Bản chất của kỹ thuật PCR

Họ và tên: Nguyễn Thị Luyến Lớp : K33c – Sinh – KTNN Trường : Đại học sư phạm Hà Nội II BÀI TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Câu hỏi: Nội dung Khái niệm Bản chất của kỹ thuật PCR( phản ứng chuỗi trùng hợp,phản ứng nhờ chuỗi polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo nhân AND với tốc độ nhsnh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt(máy PCR) Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. Nguyên lý Kỹ thuật tổng hợp AND ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép AND trong cơ thẻ như: Đoạn AND cần nhân mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có cặp mồi, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzim AND polymerase. PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base. Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD. Đoạn mồi Đoạn DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới. Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó (Tm-melting) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR -- được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80°C sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C. Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợp tương tự nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là tương tự nhưng không giống nhau. Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin isoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR. Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60% - Tính toán nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50°C và nhiệt biến tính của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10°C - Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50°C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … - Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổ sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp với mẫu. Có cả chương trình hỗ trợ việc thiết kế mồi (xem External links) Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2) (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút. (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút. III. Các thành phần tham gia phản ứng Enzyme - Các đặc tính enzyme DNA polymerase và định nghĩa đơn vị (unit) của mỗi loại (hãng) sản xuất là khác nhau. Cần kiểm tra thông tin trên các tờ hướng dẫn đi kèm hóa chất. - Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích thước phản ứng PCR. Tuy nhiên, thành phần này chỉ nên hiệu chỉnh khi 1) sản phẩm PCR lớn hơn 5kb; 2) có khả năng hoạt tính của enzyme bị giảm sút do thiếu sót ở khâu bảo quản; 3) đã tiến hành hiệu chỉnh bằng nhiều cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc không có gì. - Không nên tăng enzyme quá 2U (5µl) trên 50 µl tổng thể tích phản ứng Việc thay đổi loại DNA polymerase có thể làm thay đổi hiệu suất của phản ứng PCR. - Khi tính toán chiến lược cloning bằng hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA polymerase có đặc tính tạo đầu treo A ở đầu 3' hay không. Nếu không thì cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow và ATP. - Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´→5´ exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase có hay không có hoạt tính này.2. Buffers _Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. _Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt có thể ảnh hưởng đến các phản ứng microarray hoặc DHPLC. _Nhiều loại buffer đã có sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý khi tối ưu hóa nồng độ Mg2+ .3. Nồng độ Mg2+ và dNTP _ Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. _ Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1 lượng nhất định ion Mg2+). _ Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM. _ dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác. 3. Template và Primers _ Nồng độ tối ưu DNA template là từ 1) đối với các mẫu DNA tương đối đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA): 1 pg - 10 ng / 50 µl tổng thể tích phản ứng; 2) đối với mẫu DNA genome thì từ 50 - 500 ng/50 µl tổng thể tích. _ Nồng độ primer thường tối ưu ở 10 mM mỗi loại. 4. Chất khác _ Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase. _ Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống. Một số buffer đã có chứa sẵn loading buffer để có thể điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này không cao.  IV: Chu kỳ phản ứng của PCR Biến tính - Việc tăng nhiệt độ hoặc kéo dài thời gian biến tính có thể làm tăng tính đặc hiệu của PCR nhưng làm giảm tuổi thọ của enzyme DNA polymerase. - Đối với những enzyme DNA polymerase bền nhiệt thường nên sử dụng nhiệt độ biến tính 95°C-98°C. Bao gồm bước biến tính dài lúc khởi đầu và một bước biến tính ngắn trước từng chu kỳ nhiệt. - Đối với các genome lớn như thực vật thường sử dụng bước biến tính dài đến 5 min. Để làm giảm ảnh hướng đối với enzyme thì có thể bổ sung enzyme DNA polymerase sau khi biến tính ban đầu. - Khi đã tối ưu PCR thì cần giảm tối thiểu thời gian biến tính mỗi chu kỳ để tăng lượng sản phẩm. Thông thường từ 10s đến 30s. - Tốc độ gia nhiệt và chế độ điều khiển nhiệt độ ở mỗi hệ thống luân nhiệt (PCR machine, thermocylcer) là khác nhau phụ thuộc hãng sản xuất. Một số hệ thống cho phép thay đổi thông số này khi tối ưu PCR. 2. Bắt mồi - Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. - Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ bắt mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5°C). - Đối với các cặp Tm cao hoặc tự bắt cặp, có loop thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C). 3. Kéo dài - Nhiệt độ kéo dài thường tiến hành ở 72°C tuy nhiên, hoạt tính 5'-3' DNA polymerase vẫn xảy ra ở nhiệt độ 68°C - Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. 1) Đối với DNA đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA) thì tốc độ có thể đạt tới 15s/kb; 2) đối với DNA genome lớn, phức tạp thì tốc độ thường 30s-1min/kb. V. Ứng dụng kỹ thuật PCR - Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn AND riêng biệt. - Chuẩn đoán nhanh, nhạy tất cả các bệnh di truyền và nhiễm trùng( ung thư, virut, vi khuẩn, . . .) - Xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hình sự, quan hệ di truyền thừ những dấu vết rất nhỏ: giọt máu, nước bọt, . . . - Xác định trình tự AND tự động. - Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.