Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật rapd và aflp

Phần 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay, máy luân nhiệt (Thermocycles - PCR) được sử dụng rộng rãi tại các trường Đại học, phòng thí nghiệm, bệnh viện, viện nghiên cứu Máy PCR là công cụ không thể thiếu đối với các thí nghiệm liên quan đến khuếch đại đoạn DNA. Những máy PCR đang sử dụng tất cả đều nhập từ nước ngoài với giá thành cao, hơn nữa trong quá trình sử dụng gặp hư hỏng chi phí sửa chữa khá cao; đôi khi trong nước không sửa chữa được phải ra nước ngoài, tốn thời gian và chi phí vận chuyển. Với những thiết bị đắt tiền như vậy, sinh viên khó tiếp cận thực hiện các thí nghiệm của mình, chỉ có thể kiến tập hoặc nhiều sinh viên thực tập trên một máy. Số lượng máy PCR hiện nay tại các trường đại học còn khiêm tốn, trong khi lượng sinh viên ngày một nhiều. Do vậy, việc chế tạo máy PCR trong nước với giá thành hạ rất cần thiết. Khi chưa có máy PCR, ta cũng có thể thực hiện khuếch đại đoạn DNA với các hộp chứa nước ở nhiệt độ khác nhau. Tuy nhiên, việc làm này tốn nhiều thời gian và công sức, độ tin cậy không cao, không thích hợp khi lượng mẫu cần phân tích nhiều. Máy PCR lúc đầu mới ra dùng dầu, còn có nhiều nhược điểm như: hút DNA ra khó dễ bị lẫn dầu, thu được lượng DNA sạch ít hơn dự kiến v.v Để khắc phục những khuyết điểm đó, dòng máy thứ hai ra đời dùng nguyên lý điện nhiệt học để chuyển tải nhiệt có thêm nắp chống ngưng tụ, khắc phục được những khuyết điểm trên. Đề tài nghiên cứu này, được thực hiện với mục đích hạ thấp giá thành của máy, kiểm tra độ hoạt động ổn định của máy và kiểm tra chạy phản ứng PCR. MỤC LỤC Trang Phần 1. Mở đầu 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích yêu cầu 1 1.2.1. Mục đích đề tài 1 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Giới hạn của đề tài 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu 3 2.1. Nguyên lý phản ứng PCR 3 2.2. Các thành phần của phản ứng 3 2.2.1. Các polymerase chịu nhiệt 3 2.2.2. DNA khuôn mẫu 4 2.2.3. Primer 4 2.3. Nguyên lý hoạt động của máy PCR 4 2.4. Nguyên lý Pentier 5 2.5. Thermoelectric module 5 2.5.1. Giới thiệu 5 2.5.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động 6 2.5.2.1. Cấu tạo 6 2.5.2.2. Nguyên lý hoạt động 7 2.6. Bán dẫn loại N và bán dẫn loại P 8 2.7. Sensor nhiệt 9 2.7.1. Nhiệt điện trở Platine 9 2.7.1.1. Cách tính nhiệt độ theo điện trở 10 2.7.1.2. Sai số cho phép 11 2.7.1.3. Cấu trúc của cảm biến nhiệt platine 11 2.7.1.4. Kỹ thuật nối dây 12 2.7.2. Cặp nhiệt điện 13 2.8. Cấu trúc và đặc tính của chip AT90S8535 13 2.9. Ngôn ngữ Bascom 15 2.10. Mạch điện 15 2.11. Ứng dụng của PCR 15 2.11.1. PCR định lượng 15 2.11.2. PCR sản xuất đột biến (PCR mutagenesis) 2.11.3. PCR ứng dụng trong cloning tái tổ hợp (cloning of recombinant) 15 2.11.4. PCR nhân bản đoạn DNA mong muốn 16 2.11.5. PCR dùng trong phát hiện các vi sinh vật gây bệnh 17 2.11.6. PCR với tiến hóa và khảo cổ học 19 2.11.7. PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene 19 2.11.8. PCR và việc định loại các mô 20 2.11.9. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền 20 2.11.10. PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA sequencing) 21 2.12. Thành phần hóa học của DNA 22 Phần 3. Vật liệu và cách thức tiến hành 24 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 24 3.2. Vật liệu 24 3.2.1. Linh kiện cho bộ khuếch đại tín hiệu từ cảm biến 24 3.2.2. Linh kiện cho mạch vi xử lý 24 3.2.3. Linh kiện cho mạch khuếch đại công suất 25 3.2.4. Linh kiện và thiết bị cho bộ nguồn 25 3.2.5. Linh kiện cho bộ luân nhiệt và nắp chống ngưng 25 3.2.6. Vật liệu làm khung và vỏ máy 25 3.2.7. Hoá chất chạy PCR và dụng điện di 26 3.3. Cách thức tiến hành 26 3.3.1. Thiết kế 26 3.3.1.1. Thiết kế khung và vỏ máy 26 a. Bộ phận bên ngoài của máy 26 b. Bộ phận bên trong 26 3.3.1.2. Thiết kế bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorf) 28 3.3.1.3. Thiết kế tấm cố định 28 3.3.1.4. Thiết kế nắp chống ngưng 29 3.3.2. Chế tạo 29 3.3.2.1. Gia công bộ phận truyền tải nhiệt cho ống plastic (eppendorf) 29 3.3.2.2. Khảo sát và chế tạo nắp chống ngưng 31 3.3.2.3. Làm khung và gò máy 31 3.3.2.4. Làm nguồn cung cấp cho bộ khuyếch đại và vi xử lý 31 3.3.2.5. Làm mạch khuyếch đại cho TE 32 3.3.2.6. Thiết kế và lắp mạch vi xử lý 32 3.3.2.7. Làm mạch khuyếch đại cho Pt100 32 3.3.3. Viết chương trình và nạp cho vi xử lý 33 3.3.4. Chạy phản ứng PCR 33 Phần 4. Kết quả thảo luận 34 4.1. Về phần cứng 34 4.1.1. Về bộ phận điều khiển và nhiệt độ 34 4.1.2. Về toàn phần máy 34 4.2. Về phần mền 34 4.3. Về nhiệt độ 35 4.4. Về kết quả chạy mẫu 43 4.4.1 Hoạt động của máy 44 4.4.2. Chạy phản ứng PCR 45 Phần 5. Kết luận và đề nghị 48 5.1. Kết luận 48 5.2. Đề nghị 48 5.2.1. Bộ phận khuyếch đại 48 5.2.2. Bộ phận vi xử lý 48 5.2.3. Mạch khuyếch đại Pt 48 5.2.4. Nguồn điện 48 5.2.5. Bàn phím 49 5.2.6. Vỏ và khung 49 5.2.7. Chương trình 49 5.2.8. Thermoelectric module 49 5.2.9. Tản nhiệt 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục : Chương trình viết với ngôn ngữ Bascom cho vi điều khiển