Bước đầu đọc trình tự vùng RDNA - ITS của nấm Rhizoctonia solani KUHN

PAGE  PAGE  PAGE iii Lời Cảm Tạ Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ suốt đời dạy dỗ, tận tuỵ vì con cho con có được ngày hôm nay. Chân thành cám ơn: Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi kiến thức quí giá trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Trân trọng biết ơn cô Từ Thị Mỹ Thuận đã hết lòng tận tuỵ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện khoá luận này. Chân thành cảm ơn thầy Bùi Minh Trí , và các anh chi thuộc trung tâm phân tích đã tân tình giúp tôi trong quá trình hoàn thành khoá luận này. Cảm ơn tấc cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khoá luận này. Thủ Đức, ngày 08 tháng 08 năm 2005 Người thực hiện Lê Tuấn Kiệt TÓM TẮT LÊ TUẤN KIỆT, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh , tháng 9/2005. “BƯỚC ĐẦU ĐỌC TRÌNH TỰ VÙNG rDNA-ITS CỦA NẤM Rhizoctonia solani KUHN”. Giáo viên hướng dẫn Th.S. TỪ THỊ MỸ THUẬN Đề tài được thực hiện trên nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có thể gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau., ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Chúng tôi bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm này để bổ sung them thong tin về quần thể nấm này ở nước ta làm cơ sở cho việc phát triển các chương trình lai tạo thích hợp cho các vùng sinh thái riêng biệt. Đề tài được thực hiện tại phòng Bệnh cây khoa Nộng Học và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 01/03/2005 đến 30/08/2005. Nội dung nghiên cứu Thu thập các mẫu thực vật bệnh ở nhiều tỉnh và phân lập nấm R. solani. Nuôi cấy sinh khối các dòng nấm đã phân lập được. Li trích DNA các dòng nấm trên. Tiến hành phản ứng PCR với DNA vừa li trích trên vùng ITS của rDNA sử dụng hai mồi (primer) ITS4 và ITS5. Đọc trình tự vùng rDNA – ITS với hai primer ITS1 và ITS4. Kết quả thu đư ợc Thu thập và phân lập được 20 dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều mẫu thực vật bệnh do nấm này gây ra. Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R. solani bằng cách thêm một khâu khử protein. DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản ứng PCR mà không cần xử lí Rnase cho 20 dòng nấm này. Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani. Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của 2 dòng nấm R. Solani là BV-62-03 và SR-650. Trang Mục lục Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Mục viết tắt viii Danh sách các bảng ix Phần I Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 1 1.3. Yêu cầu 2 1.4. Giới hạn đề tài 2 Phần II Tổng quan tài liệu 2.1. Nấm Rhizoctonia solani 3 2.1.1. Vị trí phân loại 3 2.1.2. Đăc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani 3 2.1.3. Đặc điểm sinh lí 3 2.1.4. Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani 4 2.1.5. Sự xâm nhiễm và khả năng gây bệnh 5 2.2. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 5 2.2.1. Giới thiệu kĩ thuật PCR 5 2.2.2. Qui trình 5 2.2.2.1. Biến tính 5 2.2.2.2. Giai đoạn lai 6 2.2.2.3 giai đoạn kéo dài 6 2.2.3. Các thành phần ảnh hưởng đến phản ứng PCR 6 2.2.3.1. DNA khuôn (template) 6 2.2.3.2. Enzyme 7 2.2.3.3. Primer 7 2.2.3.4. Ion magnesium 8 2.2.4. Ứng dụng của kĩ thuật PCR 8 2.3. Đọc trình tự (sequencing) 9 2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật sequecing 9 2.3.2. Các phương pháp sequencing 9 2.3.2.1. Phương pháp Maxam và Gilbert (phương pháp hóa học) 9 2.3.2.2. Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger 11 2.4. Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA 13 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 14 2.5.1. Nghiên cứu trong nước 14 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước 14 Phần III Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.2.Phương pháp 16 3.2.1. Lấy mẫu và phân lập 16 3.2.2. môi trường phân lập nà nuôi cấy 16 3.2.3. Nuôi thu sinh khối 17 3.2.4. Li trích DNA 17 3.2.5. Phản ứng PCR 18 3.2.6. Sequencing 19 Phần IV Kết quả vào thảo luận 4.1. Phân lập mẫu 21 4.2. Li trích DNA 22 4.3. Phản ứng PCR 24 4.4. Đọc trìmh tự 26 Phần V Kết luận và đề nghị 1. Kết luận 34 2. Đề nghị 34 Phần VI Tài liệu tham khảo 1. Tiếng Việt 35 2. Tiếng Anh 35 3. Internet 37 Phần VII Phụ lục Phụ lục 1 38 Phụ lục 2 39 Phụ lục 3 40 Phụ lục 4 41 Các mục viết tắt DNA : deoxynucleic acid PCR : polymerase chain reaction RFLP Restriction fragment length polymorphism ITS : internal transcribed spacer PGA : potato glucose agar PDA : potato dextrose agar PGB : potato glucose broth dNTP: deoxynucleotide triphophate A : Adenine T : Thiamine G : Guanine C  :Cytosine Mg2+ : ion magnesium RAPD : Random amplified polymorphism DNA RE : Restriction Endonuclease M : methylase Nu : nucleotide U : unit (đơn vị quốc tế) µl : microlit ng : nanogram pmol : picomol ctv: cộng tác viên Danh sách các hình và các bảng Hình 1. Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert 10 Hình 2. Lược đồ phương pháp đọc trình tự của Sanger 12 Hình 3. Lược đồ công thức của dNTP và ddNTP 12 Hình 4. Lược đồ đoạn ITS – rDNA và các primer 13 Hình 5. DNA tổng số li trích theo qui trình của Lee và Taylor 22 Hình 6 . DNA tổng số li trích theo theo qui trình của Lee và Taylor cải tiến 23 Hình 7. DNA tồng số sau khi pha loãng chuẩn bị cho phản ứng PCR 24 Hình 8. Sản phẩm PCR có nồng độ primer là 1µM (1 pmol/µl) 24 Hình 9. Sản phẩm PCR có nồng độ primer là 0,4µM (0,4 pmol/µl) 25 Hình .10.Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03………..27 Hình 11. Trình tự và peak vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 28 Bảng 1: Thành phần của phản ứng PCR 18 Bảng 2: Qui trinh nhiệt của phản ứng PCR 18 Bảng 3: Danh sách các dòng nấm R. Solani nghiên cứu 21