystine 20,2 % 10,2 % 8,3 % 7,4 % 6,5 % 6,4 % 5,7 % 5,7 % 5,5 % 4,5 % 4,4 % 3,7 % 2,8 % 2,7 % 2,5 % 2,4 % 1,1 % 0,3 % Nguồn: truy cập ngày: 16/12/2006 2.5 SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME BROMELAIN Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi về thành phần hóa học của bromelain thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2-hydroxy-5-5-nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelain bị biến đổi mạnh về cấu trúc, thành phần các acid amine trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 13 Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại protease từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuỗi amino acid cuối cùng là Ala – Val – Pro – Gln – Ser – Ile – Asp – Trp – Arg – Asp – Tyr – Gly – Ala Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt nhiều so với bromelain thân, tuy nhiên về cấu tạo FA2 có ít hơn về tổng lượng lysine và alanine so với glycine như bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein. (Nguồn: opt=Abstract, truy cập ngày: 12/03/2007) Waliszewski và Corzo (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme bromelain quả dạng thô trên những cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện với dịch quả dứa ở bốn mức độ chín khác nhau trên năm loai cơ chất gồm azocasein, azoalbumine, hemoglobin, natricaseinate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đã đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ tối thích đối với hoạt tính xúc tác của bromelain quả trên từng loại cơ chất trên. (Nguồn: truy cập ngày: 15/03/2007) Bên cạnh đó, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần kết quả nghiên cứu cho thấy trong thân dứa có tối thiểu bốn loại cysteine protease trong khi trong quả dứa chỉ chứa 2 loại là bromelain thân và bromelain quả với bromelain quả là chủ yếu. Với cơ chất tổng hợp, hoạt tính của các cysteine proteinase này là thể hiện mạnh nhất. Ở trong nước, Phạm Thị Trân Châu và cộng sự cũng nghiên cứu một số tính chất của bromelain tách từ chồi dứa tây cho thấy trong chồi dứa, bromelain có hoạt tính cực đại ở pH = 6,5 nhiệt độ tối thích là 600C. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 14 2.6 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu: khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein. Phần thí nghiệm bao gồm các nội dung:  Trích ly dung dịch enzyme bromelain quả (thô) từ nguồn nguyên liệu dứa tươi, giống dứa Queen (Ananas comosus), đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt, thường sử dụng trong chế biến các sản phẩm dứa_thực phẩm)  Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau.  Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả (thô) trên cơ chất là casein và sau đó xác định hoạt tính của enzyme bằng cách xác định nồng độ sản phẩm sinh ra từ phản ứng thủy phân bằng phương pháp quang phổ. (áp dụng phương pháp Kunitz) Từ cơ sở là quá trình nghiên cứu trên, xây dựng biểu đồ biểu diễn mối tương quan giữa pH và nhiệt độ ảnh hưởng lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 15 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Từ 12/3/2007 đến 28/5/2007. 3.1.2 Nguyên liệu  Dứa giống Queen, đạt độ chín 2 (chín 2-3 hàng mắt) 3.1.3 Hóa chất thí nghiệm  Casein – sodium caseinate, từ sữa bò (Sigma)  L - Cysteine hydrochlorid – monohydrate (Merck)  Trichloroacetic acid (TCA) (Trung Quốc)  Ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA) (Trung Quốc)  L - Tyrosine (C9H11NO3) (Merck)  Disodium hydro phosphate (Na2HPO4.12H2O), sodium dihydro phosphate (NaH2PO4.2H2O) (Trung Quốc)  Acid hydrochlorid 0,1N 3.1.4 Thiết bị thí nghiệm  Máy ly tâm lạnh (Hattich centrifugen D-78532 Tuttlingen, 1999, Germany)  Thiết bị ủ nhiệt (Water Bath)  Máy đo quang phổ (Hitachi U-1500 Spectrophotometer)  Cuvette thạch anh  Máy đo pH (Thermo electron corporation)  Cân phân tích độ chính xác 0,0001; 0,01  Micropipette, pipette, nhiệt kế  Máy ép trái cây (Philip)  Tủ lạnh, tủ đông và một số dụng cụ khác Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 16 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu và hóa chất nghiên cứu i. Phương pháp trích ly enzyme bromelain quả (thô) Dứa ở độ chín đã được lựa chọn, sau khi thu hái, tiến hành trích ly enzyme bromelain theo phương pháp trích ly tổng quát cho các enzyme theo sơ đồ ở hình 6. Hình 6: Sơ đồ quy trình trích ly enzyme bromelain quả (thô) Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004 ii. Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme bromelain Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong quả khóm theo các điều kiện xử lý khác nhau được tiến hành theo phản ứng thủy phân của enzyme bromelain trong dịch quả trên cơ chất là casein (phương pháp Kunitz, xem phụ lục). iii. Phương pháp chuẩn bị dung dịch casein 1% Cơ chất casein sử dụng trong quá trình xác định hoạt tính của enzyme bromelain được chuẩn bị theo sơ đồ ở hình 7. Hình 7: Sơ đồ chuẩn bị dung dịch casein 1% Casein (1 g) 100 ml dd đệm phosphate 0,05 M, pH = 7,5 Đun cách thủy (85-900C, 1h) Bảo quản (40C) Dứa chín Gọt vỏ, bỏ mắt, cắt nhỏ Ép lấy dịch quả Lọc (giấy lọc) Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút, 40C) Dịch chiết chứa enzyme bromelain quả Bảo quản Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 17 3.2.2 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát sự thay đổi các đặc tính của enzyme bromelain trong dịch chiết (tính chất vật lý, hoạt tính thủy phân) theo thời gian bảo quản ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Mục đích Xác định điều kiện bảo quản thích hợp mà enzyme vẫn duy trì và ổn định hoạt tính. Tiến hành thí nghiệm Dung dịch enzyme sau khi trích ly sẽ được đưa vào bảo quản với 2 nhân tố Nhân tố A: Nhiệt độ bảo quản A1: Nhiệt độ lạnh 40C A2: Nhiệt độ lạnh đông -30 0C Nhân tố B: Thời gian bảo quản, thay đổi ở 10 mức độ: B1: 1 ngày B2: 2 ngày B3: 3 ngày B4: 4 ngày B5: 5 ngày B6: 6 ngày B7: 8 ngày B8:10 ngày B9:12 ngày B10:14 ngày Mẫu chuẩn đối chứng là mẫu không bảo quản (mẫu vừa mới trích ly): B0 Ứng với mỗi nghiệm thức thời gian là một mẫu thử, lặp lại 2 lần. Số mẫu thí nghiệm: (10 nghiệm thức + 1 mẫu đối chứng)* 2 lần lặp lại * 2 (điều kiện bảo quản) = 44 mẫu Thu nhận kết quả Sau thời gian bảo quản, mẫu thí nghiệm được kiểm tra để xác định đặc tính vật lý (màu sắc, độ kết lắng) và hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz với cơ chất là casein, điều kiện thí nghiệm: pH = 7,5; nhiệt độ = 370C. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả(trong dịch quả dứa) trên cơ chất là casein Mục đích Tìm hiểu quy luật biến đổi hoạt tính của enzyme bromelain trong dịch quả dứa ở những điều kiện tiền xử lý khác nhau. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 18 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: Nhân tố C: pH môi trường Với khoảng pH khảo sát từ 4,6 ÷ 9,5; chia làm 11 mức độ C1: pH = 4,6 C2: pH = 5,6 C3: pH = 6,2 C4: pH = 6,5 C5: pH =6,8 C6: pH = 7,1 C7: pH = 7,5 C8: pH = 7,8 C9: pH = 8,4 C10: pH = 9,0 C11: pH = 9,5 Nhân tố D: Nhiệt độ môi trường Với khoảng nhiệt độ khảo sát thay đổi từ 100C ÷ 700C; chia làm 13 mức độ D1: 100C D2: 150C D3: 200C D4: 250C D5: 300C D6: 350C D7: 400C D8: 450C D9: 500C D10: 550C D11: 600C D12: 650C D13: 700C Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Tổng số mẫu thí nghiệm: n x m = 11 x 13 x 2 (lần lặp lại) = 286 mẫu Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau: D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 C1 C1 D1 C1 D2 C2 C2 D3 C3 C3 D4 C4 C4 D5 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 19 Tiến hành thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân của enzyme bromelain quả trên cơ chất là casein. Các bước thực hiện dựa vào phương pháp Kunitz (phụ lục). Ứng với mỗi giá trị khảo sát có thực hiện thêm 1 mẫu đối chứng kèm theo (hình 8). Kết quả thí nghiệm - Hoạt tính của enzyme bromelain còn lại trong mẫu ở các chế độ xử lý khác nhau, được xác định theo mức độ thủy phân casein. - Xác định sự tương tác của điều kiện pH môi trường và nhiệt độ xử lý đến sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain quả dứa. Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN BẢO QUẢN DỊCH CHIẾT DỨA CHỨA ENZYME BROMELAIN QUẢ ĐẾN ĐẶC TÍNH ENZYME Trong quá trình nghiên cứu về enzyme bromelain ở dạng còn tồn tại trong dung dịch dứa tươi, bước đầu tiên là trích ly dung dịch dứa, loại bỏ các hợp chất màu và tạp chất. Để đồng nhất mẫu, cần tiến hành trích ly một lượng lớn enzyme, sau đó đưa vào bảo quản ở điều kiện tối ưu nhất mà không làm thay đổi lớn đến đặc tính enzyme trong dung dịch. Vì vậy, vấn đề đặt ra là cần tiến hành khảo sát khả năng bảo quản enzyme trong điều kiện nào là tốt nhất để hạn chế tối thiểu sự biến đổi của dung dịch enzyme. Thí nghiệm tiến hành khảo sát ở hai điều kiện bảo quản là tồn trữ lạnh ở nhiệt độ 4oC và bảo quản lạnh đông ở nhiệt độ -30oC. Dung dịch dứa tươi chứa enzyme bromelain quả được tiến hành trích ly, ly tâm và cho vào bao PA (5ml dd / mẫu), tiến hành bảo quản ở 2 chế độ nhiệt độ: bảo quản lạnh 4oC và lạnh đông ở -30oC, sau các khoảng thời gian dự kiến, mẫu được đem phân tích hoạt tính enzyme theo phương pháp Kunitz, đồng thời được đánh giá cảm quan về các đặc tính vật lý, có sự so sánh giữa các mẫu. Sự thay đổi hoạt tính của enzyme bromelain theo thời gian bảo quản được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Kết quả theo dõi hoạt tính enzyme bromelain trong dd dứa tươi theo thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Bảo quản lạnh (4 0C) Bảo quản lạnh đông (-30 0C) 0 10,355 b 10,270 c 1 10,375 b 9,320 a 2 10,775 c 9,580 b 3 11,385 d 11,795 c 4 11,415 d 11,925 d 5 12,050 e 11,925 d 6 12,040 e 11,910 d 8 12,045 e 11,895 d 10 12,015 e 11,890 d 12 10,775 c 11,985 d 14 7,825a 11,990 d Kết quả thể hiện là hoạt tính của enzyme theo đơn vị TU/ml dd, trên cơ chất là casein Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95% Luận văn Tốt nghiệp khóa 28 - 2007 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng Trang 21 Từ kết quả ở bảng 2 và đồ thị ở hình 8 cho thấy các mẫu dung dịch chứa enzyme được bảo quản trong điều kiện lạnh và lạnh đông có hoạt tính enzyme không ổn định trong khoảng 3 ngày bảo quản đầu. Tuy nhiên, ở ngày bảo quản thứ 4 có sự thay đổi rõ rệt, hoạt tính enzyme bắt đầu ổn định hơn so với những ngày bảo quản tiếp sau, thể hiện qua giá trị hoạt tính TU/ml dung dịch tăng khác biệt đáng kể. Điều này có thể lý giải là do dung dịch ban đầu là một hệ tương đối phức tạp, trong thời gian đầu có thể có các phần tử trong hệ tương tác với nhau làm hoạt tính enzyme proteases trong hệ không được ổn định. Bên cạnh đó, do trong dung dịch ban đầu còn tồn tại một số phần tử “tiền enzyme” protease, sau một thời gian, gặp điều kiện thích hợp, các phần tử này sẽ biến đổi thành các protease, làm tăng nồng độ enzyme trong hệ nên hoạt tính thủy phân của enzyme tổng tăng lên. Ngoài ra, trong quá trình trích ly, các tác động của những thiết bị ép tách, ly tâm và sự chênh lệch nhiệt độ giữa các công đoạn có thể làm enzyme trong dung dịch bị ảnh hưởng. 6 7 8 9 10 11 12 13 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Thời gian (ngày) H o ạt tín h( TU /m l) BQ lạnh BQ lạnh đông Hình 8: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính của enzyme bromelain trong dd dứa tươi So sánh giữa hai điều kiện bảo quản cho thấy, mẫu được bảo quản ở các điều kiện lạnh và lạnh đông nhìn chung hoạt tính enzyme thể hiện tốt vào ngày bảo quản thứ 4 trở đi. Tuy nhiên đến ngày bảo quản thứ 10, một số mẫu bảo quản ở điều kiện nhiệt độ lạnh có hiện tượng hư hỏng, enzyme bromelain trong dung dịch lúc này bắt đầu giảm hoạt tính. Hoạt tính enzyme ở ngày thứ 12 và 14 giảm thấp hẳn, khác biệt có ý nghĩa khi so sánh với giá trị thu được từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 10. Do enzyme tồn tại trong dung dịch dứa là một hệ phức tạp, các biến đổi khác của các phần tử bên trong hệ đều gây ảnh hưởng đến đặc tính của enzyme. Xét về mặt khoa học thực phẩm, mẫu lúc này sẽ không còn khả năng sử dụng được nên ngừng quá trình khảo sát. Đối với mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh đông, tính chất của enzyme trong dung dịch ổn định hơn, thể hiện qua giá trị hoạt tính thu được không thay đổi trong suốt thời gian tồn Luận văn Tốt nghiệp khóa 28