Bài giảng phân tích công cụ

2. Các ảnh hưởng về phổ như sự trùng vạch, sự chen lấn của các vạch phổ gần nhau, sự hấp thụ nền,... Với những máy có độ tán sắc nhỏ thì các hiện tượng này dễ xuất hiện nhưng với những máy có độ tán sắc cao thì ảnh hưởng này dễ dàng được loại trừ. Còn ảnh hưởng về hấp thụ nền, bằng các phương pháp bổ chính phù hợp thì các máy đo AAS hiện nay đều có thể loại trừ được. 3. Các yếu tố vật lý như độ nhớt của dung dịch mẫu, hiện tượng ion hóa, sự phát xạ,... Bằng cách chọn các chất phụ gia phù hợp chúng ta có thể loại trừ được các hiện tượng ion hóa, sự phát xạ. 4. Các ảnh hưởng về hóa học. Yếu tố này rất đa dạng và phức tạp. Có trường hợp xuất hiện, có trường hợp lại không là tùy thuộc vào thành phần của mẫu phân tích và nguyên tố phân tích. Các ảnh hưởng này bao gồm: môi trường pH của dung dịch mẫu đo phổ; ảnh hưởng của chất nền của mẫu (matrix effect); ảnh hưởng của các nguyên tố khác (nguyên tố thứ 3) có trong mẫu; ảnh hưởng của 1 số anion của các axit khó bay hơi như SO4 2-, PO4 3-, SiO3 2-. Vì thế với mỗi 1 loại mẫu phân tích, chúng ta phải nghiên cứu để tìm những điều kiện đo phù hợp nhất. Đó là quá trình tiêu chuẩn hóa xây dựng 1 quy trình phân tích. 5 C1 C2 C3 C4 C5 Cx 0 10 15 20 C (µg/ml) D (Mg – 285,2 nm) Hình 8.7. Ứng dụng hiệu ứng giảm cường độ vạch phổ Mg để xác định F 139 8.8. Ứng dụng của phép đo AAS Hiện nay phép đo phổ hấp thụ nguyên tử đã và đang được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, để phân tích không những các kim loại có phổ hấp thụ nguyên tử mà cả để phân tích những hợp chất hữu cơ hay các anion không có phổ hấp thụ nguyên tử. Nó là 1 công cụ phân tích rất quan trọng trong các ngành địa chất, công nghiệp hóa học, hóa dầu khí, y học, sinh hóa, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và thực phẩm,… 140 CHƯƠNG 9 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 9.1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG CỦA SẮC KÝ 9.1.1.Mở đầu Sắc kí là một kĩ thuật vật lí và hóa lí để tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp. Cơ sở của sự tách sắc ký là các quá trình xảy ra ở trong cột tách khi mẫu được nạp vào. Ở đây, có sự tương tác của chất phân tích với chất nhồi ở trong cột tách (pha tĩnh) theo các tính chất hòa lý nhất định như: Sự hấp phụ (Adsorption), Sự trao đổi (Ionexchange), Sự phân bố giữa hai tướng (extraction), Sự rây phân tử, v.v… Vì thế ứng với mỗi loại bản chất của sự tương tác đó người ta có một loại sắc kí riêng. Qúa trình sắc ký được thực hiện (xảy ra) ở trong cột tách là giữa hai pha: pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh nằm cố định ở trong cột tách. Pha động luôn chạy qua cột tách với một tốc độ nhất định và mang theo chất mẫu ra khỏi cột tách. Trong sắc ký khí, pha động là các chất khí, như không khí, oxy, hiđro, argon, heli. Chọn loại khí nào là do chất phân tích và loại detector quyết định. Trong sắc ký lỏng, pha động là các chất lỏng nguyên chất hay hỗn hợp của hai hoặc ba chất theeo một tỉ lệ phù hợp; hoặc là dung dịc của một axit, muối có thêm chất đệm pH, chất tạo phức. Ví dụ như axetonitril, metanol, n-hexan, hỗn hợp của methanol và nước, acetonitril và nước, dung dịch nước của các muối kim loại tan trong nước (dung dịch KCl, NH4 CH3COO, …). Căn cứ theo pha động, người ta chia thành hai nhóm sắc ký, tức là hai loại kỹ thuật sắc ký ứng với hai loại chất mang khí và lỏng. Chất mang (pha động) là khí ta có sắc ký khí Chất mang (pha động) là chất lỏng, ta có sắc ký lỏng. Trong sắc ký lỏng lại có sắc ký lỏng thường và áp suất cao. Trong sắc ký khí chủ yếu có hai loại là sắc ký pha thường vá pha ngược. Hai loại này được dùng nhiều để phân tích các chất hữu cơ, hợp chất tự nhiên, các hợp chất cơ kim, … Trong sắc ký lỏng cao áp có đủ 4 loại theo 4 bản chất của sự tương tác ở trong cột tách, như: Sắc ký hấp phụ, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký phân bố, Sắc ký rây phân tủ (Gel.) Trong đó loại 4 là để tách các phân tử lượng lớn hơn 2000. Nhưng trong sắc ký hấp phụ lại có hai có chế ngược nhau do bản chất của pha tĩnh quyết định. Vì thế 141 nó lại chia thành sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC), hấp phụ pha ngược (RP- HPLC). Bên cạnh sắc ký khí và sắc ký lỏng còn có sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy và sắc ký điện đi. Khái quát chung là như thế, song giáo trình này, chúng ta chỉ đề cập đến 2 loại sắc ký đang được sử dụng nhiều và có nhiều ưu viêt, đó là: Sắc ký lỏng áp suất cao (High Pressure Liquid Chromatography-HPLC) và Sắc ký khí (Gas Chromatography-GC) 9.2 Nguyên tắc sự tách trong cột săc ký Qúa trình tách ở trong cột sắc ký là sự tương tác của các chất mẫu (chất phân tích) với pha tĩnh đứng yên trong cột tách và pha động luôn chuyển động qua cột tách với một tốc độ nhất định. Như vậy sẽ có 3 sự tương tác đồng thời xảy ra: - Tương tác giữa chất phân tích với pha tĩnh. - Tương tác giữa chất phân tích với pha động. - Tương tác của pha động và pha tĩnh. Nếu gọi Fa, Fb và Fc là lực ứng với từng tương tác đó thì ở đây Fa và Fb là ngược nhau. Fa giữ chất phân tích lại trên cột sắc ký; Fb lại kéo chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Khi đó Fc là sự tương tác giữa pha tĩnh và pha động trong cột. Do đó quá trình tách sắc ký một hỗn hợp chất mẫu là được quyết định bởi tổng đại số của ba loại liên kết này, nghĩa là ta có: Ft=Fa + Fb + Fc (9.1) trong đó Ft là lực rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách. Sự tương tác tay ba này có thể minh họa một cách tương tự như hình 9.1. Trong hình 9.1: SP : pha tĩnh (stationary phase) MP : pha động (mobile phase) X : chất phân tích (analyte) X SP MP Fa Fc Fb Hình 9.1. Sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất phân tích 142 Nhưng trong một hệ sắc ký nhất định thì gồm một pha tĩnh và một pha động nên lực Fc là không đổi (Fc = const). Do đó Ft chỉ còn phụ thuộc vào tổng của hai lực (Fa + Fb), mà Fa và Fb của mỗi chất phân tích là khác nhau, nó phụ thuộc vào bản chất và cấu trúc của pha tĩnh, pha động và cả chính nó (chất phân tích nữa). Vì thế lực Ft của mỗi chất phân tích là khác nhau đối với một hệ sắc ký.Nếu Ft càng nhỏ, thì chất phân tích bị giữ yếu trong cột tách, nghĩa là chất nào có lực Ft nhỏ nhất sẽ rời khỏi cột tách đầu tiên, chất phân tích nào có Ft lớn nhất sẽ ra sau cùng. Những chất nào có Ft bằng nhau hay gần nhau thì sẽ ra khỏi cột tách cùng nhau. Do đó, khi ra khỏi cột tách, có những chất tách ra khỏi nhau, có nhưng chất còn nằm chung với nhau trong một phân đoạn (hinh 9.2). Trong ví dụ này, các chất X1, X2, X5, X6 là đã được tách ra khỏi nhau, nhưng chất X3, X4 thì chưa, chúng còn chập vào nhau trong cùng một pic. Ở đây ta có: F1 < F2 < F3 ≈ F4 < F5 < F6 Do đó trong hệ sắc ký này 2 chất X3 và X4 không có hiệu quả tách, muốn tách được ta phải thay đổi các điều kiện sắc ký. Ví dụ thành phần pha động, tốc độ pha động, pH của sự tách, nhiệt độ cột tách, … Vì thế các quá trình xảy ra ở trong cột tách là nội dung chính của sắc ký. Tiếp đó là các detector để phát hiện chính xác sự tách đó xảy ra như thế nào, tách được hay không có sự tách tốt. Hai bộ phận này hay hai công việc này có quan hệ chặt chẽ với nhau. Mọi yếu tố làm ảnh hưởng đến hai hoạt động này đều làm sai lệch kết quả sắc ký. t (sec) X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 Hình 9.2 Ví dụ về sự tách sắc ký của các chất X1, X2, X3, …X6. 9.3. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký Qúa trình sắc ký xảy ra ở trong cột tách. Vì thế cơ sở lý thuyết sắc ký chính là lý thuyết động học của các quá trình ở trong cột sắc ký. Đó là các vấn đề phân bố của chất, sự lưu giữ của chất ở trong cột tách, sự phân giải của hai chất sau khi qua cột v.v… Cho nên muốn hiểu sắc ký, trước hết chúng ta phải làm quen với nhưng cơ sở lý thuyết và các khái niệm về những vấn đề đó. 143 9.3.1. Sự phân bố Sắc ký là quá trình phân bố chất tan (chất mẫu) giữa hai pha không hòa tan vào nhau: pha tĩnh và pha động, khi pha động chảy liên tục, vào ở đầu cột và ra ở cuối cột. Đó là những cân bằng phân bố động và ở đây chúng ta luôn có: Ki=Ci(S)/Ci(M) với Ci (M) và Ci (S) là nồng độ chất tan i ở mỗi pha lỏng M và pha rắn S. Đơn vị của Ci là mol/l. Ki là hệ số phân bố, nó đặc trưng cho quá trình phân bố đó và Ki phụ thuộc vào bản chất của chất tan i, bản chất của hai pha S và M, đồng thời phụ thuộc cả vào nhiệt độ của hệ. Sự phân bố của chất tan i vào hai pha cũng xảy ra theo 3 trường hợp (hình 9.3): + Phân bố tuyến tính (Laugmua) (a), + Phân bố lồi (không tuyến tính) (b), + Phân bố lõm (không tuyên tính) (c). (a) (b) (c) (a) (b) (c) Hình 9.3. Sự phân bố của các chất Khi nông độ Ci nhỏ, sự phân bố của chất tuyến tính, khi nồng độ Ci lớn ta không có sự phân bố tuyến tính. Nói chung, sự phân bố theo 3 kiểu nói trên đều ảnh hưởng khác nhau đến dạng của pic sắc ký, tức là quá trình tách sắc ký (hình 1.3). Chỉ có dạng phân bố tuyến tính là cho pic cân đối và đẹp. Tất nhiên trong điều kiện này hiệu suất tách của cột cao. Vì thế trong phân tích không nên nạp lượng mẫu lớn vào cột tách. 144 9.3.2 Sự lưu giữ Trong quá trình sắc ký, có chất sẽ ra khỏi cột trước, có chất ra sau, và trong một hệ sắc ký xác định đã chọn, mỗi chất đều được lưu lại trong cột tách trong một thời gian nhất định, đặc trưng cho chất đó và được gọi là thời gian lưu của chất (tRi). Thời gian lưu là thời gian chất phân tích được đưa vào cột tách, ở van bơm mẫu cho đến lúc chất ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại (hình 9.4). tRi t'Ri Hmax Wi tRi t(sec)0 tM Hình 9.4. Thời gian lưu của chất tan Trong đó: tM là thời gian lưu của pha động (không lưu giữ chất tan i:dead time), tRi là thời gian lưu toàn phần của chất tan i. Nhưng cũng có lúc chất phân tích I nằm trong pha động và nó không bị pha tĩnh giữ, nên thời gian lưu thực của nó là: MRiRi ttt −= ' (9.3b) Cũng tương tự, ta có thể tích lưu của chất I là: MRiRi VVV −= ' (9.3c) ở đây VM : thể tích lưu của pha động. Nhử vậy, nếu 2 chất A và B có thời gian lưu tA và tB khác nhau nhiều, thì chúng ta được tách riêng biệt sau khi qua cột sắc ký. Nếu tốc độ pha động qua cột là Fm (ml/ph) thì ta có thể tích lưu VRlà: mRR FtV .= (9.3d) 9.3.3 Tốc độ pha động Trong sắc ký lỏng, tốc độ pha động qua cột được đặt trưng bởi hai khái niệm: 145 Tốc độ thể tích, biểu diễn (chỉ rõ) số ml của pha động chảy qua cột trong một phút, và được ký hiệu là Fm. Ví dụ Fm=1,2 ml/ph. Tốc độ này có liên quan đến diện tích ngang (thiết diện) của cột tách và tốc độ thể tích được tính theo công thức sau: Ri Ri m t V F = (9.4a) Tốc độ tuyến tính (là tốc độ dài): nó cho ta biết trong một đơn vi thời gian (phút hay giây), một lớp chất mẫu (một đĩa sắc ký) chuyển động được bao nhiêu cm ở trong cột. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện ngang của cột. Nó là một đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký. Như vậy ta có tốc độ tuyến tính trung bình của chất tan: Rit L u = (9.4b) và của pha động tự do (của phân tử của pha động). Mt L u =0 (9.4c) Ở đây L là chiều dài của cột sắc ký. Như vậy, giữa tốc độ thể tích (Fm) và tốc độ tuyến tính u có quan hệ với nhau theo công thức: Ri m V FL u . = (9.4d) Nhưng trong một hệ sắc ký đã chọn thì L=const, nếu u phụ thuộc chỉ vào tỷ số của đại lượng (Fm/VRi). 9.3.4. Hệ số dung tích (Capacity Factor) Hệ số dung tích là một thông số rất quan trọng được dùng để mô tả khả năng hấp phụ của chất tan (chất phân tích) ở trên một loại cột, được ký hiệu là 'ik , nếu pha tĩnh càng có khả năng hấp phụ mạnh thì 'ik càng lớn. Hệ số dung tích được định nghĩa như sau: M MRi M Ri i t tt t t k )('' −== (9.5a) Tương tự như thế ta cũng có: M Ri i V V k =' (9.5b) Hay là tRi=ki.tM (9.5c) VRi=ki.VM (9.5d) 146 Nhưng vì MRiRi ttt −= ' và MRiRi VVV −= ' Nên ta có: )1( iMRi ktt += (9.5 e) )1( iMRi kVV += (9.5 f) Hai công thức 9.5e và 9.5f cho ta biết mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ số dung tích của một chất tan I trong một hệ sắc ký. 9.3.5 Hệ số chọn lọc (Seletivity Factor) Hệ số dung tích chỉ mới cho ta biết khả năng bị lưu giữ của môt chất ở trên cột tách, nhưng chưa cho ta biết hai chất khi qua cột tách chúng có được tách ra không. Để đặc trưng cho vấn đề này, người ta dùng hệ số chọn lọc α và nó được xác định hoặc theo 'ik (hệ số dung tích) hoặc theo K (hệ số phân bố), tức là: ' ' / B A BA K K r ==α hay B A K K =α (9.6a) Trong đó 'AK , ' BK là hệ số dung tích của chất A và chất B; còn KA, KB là hệ số phân bố. Nhưng như trên chúng ta đã biết: )1( 'iMRi ktt += hay M MR i t tt k )(' −= Nên ta cũng có: )( )( )( )( MBR MAR tt tt − − =α (9.6b) Như vậy từ biểu đồ sắc ký ta xác định được tRi, tM và xác định được giá trị α của hai chất A và B và nếu: α = 1 : không có sự tách sắc ký α ≠ 1 : có sự tách sắc ký và nếu tA>tB và α khác 1 càng lớn. thì sự tách của hai chất A và B càng rõ rang, tức là hai pic sắc ký tách biệt nhau hoàn toàn. Song cũng từ công thức 1.6a, nếu biết hệ số dung tích 'ik hay hệ số phân bố K của hai chất A và B, thì chúng ta cũng có thể dự đoán được α . 9.3.6 Chiều cao của đĩa, số đĩa Nếu cột sắc ký có độ dài là L, và H là chiều cao của một đĩa lý thuyết của cột tách thì tổng số đĩa lý thuyết N của một cột sắc lý sẽ là: H L N = (9.7a) Nhưng theo lý thuyết đĩa và quy luật Gaoxo chiều cao một đĩa lý thuyết của cột sắc ký là: 147 L H 2σ = ((9.7b) trong đó σ là độ lệch chuẩn. Mặt khác: Rt WL 4 . =σ (9.7c) Do đó 2 2 ).(16 . Rt WL H = (9.7d) 2 .16      = W t N R (9.7e) Như vậy từ biểu đồ sắc ký chất tan I, sau khi đo Rt và W chúng ta có thể dễ dàng tính được số đĩa lý thuyết N của một cột tách. 9.3.7. Độ phân giải Độ phân giải là đại lượng cho ta biết khả năng tách của 2 pic sắc ký của 2 chất kề nhau như thế nào. Nếu hai chất A và B có pic sắc ký như hình 9.5 thì ta có độ phân giải RS của nó là: )( 2 )2/2/(/ BABA BA WW Z WW Z R + ∆ = + ∆ = (9.8a) Hay là: )( )(2 ' )( ' )( / BA BRAR BA WW tt R + − = (9.8b) Trong đó WA, WB là đáy của các pic sắc ký. Một cách gần đúng, ở đây có thể xêm (WA+WB) ≈ 2WA, do đó ta có giá trị của độ phân giải R là: A BA BA W tt R '' / − = (9.8c) Nhưng như trên chúng ta đã biết theo tR. Do đó ta lại có: N k k R A A BA ⋅+ ⋅ − ⋅= )1( )1( 4 1 ' ' / α α (9.8d) 148 Hay: efBA NR ⋅ − ⋅= α α )1( 4 1 / (9.8e) Từ công thức này, để đạt được độ phân giải BAR / nhất định theo yêu cầu, và các giá trị 'Ak , ' Bk , ta có thể tính được số đĩa tối thiểu N cho một cột sắc ký, sau đó tìm chiều dài L của cột theo công thức: H L N = . 9.3.8. Nồng độ của chất theo pic sắc ký Nếu chất phân tích I trong mẫu có nồng độ là C0, thể tích mẫu được nạp vào cột sắc ký là Vsi, thì lượng mẫu qi đã được nạp vào là: 0CVq sii ⋅= (9.9a) và trong quá trình tách, chất I sẽ được rửa giải ra khỏi cột tách, tại đỉnh của pic sắc ký sẽ có nồng độ là: 2/1(max) )2.( piσ v i i q C = (9.9b) Đồng thời trong quá trình sắc ký, nó đã bị pha loãng ra một số lần là: Hình 9.5. Độ phân giải của hai chất tan A và B 149 2/1)2.( piσ v si l V D = (9.9c) Gía trị lD luôn lớn hơn 1, và nếu lD càng lớn, thì giá trị (max)iC càng giảm. Độ pha loãng lD phụ thuộc vào: - Chiều dài của đường dẫn trong hệ thống HPLC (tức là từ van bơm mẫu đến flowcell của detector). Do đó muốn giảm lD thì đường dẫn phải ngắn. - Tốc độ của pha động. 9.3.9 Quan hệ giữa chiều dày đĩa và tốc độ của pha động (H-u) Chiều cao của đĩa và tốc đọ dich chuyển của đĩa (u) có liên quan chặt chẽ với nhau. Mối quan hệ này được chỉ ra bởi phương trình Van Deemter: uCuCuC u B AH 321 ++++= (9.10a) Trong đó: dpA λ2= là hằng số của chất nhồi cột (pha tĩnh), nên A phụ thuộc vào đường kính dp của pha tĩnh. Nó là hợp phần chính quyết định chiều cao của đĩa H; iDB γ2= và là hằng số, Di là tốc độ khuếch tán của chất tan trong pha động. Vì thế B là yếu tố ảnh hưởng của pha động đến H, nó là yếu tố thứ 2 đóng góp đáng kể cho H. Các giá trị của C1, C2, C3 là như sau: { } sii DdlkkC /.)1/(3/2 2''1 += (9.10b) [ ] iii DdkkqC /).()1/()(. 222'2'12 += (9.10c) iDdpqC /)( 2 23 = (9.10d) Trong đó: d1, q1, q2 là các hằng số; DS là độ khuếch tán chất tan trong pha tĩnh và nó là ảnh hưởng của pha tĩnh đến chiều cao H. Trong thực tế của phân tích sắc ký, C2.u và C3.u rất nhỏ (dưới 5% của H), vì thế ta có thể viết phương trình Van Deemter như sau: uC u B AH .1++= (9.10e). Và mối quan hệ H – u được biểu diễn như trong hình 9.6 150 Ở đây u0 là tốc độ tối ưu nhất của hệ sắc ký, và ở tốc độ u0 này chiều cao H là nhỏ nhất, có nghĩa số đĩa N trong cột sắc ký là lớn nhất. - Nếu u<u0 chiều cao H tăng khi giảm u - Nếu u>u0 chiều cao H cũng tăng theo u Do đó trong phân tích chúng ta cố gắng chọn tốc độ chảy Fm của pha động qua cột sao cho giá trị u gần bằng u0 hoặc bằng u0 là điều lý tưởng nhất để có hiệu quả tách cao nhất. Vì thế muốn tìm được tốc độ pha động phù hợp ta phải xây dựng đường cong H – u, qua các giá trị thực nghiệm ỏ những tốc độ chảy Fm khác nhau, rồi tính theo công thức: ' Rit L u = Và H theo công thức: 2' 2 ).(16 . Rit WL H = Sau đó từ các cặp giá trị của u và H ta sẽ dựng được đường cong Van Deemter, rồi tìm u từ đường cong này, sau đó suy ra Fm. Hình 9.6. Quan hệ giữa H và u (đường cong Van Deemter) 151 Tóm lại một số thông số đặc trưng cơ bản cho quá trình sắc ký chúng ta có thể xem trong bảng 9.2 dưới đây. Bảng 9.2. Tóm tắt các đại lượng đặc trưng của sắc ký Important Derived Quantities and Relationships Name Calculation of Devired Quantities Relationship to Other Quantities Linear mobile phase velocity Mt L u = Volume of mobile phase FtV MM = Capacity factor M MR t tt k )(' −= M S V KV k =' Partition coefficient S M V Vk K ' = M S C C K = Selectivity fartor MAR MBR tt tt − − = )( )( α A B A B K K k k == ' ' α Resolution BA ARBR S WW tt R + − = ))()((2       +       −= ' ' 1 1 4 B B S k kN R α α Number of plates 2 16      = W t N R 2 ' '2 2 1 1 16       +       − = B B S k k RN α α Plate height N L H = Retention time 2' 3'22 )( )1( 1 16 )( B BS BR k k u HR t +       − = α α 9.4. Detector của sắc ký Detector là một bộ phận rất quan trọng trong hệ thống máy sắc ký. Nó ghi nhận sự tách xảy ra ở trong cột sắc ký. Vì thế, nếu nó ghi nhận không trung thực thì chúng ta sẽ không hiểu đúng được sự tách sắc ký. Mỗi loại detector ghi nhận chất phân tích theo những đặc trưng hóa lý nhất định, ví dụ như: 1. Sự hấp thụ bức xạ UV, VIS 2. Độ huỳnh quang của chất phân tích 152 3. Sự thay đổi dòng điện, điện thế, độ dẫn điện 4. Độ dẫn nhiệt 5. Sự biến thiên chiết suất, v.v… Mặc dù có nhiều lọai khác nhau, nhưng yêu cầu chung của một detector để dùng trong máy sắc ký phải có: Có độ nhạy cao để phát hiên chất phân tích, thường là 10-8-10-15 g/g, và nhạy hơn thì càng tốt. Phải ổn định, phải lặp lại tốt các giá trị đo, bền vững theo thời gian, để đảm bảo phép đo đạt độ chính xác cao. Có vùng tuyến rộng, thường 103 đến 104. Vùng làm việc ở khoảng nhiệt độ rộng (khoảng 4000C). Yêu cầu này là do GC. Thời gian đáp tuyến phải ngắn, để nhạy cảm kịp thời với các qua trình xảy ra của sự tách trong cột sắc ký. Có tính linh hoạt cao và sử dụng dễ dàng, để chọn các tham số đo cho các yêu cầu phân tích khác nhau. Thích hợp được cho nhiều loại nhóm chất để theo dõi được nhưng hỗn hợp mẫu có thành phần phức tạp. Trong quá trình phát hiện nó không làm ảnh hưởng hay làm sai nồng độ chất phân tích, hay ảnh hưởng cấu trúc của chất. Detector nào thỏa mãn tốt các yêu cầu đó được gọi là lý tưởng. Tất nhiên trong thực tế sự thỏa mãn hoàn toàn cao là khó. Tùy loại mẫu tách mà yêu cầu nào được đặt lên hàng đầu. Có nhiều kỹ thuật sắc ký khác nhau và cũng có nhiều cách phân chia và phân loại, song cách phân loại theo bản chất chính của quá trình sắc ký ở trong cột tách hiện nay được sử dụng nhiều hơn và hợp lý hơn. Theo cách phân loại này chúng ta có 4 loại sắc ký: Sắc ký khí: là loại sắc ký sự tách các chất xảy ra ở trạng thái khí. Sắc ký lỏng: là loại sắc ký sự tách của các chất xảy ra ở thể lỏng. Pha động là chất lỏng. Trong nhóm sắc ký này lại được chia thành: sắc ký hấp phụ pha thường, sắc ký hấp phụ pha ngược, sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố, sắc ký rây phân tử. Trong nhóm sắc ký lỏng, lại có sắc ký lỏng áp suất thấp (cổ điển) và sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC). 153 Sắc ký giấy: là loại sắc ký sự tách xảy ra trên nền, giấy sắc ký nguyên liệu tách (pha tĩnh). Sắc ký lớp mỏng: là loại sắc ký mà sự tách của chất xảy ra trên lớp màng mỏng silica hay oxit nhôm có tính chất sắc ký, nó là pha tĩnh. Trên đây là cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, song trong giáo trình này chúng ta chỉ nghiên cứu đi sâu vào hai loại sắc ký đầu tiên. Đó là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khí (GC) . 9.5. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG 9.5.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là quá trình tách một hỗn hợp các chất ở trong cột tách sắc ký ở trạng thái lỏng. Vì thế các chất mẫu phân tích phải hòa tan trong một chất lỏng nào đó, thường là pha động của quá trình sắc ký. Nó thường thích hợp cho cả các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như thấp (trừ các chất ở điều kiện thường là khí). Sắc ký lỏng có hai loại: Sắc ký lỏng áp suất thường (cổ điển) Sắc ký lỏng áp suất cao – HPLC. Chúng đều giống nhau ở pha động là chất lỏng, có thể là một dung môi đơn, hay hỗn hợp của 2 hoặc 3 dung môi theo những tit lệ nào đó. Pha tĩnh trong sác ký lỏng có thể là chất rắn hay chất lỏng. Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành cột chất nhồi có dạng của cột sắc ký. Pha tĩnh lỏng được giữ trong cột sắc ký nhờ chất mang trơ, nó là một màng (lớp) mỏng (1-3 µm bám xung quanh hạt chất mang. Loại pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn loại pha tĩnh rắn xốp toàn phần. Do trạng thái của pha như thế nên có tên: sắc ký lỏng – lỏng (LLC), sắc ký lỏng – rắn (LSC). Trong thực tế loại LSC được sử dụng nhiều hơn. Với sắc ký lỏng, việc thực hiện quá trình tách sắc ký có thể theo hai kĩ thuật sau: Kĩ thuật giữ thành phần và tốc độ pha động là hằng số. Kĩ thuật gradient pha động. Ở đây có thể gradient từng bậc (tăng hoặc giảm), hay gradient liên tục thành phần pha động, để chọn thành phần pha động trong quá trình tách sắc ký để rửa giải các chất. Trong sắc ký lỏng áp suất thường, thời gian tách lâu, tốn nhiều chất nhồi và pha động, hiệu suất tách lại kém, việc tách các chất không gọn như sắc ký lỏng áp suất cao (HPLC). Nó là kĩ thuật tách cổ điển. Do đó ở đây chúng ta chỉ bàn đến sắc ký lỏng áp suất cao. 154 Trong HPLC, mẫu được bơm vào cột nhừ một van bơm mẫu, sau đó nhờ một bơm cao áp bơm pha động chảy qua cột với một tốc độ xác định từ đầu đến cuối cột tách. Qúa trình tách sắc ký của một hỗn hợp gồm hai chất A và B có thể được minh họa như hình 1.1. Lúc đầu 2 chất A và B cùng trong một vùng trên cột, nhưng theo thời gian chạy sắc ký hai chất dần đàn tách ra khỏi nhau, để đến cuối cột tách 2 chất tách thành hai vùng riêng biệt và trên sắc đồ sắc ký chúng ta sẽ thu được hai pic sắc ký riêng biệt. 9.5.2. Máy sắc ký lỏng cao áp Máy sắc ký lỏng cao áp là một hệ thống trang bị để tực hiện quá trình sắc ký. Nó bao gồm các bộ phận cơ bản sau đây: 1. Van bơm mẫu (sample injection valve): Van bơm mẫu có chứa vòng mẫu với thể tích nhất định, ví dụ 20, 50, hay 100 µl, dùng để bơm mẫu phân tích vào cột Hình 9.7. Ví dụ về sự tách sắc ký hai chất A và B. 155 tách. Có nhiều loại van, nhưng loại van 6 chiều được sử dụng nhiều hơn, vì nó thuận lợi hơn các loại khác. 2. Cột sắc ký: Cột sắc ký HPLC làm bằng thép hay thủy tinh thạch anh có vỏ thép để chịu áp suất cao. Cột HPLC thường có kích thước bình thường là 250 ×4mm; 150 ×4mm; 125 ×4mm; hay 250 ×1mm; 150 ×1mm, hoặc 50 ×1mm hay 50 ×2mm. Các loại cột có kích thước nhỏ hơn 5 cm (chiều dài) và 1 mm đường kính gọi là microbore. Tất nhiên chiều dài của cột phụ thuộc vào cỡ hạt chủa chất nhồi. Hạt càng to thì cột phải dài, để đảm bảo đủ số đĩa lý thuyết tối thiểu cho một cột tách sắc ký. Chất nhồi đường kính hạt 5 µm, cần cột dài 125-150 mm là đủ, nhưng nếu chất nhồi đường kính 7 – 10 mm, phải dùng cột dài 250 – 300 mm. Chất nhồi đường kính 2-3 µm, chỉ cần cột dài 3-5 cm. Cột tách là một bộ phận kết quả tách của một hỗn hợp chất mẫu là tốt hay xấu, và với mỗi loại chất mẫu phải chọn một loại cột tách riêng cho nó. Đó là loại chất nhồi – pha tĩnh (stationary phase). 3. Bơm cao áp Là dụng cụ để bơm pha động qua cột tách với tốc độ xác định, phục vụ quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột sắc ký. Nó phải có độ ổn định và lặp lại cao của tốc độ bơm. Có bơm 1 kênh, có bơm 2 kênh song song hoặc 2 kênh nối tiếp, và làm việc trong vùng áp suất từ 0 – 400 bar. Nhưng bơm 2 kênh cho tốc độ ổn định hơn. 4. Bộ gradient pha động Bộ này chỉ cần khi thực hiện kĩ thuật tách với gradient pha động. Nó được đặt trước bơm cao áp, để chuẩn bị gradient pha đọng với thành phần phụ hợp theo yêu cầu để cho bơm cao áp bơm vào cột tách. 5. Detector Là bộ phận để thu nhận vàn phát hiện tín hiệu của chất phân tích, theo một tính chất nào đó của nó, ví dụ như: Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS Sự hấp thụ hay phát xạ của nguyên tử Tính chất phát huỳnh quang của phân tử hay nguyên tử Độ dẫn điện của các chất Sự biến thiên của dòng điện giữa 2 điện cực Độ dẫn điện của chất Sự biến thiên chiết suất của dung dịch mẫu. 156 Nhưng dù loại nào nó cũng phải đạt được những yêu cầu nhất đinh (xem mục 9.4 ở trên). Và cứ ứng với mỗi một loại tính chất đó thì ta có một loại detector. Ví dụ như detector phổ hấp thụ nguyên tử UV-VIS (190-1000nm), detector huỳnh quang, detector đo độ dẫn của dung dịch v.v… 6. Bộ phận ghi nhận kết quả Có thể là: Máy tự ghi (recorder), đây là trang bị được dùng phổ biến nhất Máy intergrator. Máy printer. Hay computer với màn video. Những hệ máy HPLC hiện đại và hoàn chỉnh, hiện nay luôn có gắn computer và có cài các chương trình chạy sắc ký, hệ thống bơm mẫu tự động, … Sơ đồ khối của một hệ thống máy HPLC được mô tả trong hình 9.8. Bảng 9.3. Các loại detector và tính năng của nó Loại detector Độ nhạy Tính năng vùng t. tính Ứng dụng Phổ UV Phổ UV-VIS Phổ huỳnh quang Chiết suất (RI) Đo độ dẫn điện Độ dẫn điện Cực phổ (Amp.) Phổ MS > 1 ng >1 ng >0.01 ng >100 ng >10 ng >1 µg >0.1 ng >0.01ng 103 103 104 104 104 104 104 104 phổ biến phổ biến vừa ít dùng vừa ít dùng ít dùng ít (mới) 157 9.5.3. Pha tĩnh trong HPLC Pha tĩnh trong HPLC (hay còn gọi là chất nhồi cột) cũng có 4 loại, tương ứng với các loại sắc ký đó, đó là các loại chất nhồi của sắc ký: Hấp phụ gia thường (NP-HPLC) Hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) Trao đổi ion (IE-HPLC) Phân bố - sắc ký chiết (P-HPLC) Rây phân tử (GEL-HPLC) Tuy có 4 loại, nhưng cũng được chế tạo trên 3 chất nền là silica, oxit nhôm và cao phân tử hữu cơ (polystyrene). Nhưng silica vẫn là chủ yếu (chiếm 30%), sau đó là nền oxit nhôm. Pha tĩnh cũng có pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng. Pha tĩnh lỏng thường là các chất hữu cơ được giữ ở trong cột tách nhờ các hạt chất mang trơ. Nó tạo thành một lớp màng mỏng xung quanh các hạt chất mang có độ dày 1 – 3 µm. Hình 9.8. Sơ đồ nguyên tắc của hệ máy HPLC 158 Các hạt chất mang trơ là các hạt silica đã được hoạt hóa cho mất tính hấp phụ. Nó trơ trong quá trình sắc ký. Vì thế trong kỹ thuật HPLC cũng có: Sắc ký lỏng – lỏng Sắc ký lỏng – rắn Pha tĩnh rắn là các hạt có hình cầu hay là các mảnh có đường kính từ 3 – 10 µm. Phổ biến nhất hiện nay là cở 5 – 7 µm. Nên silica là nguyên liệu chính để chế tạo pha tĩnh trong HPLC. Pha tĩnh của HPLC hấp phụ pha thường là các silica trung tính (silica trần). Trên bề mặt của nó còn chứa nhiều nhóm phân tực – OH (hình 1.3a). Nhóm này ưa nước, và để liên kết cầu hidro với các phân tử nước, làm giảm hoạt tính sắc ký của pha tĩnh. Loại này để tách các chất không phân cực và ít phân cực. Pha động của loại pha tĩnh này là những chất kỵ nước (không ưa nước); nghĩa là không hòa tan nước. Ví dụ như CHCl3, benzene, CCl4, etylacetat, n-hexan, n-pentan, v.v… (bảng 2.4). Pha tĩnh của HPLC hấp thụ pha ngược là các silica trung tính đã được alkyl hóa nhóm OH trên bề mặt bằng các nhóm alkyl của mạch cacbon C3, C8, C18 hay nhân phenyl. Vì thế loại chất nhồi này có bề mặt không phân cực. Nó thuộc loại chất nhồi kỵ nước (hình 9.9) . Nghĩa là nước không ảnh hưởng đến tính chất bề mặt của nó. Pha động cho loại sắc ký này là nước có hòa tan thêm các chất hữu cơ, ví dụ như methanol, acetonitril được trộn với nước theo tỉ lệ phù hợp. Hình 9.9. Cấu trúc của pha tĩnh trong HPLC 159 Tất nhiên các tính chất, đặc trưng, cấu trúc của hạt pha tĩnh đều có ảnh hưởng đến hiệu quả sắc ký. . Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sắc ký có rất nhiều, ví dụ như độ xốp của pha tĩnh, thành phần, tốc độ của pha động, … Bảng 9.4. Vài ví dụ về pha tĩnh trong HPLC. Tên pha tĩnh Loại nhóm thế Trên nền Loại pha ODS-Hypersil Lichrosorb RP18 Micropack CH Lichrosorb RP8 Zorback-ODS ODS-Sil X-I C18 C18 C18 C8 C18 C18 Silica Silica Silica Silica Silica Silica Hấp phụ RP ntr. ntr. ntr. ntr. ntr. Hypersil Partisil Lichrosorb-Si60, Si100 Zorbac-Sil µ-Porasil Silica Silica Silica Silica Silica Hấp phụ NP ntr. ntr. ntr. ntr. Partisil 10SCX Lichrosorb KAT Aminex-A28 Silica Silica Polyme hữu cơ Trao đổi ion ntr. ntr. 9.5.4. Pha động trong HPLC Pha động trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) tùy thuộc vào mỗi loại chất nhồi cột khác nhau. Nó có thể là một dung môi đơn, hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi trộn với nhau theo tỉ lệ phù hợp. Song với bất kỳ loại sắc ký nào thì yêu cầu của dung môi làm pha động cũng phải thỏa mãn những yêu cầu nhất định như: Phải trơ và không có tác dụng hóa học với pha tĩnh Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký Hòa tan tốt hỗn hợp chất mẫu Phù hợp với loại detector đã chọn để phát hiện chất phân tích 160 Trong sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC), vì pha tĩnh là chất phân cực, nên pha động là những chất không phân cực hay ít phân cực. Ví dụ n-hexan, n- heptan, benzene, tetrachlocacbon, chloroform, …Nói chúng đó là các dung môi hữu cơ. Các dung môi này thường kỵ nước. Hệ sắc ký này thường được sử dụng để tách và phân tích các hỗn hợp hiđrocacbon, các chất hữu cơ không phân cực hay ít phân cực. Trong sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC), vì pha tĩnh không phân cực hay rất ít phân cực, nên pha động phân cực. Pha động trong loại sắc ký này đều trên nền nước cất có thêm các dung môi hữu cơ tan tốt trong nước như methanol, acetonitril, izo-butanol, …Phổ biến nhất là hỗn hợp của (methanol + nước) theo tỉ lệ nhất định tùy theo mỗi loại hỗn hợp mẫu cân sắc ký. Hệ sắc ký này phù hợp cho sự tách sắc ký của nhiều loại hỗn hợp mẫu, như hyđrocacbon, nhóm các chất mạch vòng, hợp chất tự nhiên, các phenol, các amin, amino-axit, …Phạm vi sử dụng của RP-HPLC phong phú và đa dạng hơn nhiều loại NP-HPLC. 9.5.5. Sự lưu giữ trong cột Các chất phân tích được lưu giữ trong cột tách bao lâu là được quyết định bởi các yếu tố: Bản chất của chất phân tích, như cấu trúc phân tử, các nhóm thế và vị trí của chúng, … Bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh trong cột tách, như cỡ hạt, độ xốp, kích thước lỗ xốp, … Pha động như bản chất của các dung môi làm pha động, thành phần và tốc độ của pha động, pH của pha động Nhiệt độ cột tách. Tất cả các yếu tố đó ảnh hưởng trong những mức độ nhất định đến hiệu quả sắc ký của một hỗn hợp chất và chỉ khi chon được những điều kiện phù hợp nhất, thì chúng ta mới thu được kết quả sắc ký tốt. 9.5.6. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký là nghiên cứu chọn lọc các điều kiện sắc ký phù hợp nhất cho một hỗn hợp mẫu phân tích để thu được hiệu quả tách cao nhất của sự tách các chất. Nghĩa là các chất có trong hỗn hợp mẫu được tách nhau hoàn toàn. Giải quyết vấn đề này bao gồm những cong việc như sau dựa theo tính chất của hỗn hợp chất mẫu: 1. Chọn pha tĩnh phù hợp theo các tính chất và đặc trưng như loại, độ xốp, cỡ hạt, kích thước cột chứa pha tĩnh, … 161 2. Chọn pha động phù hợp. Nó bao gồm chọn dung môi làm pha động, thành phần của chúng, tốc độ pha động, và chất đện Ph, chất tạo phức, nếu cần cho sự tách đạt hiệu quả cao. Ví dụ như trong sắc ký trao đổi ion. 3. Chọn loại detector và các thông số của nó để phát hiện chất phân tích với hiệu quả cao (độ nhạy và độ chọn lọc cao). 4. Lượng mẫu bơm vào cột tách 5. Nhiệt độ của cột tách trong quá trình sắc ký 6. Chế độ gradient có cần không?, … Thực hiện nghiên cứu chọn được các điều kiện nói trên phù hợp, tức là công việc tối ưu các điều kiện sắc ký. Nghĩa là xây dựng một quy trình tách sắc ký các chất trong một hỗn hơp mẫu phân tích. 9.5.7. Phân tích định tính trong HPLC Chúng ta biết rằng trong một (thông số đặc trưng) để phát hiện định tính một chất trong hỗn hợp mẫu. Vì thế nguyên tắc của phân tích định tính theo HPLC là: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, dùng các chất chuẩn để xác định thời gian lưu của các chất phân tích theo sắc đồ bơm mẫu riêng của tưng chất. như thế ta lập được thời gian lưu của mỗi chất, ví dụ như đối với các chất A, B, C, D,…ta có các thời gian lưu tương ứng là tA, tB, tC, tD, … Do đó đến khi phân tích mẫu chưa biết, ta cũng bơm mẫu và ghi sắc đồ của mẫu phân tích và nếu có một chất có thời gian lưu trùng với tB thì ta nói chất chưa biết đó là chất B 9.5.8. Phân tích định lượng Nguyên tắc của phân tích định lượng trong HPLC là dựa trên cơ sở trong một phạm vi nhất định của chất phân tích thì chiều cao hay diện tích của pic sắc ký là có quan hệ tỉ lệ thuận với nông độ của nó ở trong mẫu theo biểu thức: H = k.C (9.9a) Hay là S = k.C (9.9b) Trong đó H là chiều cao và S là diện tích của pic sắc ký của chất. Trong hai biểu thức này, quan hệ tuyến tính giữa S và C rộng hơn quan hệ tuyến tính giữa H và C. Còn k là hằng số của các điều kiện thực nghiệm của quá trình sắc ký. Vì thế trong một điều kiến sắc ký xác định thì nó sẽ không đổi. Do đó nguyên tắc của phương pháp phân tích định theo kĩ thuật HPLC là: Chuẩn bị một dãy mẩu chuẩn cùng với các mẫu phân tích trong cùng một điều kiện. 162 Chọn một quy trình phù hợp để chạy sắc ký dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân tích. Thừ sắc đồ thu được, xác định giá trị H (hay S) của các chất phân tích ở trong các mẫu và các mẫu phân tích tương ứng. Ví dụ như trong bảng sau: Dãy các chuẩn Mẫu phân tích Mẫu C1 C2 C3 C4 C5 CX1 CX2 CX3 Gía trị H H1 H2 H3 H4 H5 HX1 HX2 HX3 Gía trị S S1 S2 S3 S4 S5 SX1 SX2 SX2 - Sau đó dựng đường chuẩn H – C (hay S – C). Rồi từ các đường chuẩn này. Và các giá trị Hx hay Sx chúng ta dễ dàng phát hiện được nồng độ của chất phân tích 9.5.9. Vài ứng dụng của HPLC Hiện nay sắc ký lỏng cao áp được áp dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Vì nó có nhiều ưu việt hơn sắc ký cổ điển, ví dụ như: Độ nhạy cao Khả năng tách được nhiều loại hỗn hợp chất Tốc độ phân tích lớn Nhanh chóng cho kết quả Tốn ít mẫu Song về mặt trang bị so với sắc ký cổ điển, thì kĩ thuật HPLC cần có các trang bị đắt tiền hơn. Các lĩnh vực đã và đang sử dụng HPLC nhiều là: Công nghiệp hóa học, hóa dầu Công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, thuốc trừ sâu Y học, lâm sàng Hóa sinh và hóa hợp chất tự nhiên Công nghệ dược phẩm, … 9.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ 9.6..1 Nguyên tắc Sắc ký khí là quá trình tách các chất trong cột tách ở trạng thái khí, chất mang mẫu là chất khí. Vì thế chỉ có thể để tách được hỗn hợp các chất khí hay các chất lỏng hoặc chất rắn có thể dễ dàng hóa khí ở dưới 2500C, khi bơm mẫu vào cột 163 ở dạng lỏng. Nếu là chất rắn thì phải hòa tan trước trong một dung môi phù hợp tạo ra dung dịch mẫu rồi mới bơm vào cột sắc ký để hóa khí chúng. Với các chất ở nhiệt độ hóa hơi cao hơn 2500C, phải hóa hơi trước trong buồng hóa hơi riêng có nhiệt độ cao ở đầu cột sắc ký, sau đó mới dẫn vào cột tách. Tất nhiên, với các chất loại này, việc sắc ký là rất phức tạp và khó khăn. Trong sắc ký khí, pha tĩnh cũng là chất rắn. Nó được nhồi đầy vào cột tách (cột thường), hoặc chỉ là một lớp mỏng bám vào thành trong của cột sắc ký (sắc ký mao quản). Còn pha động là một chất khí, hay một hỗn hợp hai chất khí. Chất khí này mang mẫu vào cột để thực hiện quá trình tách. Nó chuyển động (hay dẫn vào) liên tục trong suất quá trình tách với một tốc độ xác định. Với sắc ký khí, việc thực hiên quá trình sắc ký có thể theo hai kĩ thuật: Giữ nhiệt độ hằng số trong suốt quá trình tách. Thực hiện gradient nhiệt độ trong quá trình tách. Khi tách một hỗn hợp phức tạp chứa nhiều chất có nhiệt độ sôi khác nhau lớn, như các hợp chất tự nhiên, các dược phẩm, …Qúa trình gradient nhiệt độ là rất cấn thiết vì quá trình này tạo điều kiện để các chất tách ra khỏi nhau. 9.6.2. Máy sắc ký khí Máy sắc ký khí là một hệ thống trang bị để thực hiện quá trình sắc ký. Nó bao gồm 6 phần cơ bản: 9.6.2.1. Hệ thống cung cấp khí cho quá trình sắc ký, gồm các regulator, flow meter, gas valves. Hệ thống này phải cấp được dòng khí ổn định cần thiết theo yêu cầu của quy trình phân tích sắc ký. 9.6.2.2 Bộ xylanh bơm mẫu vào cột (sample Valve), có thể bơm được một lượng mẫu chính xác vào cột trong vùng thể tích từ 5-100 µl, và lặp lại được tốt. 9.6.2.3. Cột tách sắc ký. Đây là phần quan trọng nhất, nó quyết định hết quả của sự tách một hỗn hợp tốt hay xấu. Đó là pha tĩnh, chất nhồi cột (packing materials). Tất nhiên, đối với mỗi loại sắc ký, chất nhồi khác nhau về bản chất. Cột sắc ký làm bằng thép, hợp kim đồng, có chiều dài từ 3-5m, đường kính 2,5-4 mm. Cột mao quản làm bằng thủy tinh, chiều dài từ 15-100m, đường kính 0,25-1 mm. 9.6.2.4. Hệ lò nung cột tách và hệ điện tử điều khiển lò nung: có nhiệm vụ làm nóng cột hoặc theo chế độ nhiệt độ không đổi hay chế độ gradient nhiệt độ của sự tách sắc ký yêu cầu. 9.6.2.5. Detector: là nộ phận để phát hiện, nhận biết các chất phân tích dựa theo nhứng tính chất vật lý hóa học nào đó, và ứng với mỗi một tính chất của sự phát hiện, người ta có một loại detector nhất định, ví dụ: 164 - Detector ion hóa ngọn lửa (Flame ionization detector: FIA) - Detector bắt điện tử (Electron capture detector: ECD) - Detector độ dẫn (Conductivity detector: CD) - Detector dẫn nhiệt (Thermal conductivity detector: TCD) - Detector phát xạ nguyên tử (Atomic emission detector: AED) - Trong các loại detector này, loại 1 và 2 được sử dụng phổ biến hơn (bảng 9.5.). Nhưng bất kỳ loại nào cũng phải thỏa mãn những yêu cầu đã nêu trong mục 9.4 ở trên mới có thể dùng được. 9.6.2.6. Bộ phận ghi và chỉ thị kết quả tách sau detector. Nó có thể là một trong các bộ phận sau: - Bộ tích phân kế (Intergrator) - Máy tự ghi (Strip-chart-recorder) - Hay computer with printer - Đó là 6 phần cơ bản cần thiết nhất. Tất nhiên hiện nay có hệ thống máy sắc ký hoàn chỉnh thường có gắn theo máy tính, bộ phận tự động bơm mẫu, bộ phận xử lý kết quả theo chương trình đặt ra, chương trình hóa quá trình sắc ký, …Toàn bộ hệ thống máy sắc ký ta có thể minh họa như trong hình 9.10. Bảng 9.5. Các loại detecter trong GC Loại Ứng dụng Độ nhạy (g) T.tính Noise Khí mang FIA phổ biến 10-13 107 nhỏ H2, Air ECD phổ biến chọn lọc 10-13 107 nhỏ N2, H2 CD Ít 10-10 105 nhỏ N2, Air TCD nhiều 10-8 105 vừa H2, He AED Ít (mới) 10-10 105 lớn, vừa He, Air, N2 TID Ít (mới) 10-8 105 nhỏ, vừa N2 165 Hình 9.10. Sơ đồ khối của thiết bị sắc ký khí 9.6..3. Pha tĩnh trong sắc ký khí Pha tĩnh trong sắc ký khí có thể được chế tạo và sử dụng ở 2 trạng thái rắn và lỏng. Do đó có tên: Gas- Liquid Chr (GLC) và Gas- Solid Chr (GSC). Nếu ở trạng thái lỏng để giữ nó trong cột tách, thì phải tẩm nó trên chất mang trơ rắn. Do đó pha tĩnh chỉ là một lớp màng mỏng xung quanh hạt chất mang trơ. Chất mang trơ là các oxit silica đã hoạt hoá cho trơ và chế tạo thành những hạt hình cầu kích thước Φ = 3÷5µm. Pha tĩnh lỏng thường là các dầu silicon hay các polyeter. Do có cấu tạo như thế nên pha tĩnh loại này có dung tích hấp phụ nhỏ. Mặt khác lại là màng chất lỏng, nên sự tách thường chỉ được dùng ở nhiệt độ thấp. vì thế nó ít được sử dụng hơn pha tĩnh rắn Pha tĩnh rắn là được chế tạo ở dạng các hạt hình cầu hay mảnh nhỏ có Φ= 3÷7 hay 10µm, trên ba loại nền là silica, oxit nhôm, và cao phân tử hữu cơ (polystyrene). Nhưng phổ biến nhất là nền silica, và ứng dụng với loại sắc ký cũng có một loại pha tĩnh riêng, ví dụ pha tĩnh của: - Sắc ký hấp thụ pha thường - Sắc ký hấp thụ pha ngược - Sắc ký trao đổi ion - Sắc ký rây (sàng) phân tử Song sắc ký khí, chủ yếu chỉ có hai loại hấp thụ pha thường và pha ngược là 166 được sử dụng nhiều. Chất nhồi pha thường của sắc ký khí là các silica trung tính được chế tạo trong điều kiện đặc biệt, có dung lượng hấp phụ cao, diện tích bề mặt riêng lớn, độ xốp cao (bảng 9.6). Gần 80% số chất nhồi loại này của các hãng đều sản xuất trên nền silica. Nền thứ hai là nhôm oxit Pha tĩnh của loại hấp thụ pha thường là rất kỵ nước. Nó có bề mặt ưa nước và nước làm mất tính chất sắc ký của bề mặt hấp thụ, qua việc hình thành các cầu hydro của nhóm OH trên bề mặt pha tĩnh với các phân tử nước Chất nhồi cột pha ngược là các silica trung tính đã được ankyl hoa, các nhóm OH trên bề mặt đã bị thay bằng các nhóm ankyl, ví dụ: -CH3, - C2H5, - C3H7, - C18H17, - C18H37, phenyl,…Do đó tính ưa nước không còn nữa. Nên bề mặt sắc ký không còn bị ảnh hưởng bởi độ ẩm nữa. Trong thực tế loại pha ngược được sử dụng phổ biến hơn. Nó thích hợp cho việc tách nhiều loại hợp chất, từ không phân cực đến phân cực (bảng 9.7) Bảng 9.6. Pha tĩnh của GLC Tên Ký hiệu Tmax (C) Để tách Polydimethyl siloxane OV-1; SE-30 350 Hydrocacbon, aromatic, drugs, steroides Poly-(phenyl methyl)- siloxane (10% phenyl) OV-3; SE-52 350 Axit béo, ester, alkaloides halogen compounds, drugs Polyethylene glycol Carbowax20M 250 Axit tự do, alkohols, ethers, oils, glycols Pha tĩnh được nạp vào trong cột tách có thể theo hai cách: - Nhồi đầy cột bằng kỹ thuật rung, cách này cho các cột tách kích thước bình thường (Φ= 2-4mm) và cột thép hay cột đồng - Tẩm thành một lớp bề mặt trong của cột, cách này thường dùng cho các loại cột mao quản bằng thuỷ tinh, đường kính nhỏ hơn 1mm Bảng 9.7.. Ví dụ về pha tĩnh rắn (GSC) Nền (Matrix) Carbowax Chromsorb W Chromsorb G Anachrom Chromsorb N-AW Celite 545 Chromsorb W-AWDMCS Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica 167 9.6.4. Pha động trong sắc ký khí Pha động trong sắc ký khí thường là các chất khí đơn hay hỗn hợp của hai khí. Nó có nhiệm vụ: - Rửa giãi chất phân tích ra khỏi cột - Mang chất phân tích ra khỏi cột Vì thế nhiều người quen gọi là khí mang của GC. Việc chọn chất khí nào làm khí mang là tuỳ thuộc vào: - Bản chất của chất phân tích - Loại detector chọn để phát hiện chất phân tích - Kỹ thuật sắc ký (T= const hay građient T) Các chất khí thường được dùng là hydro, nitơ, heli, argon tinh khiết phải đạt > 99,9% Trong quá trình sắc ký, tốc độ chảy của pha động có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách một hỗn hợp. Nói chung, tốc độ khí thường được sử dụng trong vòng từ 100-250 ml/phut cho nhiều đối tượng mẫu. 9.6..5. Sự lưu giữ của chất Sự lưu giữ của các chất trong cột tách cũng được quyết định bởi các yếu tố như: - Các đặc trưng của pha tĩnh - Bản chất của pha động, thành phần và tốc độ của pha động - Nhiệt độ của quá trình tách. Trong GC yếu tố này cực kỳ quan trọng. Do đó trong nhiều trường hợp người ta phải thực hiện chế độ građient nhiệt độ để thu được kết kết quả tách tốt. 9.6.6. Tối ưu hoá các điều kiện sắc ký Tối ưu hoá các điều kiện sắc ký là quá trình nghiên cứu tìm những điều kiện tách phù hợp nhất cho một hỗn hợp hay một loại hỗn hợp chất cần phân tích. Công việc này chính là xây dựng một quy trình phân tích. Nó bao gồm các vấn đề sau dựa theo chất mẫu phân tích: 1. Chọn loại cột sắc ký: Kích thước, loại pha tĩnh, cột sắc ký thường hay cột mao quản 2. Chọn pha động là chất nào, thành phần và tốc độ của nó 3. Chọn kỹ thuật sắc ký ở nhiệt độ không đổi, hay gradient nhiệt độ liên tục, gradient nhiệt độ từng bậc, từng đoạn cần thiết,.v.v… 168 4. Chọn máy GC với detector phù hợp để phát hiện các chất phân tích với độ nhạy cao 5. Chọn cách xử lý mẫu và lượng mẫu bơm vào cột tách. Ở đây rất quan trọng là dung môi hoà tan mẫu mà không gây ảnh hưởng đến kết quả tách 6. Chọn điều kiện thu ghi sắc đồ của quá trình tách sắc ký của hỗn hợp mẫu Thực hiện hoàn chỉnh 6 công việc này ta sẽ chọn được điều kiện phù hợp cho việc phân tích định lượng một hỗn hợp mẫu đạt kết quả tốt. Nếu làm tất cả những việc trên, mà chất nền (matrix) của mẫu vẫn ảnh hưởng đến quá trình tách, sắc đồ chưa tốt, thì ta phải tìm cách loại bề mặt chất nền của mẫu. 9.6.7. Phân tích định tính Nguyên tắc của phát hiện định tính là dựa vào thời gian lưu (tRi) của các chất trong một điều kiện sắc ký nhất định đã chọn. Vì như ta đã biết, thời gian lưu tRi là đặc trưng cho mỗi chất. Do đó để định tính một hỗn hợp các chất ta phải: - Chạy sắc ký của một hỗn hợp các chất chuẩn để xác định thời gian lưu tRi của các chất đó - Chạy sắc ký của hỗn hợp mẫu phân tích Sau đó so sánh thời gian lưu tRi của các chất trên hai sắc đồ, ta sẽ suy ra trong mẫu phân tích có chứa những chất nào. Như ví dụ trong hình 8.5 ta thấy mẫu sắc đồ chuẩn có các chất X1, X2, X3, X4, X5, còn trong mẫu phân tích chỉ có chất X2, các chất khác không có. Hiện nay với hệ thống máy GC hiện đại,có gắn máy tính và chương trình xử lí số liệu, thì computer đã nhớ sẵn thời gian lưu tRi của chất phân tích, nó sẽ so sánh và thông báo kết quả ngay sau khi chạy sắc lý mẫu phân tích. 169 9.6.8. Phân tích định lượng. Trong quá trình sắc kí, tín hiệu đo được của quá trình sắc ký hoặc là chiều cao của pic hoặc là diện tích của pic sắc ký. Trong những điều kiện sắc kí xác định, thì 2 đại lượng này luôn có quan hệ phụ thuộc vào nồng độ của chất ở trong mẫu. Mối quan hệ này có thể được biểu thị bằng 2 phương trình sau đây: Theo chiều cao H: H = k.c Hay là theo diện tích S: S = k.c Ở đây : H và S là chiều cao và diện tích của pic sắc ký; C là nồng độ của chất trong mẫu; còn k là hằng số, nó được xác định bởi các đìêu kiện sắc ký đã chọn và bản chất của chất phân tích. Đây là 2 phương trình để định lượng trong GC. Trong 2 170 phương trình này, nếu đo H thì phạm vi tuyến tính hẹp với nồng độ C; còn nếu đo S thì quan hệ tuyến tính giữa S và C lớn hơn. Do đó, trong thực tế của phân tích GC người ta hay sử dụng phương trình : S = k.c để định lượng. 9.6.8.1. Phân tích bán định lượng. Ở đây để định lượng, người ta coi tổng diện tích của tất cả các pic sắc ký của các chất trong mẫu phân tích là bằng 100%; Nghĩa là có: St = (S1 + S2 + S3 + … + Si ) = 100 Do đó % của một chất Ci: 100×= St Si Ci % Tất nhiên, ở đây việc coi tổng St = 100 % chỉ là gần đúng. Vì độ nhạy của detector với mỗi chất phân tích là khác nhau. Nên cách này chỉ là bán định lượng mà thôi 9.6.8.2.. Phân tích định lượng Cũng từ 2 phương trình cơ sở trên H=KC và S=KC, muốn định lượng chính xác một chất ta phải dùng phương pháp đường chuẩn. Cách làm cũng tương tự như mọi kỹ thuật phân tích định lượng khác sắc ký lỏng đã nói ở trên. Cụ thể là: 1.Trước hết chuẩn bị 1 dãy mẫu chuẩn của chất phân tích nồng độ Co, C1, C2, C3, C4, C5 trong cùng các điều kiện với các mẫu phân tích Cx (bảng 9.8 ) 2. Chọn các điều kiện ghi sắc đồ của các mẫu chuẩn và mẫu phân tích, ta sẽ có được các cặp giá trị tương ứng giữa S và C hay H và C như trong bảng 9.8 3. Dựng đường chuẩn và xác định giá trị Cx cần tìm (hình 9.11) Bảng 9.8. Các điều kiện dựng đường chuẩn. Nồng độ C0 C1 C2 C3 C4 C5 Cx Giá trị đo S So S1 S2 S3 S4 S5 Sx,… Giá trị đo H Ho H1 H2 H3 H4 H5 Hx,… Nếu mẫu phân tích có thành phần phức tạp chúng ta không thể pha được dãy mẫu chuẩn, thì phải dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn là tốt nhất. Vì với kỹ thuật này chúng ta loại trừ được ảnh hưởng của thành phần nền (matrix) của mẫu . 171 H 1 H 3 H 4 H 5 C 1 C 2 C 3 Cx C4 C5 H2 Hx C H (a) ` CCC1 3 C4Cx C2 (b) Hình 9.11. Đường chuẩn phân tích a. Phương pháp đường chuẩn . b. Phương pháp thêm 9.6.9. Vài ứng dụng của sắc ký khí. Hiện nay sắc ký khí cũng là một kỹ thuật phân tích được sử dụng nhiều để phân tích các chất hữu cơ trong các lĩnh vực của , hoá dầu, hoá dược phẩm, hoá chất tự nhiên , hỗn hợp các hyđrocacbon các loại … 172 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002). Cơ sở hóa học phân tích, NXB KH & KT. 2. Trần Tứ Hiếu (2002), Hóa học phân tích, NXB ĐHQG Hà Nội. 3. Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), Một số phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, Trường Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 4. Phạm Luận (1994), Cơ sở lý thuyết hóa học phân tích, Trường Đại học khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội 5. Hồ Viết Quý (1999), Các phương pháp phân tích quang học trong hóa học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội. 6. В.Н.Алексеев, Количественный анализ, Москва, издательствo “Химия”, 1972 7. H.A. Laitinen, Phân tích hóa học. Tập 1 và 2, Nguyễn Tinh Dung và Nguyễn Huyến dịch. NXB KH & KT, 1976. 8. Ο.Д. Кyρиленко, Краткий спровочник по химий издательствo “наукова думка”, 1974.