Báo cáo Trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3

quả sau mỗi ngày sử dụng hoặc khi kiểm tra thường xuyên - Thêm khoảng 5 ml dung dịch EDTA và 2 ml dung dịch acid clohidric vào 100ml nước, cho hỗn hợp chảy qua cột với tốc độ khoảng lOml/phút - Khi bình trên đỉnh đã cạn hết, rửa sạch cột bằng nước, dung dịch clohisric và nước. Nếu cột vẫn còn chưa đáp ứng khả năng thì lặp lại qui trình. 4.2.19.6 Chuẩn bị mẫu thử: Cho sữa bột vào hộp chứa có nắp đậy kín và có dung tích lđn gấp đôi thể tích sữa. Đóng ngay nắp hộp. lắc kỹ hỗn hợp bằng cách lắc và đảo chiều hộp liên tục. 4.2.19.7 Phần mẫu thử: Cân 10g mẫu thử chính xác tđi 0,0001 g và cho vào bình nón 4.2.19.8 Chiết và tách protein: - Thêm chính xác 112 ml nưđc ấm (từ 50°c đến 55°C) vào phần mẫu thử và dùng đũa thủy tinh để khuấy hoặc lắc bình để tan hết - Thêm theo thứ tự sau: 24 ml dung dịch kẽm sunfat, 24ml dung dịch kali hecxaxyanoferat (II) và 40 ml dung dịch đệm, xoay sau mỗi lần thêm. - Để yên ít nhất là 15 phút nhubg không quá 1 giờ. Sau đó lọc qua giấy lọc thu dịch lọc vào bình nón dung tích 250 ml. 4.2.19.9 Khử nitrat thành nitrit: - Dùng pipet lấy 20ml dịch lọc cho vào bình chứa trên đỉnh cột khử, thêm 5ml dung dịch đệm vào bình này và dùng đũa thủy tinh để khuấy lắc. Thu nước thoát ra vào bình định mức dung tích 100ml. - Khi bình chứa trên đỉnh đã cạn hết, rửa thành bình với khoảng 15 ml nước và khi nước đã chảy hết rửa lại lần nữa bằng 15ml nước khác. Sau khi phần nưđc lần thứ hai này chảy hết sang cột, đổ đầy nước vào bình và cho nưđc chảy qua cột với tốc độ lớn nhất - Sau khi đã thu được 10ml nước thoát ra lấy bình định mức ra và thêm nưđc cho tđi vạch và lắc đều 4.2.19.10 Xác định: - Dùng pipet lấy các thể tích như nhau của nước lọc và nước thoát ra cho vào các bình định mức dung tích 100ml riêng biệt, thêm nưđc vào mỗi bình để thu được thể tích khoảng 60ml. Sau đó xử lý lượng chứa trong mỗi bình. - Thêm 6ml dung dịch II và sau đó thêm 5 ml dung dịch I. Lắc cẩn thận và để yên dung dịch trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời. SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 88/109 - Thêm 2ml dung dịch III, lắc cẩn thận và để yên dung dịch 5 phút ổ nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trực tiếp của mặt trời. Thêm nước tới vạch và lắc đều. - Đo độ hấp thụ của dung dịch trong 15 phút so với độ hấp thụ của dung dịch của các thuốc thử trắng ở bước sóng 538 nm 4.2.19.11 Thử mẫu trắng: Tiến hành thử mẫu trắng của thuốc thử, sử dụng tất cả các thuốc thử nhưng không dùng phần mẫu thử. 4.2.19.12 Đường chuẩn: - Dùng pipet lấy 0-2-4-6-8-10-12-16 và 20ml dung dịch chuẩn natri nitrit cho vào các bình định mức dung tích 100 ml riêng biệt. Thêm nưđc vào mỗi bình đến thể tích khoảng 60 ml. - Đo độ hấp thụ của các dung dịch so với độ hấp thụ của dung dịch thứ nhất (không chứa natri nitrit) có bước sóng 538 nm trong vòng 15 phút - Vẽ đồ thị các độ hấp thụ thu được, tương ứng với các nồng độ của nitrit, microgam trên ml, tính được từ các lượng dung dịch chuẩn natri được thêm vào. 4.2.19.13 Biểu thị kết quả: 20000xcl - Hàm lượng nitrít: — mxV Trong đó: cl: là nồng độ của ion nitrit thu được từ đường chuẩn, tương ứng với độ hấp thụ đo được của dung dịch thu được khi sử dụng dịch lọc, tính bằng microgam trên lít. m: là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam V: là thể tích lấy từ dịch lọc tính bằng ml Ghi kết quả chính xác đến 0,1 mg/kg -Hàm lượng nitrát: Hàm lượng nitrat của mẫu thử, biểu thị bằng mg ion nitrat (NO2 ) trên kg được tính theo công thức: mxV Trong đó: c2: là nồng độ của ion nitrat thu được từ đường chuẩn, tương ứng với độ hấp thụ đo được của dung dịch thu được khi sử dụng nước thoát ra, tính bằng microgam trên lít. NO2: là hàm lượng nitrat của mẫu thử được, tính bằng mg/ kg m: là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam V: là thể tích lấy từ nước thoát ra tính bằng ml Ghi kết quả chính xác đến 0,1 mg/kg 4.2.19.14 Báo cáo: Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Nó cùng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định này của tiêu chuẩn hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với tất cả các tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả. CÁC CHỈ TIÊU KIỂM TRA VI SINH: SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 89/109 4.3.1 Phát hiện Salmonella (phương pháp chuẩn) theo TCVN 6402:1998: 4.3.1.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp phát hiện Salmonella trong sữa và sản phẩm sữa 4.3.1.2 Định nghĩa: - Salmonella là các vi sinh vật tạo nên các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường đặc chọn lọc và khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này thì cho thấy các đặc tính sinh hóa và huyết thanh đã được mô tả - Phát hiện Salmonella là việc xác định sự có mặt hay không của loại vi sinh vật này trong một khối lượng hay một thể tích cụ thể, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 4.3.1.3 Nguyên tắc: - Khái quát: Việc phát hiện Salmonella cần thực hiện bốn giai đoạn liên tục - Tiềm năng sinh trong môi trường lỏng: cấy phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh thích hợp và nuôi cấy ấm ở 37°c từ 16h đến 20h. - Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: cấy dịch cấy thu được vào môi trường tetrathionat và môi trường selenit xystin và nuôi môi trường tetrathionat ở 43°c và môi trường selenit xystin ở 37°c trong hai giai đoạn từ 18h đến 24h. - Ria cấy lên đĩa và nhận dạng: Từ các dịch cấy thu được, cấy hai môi trường đặc chọn lọc. Nuôi cấy môi trường đặc chọn lọc này ở 37°c và kiểm tra sau 20h đến 24h, nếu cần, sau 40h đến 48h kiểm tra sự có mặt của các khuẩn lạc được coi là Salmonella theo các đặc tính của chúng. - Khẳng định: Các khuẩn lạc được coi là Salmonella sẽ được cấy truyền tiếp và khẳng định qua các thử nghiệm sinh học và huyết thanh học. 4.3.1.4 Môi trường cây: - Nguyên liệu chính ■ Để làm tăng độ tái lập của kết quả, nên sử dụng các thành phần chính khô, các môi tníờng hoàn chỉnh khô để chuẩn bị các môi trường nuôi cấy. Cần tuân thủ nghiêm ngặt các hướng dẫn của nhà sản xuất khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy ■ Các hóa phẩm sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy là loại phân tích ■ Nước sử dụng phải là nưđc cất hoặc nước đã khử ion, không chứa các chất có thể ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong các điều kiện thử nghiệm. ■ Đo pH bằng pH mét ■ Nếu môi tníờng cấy và thuốc thử chưa sử dụng ngay thì phải bảo đảm chỗ tối và ở nhiệt độ từ 0°c đến 5°c nhưng không quá 1 tháng và trong các điều kiện không làm biến đổi thành phần của chúng, trừ khi có qui định khác. Môi trường và thuốc thử: SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 90/109 - Chuẩn bị: Hoà tan các thành phần trong nước bằng cách đun sôi Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 7,0 ±0,1 ở 25°c, khử trùng môi trường này bằng hấp áp lực 15 phút ở nhiệt độ (121 ±l)°c Dùng phối môi trường này một cách vô trùng vào các bình thí nghiệm vô trùng có dung tích thích hợp để có được các phần mẫu thử cần thiết cho thử nghiệm. > Môi trường tăng sinh chọn lọc thứ nhất( môi trường tetrathionat): - Chuẩn bị: Thêm các thành phần cơ bản khô hoặc phần cơ bản hoàn chỉnh khô trong nước và đun sôi cho đến khi hòa tan hết các thành phần có thể tan được. Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 7,0 ±0,1 ở 25°c, khử trùng phần cơ bản bằng hấp áp lực 15 phút ở nhiệt độ (121 ±l)°c. 4.3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử: Chuẩn bị mẫu thử từ mẫu thí nghiệm 4.3.1.6. Cách tiến hành: - Khái quát: Cho phần mẫu vào môi trường tiền năng sinh - Sữa không cần thiết phải tiền tăng sinh đối với sữa. Tiến hành tiếp theo qui định, sữa phần mẫu thử 25 ml và môi trường tăng sinh 225 ml. - Sữa bột chuẩn bị một bình thí nghiệm có nút đựng 225ml nưđc cất cố thêm lml dung dịch xanh brilian. Cân 25g mẫu thử một cách vô trùng và đổ lên bề mặt chất lỏng đựng trong bình đậy kín. Không lắc, để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút ±10 phút trước khi đem nuôi ấm. Không chỉnh pH. - Bột của dung dịch tách ra khi sản xuất phomat và bơ, bột bơ loãng. Cân 25g mẫu thử một cách vô trùng cho vào 1 bình thí nghiệm có nút chứa 225ml nước cất vô trùng. Lắc cho đến khi hòa tan và thêm lml dung dịch xanh brilian. - Lactoza cân 25g mẫu thử một cách vô trùng cho vào 1 bình thí nghiệm có nút chứa 225ml môi trường tiền tảng sinh và lắc cho đến tan > Môi trường tiền tăng sinh: nước đệm pepton Thành phần Pepton: 10,0 g Natri clorua: 5,0g Diatri hidrooctophotphat ngậm 12 phân tử 9,0g nưđc (Na2HP04.12H20) Kali hidrooctophotphat (KH2PO4) 1,5 g Nước: 1000 ml môi trường căn bản: Thành phần cao thịt: 5,0 g Pepton: 10,0 g Natri clorua: 3,0 g Canxi cacbonat: 45,0 g Nước 1000 ml SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 91/109 - Casein, phomat cân 25g mẫu thử một cách vô trùng cho vào cốc đựng mẫu vô trùng của mẫu nghiền trộn và thêm 225ml môi trường tiền tăng sinh ở nhiệt độ (45 ±l)°c. Trộn cho đến khi phần mẫu thử phân tán đều (từ 1 phút đến 3 phút). Giữ nhiệt độ không được vượt quá 45° - Bơ làm tan chảy mẫu (một lượng nhiều hơn 25g) trong 1 cốc đựng vô trùng trên nồi cách thủy đã điều chỉnh nhiệt độ từ (45 ±l)°c. lắc mẫu thử đã tan chảy và dùng pipet đã được làm ấm đến khoảng 45°c lấy 25 ml phần mẫu thử cho vào bình thí nghiệm có chứa 225 ml môi trường tiền tăng sinh và trộn. - Sản phẩm đông lạnh (kể cả kem thực phẩm) làm tan chảy mẫu (lđn hơn 25g) trong 1 cốc đi vô trùng trên nồi cách thủy đã chỉnh nhiệt độ ở (45 ±l)°c. Dùng pipet lấy 25g mẫu thử cho vào bình thí nghiệm cố chứa 225ml môi trường tiền năng sinh và trộn - Sữa lên men, sữa chua, bánh kem và món tráng miệng, cân 25g mẫu thử một cách vô trùng vào bình thí nghiệm có nút chứa bi thủy tinh và 225ml môi trường tiền tăng sinh và cho tan - Nuôi ấm, nuôi ấm các bình thí nghiệm đã chuẩn bị trong khoảng thời gian 16 h đến 20 h, trong tủ ấm ở nhiệt độ (37 ±l)°c. - Ria cấy và đọc số liệu: ■ Dùng que cấy vòng lấy từ một bình thí nghiệm mộy vòng đầy ria cấy lên bề mặt 1 đĩa môi trường chọn lọc thứ nhất và lên bề mặt môi trường chọn lọc thứ hai sao cho thu được các khuẩn lạc phân tích tách tốt. Tiếp tục nuôi cấy các bình thí nghiệm ■ Nuôi cấy các đĩa từ 20h đến 24h trong tủ ấm ở nhiệt độ (37 ±l)°c. ■ Sau khi nuôi ám hơn các bình thí nghiệm trong khoảng từ 18h đến 24h, lặp lại việc cấy và qui định nuôi ấm. ■ Sau khi nuôi ấm, kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc Salmonella điển hình trên các đĩa. Nếu các khuẩn lạc mọc yếu và không điển hình cho Salmonella, nuôi ấm tiếp tục các đĩa trong 20h đến 24h nữa trong tủ ấm ở nhiệt độ (37 ±l)°c.và kiểm tra lại các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc Salmonella điển hình. ■ Các khuẩn lạc Salmonella điển hình có thể có các đặc tính sau: o Trên môi trường đặc chọn lọc thứ nhất các khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu nâu hoặc màu đen có ánh kim. Một số chủng cho ra các khuẩn lạc xanh lá o Trên thạch xanh brillianư đỏ phenol các khuẩn lạc Samonella điển hình có màu hồng với vùng môi trường bao quanh đỏ tươi. SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 92/109 Màu đen Có bọt hoặc có vết nứt Đăt thach nghiêng Màu vàng: Màu đỏ hoặc không đổi màu Khẳng định: chọn các khuẩn lạc để khẳng định o Lấy năm khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa của từng môi trường chọn lọc o Nếu trên một đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ, thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó xem khẳng định o Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lọc lên bề mặt các đĩa thạch dinh dưỡng đã được làm khô trước sao cho các khuẩn lạc mọc phân tách rõ ràng o Nuôi cấy các đĩa đã cấy thời gian từ 18h đến 24h trong tủ ấm ở nhiệt độ (37 ±l)°c. lấy các khuẩn lạc thuần khiết đễ khẳng định đặc tính sinh hóa và huyết học. Khẳng định đặc tính sinh hóa : (bảng 4.3.1) o Nuôi cấy, dùng que cấy vòng từ mỗi giống vi khuẩn thu được từ các khuẩn lạc o Ria cấy lên bề mặt nghiêng của thạch và chích sâu vào mặt thạch. Nuôi cấy trong tủ 24h đặt ở nhiệt độ (37 ±l)°c. Diễn giải sự biến đổi ở các môi trường như sau: Cốt thach Màu vàng: glucoza dương tính (không lên men glucoza) màu đỏ hoặc không đổi glucoza âm tính (không lên men glucoza) màu có tạo thành sunfua hiro sinh khí từ glucoza lactoza và xacaroza dương tính (có sử dụng lactoza hoặc xacaroza lactoza và xacaroza âm tính (có sử dụng lactoza hoặc xacaroza 4.3.1.7 Các giống vi khuẩn cây để kiểm chứng: Để kiểm tra về khả năng đảm bảo cho Salmonella phát hiện của các môi trường tăng sinh và nhận biết cần cấy một giống Salmonella chuẩn vào các bình thí nghiệm chứa hai loại môi trường tăng sinh, tiếp tục theo tiến hành với các bình kiểm tra như đối với các giống vi khuẩn cấy thử nghiệm để chứng minh rằng giống vi khuẩn đối chứng dương tính có thể phát triển được . Báng 4.3.1: Suy luận các phép thử khẳng định Các phản ứng Tự dính kết Các phản ứng Suy luận sinh hóa huyết thanh SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 93/109 SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 94/109 4.3.I.9. Báo cáo kết quả: Báo cáo kết quả phải ghi số hiệu của tiêu chuẩn này và kết quả thu được. Cũng phải nêu tên môi trường đặc chọn lọc thứ hai đã sử dụng và tất cả các điều kiện thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, được xem là tùy ý, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả. 4.3.2 Định lượng E.coli giả định (kỹ thuật đếm số’ có xác suất lớn nhất) theo phương pháp TCVN 6846: 2001: 4.3.2.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này đưa ra hướng dẫn chung để định lượng E.coli giả định có trong thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng và tính số có xác suất lớn nhất, sau khi ủ ở 35°c hoặc 37°c (nhiệt độ này cần thỏa thuận các bên có liên quan) sau đó ủ ở 45°c. 4.3.2.2 Định nghĩa: E.coli giả định: vi khuẩn ở 45°c lên men lactoza và sinh khí và ở 45°c sinh ra idol từ tryptophan, khi phép thử được tiến hành theo phương pháp được qui định trong tiêu chuẩn này. 4.3.2.3 Nguyên tắc: - Nuôi cấy ba Ống môi trường tăng sinh lỏng chọn lọc nồng độ kép với một lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác - Nuôi cấy ba Ống trường tăng sinh lỏng nồng độ đơn vđi lượng mẫu thử qui định nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng hoặc với một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu các sản phẩm ở dạng khác - ủ ấm các ống môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép ở nhiệt độ 35°c hoặc 37°c (theo thỏa thuận) trong 24h -48h. Xét nghiệm các ống sinh khí - Từ các ống môi trường nồng độ đơn và nồng độ kép đã sinh khí, nuôi cấy một loạt các Ống mới chứa môi trường lỏng chọn lọc. - ủ ở 45°c từ 24h - 48h và xét nghiệm loạt Ống nghiệm mới về sinh khí. Điển hình Không Kháng thể o, Vi hoặc H dương tính Các chủng được coi là Salmonella Điển hình Không tất cả phản ứng âm tính Có thể là Salmonella Điển hình Có Không thử Phản ứng không điển hình Không Kháng thể o, Vi hoặc H dương tính Phản ứng không điển hình Không tất cả phản ứng âm tính Không được coi là Salmonella 4.3.1.8 Biểu thị kết quả: Theo kết quả suy luận, ghi lại sự có mặt hay không có mặt Salmonella trong phần mẫu thử xác định theo đơn vị khối lượng tính bằng gam hay thể tích, tính bằng ml mẫu thử SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 95/109 - Từ các ống môi trường chọn lọc đã sinh khí khi cấy một loạt các Ống nghiệm mới chứa nước trypton - ủ ở 45°c từ 24h-48h và xét nghiệm loạt Ống nghiệm mới về sinh indol 4.3.2.4 Môi trường nuôi cây, dung dịch pha loãng và thuốc thử: - Dịch pha loãng và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm trong điều kiện xét nghiệm - Canh thang tryptoza sunfat môi trường tăng sinh chọn lọc - Thành phần: 4.3.2.5 Chuẩn bị: - Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng nếu cần. Chình pH sao cho sau khi thanh trùng pH met chính xác đến 0,1 đơn vị pH ở 25°c - Phân phối từng lượng môi trường lOml vào các Ống có kích thưđc 16 mm X 16 mm chứa Ống Durham đối với môi trường nồng độ kép - Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 121°c trong 15phút - Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi thanh trùng. 4.3.2. Ó. Ong canh thang EC (môi trường chọn lọc thứ hai): - Thành phần: Môi trường nồng độ Tryptoza Lactoza Dikali hidro phosphat (k hpo ) Natri clorua Natrilauryl sanfat Nước kép 10,0g 5,5 g 5,5 g 10,0 g 0,2g 1000 ml đơn 5,0 g 2,75 g 2,75 g 5,0 g 0,1g 1000 ml Tryptoza hoặc trypticaza Lactoza Muối mật Dikali hidro phosphat (k2hpo4) Kali hidro phosp hat (KH2P o4) Natri clorua Nước 20,0g 5,0g l,5g 4,0g 1,5g 5,0g 1000 ml - Chuẩn bị: tương tự như phần 4.3.2.5 Nước trypton a) Thành phẩn Trypton 10,0g Natri clorua 5,0 g Nước 1000 ml b). Chuẩn bị: giống như phần 4.3.2.5 4.3.2.7. Thuôc thử indol: a) 1 rhành phần: 4-Dimetylaminobenzaldehyd 5,0g 2-Metyl butan-1 hoặc pentan-i-ol 75,0ml Axit hydrocloric (p20 =1,18 đến 1,19 g/ml) 25,0 ml SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 96/109 b) Chuẩn bị: Hòa tan 4-Dimetylaminobenzaldehyd trong cồn bằng cách đun nhẹ trong nồi cách thủy, duy trì ở nhiệt độ khoảng từ 50°c - 55°c. Làm nguội và thêm axit. Bảo quản tránh ánh sáng và giữ ở nhiệt độ khoảng 4°c. Thuốc thử phải có màu vàng sáng hoặc nâu sáng 4.3.2.8. Lấy mẫu: Phòng thí nghiệm phải nhận được mẫu đại diện trung thực, không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản. Phương pháp lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến lấy mẫu sản phẩm thì các bên liên quan nên thỏa thuận vđi nhau về vấn đề này. 4.3.2.9. Chuẩn bị mẫu thử: Chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn cụ thể thích hợp đối vđi sản phẩm có liên quan, nếu không có tiêu chuẩn cụ thể các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này. 4.3.2.10. Cách tiến hành: - Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng - Kỹ thuật MPN: ■ Cấy môi trường tăng sinh chọn lọc: o Lấy ba Ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet mới vô trùng chuyển lml mẫu thử nếu là chất lỏng, hoặc 10ml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác, vào mỗi Ống nghiệm trên o Sau đó, lấy ba Ống nghiệm môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn. Dùng pipet mđi vô trùng chuyển lml mẫu thử, nếu là chất lỏng hoặc lml huyền phù ban đầu, nếu các sản phẩm ở dạng khác vào mỗi Ống nghiệm trên o Đối với mỗi dịch pha loãng tiếp theo (từ 10"1 đến 10"2 tương ứng vđi mẫu thử) tiến hành nồng độ đơn ở trên. Dùng pipet mới vô trùng cho mỗi dung dịch pha loãng. Trộn kỹ chất nuôi cấy vào môi trường. ■ Ú ấm: Ú các Ống môi trường chọn lọc nồng độ kép và các Ống môi trường đơn chọn lọc trong tủ ấm ở nhiệt độ 35°c hoặc 37°c trong 24 h±2h. nếu ở giai đoạn này, hoặc sinh khí hoặc là không rõ ràng, nếu khí được tạo thành thì ủ tiếp đến 48 h±2h o Nuôi cấy môi trường chọn lọc thứ hai: Từ mỗi Ống đã được ủ và biểu hiện sinh khí, dùng vòng que cấy 10 ml môi trường chọn lọc thứ hai đã được đun nóng trước hết đến 45°c o ủ lần hai: ủ các Ống đã được ủ trong nồi cách thủy có nhiệt độ 45°c trong 24 h±2h. Nếu ở giai đoạn này không sinh khí thì ủ trong 48h o Nuôi cấy nước trypton: Từ mỗi ống đã được ủ và biểu hiện sinh khí dùng vòng que cấy vào môi trường nước trypton đã được đun nóng trước đến 45°c. ủ các ống đã được nuôi cấy trong nồi cách thủy có nhiệt độ 45°c trong 48h 4.3.2.10.1. Thử sinh indol: Thêm 0,5 ml thuốc thử indol vào các ống chứa nước trypton đã được nuôi cấy trộn kỹ và xét nghiệm sau 1 phút 4.3.2.10.2. Diễn giải: Đối vđi mỗi dịch pha loãng, tiến hành đếm số lượng các ống có SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 97/109 màu đỏ trong pha cồn, chứng tỏ có indol (các Ống dương tính). 4.3.2.11. Biểu thị kết quả: - Chọn dịch pha loãng: có 2 trường hợp sau: ■ Trường hợp 1: Chọn dịch pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu thấp nhất) lên men ba Ống dương tính cùng với hai dịch pha loãng cao hơn tiếp theo (tức là những dịch pha loãng có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/10 của dịch loãng đầu tiên được chọn). Nếu pha loãng các dịch tiếp theo mà không đủ tạo nên dịch pha loãng cao nhất để lên men ba Ống dương tính thì cần chọn để thay ba dịch pha loãng cao nhất trong các loại (tức là những dịch pha loãng có nồng độ mẫu thấp nhất). ■ Trường hợp 2: Trường hợp 1 không thể áp dụng. Chọn ba dịch pha loãng cao nhất trong loạt dịch pha loãng (tức là những dịch pha loãng có nồng độ mẫu thấp nhất) trong số đó có ít nhất một Ống cho kết quả dương tính. 4.3.2.12 Trường hựp đặc biệt: Trong tất cả các tníờng hợp, khi có nhiều hơn một trong ba dịch pha loãng được chọn và không lên men các Ống dương tính, chọn từ các dịch pha loãng này dịch pha loãng thấp nhất không lên men các Ống dương tính và hai dịch pha loãng thấp hơn tiếp theo trong các dịch pha loãng, trừ khi các Ống dương tính chỉ được thấy ở mức dịch pha loãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu. Trong trường hợp cuối, nếu cần thiết, chọn ba dịch pha loãng đầu tiên để tính MPN, thậm chí các loạt pha loãng này bao gồm hai dịch pha loãng không lên men các ống dương tính 4.3.2.13. Xác định chỉ sô' MPN: - Kiểm tra theo số lượng mẫu đã được xét nghiệm theo từng lô, khi tần suất của số lượng ống dương tính ứng với các độ pha loãng được chọn có thể chấp nhận được theo phương pháp thống kê. Sự chấp thuận phụ thuộc vào cả số lượng được kiểm tra và phụ thuộc cả quyết định có chấp nhận hay không chấp nhận theo các kết quả cấp hạng. - Đối với mỗi tần suất tìm được để chấp nhận, để có được chỉ số MPN 4.3.2.14. Tính toán số’ xác suất lớn nhất (MPN): - Lấy số E.coli giả định trên ml hoặc trên gam của sản phẩm bằng cách nhân chỉ số MPN vđi nghịch đảo của độ pha loãng thấp nhất đã được chọn (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất). - Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn ứng với các Ống đã được chuẩn bị với môi trường nồng độ kép (nuôi cấy với 10ml) tníđc hết chia chỉ số MPN cho 10 - Biểu thị kết quả bằng một số nằm trong khoảng từ 1,0 và 9,9 nhân vđi 102, trong đó X là luỹ thừa - nếu MPN nhỏ hơn 0,3 vi sinh vật trên ml hoặc g và nếu sử dụng qui trình thích hợp đối với số E.coli giả định thấp, biểu thị kết quả theo cách sau: ‘’không có E.coli SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 98/109 giả định trong 1 ml hoặc trong 1 g sản phẩm) 4.3.2.15. Báo cáo thử nghiệm: Báo cáo thử nghiệm phải qui định phương pháp đã sử dụng, nhiệt độ ủ ấm và kết quả thu được, báo cáo thử nghiệm cũng phải cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố ảnh hưởng đến các kết quả thử. 4.3.3. Định lượng đơn vị khuẩn lạc nấm men và nấm mốc theo phương pháp TCVN 6265:1997: 4.3.3.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ nấm men và nấm mốc nhìn thấy trong sữa và sản phẩm sữa bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 25°c 4.3.3.2 Định nghĩa:Nấm men và nấm mốc các vi sinh vật ở 25°c dưđi các điều kiện qui định trong tiêu chuẩn này tạo thành các khẩun lạc. 4.3.3.3 Nguyên tắc: - Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc và một lượng mẫu thử xác định nếu như sản phẩm dạng lỏng, hoặc dạng huyền phù ban đầu khi sản phẩm dạng khác. Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, với các dung dịch pha loãng thập phân hoặc huyền phù từ mẫu thử - Nuôi ấm các đĩa 5 ngày d 25°c trong môi trường có không khí - Tính số đơn vị khuẩn lạc tạo thành của nấm men và nấm mốc trong 1 gam hoặc trong 1 ml sản phẩm từ số khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn ở mức độ pha loãng sao để có được kết quả đúng 4.3.3A Môi trường cao men/ dextroza/ oxitetraxiclin/ thạch: a) Môi trường cơ bản: - Thành phẩn: Bôt cao men 5,0g Dextroza (CtìH^Otì) 20,0 Tha ch 10 g đến 15 g SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 99/109 Nước 900 ml - Chuẩn bị: Hoà tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước đun nóng, nếu cần chỉnh pH để đạt sau khi khử trùng pH là 6,6 ở 25°c Khử trùng bằng hấp trong nồi hấp áp lực ở 121°c ±l°c khoảng 15 phút b) Dung dịch Oxitetraxiclin: - Chuẩn bị: Làm nguội môi trường cơ bản đã khử trùng tới 45°c. Ngay trước khi sử dụng đưa dung dịch OxitetraxicHn về 45°c và cho 10 ml dung dịch này vào 90 ml môi trường cơ bản 4.3.3.5 Cách tiến hành: - Để tăng độ chính xác của phương pháp, việc chuẩn bị các dung dịch pha loãng phải được chuẩn hóa cần thận. Những yếu tố tác động độ chính xác là: ■ Kiểu loại thiết bị khuấy trộn ■ Thời gian khuấy trộn ■ Chất pha loãng ■ Thời gian để cho các hạt tơ lắng xuống ■ Thời gian trộn cho phép khi chuẩn bị các dung dịch loãng thập phân - Cấy và nuôi ấm: ■ Lấy hai đĩa petri vô trùng. Dùng một pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử, nếu là dạng lỏng, hoặc lml chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác ■ Lấy tiếp hai đĩa petri vô trùng. Dùng một pipet vô trùng khác, cho vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10“1 (sản phẩm ở dạng lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10"2 (sản phẩm ở dạng khác). ■ Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo ■ Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường chứa oxitetraxiclin hoặc môi trường chứa cloramphenicol đã được làm cho nóng chảy từ trước và giữ ở 45 °c - Thành phẩn: Oxitetraxiclin hidroclorua (C22lỈ3oN20ii).HCl 50 mg Nước 50 ml - Chuẩn bị:Hoà tan Oxitetraxiclin trong nước. Chuẩn bị dung dịch mới trước mỗi lần sử dụng. Khử trùng dung dịch bằng cách lọc. c) Môi trường hoàn chỉnh: - Thành phần: _______________________________ _________________ Oxitetraxiclin hidroclorua (C22H3oN20ii).HC1 10 ml Môi trường cơ bản 90 ml SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 100/109 trong nồi cách thủy SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 101/109 ■ Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa petri và để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách đặt các đĩa petri này trên một mặt phẳng nằm ngang, mát. ■Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy vđi môi trường không được vượt quá 15 phút ■Chuẩn bị đủ số đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng ■ Lật ngược các đĩa đã cấy xong và đặt chúng vào tủ ấm 4 ngày, ỏ nhiệt độ 25 c. o Phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên trên bề mặt các đĩa đã cấy sau khi đã đông đặc hoặc o Nhỏ thêm một giọt glixerol lên trên giấy lọc của nắp đĩa ■ Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau, cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm. 4.3.3. Ó. Đọc kết quả: - Đếm số khuẩn lạc trong mỗi đĩa, tránh đếm nhầm các khuẩn lạc mọc bất thường. Nếu cần, phân biệt các khẩun lạc nấm men và nấm mốc dựa trên cơ sở đặc tính hình thái sinh vật. - Chỉ giữ lại các đĩa có từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Nếu các phần của đĩa bị nấm mốc che phủ, hoặc nếu khó có thể các khuẩn lạc riêng biệt thì đếm các khuẩn lạc trong các đĩa có độ pha loãng cao hơn tiếp theo, thậm chí số khuẩn lạc đó có thể ít hơn 4.3.3.7. Trong trường hỢp như thế tiến hành: ■Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau: - ít hơn 10 CFU của nấm men và nấm mốc có trong một mililit - ít hôn 10 X 1/d CFU của nấm men và nấm mốc có trong một gam (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của chất huyền phù ban đầu ■Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 150 khuẩn lạc thì số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 150 nhất và nhân số này với số nghịch đảo của hệ số pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo ”số lượng đơn vị khuẩn lạc CFU nấm men và nấm mốc ưđc tính trong một gam hoặc một mililit sản phẩm’ ’. 4.3.3.8. Biểu thị kết quả: - Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất là 10 khuẩn lạc, nhiều nhất là 150 khuẩn lạc - Tính sô' CFU của nấm mốc và nấm men, N trong 1 gam hoặc trong 1 mililit sản phẩm, theo công thức: Y c N - ------ ^ ------- (nl + 0,ln2)xd Trong đó: ZC: là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại nl: là số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc n2: là số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc d: là hệ số pha SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 102/109 loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất - Nếu có nhiều hơn hai độ pha loãng có thể đếm được, cho kết quả từ 10 đến 150 khuẩn lạc thì công thức phải được sửa đổi, có tính đến những độ pha loãng tiếp theo đó. Với ba độ pha loãng thì theo công thức: N = ---------- ^ ------------- («1 + 0,1«2 + 0,01«3 )xd Trong đó: n3: là số đĩa của độ pha loãng thứ ba có chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc - Làm tròn số kết quả thu được đến 2 chữ số có nghĩa. Khi số cần làm tròn là 5 mà không có chữ số có nghĩa nào đúng theo sau thì làm tròn đúng tníđc chữ số 5 cho thành số chẩn. Thí du: 28 500 là làm tròn thành 28000 - Lấy kết quả là số CFU nấm mốc và nấm men có trong 1 ml hoặc trong 1 gam sản phẩm biểu thị bằng số từ 1,0 đến 9,9 nhân vđi 10*, trong đó X là lũy thừa tương ứng của 10. Thí du: Việc đếm khuẩn lạc CFU của nấm men và nấm mốc cho kết quả sau (hai đĩa poetri cho mỗi độ pha loãng đã được ủ) -Độ pha loãng thứ nhất (102) được giữ lại chứa 83 và 97 khuẩn lạc - Độ pha loãng thứ hai (103) được giữ lại chứa 33 và 28 khuẩn lạc N = zc/ (ri! + 0,1 n2) d = 83 + 97 + 33 + 28/ -[2+(0,1x2)] 10-2 = 241/ 0,022 = 10 954 Làm tròn kết quả như hướng dẫn trên thu được 11 000 hoặc 1,1 X 104 CFU của nấm men và nấm mốc có ữong một gam, hoặc một mililit sản phẩm. - Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử (sản phẩm lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc thì báo cáo kết quả như sau: -ít hơn 10 CFU của nấm men hoặc nấm mốc có trong một ml (sản phẩm lỏng) -ít hơn 10 X 1/d CFU của nấm men hoặc nấm mốc có trong một g (sản phẩm dạng khác), trong đó d là hệ số pha loãng của chất huyền phù ban đầu. - Nếu tất cả các đĩa đều chứa nhiều hơn 150 khuẩn lạc thì tính số lượng ước tính từ các đĩa có số khuẩn lạc gần 150 khuẩn lạc và nhân số này với số nghịch đảo của hệ số pha loãng cao nhất. Báo cáo kết quả theo ”số lượng đơn vị khuẩn lạc CFU nấm men hoặc nấm mốc ước tính trong một gam hoặc một mililit sản phẩm”. 4.3.3.9 Báo cáo kết quả: Báo cáo kết quả phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng, kết quả thử nghiệm thu được và phương pháp biểu thị đã sử dụng. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết không qui định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy ý lựa chọn cùng vđi các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả. SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 103/109 4.3.4. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo phương pháp TCVN 5165-90: 4.3.4.1 Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± l°c trong thời gian từ 48 đến 72 giờ. SỐ lượng vi khuẩn hiếu khí trong lg hoặc lml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng 4.3.4.2 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu: Lượng mẫu cân tối thiểu để pha loãng không ít hơn lml đối với sản phẩm lỏng và 10 + 0,1 g đối với các sản phẩm khác. 4.3.4.3 Hóa chất: - Thạch dùng cho vi sinh vật; Pepton dùng cho vi sinh vật; Cao thịt - Natri clorua tinh khiết (NaCl); Trypton; Clucoza tinh khiết; - Natri hydrophophat tinh khiết (Na2ĨỈP04) - Kali dihydrophophat tinh khiết (KH2PO4) - Natri hydroxit tinh khiết (NaOH), dung dịch 0,1 N 4.3.4.4 Môi trường: Cách pha chế: Đun sôi để hoà tan các chất. Để nguội đến 30±5°c. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1 N sao cho sau khi tiệt khuẩn pH = 7,0 ±0,2. Rót vào các bình dung tích 250 ml mỗi bình 90 ml, vào các Ống nghiệm mỗi Ống 9 ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120°c trong 15 phút. Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo quản nơi khô ráo, trong bóng tối, ở nhiệt độ từ 0 đến 5°c không quá 30 ngày, c) Môi trường thạch thường: Để nguội môi trường đến 55±5°c, điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn pH = 7,0 ±0,2. Rót vào các bình thủy tinh lượng môi trường không quá 1/ 2 dung tích bình. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 °c trong 15 phút. Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45±l°c ở nồi cách thủy, nếu chưa sử Nưđc đệm pep ton: Pepton, g NaCl, g Na2HP04,g kh2po4, g Nưđc cất, mL 10 5 9 1,5 1000 b) NƯđc pepton: Pepton, g NaCl, g Nưđc cất, mL 1 8,5 1000 Pepton, g NaCl, g Cao thịt, s Glucoza,g Thạch, g Nước cất, mL 10 5 5 1 15-20 1000 d) Môi trường thạch thường: Trypton, g Cao men, g Glucoza,g Thạch, g Nưđc cất, mL 5 2,5 1 15-20 1000 Cách pha chế: Đun nhỏ lửa, quyấy đều để hòa tan các chất đến khi sôi. SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 104/109 dụng thì cần bảo quản ở nơi khô ráo, trong bóng tối với nhiệt độ từ 0 đến 5°c không quá 30 ngày. Trước khi nuôi cấy đun cách thủy cho môi trường nóng chảy và để nguội đến 45+1 °c 4.3.3.S Các bước nuôi cây: 4.3.3.5.1 Pha loãng mẫu: Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm độ pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên đĩa theo dự tính. 4.3.3.5.2 ĐỖ dĩa: - Đối với mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng. - Lấy lml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri - Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch c hoặc d, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. - Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang - Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút - Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên bề mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên mặt. 4.3.3.5.3 ủ ấm - Khi thạch đã đông, lật sáp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30+1 °c từ 48 đến 72 giờ. - Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức. 4.3.3. Ó Tính kết quả Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố của khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. Tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa theo công thức sau: Ỹc N = ------ ^ -------- («1 + 0,\xn2)xd Trong đó: C: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn nl, n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2 d hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1 4.3.5 Phát hiện Listeria monocytogen theo phương pháp TCVN 6401-98: 4.3.5.1 Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện Listeria monocytogens trong sữa và sản phẩm sữa. 4.3.5.2 Định nghĩa: - Listeria spp: các vi sinh vật tạo thành các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 105/109 đặc chọn lọc và cho thấy rõ các đặc tính hình thái học, sinh lý và sinh hóa như mô tả, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này - Listeria monocytogen: là một loài Listeria gây bệnh và có thể phân biệt với loài Listeria không gây bệnh khác có mặt trong sữa và sản phẩm sữa bằng các đặc tính sinh hóa nhất định - Phát hiện Listeria monocytogen: là việc xác định sự có mặt hay không của các vi sinh vật này trong một khối lượng hay một thể tích được qui định, khi tiến hành thử theo tiêu chuẩn này. 4.3.5.3 Nguyên tắc: - Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc: cấy phần mẫu vào môi trường chọn lọc và nuôi ấm ở 30°c trong 48h - Phân lập và nhận dạng sơ bộ: cấy từ mẫu thử trong môi trường tăng sinh vào môi tníờng phân lập, nuôi ấm ở 37°c và sau 48h kiểm tra sự có mặt các khuẩn lạc được coi là Listeria spp giả định theo dáng vẻ bên ngoài - Khẳng định: cấy truyền các khuẩn lạc Listeria spp giả định lên một môi trường đặc không chọn lọc và khẳng định bằng các thử nghiệm hình thái, sinh lý và sinh hóa 4.3.5.4 Môi trường chọn lọc (môi trường tăng sinh): a) Môi trường cơ bản: Hòa tan các thành phần khô hoặc môi trường cơ bản hoàn chỉnh khô trong nưđc bằng cách đun sôi. Nếu cần, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,3 ở nhiệt độ 25°c. Phân phối từng lượng 225 ml vào các bình thí nghiệm dung tích 500ml (hoặc các bội số của 225ml vào các bình thí nghiệm có dung tích thích hợp). Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121°c - Thành phần Canh thang tripton đậu tương, g Cao men, g Nước, mL 30 6 1000 - Chuẩn bị: b) Phần bố sung 1: Thành phần: Chuẩn bi: Acriflavin hidroclorua 23 mg Hòa tan Acriílavin hidroclorua trong nước. Khử trùng qua lọc Nước 10 lĩiL c) Phần bổ sung 2: Thành phần: Chuẩn bi: Axit nalidixic (muối natri) 46 mg Hòa tan Axit nalidixic trong dung dịch natri hidroxit. Khử trùng qua loc Natri hidroxit (0,05 mol/1) 10 lĩiL SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 106/109 e) Môi trường hoàn chỉnh: Bảo quản riêng môi trường cơ bản và các phần bổ sung đã chuẩn bị chỗ tối ở nhiệt độ từ 2°c đến 5°c. Chuẩn bị môi tníờng hoàn chỉnh bằng cách thêm: lml của phần bổ sung 1; 2ml của phần bổ sung 2 và 2ml của phần bể sung 3 vào 225 ml môi trường cơ bản. 4.3.5.5 Môi trường phân lập (thạch Oxford): 4.3.5.7 Cách tiến hành: a) Cấy vào môi trường tăng sinh: Cho phần mẫu vào môi trường tăng sinh - Sữa bột: cân 25 ml mẫu thử một cách vô trùng cho vào bình thí nghiệm có nút, chứa 225 ml môi trường tăng sinh. Lắc để hòa tan. - Nuôi ấm: môi trường tăng sinh đã được cấy mẫu trong tủ ấm ở 30°c -48h - Phân lập và nhận dạng sơ bộ: • Dùng que cấy vòng, ria cấy mẫu đã nuôi ở trên lên bề mặt đĩa thạch Oxford để thu được các khuẩn lạc tách biệt rõ ràng • Lật sấp đĩa và đặt vào tủ ấm để ở 37°c trong 48h • Kiểm tra đĩa cấy sự có mặt các khuẩn lạc listeria spp đặc tníng - Khẳng định: • Chọn các khuẩn lạc để khẳng định: Từ mỗi đĩa môi trường phân lập chọn d) Phẩn bổ sung 3: Thành phần: Chuẩn bi: Xicloheximid 57,5 mg Hòa tan Xicloheximid trong hỗn hợp Etanol/ nước. Khử trùng qua lọc Etanol 4mL Nước 6 lĩiL Thành phần: Chuẩn bi: Môi trường thạch Columbia cơ bản 39 g Hòa tan các thành phần rắn trong nước bằng cách đun sôi Aesculin 1 g Amoni sắt (III) xitrat 0,5 g Liti clorua 15* Nước 1000 mL b) Mỏi trường cơ bán: Thành phần: Chuẩn bi: Xicloh eximid:200mg Fosfomixin : 5 mg Hòa tan các thành phần rắn trong hỗn hợp etanol/ nước. Khử trùng qua lọc Colistin sunfat: 10mg Etanola : 2,5 mg Acriflavin : 2,5mg Nước : 2,5 mL Xefotetan : lmg c) Môi trường hoàn chỉnh: Lấy 5ooml môi trường thạch cơ bản. Khử trùng 15 phút trong nồi hấp ở nhiệt độ 121°c. Làm nguội 50°c, vô trùng. Độ ph của môi trường là 7,0 ở 25°c 4.3.5.Ó Thuốc thử: dung dịch hidro peroxit, 3% (v/v) SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 107/109 năm khuẩn lạc điển hình hoặc có nghi ngờ, nếu có ít hơn năm khuẩn lạc như trên thì tất cả để thử khẳng định. • Nuôi ấm: Ria cấy các khuẩn lạc đã chọn lên bề mặt đĩa thạch TSYEA sao cho các khuẩn lạc mọc phân tách rõ. đặt các đĩa này trong tủ ấm ở 37oC trong 24h, hoặc cho đến khi có các khuẩn lạc mọc. Độ dày của lđp môi trường thạch (15ml/đĩa) là quan trọng đối với độ rọi Herry tốt b) Diễn giải các đặc tính hình thái và sinh lý và phản ứng sinh hóa: tất cả các chủng listeria spp đều là các trực khuẩn nhỏ, gram dương (chỉ vđi các mẫu cấy 24h tuổi) có tính chuyển động trong tiêu bản ướt và môi trường di động. Chúng là các chủng listeria spp, catalaza dương tính, L.monocytogens chuyển hóa ramnoza nhưng không chuyển hóa xyloza, L.monocytogens, L.ivanovii và L. seeligeri (phản ứng yếu) tạo tan máu ß khi cấy trong thạch máu. lấy khuẩn lạc này để kiểm tra tính tan máu ở mặt dưới khuẩn lạc. Trong ba chủng listeria spp làm tan máu, chí có L.monocytogens không chuyển hóa xyloza và dương tính với ramnoza (bảng 4.3.5) - — không phản ứng 4.3.5.8 Biểu thị kết quả: báo cáo sự có mặt hay không listeria monocytogens trong phần mẫu thử, ghi rõ mẫu thử theo khối lượng bằng gam, hoặc theo thể tích bằng mililit 4.3.5.9 Báo cáo kết quả : báo cáo ghi rõ, phương pháp lấy mẫu, phương pháp sử dụng, kết quả thu được. 4.3.6 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo phương pháp TCVN 5165-90: 4.3.6.1 Phạm vi áp dụng: phương pháp định lượng coliform bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng và tính số có xác suất lớn nhất (MPN) sau khi nuôi cấy ở 30°c. có thể áp dụng cho sữa bột, sản phẩm sữa đông lạnh, sữa dạng lỏng ... 4.3. Ó.2 Định nghĩa: Coliíorm là các vi khuẩn ở nhiệt độ 30oC tạo thành các khuẩn lạc đặc trưng và có thể lên men lactoza kèm theo sự sinh hơi trong các điều kiện. 4.3. Ó.3 Nguyên tắc: - Nuôi cấy một phần mẫu thử hoặc một lượng từ một loạt mẫu thử pha loãng theo hệ thập phân vào từng dãy ba Ống môi trường nuôi cấy lỏng chọn lọc đã qui định có Báng 4.3.5 các phán ứng nhận biết Listeria spp Các loại Sinh axit Thử CAMP Ramnoza Xyloza S.aureus R. equi L.monocytogens + - + - L. innocua V - - - L.ivanovii - + - + L. seeligeri - + (+) - L.welshimeri V + - - L.murrayi V - - - V = phản ứng có thể thay đổi (+) = phản ứng yếu + = phản ứng dương tính SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 108/109 chứa Ống Durham - Nuôi ấm các ống nghiệm ở 30 °c trong 48h - Lấy từ các ống nghiệm coi là dương tính nghĩa là các Ống cho thấy có sự sinh hơi trong Ống Durham trong canh thang lục sáng mật lactoza,cấy truyền lên bề mặt thạch eosin xanh metylen - Nuôi ấm ở 30°c trong 24h 4.3. Ó.4 Chất pha loãng và môi trường 4.3.6.4.1 Nguyên liệu chính: Để làm tăng độ tái lập của kết quả, nên sử dụng các thành phần khô hoặc các môi trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị các chất pha loãng và các môi trường nuôi cấy. Các hóa phẩm phải đạt chất lượng phân tích. Nước sử dụng phải là nuđc được cất bằng dung cụ thủy tinh hoặc nước đã khử ion. Nưđc này không được chứa các chất có thể ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật trong các điều kiện thử. 4.3. Ó.4.2 Chất pha loãng: - Dung dịch pepton/ muối: ___________________________________________ 4.3. Ó.5 Phân phối, khử trùng và bảo quản chất pha loãng: Phân phối chất pha loãng dùng cho độ pha loãng ban đầu vào các bình hoặc các lọ, phân phối chất pha loãng dùng cho các độ pha loãng tiếp theo vào các ống nghiệm hoặc các lọ nhỏ. Lượng được phân phối sau khi khử trùng chứa trong mỗi bình hoặc lọ phải là 90 ml chất pha loãng hoặc một bội số của 90 ml và mỗi ống nghiệm hoặc lọ nhỏ phải chứa 9,0 ml chất pha loãng. Đậy nắp các Ống nghiệm, bình hoặc lọ. 4.3.6. Ó Cách tiến hành: 4.3.6.6.1 Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu: Để ttánh làm ảnh hưởng các vi sinh vật do thay đổi nhiệt độ đột ngột, nhiệt độ của chất pha loãng trong suốt quá trình thao tác: Thành phần Pepton, g Natri clorua (NaCl), g Nước, mL 1,0 8,5 1000 Chuẩn bị: Hoà tan các thành phần trong nưđc, đun nóng nếu cần. Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ±0,1 ở 25°c - Dung dịch pepton: Thành phần Pepton, g Nước, mL 1,0 1000 Chuẩn bị: Hoà tan pepton trong nưđc. Điều chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,0 ±0,1 ở 25°c SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 109/109 > Sữa và các sản phẩm sữa dạng lỏng: - Trộn mẫu thử thật kỹ sao cho các vi sinh vật phân bố càng đều càng tốt bằng cách đảo chiều lọ chứa liên tục 25 lần. cần phải tránh tạo bọt hoặc để bọt tan hết. Khoảng thời gian từ khi trộn đến khi lấy phần mẫu thử không quá 3 phút - Dùng pipet lấy lml mẫu thử và cho vào 9 ml chất pha loãng. Lắc đều dung dịch pha loãng ban đầu này. Như vậy thu được dung dịch pha loãng 10“1 4.3.6. Ó.2 Dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo: - Dùng pipet sạch lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu cho vào 1 Ống nghiệm khác chứa 9 ml chất pha loãng vô trùng, không để pipet tiếp xúc với chất pha loãng. Mỗi lần phải sử dụng một pipet mới - Trộn kỹ hoặc bằng cách dùng pipet sạch hút thả 10 lần để thu được dung dịch pha loãng 10"2. - Nếu thấy cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10“2 và các dun dịch pha loãng tiếp theo để nhận được dung dịch pha loãng 10“3, 10“4 ... - Khi lấy tỉ lệ lOml cộng 90ml, llml cộng 99ml hoặc lml cộng 99ml thì lắc bằng tay. - Pha đủ số lượng các dung dịch pha loãng để đảm bảo rằng tất cả các Ống nghiệm tương ứng với độ pha loãng cuối cùng cho kết quả âm tính. 4.3.6. Ó.3 Thời gian thao tác: Khoảng thời gian từ lúc bắt đầu cân đo phần mẫu thử hoặc từ lúc kết thúc việc chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu và cho đến khi trộn các dung dịch cấy vđi môi trường không được quá 15 phút, trừ khi có qui định khác. 4.3. Ó.7 Cấy mẫu: - Lấy ba Ống nghiệm đựng canh thang nồng độ kép và dùng pipet cho vào mỗi ống 10 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc lOml dung dịch pha loãng ban đầu - Lấy ba Ống nghiệm đựng canh thang nồng độ đơn và dùng pipet cho vào mỗi ống 1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc lml dung dịch pha loãng ban đầu - Đôi với mỗi một dung dịch pha loãng tiếp theo (10_1 hoặc 10“2, tùy theo trường hợp) lấy ba Ống nghiệm canh thang nồng độ đơn. Cho vào mỗi ống lml dung dịch pha loãng thích hợp. Đối với mỗi độ pha loãng dùng một pipet mới. Trộn cẩn thận chất nuôi cấy với môi trường - Nuôi ấm các ống nghiệm canh thang nồng độ đơn ở 30°c±l°c trong 24h±2h - Nuôi ấm các ống nghiệm canh thang nồng độ kép ở 30°c ±l°c trong 24h±2h - Cấy truyền từ Ống nghiệm canh thang nồng độ kép đã nuôi ấm: Từ mỗi ống nghiệm canh thang nồng độ kép đã nuôi ấm dùng que cấy vòng cấy vào 1 ống nghiệm canh thang nồng độ đơn. Nuôi ấm ở 30°c ±l°c trong 48h±2h - Thử khẳng định: - Từ mỗi ống nghiệm nuôi ấm cho thấy có sự sinh hơi trong Ống Durham, cấy một vòng đầy lên thạch eosin xanh metylen. Nuôi ấm ở 30°c ±l°c trong 24h±2h SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 110/109 - Các khuẩn lạc mọc có màu đỏ/ hồng, ánh kim và đục được coi là đặc trưng, nếu cần khẳng định thêm nữa, nuôi cấy các khuẩn lạc vào Ống nghiệm chứa canh thang nồng độ đơn và kiểm tra sự sinh hơi sau khi nuôi ấm - Ghi lại số ống khẳng định dương tính đối vđi một độ pha loãng 4.3. Ó.8 Biểu thị kết quả: - Lựa chọn các độ pha loãng - Xác định chỉ số MPN - Tính số xác suất lđn nhất (MPN) - Độ chính xác 4.3. Ó.9 Báo cáo kết quả: - Báo cáo chỉ ra phương pháp xác định đã sử dụng và kết quả thu được, chỉ rõ phương pháp biểu thị đã dùng. Nó cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong phần này của tiêu chuẩn. CHƯƠNG V: KẾT LUẬN Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 là đơn vị sự nghiệp khoa học phục vụ cho công tác quản lý Nhà nước về tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng. Bao gồm chức năng và nhiệm vụ chính của Trung tâm là: - Kiểm tra nhà nước về chất lượng hàng hóa xuất nhập khẩu - Thẩm định kỹ thuật thiết bị công nghệ và hàng hóa - Kiểm định, hiệu chuẩn phương tiện đo kiểm - Thử nghiệm chất lượng sản phẩm (hàng hóa) và hệ thống quản lý - Hướng dẫn, đào tạo, tư vấn về tiêu chuẩn, đo lường và quản lý chất lượng - Cung cấp các thông tín về tiêu chuẩn hóa, đo lường và quản lý chất lượng - Nghiên cứu, chế tạo chuẩn đo lường và phương tiện đo - Trung tâm còn được chỉ định là cơ quan kiểm tra đối với các sản phẩm và hàng hóa bắt buộc phải kiểm tra Nhà nước về chất lượng - Hiện nay, Trung tâm đang xây dựng các nhà thử nghiệm sóng điện từ (EMC) với các hệ thống công nghệ cao do Nhật đảm nhiệm, lắp ráp các thiết bị. Các hệ thống tiêu chuẩn: - Phần lớn các tiêu chuẩn đã có thời gian ban hành khá lâu và theo thống kê của Trung tâm Tiêu chuẩn thì có khoảng 40% số lượng tiêu chuẩn không còn phù hợp với xu thế hiện nay. Điều này là một bất lợi lớn khi chúng ta đang trong quá trình hội nhập vđi thế giới thông qua WTO, AFTA. - Giải pháp cho các tiêu chuẩn là: Các cơ quan quản lý có chức năng đưa ra một khoảng thời gian nhất định, để định kỳ xem xét lại hệ thống tiêu chuẩn phù hợp với nhịp độ phát triển của xã hội nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm. Đây là một khó khăn lđn vì tốn nhiều chi phí, nguồn lực để thực hiện cho nên vẫn phải có sự phối hợp tốt, nhất quán giữa các Bộ, Ngành liên quan. SVTH: HỒ THỊ MINH VẪN Báo cáo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Trang 111/109 - Ngoài ra, các tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) sử dụng trong nưđc, trung tâm còn thực hiện phép thử theo các phương pháp khác nhau như: AOAC,AOCS, AACC, BS, CODEX STAN, FAO FNP, ISO, IS, EEC, GAFT A, ICUMSA ... Sản phẩm sữa có rất nhiều chỉ tiêu và các phương pháp thử khác nhau: - Phần hóa lý: phân tích các hàm lượng béo, đạm, casein, chỉ số acid, canxi, lactose, chất khô ... - Phần vi sinh: tổng số vi sinh vật, men, mốc.... - Hiện nay, trong sữa có rất nhiều chỉ tiêu cần thử nghiệm nhiữig các cơ quan chưa có đủ thiết bị để thử nghiệm hết các chỉ tiêu này như: các vitamin B5, B12, màng béo sữa, các chỉ số thông minh A+ DHA, WG3