Biện tuấn an khảo sát hệ vi khuẩn methylobacterium sp trên lúa (oryza sativa l.) ở Tây Ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * BIỆN TUẤN AN KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN Th.S KIỀU PHƢƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * INVESTIGATING Methylobacterium sp. IN RICE (Oryza sativa L.) AT TAY NINH PROVINCE GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: Assoc.Prof.PhD. BUI VAN LE BIEN TUAN AN MSc. KIEU PHUONG NAM TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Em vô cùng biết ơn PGS. TS Bùi Văn Lệ, Th.S. Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường. Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em trong suốt thời gian em học ở trường. Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt nghiệp này. Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập. Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay. Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con. Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến trường. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Biện Tuấn An v TÓM TẮT Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh”. Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS Bùi Văn Lệ Th.S Kiều Phương Nam Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon. Là vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có lợi cho thực vật và con người. Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. Được thực hiện qua các bước sau: - Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. - Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm thuần. - Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng. - Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định danh. Các kết quả đạt được: - Thu thập, phân lập và làm thuần 26 dòng vi khuẩn khác nhau thuộc chi Methylobacterium. - Khảo sát được các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng đã được làm thuần và phân bốn nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. - Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng phương pháp PCR và giải trình tự. Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các chủng so với các loài đã công bố. vi - Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy PHB. Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh vật trong thời đại ngày nay. Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác. vii MỤC LỤC TRANG MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi Danh mục các chữ viết tắt ............................................................................................... x Dang sách các bảng ........................................................................................................ xi Dang sách các hình-sơ đồ .............................................................................................. xii Phần I: Phần mở đầu ........................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích, yêu cầu .................................................................................................. 2 Phần II: Tổng quan tài liệu .............................................................................................. 3 2.1. Cây lúa ................................................................................................................. 3 2.1.1. Nguồn gốc phân bố .......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại .......................................................................................... 4 2.1.2.1. Đặc điểm chung ........................................................................................ 4 2.1.2.2. Phân loại .................................................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn ............................................................................................................. 7 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ......................................................................... 7 2.2.2. Đặc điểm chung ............................................................................................. 12 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố ................................................................ 12 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ...................................................... 13 2.3. Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật ............................................................ 16 2.3.1. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ......................................... 16 2.3.2. Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật ........................................ 17 2.3.3. Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium ...................... 19 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium .................................... 21 2.4. Phương pháp định danh vi sinh vật ..................................................................... 23 2.4.1. Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống ................................ 23 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................. 24 2.4.2.1. Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử ........................................................... 24 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật ....................... 26 Phần III: Vật liệu và phương pháp ................................................................................ 28 3.1. Vật liệu ................................................................................................................ 28 viii 3.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................................. 28 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................ 28 3.1.3. Hóa chất ......................................................................................................... 28 3.1.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần .......................................................... 28 3.1.3.2. Môi trường giử giống vi khuẩn .............................................................. 29 3.1.3.3. Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn .......................................................................................................... 29 3.1.3.4. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn ...................................................... 29 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR ... 29 3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 30 3.2.1. Lấy mẫu ......................................................................................................... 30 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn ........................................................................................ 31 3.2.3. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 31 3.2.4. Làm thuần ...................................................................................................... 31 3.2.5. Giữ giống ....................................................................................................... 31 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa ......................................................... 31 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào .............................................. 32 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxy ................................................................................ 33 3.2.6.3. Khả năng di động ..................................................................................... 34 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ................... 34 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR ................................. 34 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH .................................................. 37 3.2.6.7. Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn ..................................... 38 3.3. Định danh vi khuẩn ............................................................................................. 38 3.3.1. Tính hệ số tương đồng di truyền .................................................................. 38 3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn ................................................................................. 38 3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR ............................................................................. 39 3.3.3.1. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 39 3.3.3.2. Các primer sử dụng ................................................................................ 39 3.3.3.3. Điện di và xem kết quả ........................................................................... 41 3.3.4. Giải trình tự .................................................................................................. 41 ix 3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................ 41 3.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp ..................................... 42 3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin ...................................................... 42 3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB ........................................................ 42 Phần IV: Kết quả và biện luận ....................................................................................... 44 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ............................................................................ 44 4.2. Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa ................................................. 46 4.2.1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào ....................................... 46 4.2.2. Mối quan hệ với oxy ..................................................................................... 46 4.2.3. Khă năng di động ........................................................................................... 47 4.2.4. Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon ........................................... 47 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GNR .......................................................................... 49 4.2.6. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn ... 50 4.2.7. Đường cong tăng trưởng tế bào ..................................................................... 52 4.3. Kết quả định danh vi khuẩn ................................................................................ 55 4.3.1. Hệ số tương đồng di truyền ........................................................................... 55 4.3.2. Kết quả PCR .................................................................................................. 56 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium .................................. 56 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn ............................... 57 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã công bố ................................................................................................................ 58 4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp .................................. 61 4.4.1. Định tính auxin ............................................................................................... 61 4.4.2. Định tính PHB ................................................................................................ 61 Phần V: Kết luận và đề nghị .......................................................................................... 62 5.1. Kết luận................................................................................................................. 62 5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 62 Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 63 Phụ luc ........................................................................................................................... 76 x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMS: môi trường MS bổ sung caseine hydrolase CP: môi trường cao thịt-peptone ctv: cộng tác viên DC: đối chứng DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one IAA: indole-3-acetic acid MMS:môi trường methanol mineral salts NCBI: National Center for Biotechnology Imformation OD: optical density PCR: polymerase chain reaction PHB: poly- -hydroxybutyrate PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA RNA: ribonucleotide rRNA: RNA ribosome tRNA: RNA vận chuyển UV: ultraviolet Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza .................................... 6 Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên ......................................... 8 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR ..................... 36 Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần ................................. 44 Bảng 4.2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................ 47 Bảng 4.3: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR .............................................. 49 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn ................ 53 Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền Jaccard.............................................................. 55 Bảng 4.6: Hệ số tương đồng của chủng TN10 với các loài đã công bố ........................ 58 Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các loài đã công bố ......................... 59 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH-SƠ ĐỒ Hình 2.1: Hình thái cây lúa .............................................................................................. 5 Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới kính hiển vi điện tử ....................................................................................... 13 Hình 2.3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB trong quá trình biến dưỡng ............................................................................ 15 Hình 2.4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp. ở cây dương nuôi cấy mô .................. 22 Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA ........................................... 40 Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi 2F và 2R .................................... 40 Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F ..................................................................................... 41 Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MMS ................................................. 45 Hình 4.2: Hình dạng tế bào trong thử nghiệm gram với vật kính 100X ....................... 46 Hình 4.3: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn ............................................. 48 Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào ............................. 50 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ............................ 50 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn ................................... 51 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn .......................................................... 52 Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R ..................... 57 Hình 4.9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R Và FPGS1509 với 2F .................................................................................... 58 Hình 4.10: Cây phát sinh loài ........................................................................................ 60 Hình 4.11: Kết quả định tính auxin ............................................................................... 61 Hình 4.12: Sự bắt sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang .................... 62 1 Phần I: Phần mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Cây lúa là cây lương thực chủ yếu của các nước châu Á và Việt Nam. Cùng với sự gia tăng dân số trên toàn thế giới thì nhu cầu về lương thực nói chung và nhu cầu lúa gạo nói riêng đang ngày một tăng lên. Vì vậy, một nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải gia tăng diện tích gieo trồng và năng suất lúa. Trong đó, việc gia tăng năng suất là chủ yếu. Để gia tăng năng suất lúa thì việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, việc sử dụng hóa chất để khống chế sự phá hại của sinh vật gây bệnh cũng như để gia tăng sự phát triển của thực vật đem lại những hiệu quả nhất định. Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất đã và đang làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng. Bên cạnh đó, lượng khí methan tạo ra do canh tác lúa nước là nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính. Cho nên, kiến tạo một nền nông nghiệp bền vững là xu hướng chung hiện nay của thế giới cũng như ở Việt Nam. Phương pháp này là dùng các nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên để kích thích sự phát triển của thực vật cũng như trong phòng trị bệnh và kiểm soát các tác nhân có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường. Một trong những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng là vi sinh vật. Vì vi sinh vật không những có khả năng tạo ra các chất khác nhau, các hormone góp phần điều chỉnh sự tăng trưởng ở thực vật, mà còn có khả năng tạo ra tính kháng của thực vật với tác nhân gây hại. Ngoài ra, vi sinh vật còn có khả năng biến dưỡng các chất có hại trong môi trường thành chất không có hại và thực vật có thể hấp thu dễ dàng. Vi khuẩn Methylobacterium cũng thuộc nhóm này, đây là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tùy ý có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau và cũng có khả năng kích thích tính kháng cũng như tạo các chất có lợi, các hormon điều hòa sinh trưởng của thực vật. Theo Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nẩy mầm, gia tăng chiều cao cây lúa non,… trong điều kiện in vitro. Năm 2004, Madhaiyan và ctv đã tiến hành thí nghiệm xử lý Methylobacterium bằng cách trộn với hạt và phun trên lá, kết quả làm gia tăng sự đẻ nhánh của cây lúa, gia tăng năng suất lúa từ 22,1 – 24,1%. Ngoài ra, cũng theo báo cáo này thì các chủng Methylobacterium sp. còn có vai trò giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8 – 23,7%. Từ những cơ sở đó, để có thể hiểu rõ hơn về các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên cây lúa và mối quan hệ của vi khuẩn này với cây lúa. Được sự chấp nhận của Bộ môn Công nghệ 2 Sinh học nên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh” với sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Văn Lệ và ThS. Kiều Phương Nam. 1.2. Mục đích và yêu cầu Mục đích: Định danh và khảo sát một vài đặc điểm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên ruộng lúa. Yêu cầu: Phân lập, làm thuần và định danh các chủng vi khẩn Methylobacterium sp. bằng phương pháp phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một vài các hợp chất thứ cấp. 3 Phần II: Tổng quan tài liệu 2.1. Cây lúa 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố Cây lúa là loại thực vật được canh tác từ rất lâu. Tuy nhiên, về nguồn gốc của cây lúa trồng chưa được hiểu rõ ràng và có nhiều ý kiến khác nhau. Theo một số tác giả thì O. sativa được trồng đầu tiên ở Đông Nam Á, Ấn Độ và Trung Quốc cách đây khoảng 8000 – 15000 năm. Và O. glaberrima được trồng cách đây khoảng 1000 năm trước công nguyên. Trong khi đó, các nhà khảo cổ học Mỹ cho rằng lúa trồng xuất hiện rất sớm cách đây khoảng hơn 9 – 10 nghìn năm. Nhiều nhà khảo cổ học khác cho là lúa trồng xuất hiện cách đây 6000 năm, đối với lúa trồng châu Phi (Oryza glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3500 năm. Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1800 – 1900 năm [1],[23]. Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố rộng, loài O. sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia. Nhưng khoảng 90% lượng gạo được sản xuất và tiêu thụ ở châu Á. Diện tích gieo trồng chiếm khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha). Lúa gạo được trồng từ độ cao bằng mực nước biển đến độ cao 3000m so với mực nước biển. Lúa được trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới. Lúa gạo có thể được trồng trên nhiều loại đất khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn [23]. Những dòng lúa có thể được phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica ( được trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới). Có hai dòng được canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica [1], [2],[23]. 4 2.1.2. Đặc điểm và phân loại. 2.1.2.1. Đặc diểm chung Lúa là loại thực vật cổ xưa, có tính đa dạng di truyền và hình thái hơn một số loại cây trồng khác. Trong ngân hàng gen lúa thế giới (The International Rice Gene Bank) đang giữ khoảng 100000 dòng lúa khác nhau, hầu hết thuộc O. sativa [23]. Lúa trồng O. sativa có kích thước genome lưỡng bội (2n = 24) nhỏ (430 triệu bp). Đây là genome nhỏ nhất trong số tất cả các genome của các cây lương thực khác. Và xấp xỉ 50% genome bao gồm những trình tự lặp lại. Hầu hết các loài Oryza khác cũng có nhiễm sắc thể lưỡng bội, tuy nhiên cũng có vài loài là tứ bội (2n= 48) [1], [23]. Cây lúa trồng châu Á O. Sativa là cây thân thảo, có hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày. Cây lúa mọc thẳng đứng hay mọc nghiên rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nước ngập chân hoặc một phần thân hay trong nước sâu 2 – 4m. Thân cao từ 70 – 150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 – 3m, hay 5 – 6m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẳn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn. Lúa thường tạo thành nhiều nhánh (dảnh lúa tillers), bao gồm cọng và lá có hoặc không có bông (panical). Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lưỡi bẹ và hai thìa lìa từ cổ lá. Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con. Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống dài 15 – 30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím. Lúa có hoa lưỡng tính, là hoa tự thụ phấn. Hoa có sáu nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [1], [2], [23]. 5 Hình 2.1: Hình thái cây lúa [23]. Có ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu lúa quốc tế (International Rice Research Institution, 2002): - Nẩy mầm và sinh trưởng sinh dưỡng. - Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản. - Giai đoạn hạt chín [23] 2.1.2.2. Phân loại. Chi Oryza thuộc bộ Oryzeae của họ Poaceae. Có 12 giống bên trong bộ Oryzeae. Chi Oryza bao gồm khoảng 22 loài trong đó có 20 loài lúa hoang và hai loài lúa trồng là: O. Sativa và O. glaberrima. Oryza sativa được trồng khắp nơi bao gồm châu Á, Bắc và Nam Mỹ, châu Âu, Trung Đông và châu Phi. Còn O. glaberrima được trồng chủ yếu ở các nước Tây Phi [23] 6 Bảng 1.1: Kiểu gen và vùng phân bố của một số loài trong chi oryza [23] Loài oryza Kiểu gen châu Phi Trung và Nam Mỹ châu Á châu Đại Dương O. sativa complex. O. sativa O. glaberrima O. barthii O. glumaepatula. O. longistaminata O. meridionalis O. nivara O. rufipogon. O. officinalis complex O. punctata O. alampuzhaensis O. minuta O. eichingeri O. officinalis O. rhizomatis O. alta O. grandiglumis O. latifolia O. australiensis O. brachyantha O. granulata complex. O. granulata O. meyeriana O. ridleyi complex. O. longiglumis. O. ridleyi. O. schlechteri AA AA AA AA AA AA AA AA BB,BBCC BBCC BBCC CC CC CC CCDD CCDD CCDD EE FF GG GG HHJJ HHJJ ?? + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: AA, BB, BBCC, CC, CCDD, EE, FF, GG, HHJJ: là các kiểu gen; ??: chưa biết kiểu gen; +: có phân bố. 7 2.2. Vi khuẩn Methylobacterium 2.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl tùy ý (pink – pigmented facultatively methylotrophic; PPFM). Chúng là những vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa hợp chất một cacbon như: formate, formaldehyde và methanol. Hầu hết các loài có thể phát triển trên môi trường nutrient agar, một số loài có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung methylamine. Chỉ một loài M. organophilum được cho là có thể sử dụng methan như nguồn cacbon chủ yếu [34] Loài Methylobacterium được mô tả và phân lập đầu tiên do Bassalik năm 1913 từ giun đất và được đặt tên là Baccillus extorquens. Trong giai đoạn trước năm 1960, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau: Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynbacterium, …[34]. Mãi đến năm 1974, Patt và ctv phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có khả năng sử dụng methan, loài này được xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là M. organophilum. Tuy nhiên, chi này mô tả chỉ dựa trên khả năng sử dụng methan của một loài vi khuẩn duy nhất là M. organophilum nên đã gây nhiều khó khăn cho những nghiên cứu phân loại sau này [34]. Đến năm 1982, Green và Bousfield đã nhận thấy rằng loài M. organophilum có nhiều đặc điểm giống với các loài PPFM đã được công bố trước đây (tuy là chúng không có khả năng sử dụng methan). Tất cả 149 loài đã được nghiên cứu nhờ 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của chúng so với loài M. organophilum cho thấy rằng sự tương đồng giữa chúng là 70%. Từ kết quả này Green và Bousfield đã đề nghị xếp loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34]. Đến ngày 10 tháng 7 năm 2006 đã có 24 loài Methylobacterium sp. được đặt tên dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S khác biệt giữa các loài khác nhau. Trong đó có những loài mới có những đặc điểm đặc biệt như M. chloromethanicum có khả năng sử dụng chloromethane (đặc trưng duy nhất chỉ có ở loài này), M. thiocianatum có khả năng sử dụng thiocyanate hay cyanase là nguồn cung cấp nitrogen,…[63], [99], [104]. 8 Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacetrium đã được đặt tên Số thứ tự Tên loài Công trình công bố 1 M. adhaesivum Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium adhaesivum sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 339-342. 2 M. aminovorans Urakami, Araki, Suzuki And Komagata: Further studies of the genus Methylobacterium and description of Methylobacterium aminovorans sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43, 504-513. 3 M. aquaticum Gallego Garcia And Ventosa: Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 281-287. 4 M. chloromethanicum McDonald, Doronina, Trotsenko, Mcanulla and Murrell: Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloromethanicum sp. nov., chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51, 119- 122. 5 M. dichloromethanicum Doronina, Trotsenko , Tourova , Kuznetsov and Leisinger: Methylopila helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. a novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane. Syst. Appl. Microbiol., 2000, 23, 210-218. 6 M. extorquens Bousfield and Green: Reclassification of bacteria of the genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) emend. Green and Bousfield 1983. Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35, 209. 7 M. fujisawaense Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and 9 M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. 8 M. goesingense Idris, R., Kuffner, M., Bodrossy, L., Puschenreiter, M., Monchy, S., Wenzel, W.W., and Sessitsch, A. "Characterization of Ni-tolerant methylobacteria associated with the hyperaccumulating plant Thlaspi goesingense and description of Methylobacterium goesingense sp. nov." Sys. Appl. Microbiol. (in press as of 20 February 2006). 9 M. hispanicum Gallego, Garcia And Ventosa: Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 281-287. 9 M. isbiliense Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium isbiliense sp. nov., isolated from the drinking water system of Sevilla, Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 2333-2337. 10 M. jeotgali Aslam,Z. and Lee,S.T. Submitted (02-APR-2006) Biological Sciences, KAIST, Daejeon. 305-701, S. Korea 11 M. lusitanum Doronina, Trotsenko, Kuznetsov, Tourova And Salkinoja-Salonen: Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 773-776. 12 M. mesophilicum Green and Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 13 M. nodulans Jourand, Giraud, Béna, Sy, Willems, Gillis , Dreyfus And De Lajudie: Methylobacterium nodulans sp. nov., for a group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume root- nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 2269-2273. 14 M. organophilum Skerman, Mcgowan And Sneath (editors): Approved Lists 10 of Bacterial Names. Int. J. Syst. Bacteriol., 1980, 30, 225- 420. Patt, Cole and Hanson: Methylobacterium, a new genus of facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic Bacteriology, 1976, 26, 226-229.] 15 M. podarium Anesti, Vohra, Goonetilleka, McDonald, Straubler, Stackebrandt, Kelly and Wood. Molecular detection and isolation of facultatively methylotrophic bacteria, including Methylobacterium podarium sp. nov., from the human foot microflora. Environ. Microbiol. 6 (8), 820-830 (2004) 16 M. populi Van Aken, Peres, Lafferty Doty , Yoon And Schnoor: Methylobacterium populi sp. nov., a novel aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides x nigra DN34). Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54, 1191- 1196. 17 M. radiotolerans Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 18 M. rhodesianum Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. 19 M. rhodinum Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 875-877. 20 M. specialis Chưa xuất bản. 21 M. soumiense Doronina, N.V., Trotsenko, Y.A., Kuznetsov, B.B., Tourova, T.P. and Salkinoja-Salonen, M.S. 11 "Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink- pigmented, facultatively methylotrophic bacteria." Int. J. Syst. Evol.Microbiol. (2002) 52:773-776. 22 M. thiocyanatum Wood, Kelly, McDonald, Jordan, Morgan, Khan, Murrell and Borodina:A novel pink-pigmented facultative methylotroph, Methylobacterium thiocyanatum sp. nov., capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources. Arch. Microbiol., 1998, 169, 148-158. 23 M. variabile Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium variabile sp. nov., a methylotrophic bacterium isolated from an aquatic environment. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55, 1429-1433. 24 M. zatmanii Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium species: M. rhodesianum sp. nov., M. zatmanii sp. nov., and M. fujisawaense sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38, 124-127. Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau [41]: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae 2.2.2. Đặc điểm chung 2.2.2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng trong tự nhiên, hiện hiện ở nhiều môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, bề mặt lá cây, nốt sần rễ thực vật, ở hạt, thực phẫm, mỹ phẫm, môi trường bệnh viện, dung dịch ngâm xác động vật, có ở miệng và bề mặt da người, trong máu bệnh nhân nhiễm HIV [9], [11], [25], [29], [30], [31], [34],[94]. Sự hiện diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật rất đa dạng chúng đã được phân lập từ hơn 100 loài thực vật khác nhau, từ dương xỉ và các loại rêu đến thực vật 12 hạt trần và thực vật hạt kín. Hirano và Upper (1992), tìm thấy Methylobacterium chiếm hơn 90% của hệ vi khuẩn hiếu khí trên cây Phaseolus vulgaris trong suốt các mùa khác nhau. Năm 1978, Austin và Googfellow đã phân lập Methylobacterium từ lá cây Lolium perenne. Pirttila và ctv (2000), đã chứng minh rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. hiện diện bên trong chồi của cây thông (Pinus sylvestris) hay nằm trong các bó mạch của cây họ cam chanh (Citrus). Vi khuẩn Methylobacterium còn hiện diện trên hạt. Vi khuẩn PPFMs định cư trên bề mặt lá ở dạng kết hợp lại và trong giữa các tế bào biểu bì Omer và ctv (2004). Sự định cư của vi khuẩn Methylobacterium trên rễ cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau [9], [13], [14], [47], [59], [60], [72], [76], [89]. Vi khuẩn Methylobacterium là những vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do vậy, vi khuẩn này được phân lập từ môi trường có oxy hòa tan. Ngoài ra, Methylobacterium còn có khả năng kháng với Cl – nên vi khuẩn này còn hiện hiện trong nước máy [29], [30], [31], [37]. 13 Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá (A, C) và tế bào (B) vi khuẩn Methylobacterium 0. 2.2.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 – 1 x 1 – 8 m. Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những dạng bất thường khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng. Vi khuẩn Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng [34],[86]. Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực. Tuy nhiên, vài loài thì không. Đa số các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi. Vi khuẩn Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng đậm hay đỏ cam, một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng vi khuẩn Methylobacterium không tan trong nước và là hợp chất carotenoid. Ở môi trường lỏng, nuôi cấy tỉnh vi khuẩn Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, đều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc. Chúng có phản ứng oxydase dương tính yếu, catalase âm tính hay dương tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn. 14 Methylobacterium sp. là những vi khuẩn dị hóa sinh dưỡng có khả năng sử dụng các hợp chất methyl. Do vây, tất cả các loài có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde ở nồng độ thấp, formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng hợp chất methylamine chỉ có một loài duy nhất là M. organophilum có thể sử dụng methan là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng. Ngoài ra, M. chloromethanicum có thể sử dụng chloromethane và M. thiocinatum có thể sử dụng thiocinate. Một số loài có khả năng lên men lactose, có phản ứng LDC, Urease dương tính. Một số loài có khả năng sinh indole và một số loài có khả năng khử nitrate thành nitrite [10], [24], [25], [29], [30], [31], [34], [41], [57]. Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài vi khuẩn Methylobacterium đều theo chu trình serine. Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – – hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số chất khác [10], [24], [55], [58], [61], [68],[84], [90]. chú thích: 1, crotonyl-CoA reductase 2, L-crotonase 3, NADH-linked acetoacetyl-CoA reductase 4, D-crotonase. 5, b-ketothiolase 6, NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase 7, PHB synthase 8, PHB depolymerase 9, -hydroxybutyrate dehydrogenase 10, acetoacetate–succinyl-CoA transferase. Hình 2.3: Sự gắn kết giữa chu kỳ serine và chu kỳ PHB trong quá trình biến dưỡng [52]. 15 Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium biến thiên từ 25 – 300C. Một vài loài có thể phát triển ở nhiệt độ 370C hay 510C. Đa số các loài đều tăng trưởng trong khoảng pH trung tính, một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH từ 4 – 10 [34]. Vi khuẩn Methylobacterium có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl- , tia UV, phóng xạ ion, và nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong chi Methylobacterium đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine và tetracycline. Trong đó, tetracycline có ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium. Ngoài ra, các loài Methylobacterium sp. có khả năng đề kháng với nhiều chất kháng sinh như: cephalothine, acid nalidicic, penicyline, bacitracine, carbenicillin, colestin sulfate, polymycine B và nitrofurantoin [29], [34], [37], [102]. Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp nguồn cacbon và năng lượng của chủng vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylamine, serbactae,…Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6- trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7tetrazicine hay high- melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro-1,3,5-triazine hay royal explosive),…Do vậy, có thể phân biệt các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn này [9],[25], [28], [34],[58],[89]. Một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có bacterochlorophyll trong vài điều kiện nuôi cấy đặc biệt, từ đó cho thấy khả năng tự dưỡng của một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. [34]. 2.3. Sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật 2.3.1. Sơ lƣợc về tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật. Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, và đây là mối quan hệ rất phức tạp. Trong mối quan hệ đó, vi sinh vật có thể là tác nhân có lợi và cũng có thể là tác nhân có hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Sự định cư của vi sinh vật trên thực vật rất đa dạng có thể trên thân, lá, rễ và cả ở cơ quan sinh sản như hoa, quả, hạt. [9],[13], [14], [17], [18], [19], [21], [33], [32], [35], [38], [43], [44],… Theo Hirano và ctv (1983), cho rằng lá là nơi hổ trợ cho sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật và phần lớn trong số đó là vi sinh vật gây bệnh. Pseudomonas 16 syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38]. Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97]. Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48]. Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại 17 tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro. 2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật. Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 104 – 107 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 10 5 cfu/gram [40], [59], [60]. Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72]. Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo (cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B12 (cyanocobalamine) và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata [39], [40], [51], [84]. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả 18 năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61]. 2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là: - Sự cô lập, chuyể