Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và tăng trưởng của cá rô phi (oreochromis niloticus)

n thứ nhất cho vào đầu thí nghiệm và lần thứ hai cho vào sau khi kiểm tra tăng trọng của cá vào ngày thứ 21. Sau lần cho thuốc thứ 2 thì kiểm tra tăng trọng của cá vào ngày 42 và 54 kể từ khi bắt đầu thí nghiệm. Theo dõi các hoạt động hàng ngày ở các bể thí nghiệm. Ghi nhận số lượng và thời gian cá chết, cá chết sẽ được lấy ra để tránh làm ảnh hưởng đến môi trường nước trong bể thí nghiệm. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, DO đo ngày 2 lần/tuần và NO2-, NO3- và NH3 đo định kỳ 10 ngày/lần và đo trước khi cho thuốc vào bể. 3.4 Phương pháp phân tích 3.4.1 Cách lấy mẫu Khối lượng cá được cân bằng cân điện tử có độ chính xác 0,001g (Sartorius, Germany), đo chiều dài tổng bằng thước, chiều dài tổng được tính từ mõm đến chót đuôi. Não được lấy từ đầu cá, chuyển sang đĩa petri sạch và lạnh, máu cá đọng trên não được tách ra bằng cách lăn trên giấy thấm, não được chứa trong eppendoft 1,5 ml. Cơ và gan cá cũng được đựng trong eppendoft 1,5 ml, trữ lạnh ở -800C cho đến khi phân tích. 15 Hình 3.2: Lấy mẫu não cá Hình 3.3: Lấy mẫu cơ cá 3.4.2 Cách nghiền mẫu Trước khi phân tích hoạt tính men thì các mẫu não, cơ và gan cá được giải đông và được nghiền bằng máy nghiền mẫu. Chuyển mẫu não, cơ và gan cá vào ống thủy tinh sạch chứa dung dịch đệm KH2PO4/K2HPO4 có pH =7,5. Nghiền mẫu cá trong điều kiện lạnh, sau khi nghiền xong chuyển mẫu sang eppendoft 1,5 ml để tiến hành ly tâm lạnh. Ly tâm lạnh mẫu đã nghiền trong điều kiện 40C, vận tốc 10.000 vòng trong 10 phút. Hút lấy phần dịch trong trữ trong ống eppendoft 0,5 ml ở -800C cho đến khi phân tích hoạt tính các men và protein. 3.4.3 Phân tích ChE Nguyên tắc: ChE được phân tích theo phương pháp Ellman et al. (1961). Trong quá trình phân tích sử dụng acetylthiocholine iodine (ATChI) như là cơ chất của ChE, ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi ChE và thiocholine phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường độ màu đậm dần theo thời gian và hoạt tính của ChE được đo bằng máy so màu quang phổ. Phương trình phản ứng minh họa: Acetylthiocholine iodine  →ChE thiocholine + acetate Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate → sản phẩm có màu vàng Chuẩn bị hóa chất: • Dithiobisnitrobenzoate (DTNB, Sigma) 167 µM: 66,1 mg/ml Sodium phosphate 50 mM, pH = 7,4. • Sodium phosphate: nồng độ 50 mM, pH = 7,4. • Cơ chất Acetylthiocholine iodine (ATChI, Sigma) 30mM: 8,67 mg/ml Sodium phosphate, pH = 7,5. 16 Quá trình phân tích ChE: Bảng 3.1: Quá trình phân tích ChE Hóa chất Mẫu trắng (µL) Mẫu (µL) DTNB (nồng độ cuối 150µM) Sodium phosphate Mẫu Cơ chất (nồng độ cuối 1,5mM) 900 50 / 50 900 / 50 50 Đọc ở bước sóng 412 nm trong 10 phút Công thức tính hoạt tính men ChE: R= Abs * độ pha loãng/ thể tích mẫu (ml) * 0,0136)/protein (mg/mL) Trong đó: Đơn vị của R là nmole/min/mg protein. 0,0136: hệ số acetylthiocholine iodine chuyển thành thiocholine và acetat. Công thức tính hoạt tính ChE theo đơn vị phần trăm: R (%) = 100*A/Ao Trong đó: - R (%): phần trăm ChE so với đối chứng - A là hoạt tính ChE ở nghiệm thức có thuốc - Ao là hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng Tỷ lệ men ChE bị ức chế tính theo công thức sau: Trong đó: - T (%) là tỷ lệ phần trăm bị ức chế so với đối chứng - A là hoạt tính ChE ở nghiệm thức có thuốc - Ao là hoạt tính ChE ở nghiệm thức đối chứng 3.4.4 Phân tích GST GST được xác định theo phương pháp Habig et al., (1974) có bổ sung. Chất 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) là một hợp chất có tính kỵ 17 nước được sử dụng để đo hoạt chất của GST. CDNB có ái lực với enzyme phân tích hơn các cơ chất khác và cũng là cơ chất chuyển hóa của nhiều enzyme đồng đẳng với hoạt chất của GST. Ngoài ra, glutathione (GSH) cũng là đồng cơ chất trong phản ứng. Phản ứng thực hiện theo phương trình sau: CDNB + GSH → CDNB–GSH + HCl Hoạt tính của GST được đo bằng máy so màu quang phổ thông qua độ hấp thụ của cơ chất CDNB-GSH ở bước sóng 340 nm trong 3 phút. Hoạt tính của GST = (A340/phút – Ablank) x độ pha loãng x coff.Exmol CDNBcoeff = 9,6 nM-1cm-1 (hệ số CDNB chuyển thành CDNB-GSH + HCl dưới tác dụng của GST) Đơn vị của GST là nmol CDNB/min/mg protein Quá trình phân tích: Bảng 3.2: Quá trình phân tích GST TT Hoá chất Mẫu Blank (µL) Mẫu (µL) 1 HEPES buffer 700 700 2 CNDB 30 30 3 H2O 240 200 4 GSH 30 30 5 Mẫu / 20 Đọc ở bước sòng 340 nm trong 3 phút 3.4.5 Phân tích protein Nguyên tắc: lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry et al., (1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Trong môi trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi folin được đưa vào, folin sẽ kết dính với protein. Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ vàng sang xanh. Chuẩn bị hóa chất: Thuốc thử: o Mẫu chuẩn: BSA 10mg/ml H2O o 1N NaOH o Hỗn hợp A: pha trộn trước khi sử dụng: 150 ml Na2CO3 2% 18 1,5ml Cu2SO4.5H2O 1% 1,5 ml NaK tartrate (C4H4KNaO6) o Thuốc thử Folin (màu vàng): hòa trộn trước khi sử dụng: 10ml Folin + 10ml nước cất. Quá trình phân tích protein: Bảng 3.3: Quá trình thiết lập đường chuẩn và phân tích protein Hóa chất Đường chuẩn Mẫu BSA Mẫu H2O NaOH 0 mg Protein 0µL / 500 µL 500 µL 0,01 mg Protein 1 µL / 499 µL 500 µL 0,03 mg Protein 3 µL / 497 µL 500 µL 0,06 mg Protein 6 µL / 494 µL 500 µL 0,09 mg Protein 9 µL / 491 µL 500 µL 0,15 mg Protein 15 µL / 485 µL 500 µL 0,2 mg Protein 20 µL / 480 µL 500 µL / 10 490 µL 500 µL Ủ trong 30–120 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660 nm 3.5 Tốc độ tăng trưởng - Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối (g/ngày) (DWG) DWG = (Wc – Wđ)/t. Trong đó: Wc: khối lượng cuối (g) Wđ: khối lượng đầu (g) t: thời gian thí nghiệm (ngày) - Tỷ lệ sống (survival rate - %) =100x(số lượng thu được/số lượng thả) 19 - Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR – feed conversion ratio) FCR = Lượng thức ăn cá sử dụng/khối lượng gia tăng 3.6 Các chỉ tiêu khác - NO2- phân tích theo phương pháp Griess llosvay, Diazonium - NO3- phân tích theo phương pháp Salycilate - Oxy đo bằng máy YSI (Mỹ) - NH3 đo bằng máy YSI (Mỹ) 3.7 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các số liệu phân tích giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (std), sai số chuẩn (SE) và phân tích phương sai tìm sự khác biệt giữa các nghiệm thức (phân tích one-way ANOVA và phép thử Duncan), sử dụng mềm Microsoft Office Excel 2003 và SPSS 16.0. 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giá trị LC50 –96 giờ của hoạt chất quinalphos đối với cá rô phi 4.1.1 Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm Kết quả Bảng 4.1 cho thấy nhiệt độ trung bình buổi chiều cao hơn buổi sáng 0,20C nhưng nhiệt độ trung bình không khác biệt lớn ở các bể thí nghiệm. pH trong quá trình thí nghiệm tương đối ổn định và nằm trong giới hạn cho phép và dao động từ 7,13 đến 7,14 giữa sáng và chiều. Ở các bể thí nghiệm hàm lượng oxy trung bình 3,3 mg/L vào buổi sáng và 3,1 mg/L vào buổi chiều. Hàm lượng oxy hoà tan từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến thời điểm cuối thí nghiệm có sự chênh lệch lớn là do suốt quá trình thí nghiệm các bể tiến hành trong điều kiện hoàn toàn không sục khí, cá sử dụng oxy trong quá trình hô hấp làm giảm dần lượng oxy hòa tan trong nước, tuy nhiên lượng oxy gần như đồng nhất giữa các nghiệm thức ở từng thời điểm. Bảng 4.1: Các yếu tố môi trường trong thí nghiệm LC50–96 giờ Chỉ tiêu Sáng Chiều pH Oxy Nhiệt độ 7,13±0,10 3,30±1,89 27,2±0,20 7,14±0,10 3,30±1,89 27,4±0,20 Giá trị trình bày trung bình±độ lệch chuẩn Nhìn chung các điều kiện môi trường trong quá trình thí nghiệm là ổn định và gần như đồng nhất giữa các bể, không gây ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh lý và thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá thí nghiệm. 4.1.2 Kết quả thí nghiệm LC50–96 giờ Giá trị LC50–96 giờ của cá rô phi tiếp xúc hoạt chất quinalphos được xác định dựa vào phương pháp Probit (Finey, 1971). Kết quả phân tích trên phần mềm SPSS 16.0 cho giá trị LC50–96h là 0,84 mg/L. Ở cá rô phi giá trị LC50–96 giờ cũng đã được nghiên cứu xác định khi cho cá tiếp xúc nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau. Theo nghiên cứu của Pathiratne và George (1998) thì khi cho cá rô phi tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ có hoạt chất malathion giá trị LC50–96 giờ là 2 mg/L. Một nghiên cứu khác cũng trên cá rô phi khi cho tiếp xúc với hoạt chất diazinon giá trị LC50–96 giờ được xác định là 2,8 mg/L (El-Sherif et al., 2009). Như vậy 21 trong cùng nhóm lân hữu cơ hoạt chất quinalphos độc hơn rất nhiều so với malathin và diazinon. Một nghiên cứu khác khi cho cá rô phi tiếp xúc với hoạt chất deltamethrin thuộc nhóm pyrethroid giá trị LC50–96 giờ tương đối thấp 15,5 µg/L (Josephine et al., 2006). Tuy nhiên, giá trị LC50–96 giờ ở hoạt chất diamethoate tương đối khá cao là 20,7 mg/L (Auta et al., 2004). Có thể nói rằng giá trị LC50–96 giờ ở cá rô phi khác nhau ở từng loại thuốc BVTV và giá trị này tăng hay giảm tùy theo độ độc của thuốc và kích cỡ cá. Tương tự như các loại thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ khác, hoạt chất quinalphos cũng được nghiên cứu xác định ngưỡng gây chết trên nhiều loài động vật thủy sản. Ở cá Channa punctatus thì nồng độ gây chết LC50–96 giờ có giá trị là 0,25 mg/L (Sastry và Siddiqui, 1982), trong khi đó ở cá chép (cyprinus carpio) cỡ 2 ± 0,2 g là 7,5 µg/L (Chebbi et al., 2009). Giá trị LC50- 96 giờ này tương đối thấp điều đó cho thấy rằng hoạt chất quinalphos không chỉ độc với cá rô phi mà còn trên cá khác. Ngoài ra, giá trị LC50 của các loại hóa chất khác nhau đối với các loài cá cũng khác nhau. Nghiên cứu cho thấy giá trị LC50–96 giờ của carbaryl đối với cá chép (Cyprinus carpio) cỡ 0,6 g là 0,72 mg/L, malathion là 0,82 mg/L, parathion methyl là 0,85mg/L (Luciano và Giovanna, 1990, trích dẫn bởi Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2009). Mức độ độc của Basudin 40EC đối với cá chép, cá mè vinh và cá rô phi gần như tương đương nhau, giá trị LC50–96 giờ lần lượt là 3,66 mg/L, 3,69 mg/L và 3,50 mg/L (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999). Giá trị LC50–96 giờ của hoạt chất fenobucarb với cá lóc (Channa striata) là 11,4 mg/L (Nguyễn Văn Công và ctv, 2006). 4.2 Ngưỡng ức chế men ChE trong não và cơ gây chết cá 4.2.1 Hoạt động của cá trong thời gian thí nghiệm Ở nghiệm thức đối chứng cá có màu sáng, các sọc trên thân hơi mờ, cá hoạt động bình thường, phản ứng nhanh với tiếng động và cá thường tập trung theo đàn và di chuyển nhanh. Tuy nhiên, cá ở nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) sau 1 giờ tiếp xúc với thuốc thì các sọc trên thân cá bắt đầu chuyển sang màu đậm hơn so với đối chứng, cá phần lớn tập trung dưới đáy bể. Ở thời điểm 6 giờ của nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,84 mg/L thì đa số cá toàn thân chuyển sang màu đen, lúc này cá phân tán đều trong bể, một số con bơi trên mặt nước và hoạt động mạnh. Ở nghiệm thức có nồng độ 0,63 mg/L thì một số cá có sọc đậm; nghiệm thức nồng độ 0,42 mg/L và 0,08 mg/L cá vẫn hoạt động bình thường. 22 Ở thời điểm 24 giờ các bể ở nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) có biểu hiện ngấm thuốc và một số con hoạt động bất thường. Sau 30 giờ khi tiếp xúc với thuốc ở nồng độ cao nhất (0,84 mg/L) cá bắt đầu chết, trong khi đó cá ở bể đối chứng hoạt động bình thường. Những cá sắp chết có biểu hiện bơi lội mất thăng bằng, có lúc vây đuôi vẫy mạnh vọt thẳng lên phía trước, đôi lúc bơi lội mất định hướng, thân cá có lúc bị cong lại. Hai vây bơi hoạt động liên tục đẩy cá về phía trước và có lúc cá bơi giật lùi trở lại. Có trường hợp chỉ còn một bên vây hoạt động (vây ngực phải hoặc trái) làm cá bơi nghiêng, cá bơi chậm dần, lờ đờ, không giữ được thăng bằng dần dần chìm xuống đáy bể, không còn khả năng bơi lội, chỉ còn nắp mang và miệng cử động, vây bơi đôi lúc hoạt động do cơ bị tê giật và sau một lúc cá dừng hẳn. Thời gian từ lúc cá có các biểu hiện bơi lội khác thường đến lúc cá chết thường kéo dài từ 30–60 phút. Hình 4.1: Cá bị sẫm màu (A) và cá bình thường không bị sẫm màu (B) 4.2.2 Hoạt tính ChE ở não và cơ của cá bắt đầu chết Cá chết tập trung chủ yếu ở hai nồng độ cao nhất là 0,84 mg/L và 0,63 mg/L. Hai nghiệm thức có nồng độ 0,42 mg/L và 0,08 mg/L cá vẫn hoạt động đến thời điểm kết thúc thí nghiệm (sau 96 giờ). Hoạt tính men ChE ở cơ và não của cá sắp chết và số cá còn sống được thu ở 96 giờ (thời điểm kết thúc thí nghiệm) được trình bày ở Hình 4.2 và Hình 4.3. Kết quả cho thấy khoảng thời gian cá chết tập trung nhiều ở hai nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất trong khoảng thời gian từ 30–65 giờ khi tiếp súc với thuốc. Ở nghiệm thức 0,84 mg/L cá chết hoàn toàn ở thời điểm 91 giờ sau khi tiếp xúc với thuốc; ở nghiệm thức có nồng độ thuốc thấp hơn (0,63 mg/L) thì đa số cá chết trước 96 giờ tuy nhiên đến thời điểm kết thúc thí nghiệm số cá chưa chết là 3 con. A B 23 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (giờ) H o ạt tín h Ch E bị ứ c ch ế ở n ão so v ới đố i c hứ n g (% ) 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L 0,84 mg/L Hình 4.2: Phần trăm hoạt tính men ChE bị ức chế ở não cá Hoạt tính ChE của não ở nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) trong thời gian thí nghiệm bị ức chế khá cao so với đối chứng, dao động từ 82,2% đến 90,9%. Trong khi đó ở nồng độ 0,63 mg/L số cá chết trước 96 giờ có hoạt tính ChE bị ức chế dao động 80,7% đến 89,9%. Số cá còn lại của nghiệm thức 0,63 mg/L thì đến 96 giờ hoạt tính men bị ức chế là 87,1%. Hai nghiệm thức nồng độ thấp nhất đến thời điểm 96 giờ trung bình hoạt tính ChE ở nồng độ 0,08 mg/L và 0,42 mg/L bị ức chế lần lượt là 57,9% và 83%. Khả năng gây độc của thuốc thông qua việc ức chế hoạt tính men ChE tác động đến các hoạt động của cá dẫn đến cá chết. Theo nghiên cứu của Nguyễn Trọng Hồng Phúc (2009) thì cá chép (Cyprinus carpio) chết khi hoạt tính men ChE bị ức chế trên 82% khi tiếp xúc với hoạt chất fenobucarb (gốc carbamate), tương tự ở cá lóc (Channa striata) hoạt tính men ChE bị ức chế lên đến 88% sau 12 giờ tiếp xúc với thuốc (Cong et al., 2006). Nghiên cứu của Fulton and Key (2001) cũng cho rằng não cá bị ức chế lớn hơn 70% sẽ dẫn đến cá chết, tuy nhiên ở một số loài cá có khả năng chịu được mức độ ức chế lớn hơn 90%. Tương tự ở não, hoạt tính men ChE của cơ cá ở nồng độ thuốc cao nhất (0,84 mg/L) bị ức chế dao động từ 56,1% đến 86,7%; hoạt tính ChE ở cơ bị ức chế thấp hơn não. Ở nồng độ 0,63 mg/L hoạt tính men ChE bị ức chế ở cá bắt đầu chết dao động 57,8% đến 86,1% và ở thời điểm thu mẫu kết thúc thí nghiệm là 81,7%. Hai nghiệm thức có nồng độ thấp là 0,08 mg/L và 0,42 mg/L hoạt tính men ChE bị ức chế lần lượt là 48,6% và 67,5% ở thời điểm thu mẫu 96 giờ (Hình 4.3). Kết quả cho thấy rằng mức độ ức chế ChE gây chết ở cá phụ thuộc phần lớn bởi nồng độ và thời gian tiếp xúc của cá với thuốc, 24 nồng độ thuốc càng cao thời gian cá chết hoàn toàn trong nghiệm thức càng ngắn. Cũng trên loại thuốc gốc lân hữu cơ, khi nghiên cứu trên cá Dicentrarchus labrax Varo et al. (2003) cho rằng men ChE ở cơ bị ức chế lần lượt là 37% và 76% ở nồng độ 0,125 mg/L và 1 mg/L của hoạt chất dichlorvos ở thời điểm 96 giờ. Trong một nghiên cứu khác, hoạt tính men ChE trong cơ bị ức chế khá cao ở cá vàng (Carassius auratus) khi tiếp xúc với carbofuran, hoạt tính men bị ức chế dao động từ 86–92% sau 48 giờ tiếp xúc với thuốc (Bretaud et al., 2000). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (giờ) H o ạt tín h C hE bị ứ c ở cơ so v ới đố i c hứ n g (% ) 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L 0,84 mg/L Hình 4.3: Phần trăm hoạt tính ChE bị ức chế ở cơ cá 4.3 Mức độ nhạy cảm của men ChE và GST ở cá khi tiếp xúc với hoạt chất quinalphos 4.3.1 Biến động các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm Các yếu tố môi trường ở các nghiệm thức trong thời gian thí nghiệm biến động không lớn và tất cả đều nằm trong khoảng thích hợp cho cá. Nhiệt độ ở các nghiệm thức tương đối ổn định, nhiệt độ trung bình ở các nghiệm thức giao động từ 27,80C đến 27,90C trong buổi sáng và dao động từ 28,50C đến 28,60C vào buổi chiều, khoảng chênh lệch nhiệt độ giữa sáng và chiều cao nhất là 0,80C. Hàm lượng oxy hoà tan ở các nghiệm khác biệt nhỏ, dao động từ 4,45 mg/L đến 4,83 mg/L vào buổi sáng và từ 4,20 mg/L đến 4,97 mg/L trong buổi chiều, mức chênh lệch hai buổi cao nhất ở các bể là 0,63 mg/L, các bể được sục khí nhẹ liên tục đảm bảo đủ oxy cho cá. pH giữa các bể thí nghiệm nhìn chung không có sự khác biệt lớn, khoảng dao động trung bình 25 buổi sáng từ 7,39 đến 7,47 và buổi chiều từ 7,37 đến 7,40. Giá trị pH buổi sáng và buổi chiều chênh lệch cao nhất 0,1 (Bảng 4.2). Bảng 4.2: Các yếu tố môi trường trong thí nghiệm mức độ nhạy cảm của cá Nhiệt độ (0C) Oxy hòa tan (mg/L) pH Nghiệm thức Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều Đối chứng 27,9±0,4 28,6±0,2 4,47±0,10 4,52±0,54 7,47±0,09 7,37±0,12 0,08 mg/L 27,9±0,4 28,5±0,2 4,45±0,75 4,20±0,70 7,40±0,14 7,39±0,09 0,42 mg/L 27,8±0,4 28,5±0,7 4,83±0,45 4,97±0,62 7,39±0,07 7,39±0,07 0,63 mg/L 27,9±0,4 28,5±0,3 4,71±0,76 4,81±0,64 7,39±0,06 7,40±0,06 Giá trị trình bày trung bình±độ lệch chuẩn 4.3.2 Hoạt tính của men ChE trong não và gan cá Ở não: Khi cho cá tiếp xúc với thuốc trừ sâu hoạt chất quinalphos ở ba mức nồng độ thuốc khác nhau và một nghiệm thức đối chứng thì thấy ở các nghiệm thức có nồng độ thuốc hoạt tính men ChE đã giảm và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) sau 3 giờ tiếp xúc. Kết quả qua các lần thu mẫu ở các thời điểm tiếp theo thì hoạt tính ChE tiếp tục giảm, ở nghiệm thức nồng độ thuốc càng cao thì hoạt tính ChE bị ức chế càng thấp so với đối chứng (Bảng 4.3 và Hình 4.4). Bảng 4.3: Hoạt tính men ChE (nmol/min/mg protein) trong não cá Nồng độ thuốc Thời gian cá tiếp xúc thuốc Đối chứng 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L 3 giờ 38,5±11,1aA 23,5±3,78aB 13,6±3,49aC 8,23±2,41aC 6 giờ 37,3±8,56aA 15,6±3,94bB 9,93±3,07bC 6,54±1,94bC 9 giờ 38,2±5,97aA 13,4±3,44bcB 8,38±2,76bcC 5,96±1,63bC 12 giờ 38,8±5,32aA 12,0±3,08cB 8,31±2,51bcC 5,61±1,91bcC 24 giờ 40,5±10,5aA 11,8±2,29cB 6,96±2,35cBC 5,33±1,25bcC 48 giờ 40,4±5,89aA 10,5±2,82cB 6,97±1,91cC 4,94±1,50bcC 96 giờ 40,4±5,89aA 10,4±1,33cB 5,66±2,11cC 4,00±0,84cC Các giá trị trong cùng cột có cùng chữ cái a, b, c thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Các giá trị trong cùng hàng có cùng chữ cái A, B, C thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Giá trị trình bày±độ lệch chuẩn Vào thời điểm 3 giờ thì ở nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,08 mg/L thì men ChE giảm xuống còn 23,5 nmol/min/mg protein tương đương bị ức chế 38,9% (so với nghiệm thức đối chứng), riêng hai nghiệm thức có nồng độ là 0,42 mg/L và 0,63 mg/L men ChE giảm xuống còn 13,6 nmol/min/mg protein 26 và 8,23 nmol/min/mg protein tương đương bị ức chế lần lượt là 64,7% và 78,6% so với nghiệm thức đối chứng. Cũng ở thời điểm 3 giờ hoạt tính của men ChE của hai nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,42 mg/L và 0,63 mg/L bị ức chế cao và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức có nồng độ thuốc thấp (0,08 mg/L). Vào lần thu mẫu thời điểm 12 giờ thì hoạt tính của men ChE ở nghiệm thức có nồng độ 0,08 mg/L bị ức chế 69% so với đối chứng và không thay đổi qua các lần thu mẫu tiếp theo. Tương tự ở nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,42 mg/L thì hoạt tính men ChE bị ức chế 82,8% ở thời điểm 24 giờ và không thay đổi qua các giờ thu mẫu tiếp theo, chứng tỏ hoạt tính ChE ở hai nồng độ này chưa có dấu hiệu phục hồi ở thời điểm kết thúc thí nghiệm (96 giờ). Ở nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất (0,63 mg/L) hoạt tính men đạt giá trị thấp nhất (4 nmol/min/mg protein) ở thời điểm 96 giờ với hoạt tính men ChE bị ức chế là 90,1% (Bảng 4.3 và Hình 4.4). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 6 9 12 24 48 96 Thời gian (giờ) H o ạt tín h C hE bị ứ c ch ế ở n ão so v ới đố i c hứ n g (% ) 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L Hình 4.4: Phần trăm ChE bị ức chế ở não cá trong thí nghiệm mức độ nhạy cảm Ở gan: Bảng 4.4 cho thấy ở nghiệm thức đối chứng thì hoạt tính của men ChE ở gan cá thấp hơn nhiều so với ở não. Tương tự ở não, hoạt tính men ChE ở gan giảm theo sự gia tăng của nồng độ thuốc và qua các lần thu mẫu. Từ thời điểm lần thu mẫu đầu tiên (sau 3 giờ tiếp xúc với thuốc) thì hoạt tính men đã có sự thay đổi và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa nghiệm thức có nồng độ thuốc và nghiệm thức đối chứng, ở nghiệm thức đối chứng là 4,36 nmol/min/mg protein trong khi đó ba nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,08 mg/L; 0,42 mg/L và 0,63 mg/L hoạt tính men giảm xuống lần lượt là 2,37; 27 2,27 và 1,01 nmol/min/mg protein tương đương với mức độ ức chế là 45,6%; 47,9% và 76,8% (Bảng 4.4 và Hình 4.5). Bảng 4.4: Hoạt tính ChE (nmol/min/mg protein) trong gan cá Nồng độ thuốc Thời gian cá tiếp xúc thuốc Đối chứng 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L 3 giờ 4,36±0,85aA 2,37±0,43aB 2,27±0,24aB 1,01±0,16aB 6 giờ 3,91±0,91aA 2,26±0,59aB 1,19±0,28abC 0,97±0,12aC 9 giờ 4,53±0,74aA 1,86±0,44aB 1,11±0,28abC 0,88±0,13abC 12 giờ 4,23±0,98aA 1,91±0,58aB 0,97±0,15bC 0,76±0,12bcC 24 giờ 4,40±0,91aA 1,20±0,35bB 0,90±0,20bBC 0,66±0,11cdC 48 giờ 4,41±0,68aA 1,04±0,23bB 0,89±0,09bBC 0,54±0,15deC 96 giờ 4,79±1,00aA 1,03±0,16bB 0,76±0,18bBC 0,44±0,10eC Các giá trị trong cùng cột có cùng chữ cái a, b, c, d, e thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Các giá trị trong cùng hàng có cùng chữ cái A, B, C khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Giá trị trình bày±độ lệch chuẩn Hoạt tính men ChE ở nồng độ 0,08mg/L khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p<0,05) qua 4 lần thu mẫu (3, 6, 9 và 12 giờ) nhưng vào thời điểm 24 giờ thì hoạt tính ChE đã giảm đáng kể và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với 4 lần thu mẫu ban đầu, mức độ men bị ức chế ở thời điểm thu mẫu 24 giờ là 72,7% và không thay đổi ở những lần thu mẫu tiếp theo. Ở thời điểm thu mẫu 12 giờ hoạt tính men ở hai nồng độ 0,42 mg/L và 0,63 mg/L bị ức chế lần lượt là 77,1% và 82%, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các lần thu mẫu trước đó (p<0,05); và ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo thì hoạt tính men ChE ở nồng độ 0,42 mg/L thay đổi không khác biệt ý nghĩa thống kê so với thời điểm 12 giờ. Tuy nhiên, ở nghiệm thức có nồng độ 0,63 mg/L hoạt tính men ChE giảm rõ rệt và giá trị ở thời điểm thu mẫu cuối cùng là 0,44 nmol/phút/mg protein tức bị ức chế đến 90,8% so với đối chứng (Bảng 4.4 và Hình 4.5). 28 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 6 9 12 24 48 96 Thời gian (giờ) H o ạt tín h C hE bị ứ c ch ế ở ga n so v ới đố i c hứ n g (% ) 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L Hình 4.5: Phần trăm ChE bị ức chế ở gan cá trong thí nghiệm mức độ nhạy cảm Mức độ nhạy cảm của cá rô phi khi tiếp xúc với hoạt chất quinalphos thể hiện thông qua việc giảm rõ rệt hoạt tính men ChE ở não và gan cá; trong thời gian 96 giờ thí nghiệm thì hoạt tính men càng giảm theo sự gia tăng của nồng độ thuốc. Kết quả cũng được thể hiện qua nhiều nghiên cứu khác như theo Chandrasekera et al. (2005) thì khi cho cá rô phi tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hoạt chất chlorpyrifos, sau 24 giờ tiếp xúc hoạt tính men ChE ở não và gan bị ức chế lần lượt là 52% và 74%, tương tự ở hoạt chất carbosulfan (gốc carbamate) bị ức chế 20% và 38% lần lượt ở não và gan, trong cùng nghiệm thức đối chứng về hoạt tính men ChE ở não là 18,1 nmol/phút/mg protein trong khi đó ở gan là 3,87 nmol/min/mg protein, qua đây cho thấy rằng hoạt tính của men ChE ở não thường cao hơn đáng kể so với ở gan. Ở cá Carassius auratus hoạt tính men ở não giảm đáng kể sau 48 giờ tiếp xúc với thuốc trừ sâu hoạt chất carbosulfan, ở nồng độ 50 µg/L ức chế 19–28% và 500 µg/L ức chế 85–87% (Bretaud et al., 2000). 4.3.3 Hoạt tính của men GST trong gan và não của cá Ở gan: Hoạt tính của men GST ở nghiệm thức nồng độ 0,08 mg/L khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) qua các thời điểm thu mẫu và với đối chứng. Như vậy, ở nồng độ thuốc thấp thì men GST chưa có sự thay đổi nhiều qua thời gian tiếp xúc với thuốc. Thời điểm thu mẫu 9 giờ ở nghiệm thức nồng độ 0,42 mg/L thì hoạt tính men GST tăng rõ rệt (557,6 nmol CDNB/min/mg protein) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (463 nmol CDNB/min/mg protein) (p>0,05) và trong những lần thu mẫu tiếp theo thì 29 men GST thay đổi không lớn. Trong khi đó, ở nồng độ thuốc 0,63 mg/L thì hoạt tính men GST bắt đầu gia tăng và khác biệt có ý nghĩa ở thời điểm 24 giờ (583 nmol CDNB/min/mg protein) và đạt mức cao nhất ở thời điểm 48 giờ (609 nmol CDNB/min/mg protein) so với đối chứng (462 nmol CDNB/min/mg protein) và đến thời điểm thu mẫu cuối cùng (96 giờ) hoạt tính men GST sai khác không có ý nghĩa so với thời điểm 48 giờ (Hình 4.6). 0 100 200 300 400 500 600 700 800 3 giờ 6 giờ 9 giờ 12 giờ 24 giờ 48 giờ 96 giờ Thời gian H o ạt tin h G ST (n m o l C D N B/ m in /m g pr o te in ) Đối chứng 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L Hình 4.6: Hoạt tính GST (nmol CDNB/min/mg protein) ở gan cá Ở não: Kết quả phân tích GST ở não cho thấy rằng men GST ở não thấp hơn rất nhiều so với men GST ở gan. Hai nghiệm thức có nồng độ thuốc thấp là 0,08 mg/L và 0,42 mg/L thì hoạt tính men GST khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) qua các thời điểm thu mẫu và dao động từ 49,3 nmol CDNB/min/mg protein đến 55,5 nmol CDNB/min/mg protein ở nghiệm thức 0,08 mg/L và từ 54,8 nmol CDNB/min/mg protein đến 61,1 nmol CDNB/min/mg protein ở nghiệm thức 0,42 mg/L. Ở nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất là 0,63 mg/L thì hoạt tính men GST không biến động từ lần thu mẫu 3 giờ đến 24 giờ; nhưng đến thời điểm 48 giờ hoạt tính GST gia tăng 61,8 nmol CDNB/min/mg protein và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với thời điểm 3 giờ là 47,1 nmol CDNB/min/mg protein và tương tự đến thời điểm 96 giờ hoạt tính men GST tăng lên và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm 9 giờ (p<0,05). Hoạt tính men ở hai nghiệm thức có nồng độ thuốc thấp sai khác không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (ngoại trừ ở thời điểm thu mẫu 9 giờ), tuy nhiên bắt đầu từ thời điểm 9 giờ đến 96 giờ nghiệm thức có nồng độ 0,63 mg/L có hoạt tính men GST gia tăng lên và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (Hình 4.7). Nhìn chung, hoạt tính enzyme GST ở não có sự gia tăng đáng kể ở nghiệm thức 0,63 mg/L và hầu như không khác biệt ở hai nghiệm thức có nồng độ thấp (Hình 4.7). 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 giờ 6 giờ 9 giờ 12 giờ 24 giờ 48 giờ 96 giờ Thời gian H o ạt tín h G ST (n m o l C D N B/ m in /m g pr o te in ) Đối chứng 0,08 mg/L 0,42 mg/L 0,63 mg/L Hình 4.7: Hoạt tính GST (nmol CDNB/min/mg protein) ở não cá Qua nghiên cứu cho thấy, hoạt tính men GST gia tăng ở gan và não khi cho cá tiếp xúc với hoạt chất quinalphos và men này ở gan cao hơn rất nhiều so với ở não cá. Glutathione-S-transferases là men bảo vệ cơ quan từ các chất độc ở môi trường bên ngoài xâm nhập vào (Henson et al., 2001), men giúp chuyển hóa các chất độc hại và đào thải chúng ra khỏi cơ thể (Tremblay and Van Der Kraak, 1999 trích bởi Piyanut, 2005). Theo nghiên cứu của Farombi et al. (2008) thì hoạt tính của men GST gia tăng có ý nghĩa thống kê trong gan nhưng lại giảm trong thận và mang khi cá Clarias gariepinus tiếp xúc với ba nồng độ của butachlor (thuốc diệt cỏ) dưới ngưỡng gây chết trong thời gian 24 giờ (p<0,05). Ở cá rô phi (Oreochromis niloticus) khi cho tiếp xúc với hoạt chất alachlor ở mức nồng độ 382 µg/L thì men GST điều tăng lên ở não và gan sau thời gian 96 giờ, tuy nhiên ở cơ men GST lại giảm đáng kể (Piyanut, 2005). Ngoài ra, khi cho cá tra tiếp xúc với malachite green thì men GST gia tăng ở não nhưng ở mang lại có chiều hướng giảm (Lương Thị Diễm Trang, 2009), tương tự khi cho cá tra ăn kháng sinh florfenicol liên tục trong 7 ngày cũng làm cho hoạt tính men GST ở não, mang, gan và cơ của cá tăng lên đáng kể (Lê Kim Ngọc, 2009). 4.4 Ảnh hưởng của thuốc lên tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá 4.4.1 Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm 4.4.1.1 Nhiệt độ, Oxy hoà tan và pH Trong thời gian thí nghiệm thì nhiệt độ trung bình của các nghiệm thức dao động từ 26,70C đến 26,90C, như vậy nhiệt độ trung bình dao động không lớn và không khác biệt nhỏ giữa các nghiệm thức hay nói khác đi là nhiệt độ 31 gần như đồng nhất giữa các bể (Bảng 4.5). Tương tự, hàm lượng oxy hoà tan trung bình giữa các nghiệm thức trong thời gian thí nghiệm gần như không khác biệt, hàm lượng oxy hoà tan giao động trong các nghiệm thức từ 4,40 mg/L đến 4,45 mg/L, giá trị này điều nằm trong khoảng thích hợp cho sự sinh trưởng của cá (Bảng 4.5). pH ở các nghiệm thức dao động rất thấp trong thời gian thí nghiệm, dao động từ 7,64 đến 7,66. Nhìn chung, yếu tố nhiệt độ, oxy và pH điều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển bình thường ở cá, đảm bảo điều kiện cho cá phát triển tốt. Bảng 4.5: Yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm Nghiệm thức Nhiệt độ (0C) Oxy hòa tan (mg/L) pH Đối chứng 26,7±0,50 4,42±0,33 7,66±0,16 0,08 mg/L 26,8±0,50 4,40±0,31 7,64±0,15 0,17 mg/L 26,8±0,44 4,44±0,30 7,66±0,16 0,34 mg/L 26,8±0,50 4,45±0,33 7,65±0,14 0,50 mg/L 26,9±0,50 4,45±0,34 7,66±0,14 Giá trị trình bày±độ lệch chuẩn 4.4.1.2 Các yếu tố NO2-, NO3- và NH3 Bảng 4.6 cho thấy hàm lượng NO3- và NH3 trong các nghiệm thức qua thời gian thí nghiệm tương đối thấp và dao động không lớn giữa các nồng độ, các giá trị này điều nằm trong khoảng thích hợp cho sự phát triển của cá. Hàm lượng NO2- ở các nghiệm thức tương đối cao, dao động từ 1,30 mg/L đến 1,56 mg/L (Bảng 4.6). Theo nghiên cứu của Atwood et al. (2001) thì giá trị LC50- 96 giờ của nitrite với cá rô phi (Oreochromis niloticus) có khối lượng trung bình 4,4 g là 81 mg/L và ở cá rô phi có khối lượng 90,7 g là 8 mg/L. Điều này cho thấy ở cá có khối lượng nhỏ thì mức độ bị ảnh hưởng nởi nitrite thấp hơn cá có khối lượng lớn. Bảng 4.6: NO2-, NO3- và NH3 trong thời gian thí nghiệm Nghiệm thức NO2- (mg/L) NO3- (mg/L) NH3 (mg/L) Đối chứng 1,54±0,99 1,22±0,31 0,018±0,007 0,08 mg/L 1,56±0,99 1,36±0,40 0,018±0,007 0,17 mg/L 1,48±0,98 1,32±0,39 0,019±0,008 0,34 mg/L 1,30±0,74 1,39±0,30 0,018±0,008 0,50 mg/L 1,45±0,77 1,39±0,39 0,019±0,008 Giá trị trình bày±độ lệch chuẩn 32 4.4.2 Tỷ lệ sống của cá trong thời gian thí nghiệm Sau 54 ngày nuôi thì ở tất cả các nghiệm thức điều có cá chết nên tỷ lệ sống dao động từ 88% đến 96%. Tỷ lệ sống của cá ở nghiệm thức nồng độ thuốc cao nhất 0,50 mg/L là 88% thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng, tỷ lệ sống cá ở các nghiệm thức 0,08 mg/L; 0,17 mg/L và 0,34 mg/L có giảm nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng. Nhìn chung, tỷ lệ sống của cá giảm khi nồng độ thuốc thí nghiệm càng tăng (Hình 4.8). Hình 4.8: Tỷ lệ sống của cá qua thời gian thí nghiệm Trong lần cho thuốc vào bể đầu tiên cá chết nhiều ở thời điểm 1 đến 3 ngày sau khi tiếp xúc với thuốc ở hai nghiệm thức có nồng độ cao; từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 21 không có cá chết ở các nghiệm thức do nước được thay 30% sau 3 ngày dùng thuốc nên nồng độ thuốc ở các nghiệm thức đã giảm. Như vậy, thuốc ảnh hưởng đến cá trong thời gian đầu tiếp xúc. Khi cho thuốc lần 2 vào thời điểm ba ngày đầu tiếp xúc với thuốc vẫn còn cá chết nhưng số lượng ít hơn so với lần thứ nhất, ở nghiệm thức đối chứng không có cá chết. Như vậy, ảnh hưởng của thuốc trừ sâu trên cá khác nhau theo kích cỡ, cá càng lớn ngưỡng chịu đựng càng tăng (Pathiratne, 1999; Murty et al., 1982). Ở cá rô phi có thể vào thời điểm cho thuốc vào lần 2 kích cỡ cá lớn hơn nhiều so với lúc cho thuốc lần 1 nên khả năng bị ảnh hưởng của thuốc thấp hơn. Thời điểm cá chết nhiều tập trung vào giai đoạn từ ngày 25 đến ngày 42, thời điểm này ở các nghiệm thức điều có cá chết. Kết quả kiểm tra khối lượng cá chết cho thấy tất cả điều có khối lượng thấp, ở giai đoạn này khối lượng trung bình cá chết là 14,0 g thấp hơn khối lượng trung bình của thời điểm thu mẫu ngày thứ 21 (17,1 g) (Bảng 4.7). Cá chết tập trung phần lớn ở những con có kích thước nhỏ có thể do cá bị ảnh hưởng bởi thuốc làm khả 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 Đối chứng 0,08 mg/L 0,17 mg/L 0,34 mg/L 0,50 mg/L Nghiệm thức T ỷ lệ số n g (% ) 96,0 94,7 96,0 92,0 88,0 a ab b a ab 33 năng bắt mồi giảm, sức khỏe kém, kết quả này tương tự nghiên cứu của Nguyễn Trọng Hồng Phúc (2009) khi thực hiện trên cá chép (Cyprius carpio). Bảng 4.7: Số cá chết qua từng thời điểm Số cá chết (con) ở các nghiệm thức Lần cho thuốc Thời điểm cá tiếp xúc thuốc ĐC 0,08 mg/L 0,17 mg/L 0,34 mg/L 0,5 mg/L 1 1 – 3 ngày 0 0 0 3 4 4 – 21 ngày 0 0 0 0 0 2 22 – 24 ngày 0 1 0 0 2 25 – 42 ngày 3 3 3 3 2 43 – 54 ngày 0 0 0 0 1 Tổng số cá chết 3 4 3 6 9 Tổng số cá thí nghiệm 75 75 75 75 75 4.4.3 Ảnh hưởng của thuốc lên tăng trưởng của cá Khối lượng trung bình của cá bắt đầu thí nghiệm khác biệt không ý nghĩa ở các nghiệm thức nhưng sau 54 ngày nuôi thì tăng trưởng tuyết đối (DWG) và khối lượng trung bình của cá ở nghiệm thức có nồng độ 0,5 mg/L là thấp nhất (0,37 g/ngày và 30,4 g/con), khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các nghiệm thức còn lại. Khối lượng trung bình cá ở nghiệm thức đối chứng là cao nhất (34,2 g/con) và DWG cao nhất ở nghiệm thức đối chứng và 0,08 mg/L khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với các nghiệm thức 0,17; 0,34 và 0,50 mg/L. Hai nghiệm thức có nồng độ thuốc là 0,17 mg/L và 0,34 mg/L sau thời gian thí nghiệm có khối lượng và tăng trưởng trung bình khác biệt không ý nghĩa (p>0,05) (Bảng 4.8). Nồng độ thuốc cao tốc độ tăng trưởng của cá giảm lại, điều này cũng được thể hiện qua nghiên cứu của Guimaraes và Calil (2008) khi thực hiện nuôi tăng trưởng cá rô phi với hoạt chất trichlorfon, kết quả khối lượng cá ở nghiệm thức có thuốc giảm so với đối chứng. Ngoài ra, khi cho cá rô phi (Oreochromis niloticus) khi tiếp xúc với hoạt chất gammalin và actellic ở cùng các nồng độ thuốc 0,125; 0,25; 0,50 và 1,0 µg/L thì sau 10 tuần tốc độ tăng trưởng của cá lần lượt là 5,8; 2,4; 1,4 và l,3 g thí nghiệm với gammalin trong khi đó thí nghiệm với actellic thì 6,5; 3,9; 2,4 và 1,8 g (Ufodike et al., 1991). Ngoài ra đối với cá mè vinh, cá chép và cá rô phi khi cho tiếp xúc với thuốc Basudin, sinh trưởng tương đối của cá trong 10 ngày đầu giảm ở nồng độ LC50–96 giờ (Đỗ Thị Thanh Hương, 1999). 34 Bảng 4.8: Khối lượng và tốc độ tăng trưởng tuyệt đối của cá Nghiệm thức Wđ (g) Wc (g) DWG (g/ngày) Đối chứng 10,3±0,02a 34,1±0,81a 0,44±0,02a 0,08 mg/L 10,3±0,14a 33,1±0,47b 0,42±0,01ab 0,17 mg/L 10,4±0,08a 32,5±0,43b 0,41±0,01b 0,34 mg/L 10,3±0,05a 32,6±0,44b 0,41±0,01b 0,50 mg/L 10,3±0,08a 30,4±0,46c 0,37±0,01c Các giá trị trong cùng cột có cùng chữ cái a, b, c, thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Giá trị trình bày±độ lệch chuẩn Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy FCR của cá tăng dần theo sự gia tăng của nồng độ thuốc, ở nồng độ thuốc cao nhất (0,50 mg/L) thì FCR của cá đạt 2,14 khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và các nghiệm thức có nồng độ thuốc nhỏ hơn (p<0,05). Cá nuôi ở hai nồng độ là 0,17 mg/L và 0,34 mg/L có FCR cao hơn đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê, trong khi đó hai nghiệm thức này và nghiệm thức 0,08 mg/L khác biệt không ý nghĩa thống kê (p>0,05). Nghiệm thức đối chứng có FCR thấp nhất, tuy nhiên khác biệt không ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 0,08 mg/L (Hình 4.9). Hình 4.9: Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Kết quả cho thấy khi cho cá tiếp xúc với hoạt chất quinalphos ở mức nồng độ dưới ngưỡng gây chết 20–60% của LC50-96 giờ thì tăng trưởng của cá chậm so với đối chứng và tiêu tốn một lượng thức ăn khá lớn. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của Yaji và Auta (2007) khi cho cá Clarias gariepinus tiếp xúc với hoạt chất monocrotophos thuộc gốc lân hữu cơ ở nồng độ dưới ngưỡng gây chết 2,51; 5,02 và 10,04 mg/L thì khối lượng cá ở ba 2,141,791,641,581,41 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 Đối chứng 0,08 mg/L 0,17 mg/L 0,34 mg/L 0,50 mg/L Nghiệm thức FC R a ab c b b 35 nồng độ này giảm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng và FCR tăng khác biệt có ý nghĩa ở hai nghiệm thức có nồng độ thuốc cao nhất so với đối chứng. 36 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Kinalux 25EC (chứa hoạt chất quinalphos) là thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ rất độc đối với cá rô phi, giá trị LC50–96 giờ của cá có kích cỡ 10–12 g/con là 0,84 mg/L. - Hoạt tính men ChE ở cá sắp chết bị ức chế trên 80% ở não và trên 56% ở cơ. - Hoạt tính men ChE trong não cao hơn trong gan và ức chế cao nhất ở thời điểm 96 giờ lần lượt là 90,1% và 90,8% khi cá tiếp xúc với thuốc, hoạt tính men ChE giảm theo sự gia tăng của nồng độ thuốc. Hoạt tính men GST ở gan và não cá tăng cao nhất ở nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,63 mg/L, nồng độ thuốc càng cao hoạt tính men GST càng tăng. - Tỷ lệ sống của cá giảm dần theo sự gia tăng của nồng độ thuốc, ở nồng độ 0,50 mg/L tỷ lệ sống của cá chỉ đạt 88%. - Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối (DWG) của cá đạt giá trị thấp nhất là 0,37 g/ngày ở nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,50 mg/L. 5.2 Đề xuất - Kinalux 25EC (hoạt chất quinalphos) đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp, vì vậy cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc lên nhiều loại đối tượng thuỷ sản khác đặc biệt những loài nuôi kết hợp trong ruộng lúa nhằm làm cơ sở khuyến cáo sử dụng thuốc chung cho các đối tượng này. - Nồng độ thuốc trong nước nên từ 0,08 mg/L trở xuống sẽ không ảnh hưởng đến tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá. - Tiếp tục nghiên cứu trong điều kiện đồng ruộng về ảnh hưởng của thuốc lên sự phát triển của cá nhằm đưa ra khuyến cáo hợp lý cho người sử dụng. - Tiến hành nghiên cứu về hoạt tính của hormon tăng trưởng trong cá để có cơ sở đánh giá tốt hơn về sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến tăng trưởng của cá. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Addison R.F., 1992. Biochemical measurements: summary. Marine Ecology Progress Series, Vol. 91: p 61-63. Almli B., E. Egaas, A. Christiansen, O. M. Eklo, O. Lode and T. Källqvist, 2002. Effects of three fungicides alone and in combination on glutathione S-transferase activity (GST) and cytochrome P-450 (CYP 1A1) in the liver and gill of brown trout (Salmo trutta). Marine Environmental ResearchVolume 54, Issues 3-5, p 237-240. Atwood H. L., Q. C. Fontenot, J. R. Tomasso, J. J. Isely, 2001. Toxicity of Nitrite to Nile Tilapia: Effect of Fish Size and Environmental Chloride. North American Journal of Aquaculture, p 63: 49-51. Auta J., JK Balogun, FA Lawal, JK Ipinjolu, 2004. Acute toxicity of the insecticide, Dimethoate on juveniles of Oreochromis niloticus (Trewavas) and Clarias gariepinus (Teugels). Journal of Aquatic Sciences Vol.19 (1) p 5–8. Berg H., 2001. Pesticide use in rice and rice-fish farms in the Mekong Delta, Vietnam. Crop Protection 20: p 897-905. Biotech K. K.,1991. Summaru of toxicological studies on quinalphos. Juornal of Pesticides Science 16, p 337 – 342. Boone J. Scott and Janice E. Chambers, 1996. Time course of inhibition of cholinesterase and aliesterase activities, and nonprotein sulfhydryl levels following exposure to organophosphorus insecticides in mosquitofish (Gambusia affinisy). Fundamental and applied toxicology 29, p 202-207 Bretaud S., J. P. Toutant and P. Saglio, 2000. Effects of Carbofuran, Diuron, and Nicosulfuron on Acetylcholinesterase Activity in Goldfish (Carassius auratus). Ecotoxicology and Environmental Safety. Volume 47, Issue 2, p 117-124. Cağlan Karasu Benli A., Mahmut Selvi, Rabia Sarikaya, Figen Erkoc, Oner Kocak, 2009. Acute toxicity of deltamethrin on nile tilapia (Oreochromis niloticus) larvae and fry. G.U. Journal of science 22(1): p1-4. Chandrasekera L. K. H. U. Chandrasekera, A. Pathiratne, 2005. Response of Brain and Liver Cholinesterases of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus, to Single and Multiple Exposures of Chlorpyrifos and Carbosulfan. Bull. Environ. Contam. Toxicol. (2005) 75, p 1228–1233. Chebbi S.G. and David M., (2009). Neurobehavioral responses of the freshwater teleost, Cyprinus carpio (Linnaeus.) under quinalphos intoxication. Biotechnology in Animal Husbandry 25 (3-4), p 241-249. Cong Nguyen Van, Nguyen Thanh Phuong, Mark Bayley, 2006. Sensitivity of brain cholinesterase activity to diazinon (Basudin 50EC) and fenobucarb (Bassa 50EC) insecticides in the air-breathing fish channa striata (Block, 1793). Environmenttal Toxicology and Chemistry, 25 (5), p 1418-1425. 38 Đặng Kim Chi, 2005. Hoá Học Môi Trường, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 589 trang. Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Anh Tuấn. Ảnh hưởng của một số nông dược lên tôm và cá. Tuyển tập công trình khoa học công nghệ, Đại học Cần Thơ, 1993 – 1997, trang 245 – 251. Đỗ Thị Thanh Hương, 1999. Ảnh hưởng của Basudin 40EC lên sự thay đổi chỉ tiêu sinh lý và huyết học của cá chép, cá rô phi, cá mè vinh. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ thủy sản. Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. Đoàn Khắc Độ, 2008. Kỹ thuật nuôi cá rô phi. NXB Đà Nẵng. 70 trang. El-Sherif, M.S., M.T. Ahmed, M.A. El-Danasoury and N.H.K. El-Nwishy, 2009. Evaluation of diazinon toxicity on Nile Tilapia fish (O. niloticus). J. Fish. Aquatic Sci., 4: p 169-177. Farombi E. O., Y. R. Ajimoko and O. A. Adelowo, 2008. Effect of Butachlor on Antioxidant Enzyme Status and Lipid Peroxidation in Fresh Water African Catfish, (Clarias gariepinus). Environmental Research and Public Health. ISSN 1661-7827, p 423-427. Fulton Michael H., Peter B. Key, 2001. Acetylcholinesterase inhibition in estuarine fish and invertebrates as an indicator of organophosphorus insecticide exposure and effects. Environmental Toxicology and Chemistry, Volume 20, Issue 1, p 37–45. Guimarães Ana Tereza Bittencourt and Patrícia Calil, 2008. Growth Evaluation of Oreochromis niloticus (Cichlidae, Neopterygii). Exposed to Trichlorfon. Vol.51, p 323-332. Harrison Charo Karisa, 2006. Seclection for growth of Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) in low input environments. Wageningen University. 167 p. Henson K.L., Stauffer G., and Gallagher E.P., 2001. Induction of glutathione- Stransferase activity and protein expression in Brown Bullhead (Ameiurus nebulosus) liver by ethoxyquin. Toxicol. Science 62, p 54-60. Hmoud Fares Alkahem, 1996. Effect of Lethal and Sublethal Concentrations of Lindane on the Bchaviour and Energy Reserves of th Freshwater Fish, Oreochromis niloticus. J. King Saud Univ, Vol. 8, Science (2), p 153– 164. Hoàng Văn Bính, 2002. Độc chất học nông nghiệp và dự phòng nhiễm độc. Tái bản lần 2. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 593 trang. Cập nhật ngày 25/7/2009. Oreochromis&speciesname=niloticus+niloticus&lang=Vietnamese. Cập nhật ngày 31/10/2010. 39 u12. Một số đặc điểm sinh học cá rô phi. Cập nhật: 25/7/2009. Josephine O. Boateng, F. K. E. Nunoo, H. R. Dankwa and M. H. Ocran, 2006. Acute Toxic Effects of Deltamethrin on Tilapia, Oreochromis niloticus. West Africa Journal of Applied Ecology. Volume 9, p 1–5. Kathya A. Modesto, C.B.R. Martinez, 2010. Roundup causes oxidative stress in liver and inhibits acetylcholinesterasein muscle and brain of the fish Prochilodus lineatus. Chemosphere 78, p 294–299. Lê Huy Bá, 2007. Độc chất môi trường. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 988 trang. Lê Kim Ngọc, 2009. Ảnh hưởng của florfenicol lên sinh hoá, và tồn lưư trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong bể. Luận văn cao học ngành Nuôi trồng thuỷ sản. Trường Đại học Cần Thơ. 71 trang. Lương Thị Diễm Trang, 2009. Ảnh hưởng của malachite green lên sinh lý, sinh hoá và tồn lưu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn cao học ngành Nuôi trồng thuỷ sản. Trường Đại học Cần Thơ. 59 trang. Maduenho L. P., Claudia B.R. Martinez, 2008. Acute effects of diflubenzuron on the freshwater fish Prochilodus lineatus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 148: p 265–272. Medri V., Pereira G. V. and Leonhardt J. H., 2000. Growth of Nile tilapia Oreochromis niloticus fed with different levels of alcohol yeast. Revista Brasileira de Biologia, 17 p. Murty A. S., A. V. Ramani, K. Christopher and B. R. Rajabhushanam, 1984. Toxicity of Methyl Parathion and Fensulfothion to the Fish Mystus cavasius. Environmental Pollution (Series A) 34, p 37 – 46. Murty A. S., A. V. Ramani, K. Christopher and B. R. Rajabhushanam, 1982. Toxicity of Fenitrothion to the Fish Mystus cavasius and Labeo rotiha. Environmental Pollution (Series A) 30, p 225 – 232. Ngô Thanh Toàn, 2008. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu chứa hoạt chất diazinon lên hoạt tính enzyme cholinesterase và sinh trưởng của tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). Luận văn tốt nghiệp thạc sỹ nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Ngọc Hiền, 2008. Ảnh hưởng của mật độ và enrofloxacine lên một số chỉ tiêu sinh lý của cá tra (Pangasius hypophthalmus) trong điều kiện thí nghiệm. Luận văn thạc sỹ nuôi trồng thủy sản, Trường ĐH Cần Thơ, 56 trang. Nguyễn Trọng Hồng Phúc, 2009. Ảnh hưởng của Fenobucarb lên các chỉ tiêu huyết học, hoạt tính cholinesterase và tăng trưởng của cá Chép (Cyprius carpio). Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. 96 trang. 40 Nguyễn Văn Công, Dương Thị Kiều Ngân, và Nguyễn Thanh Phương, 2008b. Nhạy cảm của cá lóc (Channa striata) mới nở với thuốc trừ sâu chứa hoạt chất diazinon. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Trường ĐH Cần Thơ 2008(1), trang 154-162. Nguyễn Văn Công, Nguyễn Tuấn Vũ và Trần Sỹ Nam, 2008a. Nhạy cảm của cholinesterase ở cá rô đồng (Anabas Testudineus) giống với diazinon và fenobucarb. Tạp chí khoa học ĐHSP TP. HCM, số 14, trang 69–79. Nguyễn Văn Công, Nguyễn Xuân Lộc, Lư Thị Hồng Ly và Nguyễn Thanh Phương, 2006. Ảnh hưởng của basudin 50EC lên hoạt tính enzyme cholinesterase và tăng trọng của cá lóc (Channa striata), Tạp chí Nghiên cứu Khoa học 2006, ĐH Cần Thơ, trang 13-23. Palacio JA, Henao B, Vélez JH, González J, Parra CM., 2002. Acute toxicity and bioaccumulation of pesticide Diazinon in red tilapia (Oreochromis niloticus x Mossambicus albina). Environ Toxicol;17(4): p 334-340. Pathiratne A.,1999. Toxicity of Fenthion in Lebaycid to Tilapia, Oreochromis mossambicus (Peters): Effect on survival, growth and brain Acetylcholinesterase activity, Foundation Sri Lanka 27(2): p 79 – 91. Pathiratne Asoka and Stephen G. George, 1998. Toxicity of malathion to nile tilapia, Oreochromis niloticus and modulation by other environmental contaminants. Aquatic Toxicology. Volume 43, Issue 4, p 261-271. Phạm Anh Tuấn, 2006. Phát triển cá rô phi ở VN 68, 30/07/2009. Phạm Anh Tuấn, Lê Quang Hưng, Nguyễn Thị Tần, 2008. Đánh giá lựa chon vật liệu chọn giống và nâng cao tốc độ tăng trưởng cá rô phi nuôi vùng nước lợ mặn. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2008, ĐH Nông Lâm TP HCM Tập VI, Số 2: trang 161-165. Pham Văn Khánh và Lý Thị Thanh Loan, 2004. Kỹ thuật nuôi một số loài cá kinh tế nước ngọt và phòng trị bệnh cá. NXB Nông Nghiệp TP. HCM, 103 trang. Piyanut Peebua, 2005. Ecotoxicological assessment of pesticides and heavy metals in nile tilapia (oreochromis niloticus). Fac. of Grad. Studies, Mahidol Univ. 235 p Ralph A. Magnotti Jr, John P. Zaino and Rob S. McConnell, 1994. Pesticide- sensitive fish muscle cholinesterases. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 108C, No. 2. p 187-19. Rao J. Venkateswara, 2006. Sublethal effects of an organophosphorus insecticide (RPR-II) on biochemical parameters of tilapia, Oreochromis mossambicus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 143: p 492–498. 41 Sastry K. V. and Abad A. Siddiqui, 1982. Effect of endosulfan and quinalphos on intestinal absorption of glucose in the freshwater murrel, Channa punctatus Toxicology Letters Volume 12, Issue 4, p 289-293. Silvia F. Pesce, Jimena Cazenave, Magdalena V. Monferrán, Silvia Frede and Daniel A. Wunderlin, 2008. Integrated survey on toxic effects of lindane on neotropical fish: Corydoras paleatus and Jenynsia multidentata. Environmental Pollution, Volume 156, Issue 3, p 775-783. Trần Lê Cẩm Tú, Nguyễn Hữu Bon, Trần Thị Thanh Hiền, 2008. Đánh giá khả năng sử dụng khoai ngọt (Dioscorea Alata) làm thức ăn cho cá rô phi (Oreochromis niloticus). Tạp chí khoa học – Trường Đại học Cần Thơ, quyển 1, trang 141 – 146. Ufodike E. B. C. and E. Omoregie, 1991. Communications: Growth of Nile Tilapia Oreochromis niloticus niloticus Subjected to Sublethal Concentrations of Gammalin 20 and Actellic 25 EC in a Continuous- Flow Toxicant Autodelivery System. Journal of Aquatic Animal Health, p 221-223. Varo I., J. C. Navarro, F. Amat and L. Guilhermino, 2003. Effect of dichlorvos on cholinesterase activity of the European sea bass (Dicentrarchus labrax). Pesticide Biochemistry and Physiology, Volume 75, Issue 3, p 61-72. Yaji A. J. and J. Auta, 2007. Sub-lethal Effect of monocrotophos on Growth and food Utilization of the African Catfish Clarias gariepinus (Teugels). Journal of Fisheries International 2 (2): p 127 – 127. Yonas Fessehaye, 2006. Natural mating in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Wageningen University, With summary in English and Dutch, 148 p.