Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền cây Đưng (rhizophora mucronata lamk.) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật Rapd

10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở - 20 0C. c. Quy trình 3: Quy trình ly trích cải tiến thứ 2 gồm 12 bƣớc  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB (có thêm PVP – Polyvinyl pyrrolidone, trong 100 ml EB sử dụng 2 g PVP), vortex kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng / phút) đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ ở 65 0 C trong 1h.  Bƣớc 2: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 700 l dịch nổi.  Bƣớc 3: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Thu 500 l dịch nổi.  Bƣớc 4: Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi.  Bƣớc 5: Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở - 20 0C qua đêm.  Bƣớc 6: Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa trắng.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X. Ủ ở 37 0C trong 1h. 35  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100 %, trộn đều. Ủ – 20 0C trong 1 h.  Bƣớc 9: Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70 % bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 4 0C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 37 0C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 1 h.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở - 20 0C. 3.3.1.3. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Dựng đƣờng chuẩn bằng dung dịch TE 1X theo hƣớng dẫn ghi trên máy đo hấp thu quang phổ. Độ pha loãng mẫu 100 lần, ứng với 5 l DNA và 495 l TE 1X. 3.3.1.4. Kiểm tra kết quả ly trích DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose  Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X (đối với gel 6 giếng). Đun bằng lò Viba cho agarose tan thật đều.  Đổ gel, chờ agarose đông.  Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu.  Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 250 mA, thời gian khoảng 20 phút. Nhuộm ethidium bromide khoảng 15 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.3.2. Kỹ thuật RAPD 3.3.2.1. Vật liệu dùng trong RAPD a. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Tủ hút (Việt Nam). Các loại pippet (Nichiry - Nhật Bản). 36 Đầu típ các loại (Đức). Ống eppendorf 200 μl (Pháp). Giếng đổ gel. Máy điện di (Biorad - Thụy Điển). Đá gel, bao tay. Tủ lạnh – 200C (Sanyo - Nhật Bản). Máy PCR Biorad (Biorad - Thụy Điển). Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad - Thụy Điển). b. Hóa chất thí nghiệm Taq DNA polymerase (Promega - Mỹ). Ladder 2. Buffer B. MgCl2. dNTP. Nƣớc siêu sạch. Primer: sử dụng 7 primer:  Primer OPAC10: 5’ AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 34 0 C.  Primer 1: 5’ TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C.  Primer 2: 5’ AGTCAGCCAC 3’ và Tm = 34,3 0 C.  Primer OPA05: 5’AGGGGTCTTG 3’ và Tm = 30,2 o C.  Primer RAH8: 5’ GAGAGCCAAC 3’ và Tm = 31,9 0 C.  Primer 9: 5’ GGTACTCCCC 3’ và Tm = 33,9 0 C.  Primer OPA10: 5’ GTGATCGCAG 3’ và Tm = 30,7 0 C. 37 3.3.2.2. Tiến hành thí nghiệm a. Thí nghiệm 1: Sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2. Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 H2O 13 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút 38 Ổn định 40 C b. Thí nghiệm 2: Khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4. Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 H2O 13 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây Ta= Tm ± X 0 C (2 < X < 4) 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Ổn định 40 C Ta: nhiệt độ của phản ứng PCR. T m: nhiệt độ nóng chảy của mồi. Nhiệt độ phản ứng PCR đối với mỗi mồi Primer 1: Ta = 38 0 C. Primer 2: Ta = 36 0 C Primer OPA5: Ta = 34 0 C. Primer 9: Ta = 36 0 C. Primer RAH8: Ta = 34 0 C. Primer OPAC10: Ta = 36 0 C. Primer OPA10: Ta = 34 0 C. 39 c. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ primer OPAC10 với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6. Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3. Nghiệm thức Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 5 DNA 20 ng / l 1 Nghiệm thức 1 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Nghiệm thức 2 Primer 100 pmol / l 1 pmol / l 0,25 Nghiệm thức 3 Primer 100 pmol / l 0,8 pmol / l 0,2 Nghiệm thức 4 Primer 100 pmol / l 0,6 pmol / l 0,15 H2O Thêm vào cho đủ 25 l. Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3. Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 94 30 giây 40 40 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Ổn định 40 C d. Thí nghiệm 4: Sử dụng primer OPCA10 thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, với thành phần hóa chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.9 và bảng 3.10. Bảng 3.7: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4. Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng ( l) PCR buffer 10 X 1 X 2,5 MgCl2 25 mM 3 mM 3 dNTP 25 mM 0,2 mM 0,2 Primer 100 pmol / l 1,2 pmol / l 0,3 Taq DNA polymerase 5 U 1 U 0,2 DNA 20 ng / l 20 ng / l 1 H2O 17,8 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.8: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở thí nghiệm 4. Số chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian 1 94 5 phút 40 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 41 1 72 5 phút Ổn định 40 C Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD Trong thành phần phản ứng, Taq DNA polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,2 l), để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn một lần nhiều phản ứng. Các thao tác trộn mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng, nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt dẫn đến thể tích hút không chính xác, các hóa chất trong dung dịch hút không đồng đều. Taq DNA polymerase phải đƣợc thêm vào sau cùng. Sau khi đã thêm Taq vào hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải đƣợc tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay. Ngoài ra, kết quả phản ứng RAPD còn phụ thuộc một số yếu tố khách quan khác nhƣ: chất lƣợng gel (độ dày của gel không đồng nhất, chiều cao các giếng không đều), điện thế không ổn định hoặc điện cực của máy điện di bị cong và dung dịch điện di. 42 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 36 mẫu lá Đƣng từ những cây có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây con, cây mọc tự nhiên, tái sinh hay đƣợc trồng. Hình 4.1 Vị trí các mẫu Đƣng đƣợc thu thập trên bản đồ Cần Giờ. Tuy số mẫu thu đƣợc rất ít so với tổng diện tích hơn 38.000 ha (1993 - 1999) của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng các mẫu có sự phân bố rải rác giữa 43 hai vùng quan trọng, đó là vùng lõi (tiểu khu 11,12) và vùng đệm (tiểu khu 1, 2, 7, 10). Cách thu thập mẫu ngẫu nhiên cũng giúp kết quả phân tích, đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng tại đây mang tính tổng thể và khách quan hơn. Đa số nhóm cây Đƣng mọc tự nhiên (22 cây) xanh tốt, có nhiều nhánh, nhiều hoa và trái, ít sâu bệnh. Bên cạnh cây xanh tốt, những cây đƣợc trồng (11 cây) khác đều có lá to, nhiều lá vàng, sâu bệnh. Riêng 3 cây tái sinh thu thập đƣợc đều có lá to và nhiều sâu. Điều này chứng tỏ, cây mọc tự nhiên có sức sống tốt ít bị tác động bởi sâu bệnh, sinh trƣởng mạnh, cho nhiều hoa và trái to, có thể trồng xen vào các quần thể Đƣng đƣợc trồng nhằm tăng hiệu quả tái tạo rừng và đảm bảo tính đa dạng sinh học tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 4.2. Bảo quản mẫu Mẫu lá Đƣng tƣơi trong điều kiện – 20 0C sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Điều này là do khi trữ ở – 20 0C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá Đƣng. Khi tiếp xúc với nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá Đƣng đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Để khắc phục nhƣợc điểm trên, chúng tôi đề nghị một số giải pháp nhƣ sau:  Cách trữ mẫu tƣơi tốt nhất là cho vào trong túi nilông, ép hết không khí trong túi ra ngoài và trữ ở 4 oC. Với cách trữ này, mẫu có thể bảo quản đƣợc trong vòng 15 ngày mà không bị hƣ hỏng khi lấy ra ngoài điều kiện nhiệt độ phòng. Cách khác cắt mẫu lá tƣơi sẵn trƣớc khi nghiền, có thể trữ đƣợc 7 ngày. Tuy nhiên theo cách này, thì mẫu đem ra phải đƣợc nghiền ngay trong nitơ lỏng, vì nếu nghiền trong EB mẫu sẽ nhanh chóng hóa nâu, chất lƣợng ly trích giảm. Lá có màu nâu do các hợp chất phenol tiết ra trong quá trình trữ mẫu tiếp xúc với không khí. Khi nghiền những mẫu này trong nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196 0C, các thành phần có trong lá nhanh chóng đƣợc đông lạnh lại, trong suốt quá trình nghiền mẫu luôn đƣợc tiếp xúc với nitơ lỏng, vì vậy chất lƣợng DNA ly trích đƣợc sẽ tốt hơn. Mẫu lá tƣơi cũng có thể đƣợc nghiền trong nitơ lỏng và bảo quản ở - 70 0C, nhƣng sau khi lấy ra khỏi tủ âm phải 44 cho EB vào ủ liền, nếu không mẫu sẽ hóa nâu rất nhanh. Việc trữ mẫu đã nghiền trong nitơ lỏng ở điều kiện – 70 oC có thể bảo quản đƣợc trong vòng 20 ngày nhƣng mẫu nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh.  Để đạt đƣợc kết quả ly trích tốt nhất nên ủ mẫu với dịch trích EB ngay khi vừa nghiền xong. 4.3. Kết quả OD (Optical Density) Tỷ lệ OD của tất cả các mẫu thu thập đƣợc dao động từ 1,1 đến 2,43, tỷ lệ trung bình 1,7. Tỷ lệ này không cao do một số mẫu DNA có kết quả quá thấp (1,095 đến 1,66). Một số mẫu DNA khác cho kết quả cao hơn (1,72 đến 2,43). Tỷ lệ OD trung bình đối với 25 mẫu điện di cho kết quả tốt là 1,86. Tỷ lệ này không cao là do những mẫu thực hiện phản ứng RAPD không tốt có tỷ lệ OD rất thấp, từ 1,1 đến 1,75. Đó là những mẫu đƣợc ly trích đã lâu và thƣờng xuyên bị lấy ra khỏi nơi bảo quản trong quá trình thao tác gây sốc nhiệt mẫu DNA. Hàm lƣợng DNA trung bình của 36 mẫu là 676,02 ng / µl. Hàm lƣợng DNA 25 mẫu điện di tốt (752,19 ng / µl) cao hơn mức trung bình chung, tuy nhiên vẫn còn một ít mẫu có hàm lƣợng DNA thấp nhƣ mẫu 29 (263,56 ng / µl). Mẫu 1B.23 có hàm lƣợng DNA cao nhất (1436,5 ng / µl), tỷ lệ OD không cao (1,66) nhƣng kết quả điện di band sản phẩm sáng rõ, không tạp và không bị đứt gãy. Từ kết quả OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc chúng tôi nhận thấy chỉ những mẫu Đƣng có tỷ lệ OD cao hơn 1,48 và hàm lƣợng DNA phải đạt 263,56 ng / µl trở lên thì khi thực hiện phản ứng RAPD mới xây dựng đƣợc cây phân loại. 45 4.4. Kết quả điện di 4.4.1. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 1 Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 1. Ban đầu thực hiện quy trình 1 (quy trình của Doyle và Doyle (1988)), kết quả chúng tôi không thu đƣợc DNA hoặc DNA không tinh sạch và các band bị nhòe (smear) không gọn đẹp. Điều này có thể do quá trình bảo quản mẫu không tốt, thao tác nghiền mạnh, vortex quá mạnh (14.000 vòng / phút) hoặc sau khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol mà vẫn vortex đã làm DNA bị gãy. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này không đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RAPD. Việc ly trích DNA từ mẫu Đƣng gặp nhiều khó khăn vì lá Đƣng chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sự kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 5, 8, 9, cũng ảnh hƣởng đến thao tác hút dịch nổi ở bƣớc 2, 3, của cả 3 quy trình, và thêm bƣớc 4 ở quy trình 3. Ngoài ra, trong lá Đƣng chứa rất nhiều hợp chất thứ cấp nên ảnh hƣởng đến tác dụng của các hóa chất ly trích. 4.4.2. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 2 Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu ly trích theo quy trình 2. 46 Quy trình 2 đƣợc thực hiện nhằm thu đƣợc DNA chất lƣợng tốt hơn. Trong quy trình này, ly tâm sẽ đƣợc thực hiện trƣớc khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol, nhằm loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá Đƣng giúp cho Chloroform : Isoamyl alcohol có tác dụng tốt hơn, band tƣơng đối rõ, hiện tƣợng DNA gãy và lẫn tạp giảm đi một ít. Vì thế, mẫu DNA thu đƣợc có chất lƣợng tƣơng đối tốt hơn. Thế nhƣng, trong quá trình thực hiện quy trình 2, chúng tôi nhận thấy không phải mẫu lá Đƣng nào ly trích cũng cho kết quả ổn định. Trong những lần ly trích khác nhau, với cùng một mẫu lá với cùng quy trình nhƣng chất lƣợng đã có sự khác biệt. Ngoài ra, việc khắc phục hiện tƣợng DNA bị đứt gãy chƣa thật tốt, tạp chất vẫn còn nhiều. Sau nhiều lần thử nghiệm với quy trình 3, nghiền mẫu trong nitơ lỏng, có sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone) chúng tôi nhận thấy chất lƣợng DNA tốt hơn, band điện di sáng rõ, DNA ít bị đứt gãy, ít tạp hơn. Hình 4.4 Sự khác biệt giữa DNA mẫu ly trích theo quy trình 2 và quy trình 3. Cùng mẫu 7.10, ở quy trình 2 band sáng rõ, nhƣng vẫn còn tạp, quy trình 3 sản phẩm điện di tốt hơn, không bị tạp. Tƣơng tự nhƣ vậy, mẫu 7.13 ở quy trình 2 chƣa tốt, DNA bị gãy, có tạp, nhƣng quy trình 3 hai mẫu 7.13 đều tạo band sáng rõ, không tạp và DNA không bị đứt gãy. Kết quả điện di hình 4.4 thể hiện chất lƣợng DNA ly trích theo quy trình cải tiến sử dụng nitơ lỏng tốt hơn so với hai quy trình 1 và 2. Quy trình 2 Quy trình 3 47 4.4.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc theo quy trình ly trích 3 Hình 4.5 Kết quả điện di 12 mẫu ly trích theo quy trình 3. Hình 4.6 Kết quả điện di 13 mẫu ly trích theo quy trình 3. DNA mẫu thu đƣợc từ quy trình 3 khá tốt. Những mẫu đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RAPD là những DNA tạo band sáng rõ, ít bị gãy và tạp khi điện di. Kết quả OD của 25 mẫu này dao động từ 1,48 (mẫu 33) đến 2,43 (mẫu 2B.15), trung bình là 1,86. Tỷ lệ OD trung bình trên 20 mẫu thực hiện phản ứng RAPD tốt là 1,95. Đối với những mẫu thực hiện phản ứng RAPD không thành công, tỷ lệ OD trung bình 1,36 biến thiên trong khoảng 1,1 (mẫu 11.7) đến 1,75 (mẫu 11.2), tuy có vài mẫu kết quả OD tƣơng đối cao (mẫu 11.2: 1,75), nhƣng nhìn chung kết quả này rất thấp. Những mẫu này là những mẫu lá trƣởng thành, lá già. Hơn nữa, việc bảo quản mẫu không tốt, số lá thu đƣợc trên một cây bị hạn chế, lƣợng DNA bị mất dần theo thời gian bảo quản. Tất cả đều đƣợc thu thập từ những cây có lá vàng, nhiều sâu và cây ốm yếu. Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi quyết định ly trích DNA theo quy trình 3 và bảo quản mẫu ở - 20 0C, hạn chế lấy mẫu ra khỏi nơi bảo quản nhằm ổn định chất lƣợng DNA để thực hiện kỹ thuật RAPD. 48 Trong quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi nhận thấy:  Mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng tốt hơn mẫu nghiền trong EB.  Tăng thời gian ủ mẫu và ly tâm trƣớc khi cho Chloroform : Isoamyl alcohol nhằm loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá Đƣng giúp các hóa chất tăng khả năng hoạt động.  Khi đã cho Chloroform : Isoamyl alcohol không nên vortex mà chỉ đảo nhẹ để tránh làm đứt gãy DNA.  Những bƣớc lấy dịch nổi không nên để đầu tip chạm vào phần tạp (protein) ngăn cách 2 pha, cũng cần tránh hút quá mạnh vì tạp sẽ bị hút lên, ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA.  Không để khô cặn quá lâu sẽ làm hỏng DNA.  Không chọn lá quá non (đọt) vì lá còn non đang trong thời kỳ sinh trƣởng mạnh, chứa nhiều hợp chất thứ cấp ảnh hƣởng đến tác dụng của hóa chất. Ngoài ra, lá non chứa nhiều nƣớc nên lƣợng DNA trong lá non ít hơn lá trƣởng thành. Đồng thời cũng không chọn lá già. Bởi vì polysachride trong lá già tạo nhớt, ảnh hƣởng đến chất lƣợng ly trích qua các thao tác hút dịch nổi, đổ bỏ dịch trong gây thất thoát DNA mẫu. Nên sử dụng lá non (liền kề với đọt) sẽ cho kết quả ly trích tốt hơn.  Để khắc phục việc chọn mẫu lá non, chúng ta có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol nhƣ CTAB, - mercaptroethanol, chloroform và tăng lƣợng mẫu lá khi nghiền. Đối với lá già thì cho thêm PVP (Polyvinyl pyrrolidone) vào sẽ giúp hạn chế đƣợc ảnh hƣởng của polyscharide (tạo nhớt), sản phẩm ly trích ít có tạp hơn so với hai quy trình trƣớc, dịch nhớt cũng đã giảm đáng kể.  Nên trữ mẫu DNA ở - 20 0C nhằm hạn chế sự mất dần lƣợng DNA.  Dịch trích EB khi bảo quản thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (CTAB) ảnh hƣởng đến kết quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C khoảng 10 phút trƣớc khi sử dụng. Khi hút dịch trích nên khuấy đều dung dịch, để các thành phần hóa chất trong EB nhƣ nhau trong các lần hút. 49  Quy trình ly trích đã sử dụng - mercaptoethanol trong dung dịch EB, có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào tăng khả năng giải phóng DNA, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và việc sử dụng Chloroform : Isoamyl acohol 2 lần, ly tâm tốc độ cao đã giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide, và một số hợp chất thứ cấp khác. Nhìn chung quy trình ly trích cải tiến, nghiền trong nitơ lỏng và sử dụng PVP (Polyvinyl pyrrolidone) khá ổn định và hiệu quả. 4.5. Kết quả phản ứng RAPD 4.5.1. Kết quả khảo sát Primer OPAC10 Hình 4.7 Kết quả điện di sử dụng primer OPAC10, khảo sát quy trình RAPD. Kết quả điện di cho thấy chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất của quy trình RAPD trong thí nghiệm 1 phù hợp với cây Đƣng. So với những cây khác, với cùng thành phần hóa chất, cùng chu kỳ nhiệt thì cây Đƣng cho kết quả khá tốt: có nhiều band, các band tƣơng đối rõ, xuất hiện band đa hình giữa các cây. Để có đƣợc kết quả tốt hơn, chúng tôi tiến hành khảo sát trên những mồi khác với cùng thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt nhƣ thí nghiệm 1. 50 4.5.2. Kết quả khảo sát 7 mồi trên cây Đƣng cùng một số cây ngập mặn khác Hình 4.8 Kết quả điện di khảo sát Primer 1. (ĐƢ) Đưng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (MB) Mắm biển. Tham khảo kết quả của nhóm 3 cây mắm thì band đồng hình có kích thƣớc 400 bp, quan sát gel điện di thì thấy ở cây Đƣng cũng xuất hiện band có kích thƣớc tƣơng tự. Do chỉ mới khảo sát một lần đồng thời ở cây cóc và cây đƣớc đôi không xuất hiện band rõ ràng nên chƣa đủ cơ sở kết luận đây là band đại diện cho nhóm cây ngập mặn hay không. Vì vậy nên tiến hành thêm nhiều thí nghiệm kiểm chứng để có đƣợc một kết quả chính xác hơn. Hình 4.9 Kết quả điện di khảo sát Primer 9 và 2. (MĐ) Mắm đen, (MT) Mắm trắng, (C) Cóc, (ĐĐ) Đước đôi, (ĐƢ) Đưng, (MB) Mắm biển. Band đồng hình 51 Hình 4.10 Kết quả điện di khảo sát Primer RAH8. Kết quả điện di cho thấy, so với những cây khác thì Đƣng cho số band nhiều hơn, các band phân tách tƣơng đối rõ, có sự đa hình giữa các cây Đƣng với nhau (hình 4.7, 4.10). Cụ thể nhƣ sau:  Hình 4.7: Primer OPAC10 tạo nhiều band hơn các mồi khác, các mẫu đều cho nhiều band. Cụ thể, đối với mẫu 7.12 có 8 band, mẫu 2B.14 có 6 band.  Hình 4.8: Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band.  Hình 4.9: Primer 2: mẫu 7.12 có 1 band.  Hình 4.9: Primer 9: mẫu 7.12 có 2 band.  Hình 4.10: Primer RAH8: lần lƣợt theo thứ tự mẫu 7.12 có 4 band, mẫu 2B.14 có 1 band. Để thấy rõ sự khác biệt trong việc tạo sản phẩm RAPD giữa các mồi, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng RAPD với 7 mồi trên cùng một cây (7.12) theo chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất của thí nghiệm 2. Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của mẫu 7.12 với 7 mồi. (L) ladder, (Pr1) primer 1, (Pr2) primer 2, (Pr5) primer OPA5, (H8) primer RAH8, (C10) primer OPAC10,( Pr9) primer 9, (Pr10) primer OPA10. 52 Từ kết quả điện di trên hình 4.11, chúng tôi nhận thấy:  Primer 1: mẫu 7.12 có 4 band (300 bp, 430 bp, 550, bp, 650 bp).  Primer 2: mẫu 7.12 có 2 band (350 bp, >1000 bp).  Primer RAH8: mẫu 7.12 có 3 band (380 bp, 620 bp, >1000 bp) và một vài band mờ, khó xác định.  Primer OPAC10 tạo nhiều band, band sáng rõ và đậm, phân tách tốt hơn so với các mồi khác. Mẫu 7.12 có 5 band (400 bp, 520 bp, 800 bp, 1000 bp, >1000 bp).  Primer OPA5, primer 9 và primer OPA10 không có sản phẩm. Trong quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi rút ra nhận xét: Đối với các mồi OPA5, 9, OPA10 đã không tạo sản phẩm RAPD, điều này không thể hiện đƣợc bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên. Vì vậy có thể tiến hành thêm nhiều khảo sát khác để có những khi kết quả phân tích RAPD đối với ba mồi trên chính xác hơn. Từ những kết quả thu đƣợc của thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 với chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất trong thí nghiệm 1 để thực hiện phản ứng RAPD cho tất cả mẫu ly trích đạt tiêu chuẩn. Tuy nhiên, để có kết quả phản ứng RAPD tốt hơn thông qua việc thay đổi nồng độ mồi tăng khả năng tạo nhiều sản phẩm khuếch đại, nhằm thu đƣợc band sáng rõ, giúp cho việc xây dựng cây di truyền đạt đƣợc độ chính xác cao. 53 4.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ OPAC10 Hình 4.12 Kết quả điện di khảo sát nồng độ Primer OPAC10 trên mẫu 2B.14, 7.12. Theo kết quả điện di hình 4.12, thì nồng độ mồi 0,6 pmol / l và 0,8 pmol / l các band rất mờ và không phân tách rõ. Với nồng độ 1 pmol / l, số lƣợng band nhiều hơn, sáng hơn hai nồng độ trên nhƣng các band vẫn chƣa phân tách rõ ràng. Với nồng độ 1,2 pmol / l thì sản phẩm RAPD cũng có khá nhiều band, đồng thời các band đã có sự phân tách rõ hơn, dễ dàng xác định số band sản phẩm RAPD hơn các nồng độ khác, giúp xây dựng cây di truyền đạt kết quả tốt hơn. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định vẫn sử dụng nồng độ primer 1,2 pmol / l. 4.5.4. Kết quả sử dụng OPAC10 thực hiện phản ứng RAPD với tất cả các mẫu DNA ly trích đạt tiêu chuẩn Hình 4.13 Kết quả điện di 7 sản phẩm RAPD. Band đa hình Sản phẩm PCR không tốt (NT) nghiệm thức. 54 Hình 4.14 Kết quả điện di 8 sản phẩm RAPD. Hình 4.15 Kết quả điện di 10 sản phẩm RAPD. Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD với 25 mẫu DNA, 20 mẫu đạt kết quả, chiếm tỷ lệ 80 %. Kết quả điện di cho thấy phản ứng RAPD trên mẫu Đƣng cho sản phẩm PCR tƣơng đối tốt, chỉ 5 mẫu (11.3, 11.6, 2B.25, 2B.26, 33) không cho sản phẩm. Tất cả những DNA mẫu này đều là mẫu ly trích từ những cây non (2B.26, 33), lƣợng lá ít nên không chọn đƣợc loại lá thích hợp cho ly trích (lá gần kề đọt) và từ những mẫu lá già (11.3, 11.6, 2B.25) chất lƣợng ly trích không tốt, do lƣợng polysacharide lớn tạo nhiều nhớt, lƣợng DNA bị thất thoát lớn trong quá trình đổ bỏ dịch trong, hút dịch nổi. Vì vậy, cần tăng lƣợng DNA mẫu trong phản ứng RAPD nhằm có kết quả khả quan hơn. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này, không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau, từ đó làm nền tảng phân chia và xác định giống. Band đồng hình 300 bp Band đồng hình Sản phẩm PCR không tốt 300 bp 55 Hình 4.13 trong 6 mẫu DNA cho kết quả phản ứng RAPD, giữa các mẫu có sự đa hình cao (8 band đa hình, tuy nhiên không xác định đƣợc kích thƣớc các band, vì không sử dụng thang chuẩn – ladder khi điện di). Hình 4.14 trong 4 mẫu cho kết quả phản ứng RAPD thì đã xuất hiện 2 band đồng hình có kích thƣớc 300 bp, 400 bp. Tuy số mẫu rất ít cũng đã xuất hiện 4 band đa hình (đều ở mẫu 1B.23 có kích thƣớc 150 bp, 520 bp, mẫu 1B.23, 7.10 và 29: 480 bp, mẫu 1B.23 và 29: 680 bp). Hình 4.15 trong tổng số 10 mẫu đạt kết quả phản ứng RAPD đã thu đƣợc 9 band đa hình. Có 2 band đồng hình, kích thƣớc 300 bp, 400 bp. Trung bình có 4,25 band / mẫu (85 band / 20 mẫu). Tuy số band / mẫu không cao nhƣng kết quả điện di đã thấy rõ sự đa hình giữa các mẫu. Trong tổng số 20 mẫu DNA đạt kết quả trong phản ứng RAPD, căn cứ vào những band đã biết kích thƣớc, có 2 band đồng hình 300 bp, 400 bp chiếm tỷ lệ 11,11 %, 13 band đa hình chiếm tỷ lệ 72,22 %, đó là những band cùng có ở 1, 2 hoặc 3 mẫu mà không có ở những mẫu còn lại, có kích thƣớc >>> 1.000 bp (7.12), >> 1.000 bp (2B.19, 30), > 1.000 bp (7.12), 1.000 bp (30), 900 bp (7.12), 680 bp (1B.23, 29), 520 bp (1B.23), 480 bp (1B.23, 7.10, 29), 270 bp (28), 230 bp (2B.19, 30, 7.12), 180 bp (30, 2B.15), 160 (36), 150 bp (1B.23). Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn, nhƣng tất cả các mẫu đều xuất hiện band đồng hình có kích thƣớc 300 bp. Band này có thể sử dụng là band chỉ thị để phân biệt loài Đƣng Rhizophora mucronata Lamk. với các loài khác thuộc họ đƣớc Rhizophoraceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự, nhằm phục vụ cho công tác lai tạo trong chọn giống cũng nhƣ trong những nghiên cứu chuyên sâu hơn về cây Đƣng ở mức độ phân tử. Bên cạnh đó, số lƣợng band đa hình tƣơng đối cao 13 band trong 20 sản phẩm RAPD thu đƣợc. Với band đồng hình có kích thƣớc 400 bp thì một vài cây không tạo sản phẩm PCR, vì vậy cần tăng số lần thực hiện phản ứng RAPD để có kết luận chính xác hơn. 56 4.5.5. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD khá ổn định, cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề:  Với những mẫu không ra kết quả tốt có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1 μl DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng RAPD.  Một số band tách không rõ có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ agarose 2 % và điện di ở 50 V trong 70 phút cho độ phân tách cao hơn song vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, một số trƣờng hợp band không thẳng có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hƣởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng PCR, cho lƣợng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. Bên cạnh đó, khi điện di bằng gel agarose, kích thƣớc của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhƣng không thể phát hiện bằng mắt thƣờng. Có thể giải trình tự để biết chính xác kích thƣớc và trình tự của chúng. 4.6. Bƣớc đầu đánh giá mức độ di truyền cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng phần mềm NTSYS Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, theo nguyên tắc có band thì ghi 1, không có band thì ghi 0, để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS 2.1. Bảng số liệu (phụ lục 8, 9) hiển thị hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu một cách cụ thể, nhƣng vẫn khó khăn trong đánh giá tổng thể nhiều mẫu về mức độ tƣơng quan di truyền vì vậy trong phân tích đa dạng di truyền thƣờng sử dụng cây di truyền. Phụ lục 8 cho kết quả phân tích hệ số đồng dạng di truyền trên 6 mẫu đại diện, hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu biến thiên từ 14 đến 79 %. Nhƣ vậy các mẫu phân tích có khoảng cách di truyền khá xa nhau. Tuy nhiên kết luận này còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp. Nếu các mẫu có hệ số đồng dạng di 57 truyền thấp chiếm một tỷ lệ lớn, thì các mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa nhau. Ngƣợc lại nếu chỉ một vài mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp thì không kết luận đƣợc. Hình 4.16 Cây phân loại 6 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phân loại đối với 6 mẫu 7.9, 7.11, 7.13, 11.5, 27, 31 đƣợc thể hiện ở hình 4.16. Hệ số đồng dạng di truyền của các mẫu này biến thiên từ 46 đến 79 %. Các mẫu có quan hệ di truyền tƣơng I II 58 đối xa nhau, cây phân loại tạo đƣợc 2 nhánh lớn, cho thấy nhóm Đƣng này có sự phân ly phức tạp và đa dạng. Mỗi nhánh lại phân ra thành 2 nhánh nhỏ hơn, trung bình 1,5 mẫu / nhánh càng chứng tỏ nhóm 6 cây Đƣng này có nguồn gene phong phú. Tất cả những cây thuộc nhánh I (7.11, 11.5, 31) đều là cây mọc tự nhiên, trong khi đó 3 cây thuộc nhánh II (7.9, 7.13, 27) đã có 2 cây (7.9, 7.13) đƣợc trồng. Điều này càng củng cố thêm sự đa dạng về gene giữa các cây Đƣng trong nhóm. Các cây Đƣng thuộc nhánh I có hệ sống đồng dạng di truyền 52 % hệ số này thuộc dạng trung bình, chứng tỏ nhóm 11.5, 31 với mẫu 7.11 không có sự cách biệt di truyền cao. Tuy ở những tiểu khu khác nhau và không gần nhau nhiều nhƣng giữa mẫu 11.5 và mẫu 31 có quan hệ di truyền tƣơng đối gần (hệ số đồng dạng di truyền cao 79 %) có thể là do trƣớc đây 2 tiểu khu này có chung một quần thể Đƣng tự nhiên. Trong nhánh II, tuy 7.9 và 7.13 thuộc cùng một tiểu khu 7 nhƣng lại có hệ số đồng dạng di truyền (60 %) thấp hơn giữa 7.13 và 27 (79 %). Những cây có quan hệ di truyền gần phân bố rải rác ở những tiểu khu khác nhau có thể là do đã có sự can thiệp của con ngƣời trong quá trình chọn lọc giống để phục hồi rừng, đó cũng đƣợc xem là nguyên nhân vì sao 7.13 và 27 có khoảng cách di truyền thấp. Tiếp tục thực hiện phản ứng trên 14 mẫu Đƣng khác, hoàn toàn ngẫu nhiên, không phân biệt cây đƣợc trồng, tái sinh hay mọc tự nhiên, xanh tốt hay sâu bệnh, đảm bảo tính khách quan và mang tính đại diện cho quần thể Đƣng tại khu trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ và trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng di truyền (phụ lục 9), chúng tôi xây dựng đƣợc cây phân loại (hình 4.17). Các cây Đƣng chia thành 2 nhánh lớn và rất nhiều nhánh nhỏ (13 nhánh), chứng tỏ rằng các mẫu có sự phong phú về nguồn gene, giữa các cây có sự phân hóa đa dạng. Mức độ tƣơng đồng giữa 2 nhánh biến thiên từ 68 đến 100 %. 59 Hình 4.17 Cây phân loại 14 cây Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Hình 4.17 cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các mẫu, chỉ với 14 mẫu nghiên cứu đã có 13 nhánh trong cây phân loại, trung bình 1,1 mẫu / nhánh. Trong cả 2 nhánh I và II đều có một nhánh I.2 (7.12) và II.2 (1B.23) chỉ gồm một cây duy nhất. Có sự khác biệt cao giữa 7.12 và 1B.23 với các mẫu còn lại giúp tạo sự đa dạng về nguồn vật liệu di truyền giữa các cây Đƣng trong quần thể Đƣng của rừng. Với đặc điểm này, chúng ta có thể sử dụng cây 7.12 và 1B.23 làm giống để trồng xen vào các tiểu khu khác nhƣ 2B, 10, 11, 12 nhằm tăng thêm sự đa dạng về nguồn gene trong mỗi tiểu khu, đồng thời bảo tồn nguồn vật liệu di truyền của khu dự trữ sinh quyển, phục vụ cho những nghiên cứu sau này. Tuy số lƣợng mẫu thu thập đƣợc không lớn nhƣng giữa các cá thể đã có đƣợc sự phân hóa rõ thể hiện ở hình I II II.1 II.2 I.1 I.2 60 4.17, chứng tỏ quần thể Đƣng ở rừng ngập mặn Cần Giờ vẫn còn duy trì đƣợc sự đa dạng vốn có của rừng tự nhiên, công tác lâm sinh, chăm sóc và quản lý của ban quản lý rừng đạt hiệu quả. Hệ số đồng dạng di truyền giữa I.1 và I.2 là 76 %. Tất cả những cây trong nhánh I đều đƣợc thu thập dọc theo bờ biển ở những tiểu khu gần nhau (2B, 7, 10, 11, 12) (xem hình 4.1 tr.42 ) có thể đó là lý do chúng có mối quan hệ di truyền tƣơng đối gần nhau. Đặc biệt mẫu 11.1 và 12.8 thuộc 2 tiểu khu khác nhau nhƣng lại có hệ số đồng dạng di truyền là 1, trƣờng hợp này cần tiến hành nghiên cứu kỹ hơn, đồng thời cũng cần thu thêm nhiều mẫu ở 2 tiểu khu trên để có kết quả nghiên cứu tốt nhất và có thể đề ra hƣớng quản lý quần thể Đƣng ở 2 tiểu khu 11 và 12 tốt hơn. Tuy nhiên trên cơ sở những kết quả thu đƣợc có thể giải thích rằng chúng cùng một quần thể Đƣng tự nhiên sẵn có của rừng trƣớc kia và khoảng cách di truyền giữa các cá thể trong quần thể này tƣơng đối thấp. Trong nhánh II, hệ số đồng dạng di truyền giữa 2 nhánh II.1 và II.2 là 71 %, thuộc loại cao, nhƣng căn cứ vào cây phân loại hình 4.17, tuy có mối quan hệ họ hàng tƣơng đối gần, các mẫu vẫn đƣợc phân bố đều giữa các tiểu khu, không có trƣờng hợp hai cây ở gần nhau có khoảng cách di truyền quá thấp. Nhìn chung, với 36 mẫu thu nhập đƣợc, trên cơ sở phân tích 20 sản phẩm RAPD, tuy khoảng cách di truyền tổng thể giữa các mẫu thấp nhƣng các mẫu có sự phân bố tƣơng đối đều đảm bảo đƣợc tính đa dạng và phong phú vốn gene trong toàn quần thể Đƣng, góp phần ổn định hệ sinh thái chung của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chính nhờ sự phân hóa đa dạng và phức tạp trên đã giúp bảo tồn nguồn gene cây Đƣng cũng nhƣ góp phần duy trì đƣợc hệ sinh thái bền vững, mang lại lợi ích sinh thái và kinh tế lâu dài. Trên cơ sở hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu cao, chúng ta dễ dàng chọn ra đƣợc những cây tốt nhất phục vụ cho công tác lâm sinh khu rừng nói chung và cho quần thể Đƣng nói riêng. Tuy kết quả nghiên cứu quần thể Đƣng chứng tỏ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đã đi đúng hƣớng trong công tác khôi phục và bảo tồn hệ sinh thái rừng, mức độ đa dạng cao, có sự phân bố đều, nguồn gene dồi dào nhƣng các đơn vị hữu quan cũng cần quan tâm hơn đến nguồn tài nguyên di truyền phong phú của quần thể Đƣng tại Cần Giờ, đồng thời xúc tiến nhiều nghiên cứu chuyên sâu hơn trong lĩnh vực sinh học phân tử giúp bảo tồn, duy trì và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng bền vững. 61 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:  Nhiệt độ bảo quản mẫu tƣơi ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA mẫu thu đƣợc khi ly trích. Nên sử dụng lá non gần kề đọt ly trích để DNA mẫu thu đƣợc có chất lƣợng tốt. Mẫu lá nghiền nitơ lỏng xong nên ủ ngay với dịch ly trích EB. Trong tổng số 36 mẫu thu thập đã ly trích đƣợc 25 mẫu (69,44 %) đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RAPD. Sau khi ly trích mẫu DNA nên tiến hành phản ứng RAPD ngay vì lƣợng DNA sẽ mất dần trong thời gian bảo quản. Phải giữ nhiệt độ ổn định trong thời gian bảo quản mẫu DNA.  Phản ứng RAPD có khả năng nhân bản cao. Primer OPAC10 dùng trong phản ứng RAPD đã khuếch đại tại 18 locus trên 14 mẫu phản ứng, trong đó có 2 band đồng hình (11,11 %) kích thƣớc 300 bp, 400 bp và 13 band đa hình (72,22 %).  Đối với nhóm 6 cây Đƣng (7.9, 7.11, 7.13, 11.5, 27, 31) thì có sự phân nhánh rõ giữa Đƣng mọc tự nhiên và Đƣng trồng, hệ số đồng dạng di truyền thấp 46 – 79 %. Tuy kết quả phân tích trên 14 mẫu ngẫu nhiên khác, đại diện cho quần thể Đƣng tại Cần Giờ, hệ số đồng dạng di truyền thấp dao động từ 68 đến 100 % nhƣng các mẫu có sự phân bố đa dạng, đồng đều, những cây thu thập gần nhau có khoảng cách di truyền tƣơng đối xa, giữa các cá thể vẫn thể hiện đƣợc tính đa dạng sinh học cao, nguồn vật liệu di truyền phong phú. 62 5.2. Đề nghị  Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 cùng với việc thử nghiệm thêm những primer mới, để đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng với số lƣợng mẫu lớn hơn và rải rộng hơn trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Thu thập những cây Đƣng có những đặc điểm hình thái đặc biệt (về hình dạng lá, hoa, màu sắc hoa, trái) nhằm đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần thể Đƣng chính xác hơn. Đặc biệt nên thu thập những mẫu cây Đƣng nằm sâu trong rừng để đạt đƣợc một kết quả thật tổng quát về quần thể Đƣng hiện có của rừng ngập mặn Cần Giờ.  Tách band 300 bp, 400 bp để giải trình tự phục vụ cho việc phân biệt loài Đƣng (Rhizophora mucranta Lamk.) với những loài khác thuộc họ đƣớc (Rhizophoraceae). Đặc biệt là band 300 bp, vì hầu hết các sản phẩm RAPD trên cây Đƣng đều tạo band này.  Phải có biện pháp thúc đẩy những nghiên cứu làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng, phong phú của nguồn gene đảm bảo cho sự phát triển bền vững của cả khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ và các vùng phụ cận.  Hiện nay, quần thể đƣớc đang đến giai đoạn già, sâu bệnh gây hại ở mức báo động. Để khắc phục khả năng các cây đƣớc trong cùng khu vực có mối quan hệ di truyền gần, tạo điều kiện cho mầm bệnh dễ lây lan và thiếu sự đa dạng sinh thái ngay trong khu vực đó, chúng ta có thể tiến hành các kỹ thuật lâm sinh trồng xen Đƣng với đƣớc nhằm đạt đƣợc sự đa dạng cao, mang lại hiệu quả tốt nhất trong việc ngăn chặn sâu bệnh và hình thành một hệ sinh thái ổn định. 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Quỳnh Anh, 2005. Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Nguyên Ban, 2000. Nghề Lâm Sinh. Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 4. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục. 6. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo dục TP. Hồ Chí Minh. 7. Phạm Thành Hổ, 2006. Bài giảng Một số chỉ thị phân tử và ứng dụng trong công tác giống cây trồng. 8. Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuấn, 2006. Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000). Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 9. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 10. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 11. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 12. Trần Đình Nghĩa (chủ biên), 2005. Sổ tay thực tập thiên nhiên. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 64 13. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. TIẾNG ANH 14. Desmond S.T. Nicholl, 1994. An introduction to genetic engineering. University of Paisley. 15. Gene Namkoong and Dr. Mathew P. Koshy, 2001. Application of Genetic Markers to Forest tree species. 16. Ulrich G. Mueller and L. LaReesa Wolfenbarger, 1999. AFLP genotyping and fingerpringting. TRANG WEB 17. wNzYmZ3JvdXBpZD0ma2luZD1leGFjdCZrZXl3b3JkPUMlZTElYmElYTZO K0dJJWUxJWJiJTlj&page=1 18. 19. StudentScholars/project/archives/onions/rapd1.gif 20. 21. 22. 23. Mo_hinh_san_xuat_giong_va_nuoi_ca_bong_tuong_cong_nghiep.html 24. 25. 26. 27. 65 28. 0&p=5154&#entry5154 29. doc 30. an/xa_hoi/dia_ly_thu_muc/ba_he_sinh_thai_rung?left_menu=1 31. Description 32. Energy 33. #Chemistry 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 66 46. 47. 48. 49. www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/hd_so10_05.htm 50. www.nea.gov.vn/thongtinmt/noidung/sg_4_4_05.htm 51. www.saigon-tourist.com/vn/khudulich/vamsat.htm 52. www.vnn.vn/khoahoc/moitruong/2005/03/394535/ - 1 - PHỤ LỤC 1: Đặc điểm cây Đƣng đƣợc thu thập tại rừng ngập mặn Cần Giờ. STT TÊN MẪU TIỂU KHU TỌA ĐỘ ĐỊA LÝ ĐẶC ĐIỂM GHI CHÚ 48P UTM 1 11.1 11 0706116 1160712 h = 3 m, d = 2 - 4 cm. Cây có nhiều nhánh nhỏ, có nhiều hoa, trái nhỏ. Tự nhiên 2 11.2 11 0705980 1160966 h= 3 m, d = 2 cm. Cây xanh tốt, có 5 nhánh lớn, trái dài. Tự nhiên 3 11.3 11 0706034 1161073 h = 5 m, d = 8 cm. Cây xanh tốt, có nụ hoa, ít trái. Tự nhiên 4 11.4 11 0706623 1161423 h = 4 m, d = 5 cm. Cây có ít hoa, ít trái, lá có nhiều sâu. Tự nhiên 5 11.5 11 0706795 1161474 h= 3 m, d = 2 cm. Cây có nhiều lá vàng, ít sâu, lá già, không hoa, không trái. Tự nhiên 6 11.6 11 0706252 1161267 h = 3 m, d = 3 cm. Cây có ít nhánh, lá già, không hoa, không trái. Tự nhiên 7 11.7 11 0704683 1160909 h = 1 m, d = 1 cm. Cây xanh tốt, lá to. Tái sinh 8 12.8 12 0706176 1161331 h = 2 m, d = 2 cm. Cây tốt, không hoa, không trái. Tự nhiên 9 7.9 7 0711211 1165828 Cây ngập triều, còn nhỏ tuổi, không hoa, không trái. Trồng 10 7.10 7 0711348 1166061 Cây ngập triều, còn nhỏ tuổi, không hoa, không trái. Trồng - 2 - 11 7.11 7 0711394 1166150 h = 2,5 m, d = 2 cm. Cây có 3 nhánh, xanh tốt, trái nhỏ, ít hoa. Tự nhiên 12 7.12 7 0711395 1166151 h = 2,5 m, d = 2 cm. Cây xanh tốt, không hoa, không trái. Tự nhiên 13 7.13 7 0711427 1166225 Cây ngập triều, cây xanh tốt. Trồng 14 2B.14 2B 0714899 1168188 Cây ngập triều, cây xanh tốt, lá non. Trồng 15 2B.15 2B 0713958 1169946 h = 1,5 m, d = 1 cm. Cây xanh tốt. Trồng 16 2B.16 2B 0713738 1170168 h= 1 m, d = 1,5 cm. Cây có nhiều lá vàng. Trồng 17 2B.17 2B 0712242 1170840 h = 2 m, d = 1,5 cm. Cây có nhiều lá vàng. Trồng 18 2B.18 2B 0712082 1170712 h = 1 m, d = 1,5 cm. Cây có nhiều lá già. Tự nhiên 19 2B.19 2B 0711195 1170519 h < 1m, d = 1 cm. Cây có ít lá vàng. Tự nhiên 20 1.20 1 0711030 1170481 h = 1 m, d = 1 cm. Cây nhỏ, nhánh nhỏ, lá già. Tự nhiên 21 2B.21 2B 0710388 1170284 h = 3m, d= 8 cm. Cây to có nhiều quả. Tự nhiên 22 2B.22 2B 0710667 1170125 h = 2 m, d = 1,5 cm. Cây tốt, lá già. Tự nhiên 23 1B.23 1B 0710061 1170096 h = 2 m, d = 2 cm. Cây xanh tốt. Tự nhiên 24 1.24 1 0709658 1170361 h = 2,5 m, d = 3 cm. Cây xanh tốt. Tự nhiên 25 2B.25 2B 0710202 1169668 h = 1,5 m, d = 1 cm. Lá cây xanh đậm, già. Tự nhiên 26 2B.26 2B 0710689 1168900 h = 1 m, d = 1 cm. Cây còn non, lá xanh. Tự nhiên - 3 - 27 27 10 N 10° 30' 05.1" E °106 52' 05.0" h = 4 m, d = 8-10 cm. Cây xanh tốt, có nhiều hoa, nhiều trái, trái dài 20 cm. Tự nhiên 28 28 10 N 10°/ 30'/ 04.6'' E 106° 52' 04.6" h = 5 m, d = 11 cm. Cây có hoa, trái dài 20 -25 cm. Trồng 29 29 10 N 10° 30' 07.1" E 106° 52' 59.5" h = 1m, d = 1,5 cm. Cây có nhiều lá sâu, lá to. Tái sinh 30 30 10 N 10° 30' 07.3" E 106° 52' 03.3" h = 8 m, d =15 cm. Cây xanh tốt, lá to, có nhiều hoa, trái dài 30 cm. Trồng 31 31 10 N 10° 30' 06.2" E 106° 52' 10.0" h = 6m, d = 10 cm. Cây có nhiều hoa, nhiều trái. Tự nhiên 32 32 10 N 10° 30' 07.2" E 106° 52' 59.8" h = 0,8 m, d = 1 cm. Cây ngập triều có nhiều lá sâu. Tái sinh 33 33 10 N 10° 30' 05.2" E106° 52' 04.5" h = 1 m, d = 1 cm. Cây có nhiều sâu. Trồng 34 34 10 N 10° 30' 05.5" E 106° 52' 04.1" Cây ngập triều, lá nhỏ. Tự nhiên 35 35 10 N 10° 30' 05.3" E 106° 52' 04.0" Cây ngập triều, lá nhỏ. Tự nhiên 36 36 10 N 10° 30' 04.9" E 106° 52' 04.8" h = 5m, d = 3 cm. Cây xanh tốt, lá to. Trồng - 4 - PHỤ LỤC 2: Công dụng và cách pha hóa chất ly trích. HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M = 364,46 g / mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân. Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC. Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp. Dung dịch gốc. Ethanol 70% Rửa DNA. Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng. Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate. Dung dịch gốc. Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm. Dung dịch gốc. Iso Amylalcohol (C5 H10O, M = 88,75 g / mol) Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao. Dung dịch gốc. Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên. Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol. EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O8.2H2O, M = 372,54 g / mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++. Pha 100ml - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20phút trƣớc khi dùng. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M = 157,56 g / mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất. Pha 100ml - 15,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - 5 - - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M = 58,44 g / mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA. Pha 100ml - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 10X Dung dịch Stock. Pha 100ml - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA. Pha 100ml 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần. EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích. Pha 100ml - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml β - mercaptro Ethanol thêm vào ngay trƣớc khi sử dụng. Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M = 82,03 g / mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC. Pha 100ml - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích. Pha 1ml - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA. Dung dịch gốc. - 6 - PHỤ LỤC 3: Quy trình ly trích DNA từ mẫu lá Đƣng, sử dụng nitơ lỏng. Cho vào 300 l TE 1X. Ủ 370 C 1h Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%. Trộn đều. Ủ – 200 C / 1 h Bƣớc 9 Bƣớc 8 Ly tâm 11.000 vòng trong 25 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 12.000 vòng trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10 Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn ở 370C, hòa tan cặn trong 50 l TE 1X. Ủ 370 C / 1 h. Bƣớc 11 Bảo quản mẫu ở -20oC. Buớc 12 Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô. Nghiền trong nitơ lỏng. Thêm 1,2 ml dịch trích EB có PVP. Bƣớc 1 Vortex 800 vòng / phút Ủ 650C / 1 h Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút ở 4oC. Thu 700 l dịch nổi. Bƣớc 2 Lặp lại bƣớc 3. Thu 300 l dịch nổi. Bƣớc 3 Bƣớc 4 Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu 500 l dịch nổi. Thêm 200 l dung dịch isopropanol lạnh. Tủa ở -20 0 C Qua đêm Bƣớc 5 Ly tâm 11.000 vòng, 15 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong. Thu kết tủa trắng. Bƣớc 6 Bƣớc 7 - 7 - PHỤ LỤC 4: Kết quả OD (Optical Density) 25 mẫu DNA có kết quả điện di tốt. STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD Abs Abs HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 1 27 2.03300 0.11357 4.8260 E - 2 540.61930 2 28 2.01150 0.18893 9.39250E - 2 850.23970 3 29 1.71620 6.2866 E - 2 3.6631 E - 2 263.55554 4 30 1.80010 0.13046 7.2470 E - 2 559.70140 5 31 1.74413 0.13435 7.7158 E - 2 567.29270 6 33 1.47940 0.32869 0.22218 1267.61210 7 36 2.01140 5.8861 E - 2 2.9263 E - 2 264.88889 8 1.24 1.98640 0.19329 9.7306 E - 2 865.49250 9 11.1 2.01530 6.0973 E - 2 3.0255 E - 2 274.60217 10 11.3 1.79630 0.26305 0.14644 1127.40050 11 11.4 2.00030 0.19039 9.5182 E - 2 854.89790 12 11.5 1.65810 0.34877 0.21035 1436.50330 13 11.6 1.54730 0.23938 0.15471 948.74420 14 12.8 2.11180 9.1696 E - 3 1.9364 E - 3 507.05744 15 1B.23 1.65810 0.34877 0.21035 1436.50330 16 2B.14 1.79390 0.26242 0.16290 1064.18180 17 2B.15 2.43260 6.7916 E - 3 2.7919 E - 3 326.68324 18 2B.19 2.01920 0.18792 9.3068 E - 2 846.97200 19 2B.25 1.52800 0.26414 0.17287 1039.10860 20 2B.26 1.61700 0.15273 9.4405 E - 2 620.81370 21 7.10 1.74460 0.13399 7.6805 E - 2 566.29910 22 7.11 1.65590 0.14475 8.7415 E - 2 595.78350 23 7.12 2.01140 5.8861 E - 3 2.9263 E - 3 264.88889 24 7.13 1.97540 0.19388 9.8145 E - 2 866.18320 25 7.9 2.03300 0.18783 9.2391 E - 2 848.84310 - 8 - PHỤ LỤC 5: Kết quả OD (Optical Density) 11 mẫu DNA có kết quả điện di không tốt. STT TÊN MẪU TỶ LỆ OD Abs Abs HÀM LƢỢNG DNA (ng / μl) 1 11.2 1.75350 6.5513 E - 3 3.7360 E - 3 277.58077 2 11.7 1.09540 1.9694 E - 2 1.7979 E - 2 59.15086 3 2B.16 1.26960 1.4285 E - 2 1.1251 E - 2 49.34905 4 2B.17 1.21280 1.2716 E - 2 1.0485 E - 2 42.23764 5 2B.18 1.46260 0.32831 0.22448 1256.94190 6 1.20 1.14390 1.5054 E - 2 1.3161 E - 2 47.31006 7 2B.21 1.36770 8.5273 E - 3 6.2346 E - 3 311.92157 8 2B.22 1.52920 0.27609 0.18054 1086.66210 9 32 1.36130 0.33904 0.24906 1235.94560 10 34 1.51950 0.28539 0.18782 1118.95110 11 35 1.21140 1.3666 E - 2 1.11281E - 2 45.89834 PHỤ LỤC 6: Bảng mã hóa số liệu điện di trên của 6 mẫu lá Đƣng. - 9 - PHỤ LỤC 7: Bảng mã hóa số liệu điện di và kích thƣớc các band của 14 mẫu lá Đƣng. PHỤ LỤC 8: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với 6 mẫu. - 10 - PHỤ LỤC 9: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với 14 mẫu.