Báo cáo Thực hành kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÁO CÁO THỰC HÀNH KỸ THUẬT DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ Nhóm 1 Giảng viên: TS. Nguyễn Huy Thuần Họ và tên sinh viên: Đỗ Thị Hào MSSV: DTN1153150024 Lớp: 43 CNSH Khoa: CNSH& CNTP Thái Nguyên, 2013 2 Bài 1 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ E. COLI I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử. Điều quan tâm là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy. Cách pha hóa chất. - Dung dịch đệm CTAB: + CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide): 2g + Tris-HCl (pH8): 1,5756 g + EDTA (Na2H2EDTA.2H2O): 0,58448 g + NaCl: 8,14 g + H2O: 100 ml + β-mercaptoethanol: 0,2 ml (chỉ bổ sung ngay trước khi sử dụng) 3 Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng ra DNA. EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡ liên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn. - Dung dịch CIAA: + 24 ml chloroform + 1 ml isoamylalcohol Chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽ làm cho dịch này phân thành 2 lớp( pha). Hỗn hợp ly tâm mạnh để phân tách lớp. Protein bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa. Isoamylancohol là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( NA+, K+, NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA. - Dung dịch TE 1x: + Tris: 0,1212 g + EDTA: 0,03 g + H2O: 100 ml + pH =8.0 - Cồn 70%: + cồn tuyệt đối: 70 ml + H2O: 30 ml Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch mà chúng kết tủa theo DNA. II. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên tắc Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn là như nhau. Tuỳ từng loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ từng mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật tách chiết với các loại hoá chất và dung môi khác nhau. Các phương pháp tách chiết DNA thường được dùng gồm: 1. Phương pháp CTAB 2. Phương pháp PVP 3. Phương pháp phenol/chloroform 4 4. Phương pháp Silica 5. Phương pháp Guanidine-chloroform. Trong phạm vi bài giảng thực hành này sẽ giới thiệu cách tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) - phương pháp 1. Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cải tiến. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn hợp đựng trong các ống Ependorp. Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA. 3.2. Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước) A. Bước 1: Bước chuẩn bị mẫu Lấy 1.5 ml dịch nuôi vi khuẩn E. coli cho vào ống eppendoft 1.5 ml. Ly tâm 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi để thu sinh khối tế bào. Lưu ý trình tự của các mẫu phải sắp xếp phù hợp với số ống eppendorp (phần sau gọi là ống mẫu). Đánh số thứ tự trên eppendorp bằng bút dạ không bị nhòe bởi nước theo thứ tự mẫu (hình 4). B. Bước 2: Tách DNA, loại bỏ protein và các thành phần không mong muốn. + Bổ sung vào eppendorf chứa mẫu đã nghiền 500 µl dung dịch đệm CTAB, đảo trộn đều mẫu bằng máy vortex sao cho mẫu tan đều trong dung dịch đệm. Sau đó ủ ở 60oC trong 1h bằng máy lắc ổn nhiệt (hình 5). Nếu trường hợp không có máy lắc ổn nhiệt thì ủ mẫu trong 60oC trong 1 h, cứ 10 lại lấy ra đảo trộn đều 1 lần bằng máy vortex. + Sau 1 h, lấy eppendorf chứa mẫu ra, ly tâm nhẹ để toàn bộ dung dịch lắng xuống đáy ống. Sau đó bổ sung 500 µl dung dịch CIAA, đảo trộn bằng máy vortex trong vòng 30 giây. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Chú ý: đặt eppendorf phải đối xứng nhau trong máy ly tâm (hình 6). Trong trường hợp số lượng ống eppendorf lẻ, cần phải thêm 1 ống khác có trọng lượng tương đương làm đối trọng. + Sau khi ly tâm, nhẹ nhàng lấy mẫu ra khỏi máy ly tâm rồi đặt vào giá để eppendorf. Lúc này trong ống eppendorf có sự phân 3 pha bao gồm: pha dưới là dung dịch, pha giữa là phần cặn xác tế bào và pha trên là dung dịch chứa DNA hòa tan . 5 + Dùng micropipette 200 µl hút nhẹ nhàng 300 µl dung dịch ở pha trên sang ống eppendorf 1,5ml vô trùng mới. Chú ý: không được hút phần cặn tế bào ở pha giữa. Tốt nhất là không nên hút hết toàn bộ phần dung dịch pha trên. C. Bước 3: Kết tủa DNA + Bổ sung vào eppendorf 50 µl CH3COONa 3M (pH5.5) và 300 µl isopropanol. Dùng micropipette 200 µl đảo trộn đều toàn bộ khối dung dịch trong ống eppendorf. Lưu ý: dùng micropipette hút lên xuống khối dung dịch thật nhẹ nhàng với tốc độ chậm để tránh dung dịch bị bắn ra ngoài. + Ly tâm nhẹ để khối dung dịch lắng xuống phía dưới của ống eppendorf. + Đặt eppendorf chứa mẫu DNA vào tủ lạnh -20oC trong 2h. + Sau 2 h, lấy eppendorf chứa mẫu ra khỏi tủ lạnh, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút. + Sau khi ly tâm, dùng micropipette cẩn thận loại bỏ toàn bộ phần dung dịch sau cho không được hút phần cặn DNA bám dưới đáy ống eppendorf (màu trắng đục). Sau khi hút phần dung dịch lần thứ nhất có thể đặt eppendorf vào máy ly tâm rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để toàn bộ phần dung dịch bám trên thành ống di chuyển xuống phía đáy ống rồi hút loại bỏ hoàn toàn phần dung dịch. D. Rửa kết tủa DNA. + Bổ sung vào eppendorf 1000 µl dung dịch cồn 70% rồi đảo trộn mạnh bằng máy vortex sao cho phần cặn DNA long ra khỏi đáy ống. + Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Dùng micropipette 200 µl hút loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% ra khỏi ống. Ly tâm ống 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ hoàn toàn dung dịch cồn 70% khỏi ống lần 2. + Mở nắp eppendorf rồi để khô tự nhiên kết tủa DNA cho đến khi trong eppendorf không còn mùi cồn và khô hoàn toàn (khoảng 10-15 phút) ở nơi sạch, thoáng, không có người qua lại. Tốt nhất là để khô tự nhiên kết tủa DNA trong tủ Hood. E. Hòa tan DNA 6 + Bổ sung vào eppendorf chứa kết tủa DNA 100 µl dung dịch đệm TE 1x. rồi đảo trộn bằng máy vortex. Ủ eppendorf ở 70oC trong 10 phút trên máy lắc ổn nhiệt. F. Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agaro Kết quả thu được của nhóm 1: Hình 1: Điện di tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn E.coli Nhận xét: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứt gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như protein, không bị lẫn RNA, mẫu số 6 thành công nhất, sau đó mẫu số 2,7,8 và 9 chấp nhận được, các mẫu còn lại tương đối, mẫu số 3,4,5 lẫn tạp khá nhiều protein. - Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, không có DNA bị đứt gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như protein, không bị lẫn RNA. - Giếng số 2:Lượng DNA thu được ít ( hình ảnh bị mờ nên không nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường chạy điện di. - Giếng số 3: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn lẫn tạp chất như protein và RNA, DNA bị đứt gãy. 7 - Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA không bị đứt gãy, tuy nhiên còn lẫn tạp nhiều protein và RNA ở cuối đường chạy điện di. - Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA không bị đứt gãy, tuy nhiên còn lẫn tạp nhiều protein và RNA ở cuối đường chạy điện di. - Giếng số 6: Tách chiết DNA tổng số thành công, DNA không bị đứt gãy, không lẫn RNA và protein. - Giếng số 7: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường chạy điện di. - Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp chất protein bị dính ở miệng và giếng và RNA ở cuối đường chạy điện di. - Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số thành công, băng vạch gọn nhỏ, lượng DNA thu được ít,( hình ảnh bị mờ nên không nhận xét được DNA có bị đứt gãy không), ngoài ra bị lẫn tạp chất protein khá nhiều bị dính ở miệng giếng, tuy nhiên giếng 9 không bị lẫn RNA. IV. Giải thích Nguyên lí của quá trình tách chiết phá vỡ tế bào vi khuẩn E.coli: - Phá vỡ tế bào , màng tế bào và mô. - Loại bỏ tạp chất không phải DNA ( Protein, lipid, đường…) - Phá vỡ tế bào bằng cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh hơn để phá vỡ liên kết, lực cơ học đảo trộn bằng máy vortex. - CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào. Màng tế bào là lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan. Trong dung dịch đệm có các thành phần: - Tris- HCl: ổn định pH. 8 - EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+ canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động. - Khi bổ sung CTAB thì ủ ở 65ºC trong 1h và 10 phút đảo trộn 1 lần. - CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ở nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh hơn khi có ái lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt động trong trường hợp có NaCl). - CIAA bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ protein và các thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB. - Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả năng tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ trợ khả năng kết tủa protein, hỗ trợ sự phân pha. Sau khi bổ sung CIAA ly tâm thì có hiện tượng phân pha ( 3 pha). + Pha trên : Là DNA. + Pha giữa: Chứa protein. + Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform. - CH3 COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả năng hòa tan DNA, bổ sung isopropanol sẽ kết tủa được DNA, phân tách và thu được DNA ( CH3 COONa, CH3 COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn). - Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa vì DNA bị hòa tan trong nước không hòa tan trong cồn. Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn 70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng cồn xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn. Nếu còn cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo. - Hòa tan DNA bằng TE 1X hoặc nước khử ion, nước khử ion và TE 1X đều có thể hòa tan tủa DNA nhưng ít khi sử dụng nước khử ion vì rửa tủa bằng TE 1X hiệu quả hơn có thể bảo quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme giúp bảo quản được lâu. Hạn chế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các enzyme các phản ứng sinh học phân tử sau này. Cho nên sử dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phản ứng sinh học sau này. Sử dụng TE 1X là được. 9 Bài 2 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DNA BẰNG QUANG PHỔ KẾ I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Phương pháp định lượng acid nucleic được sử dụng phổ biến nhất là phương pháp quang phổ do tính tiện dụng và chỉ số tin cậy ở mức cho phép. II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1 Thiết bị, dụng cụ - Máy đo OD bước sóng 260 và 280 nm - Pipet - Đầu tip các loại - Cuvet 2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất - Nước khử ion III. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên lý Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự hấp thụ tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Một dung dịch chứa càng nhiều acid nucleic, hay nói cách khác nồng độ acid nucleic càng cao, thì càng hấp thụ nhiều ánh sáng. Do đó nồng độ acid nucleic được tính theo tương quan giá trị mật độ quang học tại bước sóng 260 nm (Optical Density260nm - OD260). Một đơn vị OD260 tương ứng với nồng độ 50 µg/ml đối với dung dịch chứa DNA mạch kép và 40 µg/ml đối với RNA và DNA mạch đơn. 3.2. Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị cuvet. - Lấy cuvet ra khỏi dung dịch bảo vệ. Rửa sạch bằng nước cất 2 lần. Bước 2: Chuẩn bị blank - Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 1 cuvet Bước 3: Bố trí dãy pha loãng 10 - Lấy 2 ml nước khử ion cho vào 3 cuvet khác, sắp theo thứ tự 1,2,3. - Lấy 20 µl DNA cho vào cuvet thứ nhất, trộn đều bằng pipet - Lấy 20 µl từ cuvet thứ nhất cho sang cuvet thứ 2, trộn đều - Lấy 20 µl từ cuvet thứ hai cho sang cuvet thứ 3, trộn đều Bước 4: Đo OD bằng máy - Chọn chế độ đo OD 260/280 - Đưa cuvet blank vào, chuẩn hóa - Lần lượt đưa cuvet 1,2,3 vào và đo OD, ghi lại kết quả Bước 5: Tính toán và kết luận - Từ số liệu thu được, tính toán nồng độ DNA trong dung dịch gốc bằng cách nhân với 1000. - Dựng đường chuẩn với 3 điểm - Kết luận về độ sạch của DNA dựa trên chỉ số OD260/280. IV. Nhận xét: Đã sử dụng mẫu 16 ( tách DNA tổng số khá thành công) để tiến hành trong bài này , tuy nhiên do nhân tố chủ quan nên mẫu không cho được kết quả. 11 Bài 3 ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng và hàm lượng DNA. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. II. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 2.1 Thiết bị, dụng cụ - Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá và bể điện di, lược tạo giếng điện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel. - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt để đun agarose - Lò vi sóng - Ống eppendorp loại 2 ml - Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm bản gel - Máy lắc - Máy soi gen - Máy chụp ảnh (nếu có) 2.2. Hóa chất và cách pha hóa chất - Agarose - TAE 1X. TAE 1X được pha từ TAE 50X stock bao gồm: + 242 gam Tris base (FW = 121) + 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng) + 100 ml EDTA (pH = 8) + Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít. Khi pha 1X sẽ cần 1 ml dung dịch 50X stock + 9 ml nước cất. - Ethydium Bromide Solution nhuộm ở nồng độ 0,5% (0,5 μl/ml) 12 - Dye 6X. Dye 6X được pha loãng từ Dye 10X. Trong đó 10X sample buffer stock bao gồm: 50% glycerol, 0,25% bromophenol, 0,25% xylene cyanole FF và pha trong 1 x TAE buffer. Ví dụ: Để pha được 10 ml Dye 10X cần: + 5ml glycerol + 0,25% x 10 gam bromophenol + 0,25% x 10 gam xylene + Còn lại là 1 x TAE 10 ml Dye 6X sẽ được pha từ 6 ml Dye 10 X + 4 ml nước cất. III. NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 3.1. Nguyên lý Dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. 3.2. Các bước tiến hành - Bước 1: Pha 0,8 gam agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng. Lưu ý khi đun bằng bình chịu nhiệt có nắp không được đậy nắp kín, hoặc đun bằng cốc thủy tinh chỉ nên đổ khoảng 2 phần 3 thể tích cốc nhằm tránh tràn khi sôi. Đun sôi để nguội đến 60oC (khi có thể dùng tai cầm được bình đựng agarose là được) mới tiến hành đổ bản gel. - Bước 2: Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm dễ hút nước sau đó mới cài lược. Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di. Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá . Đổ bản gel, bản gel trong bài thực hành này có kích thước dài 10 cm, rộng 6,5 cm và cao 0,4 cm. Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa được 0,8 μl mẫu. Do vậy mỗi bản gel cần đổ 50 ml. Đợi khoảng 1 giờ cho khô và tháo lược (hình 9 và 10). - Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể. - Bước 4: Đặt bản gel (hình 10) vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt dung dịch TAE 1X, để được bản gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung dịch điện di. - Bước 5: Lấy 10 μl ở các mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Dye 6X bằng các ống eppendorp mới (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA được trộn đều với Dye 6X. Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ở ống vào giếng điện di bằng 13 micropipet. Ghi chép lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng. Mỗi ống mẫu được dùng một đầu côn hút riêng. Khi tra mẫu vào giếng, một tay tỳ lên thành giá của điện di làm điểm dựa, tay kia đưa micropipet sao cho đầu côn vừa sát miệng giếng rồi bơm từ micropipet ra. Cần lưu ý thao tác này nếu không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng . - Bước 6: Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút (hình 12). Lúc này quan sát bằng mắt thường có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương. Trên hình 12 là bộ điên di Power station - 300 do hãng Labonet của Mỹ sản xuất năm 2002. - Bước 7: Lấy bản gel từ bể điện di ra nhuộm trong ethydium bromid 0,5μl/ml trong 10 phút, thao tác nhuộm được thực hiện trên máy lắc, tốc độ chậm, chỉ khoảng 50-70 vòng/phút. Lưu ý khi mang bản gel nhuộm cần cẩn thận vì ethydium bromid rất độc hại với người và môi trường. Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng bằng thìa to, dạng bản, có cán dài.. (hình 13) để đưa bản gel vào khay nhuộm, lấy ra khỏi khay, mang rửa lại bằng nước sạch, đến khi đưa bản gel lên máy soi. - Bước 8: Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi đó các axít nucleic trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium bromid. Chất này có khả năng xen gắn vào giữa các bazơ của axít nucleic làm chúng phát sáng dưới dạng những vạch màu đỏ cam, dễ quan sát và chụp ảnh. IV. Nhận xét: - Điện di xác định độ tinh sạch, nguyên vẹn của DNA nhưng chỉ định tính ( có hay không, nhiều hay ít, sáng hay mờ). Băng sáng thì nhiều, băng mờ thì ít. - Xác định độ tinh sạch: Lẫn tạp protein, RNA, protein điện tích không rõ ràng thường bám vào DNA. - Độ nguyên vẹn hoàn toàn không có nghĩa là toàn bộ đoạn DNA mà là các dải đứt gãy lớn đảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng). 14 Bài 4 KỸ THUẬT PCR I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích PCR (Polymerase Chain Reaction) lần đầu tiên được Karl Mulis mô tả năm 1984. Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ. PCR được thực hiện khi có khuôn, Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ thể nào. II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT 2.1. Dụng cụ - Lò vi sóng - Cân điện tử - Bình chịu nhiệt 500 ml - Ống PCR - Máy ly tâm - Máy lắc - Máy PCR - Bộ điện di - Máy soi gen 2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng PCR - Enzyme Taq polymerase - Buffer PCR - MgCl2 PCR - Nước cất đã khử ion - Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi “sens primer” hay “forward primer” và mồi ngược “antinsens primer” hay 15 “reverse primer”, chúng là những đoạn DNA mạch đơn ngắn (olgonucleotide) có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu 3’ theo chiều phiên mã của gen. - dNTP gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP và dGTP - Ethydium bromid III. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên lý Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ. PCR được thực hiện khi có khuôn, Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxyribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. 3.2. Các bước thực hiện - Bước 1: Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppendorp loại 1.5 ml và đưa vào ống PCR với thể tích 25μl đến 50μl, cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ (spin) 3000 vòng/phút. Bước này nhằm để các thành phần nêu trên lắng xuống đáy ống PCR. Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR như sau: TT Thành phần phản ứng Hàm lượng (µl) 1 10x Buffer 2,5 2 25 mM MgCl2 1,5 3 Primer F 1,0 4 Primer R 1,0 5 100 µM dNTPs 1,5 6 5U DNA taq polymerase 0,2 7 DNA khuôn 2,0 8 H2O khử ion 15,3 Tổng 25 Bước 2: Chạy PCR khuếch đại vùng trình tự gen mục tiêu Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: - Biến tính ban đầu: 94oC trong 5 phút - Khuếch đại: 35 chu kỳ gồm các bước: 16 + Biến tính: 94oC trong 30 giây + Gắn mồi: 55oC trong 30 giây + Kéo dài: 72oC trong 45 giây - Kéo dài cuối cùng: 72oC trong 5 phút - Ủ bảo quản: 4oC trong ∞ Dưới đây là mô tả và cách vận hành trên máy PCR - System - 9700 của do hãnh Applied Biosystem của Mỹ sản xuất năm 2002. - Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong 40 phút. - Bước 4: Nhuộm bản gel trong ethydium bromid 10 phút - Bước 5: Soi và chụp ảnh (Sử dụng các bước trong bài 2). IV. Kết quả thu được: Nhận xét: Mẫu 2 và 4 thành công, mẫu 1 và 3 không thành công. 17 Bài 5 TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Sản phẩm PCR của bài 5 sẽ được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. Điều kiện tiên quyết của sản phẩm PCR là phải sạch, không lẫn các sản phẩm phụ và không còn sót các thành phần khác của PCR như enzyme, muối, dNTP... Bài thực hành này sẽ thực hiện thao tác tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cho qua cột. II. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên tắc Một số thí nghiệm như giải trình tự gene cần nguồn DNA có độ tinh khiết cao. Tinh sạch qua cột là cách làm phổ biến nhất để đáp ứng yêu cầu này. Bài thực hành này dựa trên nguyên lý sắc ký chọn lọc kích thước. Dung dịch chứa DNA hòa tan chảy qua một mạng lưới cấu tạo bởi các lỗ nhỏ và các hạt hấp thụ. Các phân tử nhỏ như muối và các nucleotide riêng lẻ sẽ chui vào trong các hạt hấp thụ, còn các phân tử lớn như các phân đoạn acid nucleic sẽ đi qua các lỗ. Đây là một phương pháp khá nhanh và đơn giản để tinh sạch acid nucleic. 3.2. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR Bước 1: Chuẩn bị mẫu và cột - Bổ sung 5 lần thể tích Buffer PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR. Trộn đều bằng pipet. Ví dụ: bổ sung 200µl Buffer PB vào 20 µl sản phẩm PCR. - Đặt cột vào ống chứa 2 ml. Bước 2: Bám DNA lên cột - Chuyển hỗn hợp DNA ở bước 1 lên cột bằng micropipette 500 ml. - Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút. - Loại bỏ dung dịch trong ống thu 2 ml. Bước 3: Rửa trôi các thành phần không mong muốn - Bổ sung 750 µl Buffer PE lên cột. - Ly tâm 10,000 vòng/phút trong 30 giây. - Chuyển cột sang ống eppendoft 1.5 ml mới. - Loại bỏ cột thu 2 ml. 18 Bước 4: Đẩy DNA ra khỏi cột và thu nhận - Dùng micropipette 100 µl để nhỏ 20 µl Buffer EB vào chính giữa của màng. - Ly tâm 12,000 v/p trong 4 phút. - Loại bỏ cột. Bước 5: Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agarose IV. Kết quả: Mẫu không lên sản phẩm , lỗi có thể do hóa chất hoặc thao tác trong quá trình thực hiện. 19 Bài 6 CẮT DNA BẰNG ENZYME GIỚI HẠN I. MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM Mục đích Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết phosphodiester ngay tại đó. Bài thực tập này cho phép sinh viên sử dụng enzyme giới hạn HindIII để cắt vector pRSET-A từ dạng mạch vòng thành dạng mạch thẳng. II. DỤNG CỤ HÓA CHẤT 2.1. Dụng cụ - Bể ổn nhiệt - Ống eppendoft 1.5 ml - Micropipet các loại - Máy ly tâm - Bộ điện di - Máy soi gen 2.1. Hóa chất và các thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn - Enzyme giới hạn ECoRI - Buffer - Plasmid pRSET - Nước khử ion - Và bao gồm toàn bộ các thành phần của bài điện di. III. CÁCH TIẾN HÀNH 3.1. Nguyên lý Endonuclease giới hạn hay còn gọi là enzyme giới hạn là những enzyme có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết phosphodiester ngay tại đó. Enzyme giới hạn ECoRI có 1 vị trí nhận biết duy nhất trên vector do đó khi cắt vector này sẽ bị chuyển từ dạng mạch vòng sang dạng mạch thẳng và phân biệt được trên bản gel điện di. 20 3.2. Các bước thực hiện - Bước 1: Trộn các thành phần đã nêu trên trong ống eppendorp loại 1.5 ml, cho vào máy ly tâm ở tốc độ nhẹ (spin). Bước này nhằm để các thành phần nêu trên lắng xuống đáy ống. Thành phần hỗn hợp phản ứng cắt enzyme HindIII: TT Thành phần phản ứng Thể tích (µl) 1 10x Buffer 1,5 2 Plasmid pRSET 2,5 3 ECoRI 0.5 4 H2O 1,0 Tổng 15 - Bước 2: Ủ phản ứng ở 37oC trong 1h để enzyme hoạt động. - Bước 3: Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong 40 phút. IV. Kết quả: Nhận xét: Cắt bằng enzyme giới hạn thành công, đã được cắt sau điện di cho ta hình ảnh 1 vạch chứng tỏ enzyme đã đã cắt plasmid thành công. ( Giếng số 2,3 và 5,6).