Bước đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững chắc cho em trong cuộc sống sau này. Để có đƣợc những thành công bƣớc đầu nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ba má là những ngƣời đã có công sinh thành, dƣỡng dục và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học. Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ƣu tú, rất tận tụy trong công tác, là ngƣời đã vạch ra hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng đƣợc tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản. Thầy Nguyễn Văn Út là ngƣời rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho em làm cơ sở áp dụng trong đề tài. Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài. Hai anh Khƣu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ Khánh Hƣng là những ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ, cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những ngƣời đã giúp đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống. Sinh viên Trƣơng Thị Hoàng Diệu iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU. Lớp DH03SH, Khóa 2003-2007, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tên đề tài: “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Kỹ sƣ NGUYỄN VĂN ÚT Thời gian tiến hành đề tài: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ sinh học sinh sản. Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó cũng là một loài đáng đƣợc lƣu tâm. Trong đề tài có 3 thí nghiệm đƣợc tiến hành: Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert- TALP và TYH Kết quả: Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM là 4,88%, 100 µM là 1,65% và đối chứng (0 µM ) là 1,3%. Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ các giai đoạn là 21,64% với nồng độ orcein là 0,75% và 28,19% với nồng độ 1%. Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trƣờng Fert- TALP là 0,4%, trên môi trƣờng TYH là 0%. v SUMMARY TRUONG THI HOANG DIEU. Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology Department of Nong Lam University. Advisor: Prof: TRAN THI DAN Engineer: NGUYEN VAN UT Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”. Period: from the 1 st Match, 2007 to the 15 th August, 2007. Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University. In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive biotechnology. Embryos are used for stem cell technology, animal breeding, conservation of valuable mammalian species,… including dog. The thesis consists of three experiments: To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on mature oocyte rate. To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result. To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro fertilization result. The results: Mature oocyte rate was 1,3% in control; 4,88% in 50 µM β-mercaptoethanol; 1,65% in 100 µM β-mercaptoethanol. Defined oocyte rate was 21,64% in 0,75% orcein; 28,19% in 1% orcein. Fertilized oocyte rate was 0,4% in Fert-TALP medium and 0% in TYH medium. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................... vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... x Danh mục các hình và biểu đồ .................................................................................. xi Danh mục các bảng .................................................................................................. xii Chƣơng 1 : MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ......................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu ........................................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1 Buồng trứng .................................................................................................... 3 2.1.1 Vị trí, hình thái ...................................................................................... 3 2.1.2 Cấu tạo................................................................................................... 3 2.1.3 Chức năng ............................................................................................. 3 2.2 Nang noãn ........................................................................................................ 4 2.2.1 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4 2.2.2 Sự phát triển của nang noãn .................................................................. 4 2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng ...................................................................... 6 2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn ............................................................. 7 2.2.4.1 Trƣởng thành nhân ...................................................................... 7 2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất ............................................................ 8 2.2.5 Sự rụng trứng ........................................................................................ 9 2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) .................... 9 2.3.1 Lịch sử IVM .......................................................................................... 9 2.3.2 Môi trƣờng IVM .................................................................................. 10 vii 2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM ......................................................... 10 2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM .......................................... 10 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM ............................................. 12 2.3.3.1 Thời gian ................................................................................... 12 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn ............................... 13 2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái ........................................... 13 2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng .................... 13 2.4 Phó tinh hoàn ................................................................................................. 13 2.5 Tinh trùng ...................................................................................................... 15 2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng ..................................................................... 15 2.5.2 Quá trình sinh tinh ............................................................................... 16 2.5.3 Cấu tạo................................................................................................. 16 2.5.4 Thành phần .......................................................................................... 17 2.5.5 Đặc tính sinh lý ................................................................................... 17 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng ........................... 18 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) ................................ 19 2.6.1 Lịch sử IVF ......................................................................................... 19 2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh ......................................................................... 20 2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi ........................................................ 21 2.6.4 Vật liệu cho IVF ................................................................................. 22 2.6.4.1 Giao tử ...................................................................................... 22 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF ......................................................................... 22 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro .............................................................. 23 2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh ................................................................... 24 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF ........................................................... 25 Chƣơng 3: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 26 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 26 3.2 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26 3.3 Vật liệu........................................................................................................... 26 viii 3.3.1 Nguồn mẫu .......................................................................................... 26 3.3.2 Hóa chất............................................................................................... 27 3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng ........................................................... 27 3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng .................................................... 29 3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh ....................................................... 30 3.3.3 Dụng cụ - thiết bị ................................................................................. 31 3.3.3.1 Dụng cụ ..................................................................................... 31 3.3.3.2 Thiết bị ...................................................................................... 31 3.4 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 32 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng .......................................................... 32 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng ............................................................... 32 3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert-TALP và TYH .................................................... 32 3.5 Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 33 3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ .......................................................... 33 3.5.2 Xử lý buồng trứng ............................................................................... 35 3.5.3 Tìm và rửa trứng ................................................................................. 35 3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ............................................................ 35 3.5.5 Nuôi trứng ........................................................................................... 36 3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi ............................................ 36 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi ..................................................... 36 3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi ...................................................... 37 3.5.7 Nhuộm trứng ....................................................................................... 38 3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ .............................................................. 39 3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng ................................................. 39 3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng ................................ 39 3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: ........... 39 ix 3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh ........................................................................ 40 3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP .................................... 41 3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH .............................................. 42 3.6 Xử lý số liệu.................................................................................................. 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................... 43 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ β-mercaptoethanol ............................................................. 43 4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng .. 44 4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert - TALP ....................................................... 47 4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF ................................................................. 48 4.4.1 Lấy mẫu ............................................................................................. 48 4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm ..................................................... 49 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 50 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 50 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 50 x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A Anaphase Kỳ sau BAS Bovine adult serum Huyết thanh bò trƣởng thành BSA Bovine serum albumine Albumine huyết thanh bò cm centimet COC Cumulus oocyte complex Phức hợp trứng - cumulus Ctv Cộng tác viên ECS Estrous cow serum Huyết thanh bò lên giống EGF Epidermal growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô Et al Cộng sự FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bò FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn GSH Glutathione GV Germinal vesicle Túi mầm GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong cơ thể sống UI Unit international Đơn vị quốc tế IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM In vitro maturation Trƣởng thành trong ống nghiệm LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng M Metaphase Kỳ giữa mm milimet NCSU North Carolina State University T Telophase Kỳ cuối xi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng ....................... 6 Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân .............................................................. 8 Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành ............................................................................. 9 Hình 2.4. Các giai đoạn xâm nhập của tinh trùng vào trứng ................................... 20 Hình 2.5. Các giai đoạn phát triển của phôi ............................................................. 21 Hình 3.1. Buồng trứng ............................................................................................. 26 Hình 3.2. Tinh hoàn ................................................................................................. 27 Hình 3.3. Phó tinh hoàn ............................................................................................ 27 Hình 3.4. Thao tác mổ lấy buồng trứng ................................................................... 35 Hình 3.5. Phân loại trứng trƣớc khi nuôi ................................................................. 36 Hình 3.6. Phân loại trứng sau khi nuôi..................................................................... 37 Hình 3.7. Sự giãn nở của tế bào cumulus................................................................. 38 Hình 4.1. Các giai đoạn phát triển của trứng nhuộm bằng orcein ........................... 46 Hình 4.2. Trứng nhuộm orcein không nhìn thấy rõ giai đoạn ................................ 46 Hình 4.3. Tiền nhân sau 24 giờ ................................................................................ 47 Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .......................... 43 Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ............... 45 xii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dự trữ trong các phần của phó tinh hoàn ..................... 15 Bảng 3.1. Thời gian mọc răng của chó .................................................................... 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ trứng chín với các nồng độ β-mercaptoethanol .............................. 43 Bảng 4.2. Tỷ lệ trứng đƣợc nhìn rõ các giai đoạn theo nồng độ orcein ................... 45 Bảng 4.3. Tỷ lệ hình thành tiền nhân trong TYH và Fert-TALP ............................. 47 Sơ đồ 3.1. Quy trình nhuộm trứng ........................................................................... 38 Sơ đồ 3.2. Quy trình thụ tinh .................................................................................... 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói riêng đã rất phát triển và đạt nhiều thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Trong sinh sản vô tính nổi bậc nhất là tạo con vật cloning, còn trong sinh sản hữu tính thành tựu quan trọng nhất là tạo phôi trong ống nghiệm (in vitro culture - IVC), mục tiêu là cải tiến, hoàn thiện quy trình tái sinh sản động vật trong điều kiện in vitro gần giống nhƣ điều kiện in vivo để từ đó đi sâu vào nghiên cứu các yếu tố sinh lý và sinh hóa làm cơ sở cho các nghiên cứu khoa học và y học phục vụ cuộc sống. Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF) là một giai đoạn quan trọng trong toàn bộ quy trình tạo phôi. Phôi là nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong chăn nuôi hay một ý nghĩa quan trọng là bảo tồn những loài động vật quý hiếm. Phôi còn là nguồn nguyên liệu khai thác tế bào mầm rất hiệu quả phục vụ cho con nguời trong việc cấy ghép nội tạng giảm nguy cơ đào thải của cơ thể. Trên thế giới đã có rất nhiều thành tựu thụ tinh trong ống nghiệm trên nhiều loài động vật (heo, bò, thỏ, dê, cừu, chó…), nhƣng trong đó chó là loài động vật có đặc điểm sinh lý rất khác biệt, do đó tỷ lệ trứng chín và tỷ lệ hình thành phôi trong ống nghiệm còn rất thấp, đây là vấn đề còn rất đƣợc quan tâm và nghiên cứu. Ở Việt Nam, công nghệ sinh học sinh sản cũng mới đƣợc quan tâm trong thời gian gần đây, viện Khoa học và Công nghệ, trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã nghiên cứu thành công trên chuột, heo, bò, nhƣng vẫn chƣa thực hiện trên chó. Vì những lý do trên mà đề tài “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó” đƣợc tiến hành. 2 1.2 Mục tiêu Bƣớc đầu tìm quy trình thụ tinh trong ống nghiệm phù hợp trên chó 1.3 Yêu cầu - Nuôi chín trứng chó trong ống nghiệm - Hoạt hóa tinh trùng - Thụ tinh trứng chó trong ống nghiệm 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng 2.1.1 Vị trí, hình thái Gia súc cái có 2 buồng trứng nằm hai bên cửa xoang chậu, phía sau lõm hông phải và trái, dƣới góc hông xƣơng cánh chậu 3-5 cm, đƣợc treo ở cạnh trƣớc dây chằng rộng của tử cung. Buồng trứng có hình hạt đậu, phần lõm là rốn buồng trứng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005). Trên chó cái, buồng trứng có dạng hình oval, nằm trong hai túi buồng trứng, ở phía sau thận, khoảng đốt sống lƣng thứ 3 - 4, buồng trứng phải nằm cao hơn buồng trứng trái. 2.1.2 Cấu tạo Buồng trứng có cấu tạo gồm 2 lớp: Bên ngoài là lớp màng liên kết sợi chắc chắn nhƣ màng bao tinh hoàn. Bên trong đƣợc cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp, gồm 2 miền: miền vỏ nằm ngoài sát bề mặt buồng trứng, là nơi sinh ra các loại nang noãn và thể vàng ở các giai đoạn khác nhau (nang noãn, thể vàng, thể trắng - thể vàng thoái biến), xảy ra sự chín và rụng trứng; miền tủy chứa nhiều mạch máu vào nuôi dƣỡng nang noãn, mạch bạch huyết, thần kinh, mô liên kết cũng dày hơn gồm sợi xốp và sợi cơ trơn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005). 2.1.3 Chức năng Buồng trứng là một trong những bộ phận quan trọng của hệ thống sinh dục thú cái, buồng trứng thực hiện hai chức năng quan trọng là ngoại tiết và nội tiết. - Ngoại tiết: sinh ra noãn chín và rụng vào vòi Fallop chuẩn bị cho sự thụ tinh. - Nội tiết: progesterone từ thể vàng và estrogen từ nang noãn là hai hormon gây nên những đặc tính sinh dục thứ cấp ở con cái, ngoài ra buồng trứng còn tiết các kích thích tố nhƣ oxytocin, relaxin, inhibin, activin (Trần Thị Dân và Dƣơng Nguyên Khang, 2006). Tế bào hạt trong biểu mô của nang noãn thành thục tiết nhiều estrogen. 4 2.2 Nang noãn 2.2.1 Đặc điểm hình thái (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) Noãn (trứng) là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích noãn lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần tinh trùng. Noãn (trứng) có cấu tạo gồm 3 phần: Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nƣớc, vật chất hữu cơ, muối khoáng và vật chất khác. Nhân gồm lƣới nhiễm sắc thể và nhiều hạt. Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này đƣợc phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các tế bào này đƣợc gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase ở phần acrosom đƣợc tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh. Màng giữa gồm nhiều tế bào, đƣợc sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi dƣỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dƣỡng cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá trình thụ tinh. Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi dƣỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. 2.2.2 Sự phát triển của nang noãn Trong suốt quá trình hình thành phôi, tế bào mầm nguyên thủy phát triển từ trung bì ở túi niệu, định vị tại buồng trứng, sau đó tăng lên về số lƣợng và biệt hóa thành nang noãn nguyên thủy. Nang noãn nguyên thủy ngừng phát triển đến giai đoạn cơ thể thành thục về mặt sinh dục. Khi đƣợc sinh ra, buồng trứng thú cái đã có sẵn các nang noãn nguyên thủy và nang noãn bậc một cho hoạt động sinh sản suốt đời. Nang noãn bậc một có thể thoái 5 hóa hoặc phát triển thành nang noãn bậc hai nếu trở nên nhạy cảm với hormone kích thích nang noãn (follicle stimulating hormone - FSH), nang noãn bậc hai đƣợc bao bọc bởi một lớp trong suốt tƣơng đối dày (vùng trong suốt), nang noãn bậc hai có hai hay nhiều lớp tế bào hạt nhƣng không có xoang nang. Nang noãn bậc ba là nang noãn có xoang, chứa dịch nang và có thể trở nên trội hẳn để chuẩn bị xuất noãn (nang Graaf). Nang noãn có xoang tƣơng tự nhƣ vết phỏng trên bề mặt buồng trứng và có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng, kích thƣớc nang noãn có xoang biến động khoảng nhỏ hơn 1 mm đến vài cm tùy theo giai đoạn phát triển hoặc thoái biến và tùy loài, ví dụ ở bò 10-15 mm (Lussier et.al., 1987), bò 12-19 mm, heo 8-12 mm (Hafez, 1968), chó 4-6 mm (Cole và Cupps, 1959). Nang noãn có xoang cấu tạo gồm 3 lớp: lớp bao ngoài, lớp bao trong và lớp tế bào hạt. Lớp bao ngoài là mô liên kết lỏng lẻo, lớp bao trong sản xuất kích thích tố adrogen dƣới ảnh hƣởng của kích tố thể vàng (luteinizing hormone-LH), lớp tế bào hạt tách rời lớp bao trong bởi màng đáy rộng, tế bào hạt sản xuất nhiều chất sinh học và trên bề mặt tế bào có thụ thể tiếp nhận LH, những chất quan trọng đƣợc sản xuất bởi tế bào hạt là estrogen, inhibin và dịch nang (Trần Thị Dân và Dƣơng Nguyên Khang, 2006). 6 2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng Sự tăng trƣởng, thành thục, rụng trứng và lutein hóa của nang Graff phụ thuộc vào các yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lƣợng đủ và tỷ lệ phù hợp của FSH và LH trong huyết thanh. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích quá trình phân bào nguyên nhiễm của tế bào hạt (có sự hỗ trợ của estradiol), quá trình hình thành dịch nang trứng. FSH còn làm tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lƣợng các thể tiếp nhận LH, đây là sự chuẩn bị cho quá trình lutein hoá của các tế bào hạt trong việc đáp ứng sóng gây rụng trứng của LH. Theo Davol (2000), trên chó 2 ngày trƣớc khi rụng trứng, tuyến yên tăng tiết LH làm cho nang noãn phồng lên nhanh chóng, nang noãn tiến dần lên bề mặt buồng trứng và khi tỷ lệ LH/FSH phù hợp thì sẽ xảy ra hiện tƣợng xuất noãn, nếu vắng mặt LH thì không xảy ra sự xuất noãn. Hình 2.1. Các giai đoạn phát triển của nang noãn trong buồng trứng (Nguồn: Cummings, 2001) 7 Estrogen do các tế bào hạt trong nang tiết ra. Estrogen cần thiết cho sự duy trì và phát triển của buồng trứng, cấu trúc sinh sản và đặc điểm sinh dục thứ cấp ở động vật cái. Có ý nghĩa quan trọng trong việc thúc đẩy trứng phát triển, chín và rụng, phát triển niêm mạc tử cung, tăng hàm lƣợng actin và myosin trong giai đoạn mang thai, tăng sinh mô tuyến của niêm mạc và tế bào biểu mô lông rung của ống dẫn trứng giúp trứng đã thụ tinh di chuyển dễ dàng vào tử cung. Progesteron đƣợc phân tiết chủ yếu từ hoàng thể. Progesteron kích thích tăng sinh niêm mạc tử cung, giúp tử cung có khả năng bài tiết, giảm co bóp cơ tử cung tạo môi trƣờng yên ổn sẵn sàng đón chờ trứng đã thụ tinh vào làm tổ, kích thích niêm mạc ống dẫn trứng bài tiết dịch chứa chất dinh dƣỡng nuôi phôi, progesteron còn có tác dụng kích thích bài tiết prolactin làm tăng phát triển các ống sữa của tuyến vú. Hàm lƣợng progesterone trong huyết thanh bắt đầu tăng lên ở giai đọan động dục, ở chó sau khi hàm lƣợng progesterone tăng đến 2 ng/ml thì sự xuất noãn sẽ xuất hiện sau đó 2 ngày, do đó hàm lƣợng progesterone cũng là một chỉ tiêu hiệu quả để xác định thời điểm phối giống trong thụ tinh nhân tạo (Davol, 2000). 2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn Khi đạt đến kích thƣớc cực đại, nang noãn chuyển sang giai đoạn mới, đó là giai đoạn trƣởng thành. Quá trình này xảy ra dƣới ảnh hƣởng của các cơ chế điều chỉnh, trong đó quan trọng nhất là cơ chế thần kinh-hormone trong tƣơng tác noãn bào với các tế bào xung quanh. Sự chuyển sang giai đoạn trƣởng thành đƣợc thực hiện dƣới ảnh hƣởng của các kích thích tố của thùy trƣớc tuyến yên. Sự trƣởng thành nang noãn bao gồm cả trƣởng thành nhân và trƣởng thành tế bào chất (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). 2.2.4.1 Trƣởng thành nhân Noãn trƣởng thành nhân là khi nhân đạt đến giai đoạn metaphase II (MII) với hình dạng đƣợc quan sát bên ngoài là sự xuất hiện thể cực thứ nhất. Ngay sau giảm phân, noãn ở giai đoạn túi mầm (germinal vesicle - GV) sẽ lần lƣợt qua các giai đoạn: tan biến túi mầm (germinal vesicle break down - GVBD), metaphase I (MI), sau giảm phân I (meiosis I) hình thành nên 2 tế bào: một gồm có 8 nhân và một chút tế bào chất tách khỏi màng noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất nhƣng ở trong màng noãn hoàng, đó chính là thể cực thứ nhất; tế bào thứ hai là noãn bào bậc hai, nhiễm sắc thể trong tế bào chất của tế bào này ngay lập tức bƣớc vào metaphase II (II) và dừng lại tại đó (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Thời gian noãn trƣởng thành khác nhau tùy loài nhƣ ở bò là 24 giờ (Sirard et al., 1989), heo là 38 giờ, chó 48-72 giờ (Rota, 2004). Đây là cơ sở cho việc thiết lập quy trình nuôi chín trứng in vitro trên nhiều loài. 2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra nhiều biến đổi. Noãn trở nên mọng nƣớc, các phiến noãn hoàng trong nƣớc và dần hòa tan vào nhau, noãn trở nên trong hơn. Trong noãn xảy ra sự tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất ở bề mặt có khả năng co giãn và xuất hiện khả năng phân chia (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Các bào quan trong tế bào chất đƣợc tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển phôi. Sự trƣởng thành tế bào chất là yếu tố gián tiếp quyết định khả năng phát triển của noãn để có thể xảy ra hiện tƣợng thụ tinh bình thƣờng, phân chia và phát triển tới Hình 2.2. Các giai đoạn phát triển của nhân (Nguồn: Mario Mayes, 2002) 9 phôi nang (blastocyst). Nếu chỉ có sự trƣởng thành về nhân mà không có sự trƣởng thành về tế bào chất thì sẽ không đảm bảo cho sự phát triển phôi sau này (Sirard et al., 1989; Yang et al., 1998). 2.2.5 Sự rụng trứng Lúc rụng trứng, thành nang vỡ ra và giải phóng trứng thứ cấp vào ống dẫn trứng, trứng vẫn đƣợc một số tế bào hạt bao quanh. Sự rụng trứng xảy ra vào cuối kỳ tăng trƣởng, ở đa số các loài trứng rụng khi đã trƣởng thành đầy đủ về nhân và tế bào chất (MII), tuy nhiên ở ngựa, chó và cáo trứng rụng khi còn ở giai đoạn GV (Vũ Văn Vụ và ctv, 2005). Ở giai đoạn này, nang trứng trội có khả năng đáp ứng với sự tăng lên mạnh và đột ngột của các kích dục tố bằng sự thay đổi hoàn toàn cấu trúc của nó, dẫn đến hiện tƣợng rách nang và giải phóng noãn bào. 2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation-IVM) 2.3.1 Lịch sử IVM Trên thế giới, kỹ thuật IVM đã xuất hiện từ rất sớm, với mục đích nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố sinh lý, sinh hóa lên sự phát triển của trứng trong in vivo, từ đó tái thiết lập quy trình IVM để làm cơ sở cho các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản sau này. Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chƣa trƣởng thành khỏi sự ức chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trƣởng thành khi nuôi cấy in vitro. Hình 2.3. Nang noãn trƣởng thành (Nguồn: Mario Mayes, 2002) 10 Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng noãn chuột đƣợc trƣởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu đƣợc thụ tinh. Năm 1983, Lenz và cộng sự cho rằng 39oC là nhiệt độ tối ƣu để noãn bò trƣởng thành in vitro. Năm 1988, Lu và cộng sự cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh in vitro. Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ. Ngày nay kỹ thuật IVM đã đƣợc thực hiện thành công trên rất nhiều loài động vật và đặc biệt là trên ngƣời, làm cơ sở cho kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization - IVF), chuyển cấy phôi và chuyển gen. ngày nay kỹ thuật IVM vẫn đang đƣợc rất chú trọng và phát triển. 2.3.2 Môi trƣờng IVM 2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM Môi trƣờng đơn giản: là hệ thống đệm bicarbonate chứa các muối nhƣ pyruvate, lactate, glucose. Các môi trƣờng thƣờng đƣợc cung cấp huyết thanh hay albumine và một lƣợng thích hợp các kháng sinh (penicillin, streptomycin, gentamycin). Môi trƣờng phức tạp thƣờng chứa thêm một số yếu tố nhƣ amino acid, vitamine, purine và những chất khác. 2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM  Thành phần chính - Nƣớc Nƣớc là thành phần chính cho mọi loại môi trƣờng. Nƣớc sử dụng trong IVM phải đƣợc qua hệ thống chƣng cất, siêu lọc, hấp vô trùng để loại bỏ các chất khoáng, ion và nguồn gây nhiễm trong nƣớc. - Nguồn năng lƣợng Glucose, lactate, pyruvate là những nguồn năng lƣợng ngoại sinh quan trọng nhất cho sự phát triển của trứng và phôi. Tuy nhiên tùy vào từng giai đoạn phát triển 11 mà nhu cầu năng lƣợng đối với từng cơ chất khác nhau. Thêm glucose vào môi trƣờng chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 mM : 1 mM) làm tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột (Downs et.al., 2000). Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII (71,9%) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6%) (Masaya Geshi et.al., 2000). - Nguồn protein Protein vừa là nguồn đạm có sẵn vừa là chất hấp thụ ion kim loại độc. Những protein thƣờng đƣợc bổ sung:  Huyết thanh Một số loại huyết thanh thƣờng đƣợc sử dụng là: huyết thanh thai bò (fetal cafl serum - FCS), huyết thanh bò lên giống (estrous cow serum - ECS), huyết thanh bò trƣởng thành (bovine adult serum - BAS). Tỷ lệ noãn tiếp diễn giảm phân và trƣởng thành khi thêm huyết thanh chó lên giống (16,3%) cao hơn so với huyết thanh chó không lên giống (11,1%) (Otoi et.al., 1999).  Albumine huyết thanh Nếu không bổ sung huyết thanh vào môi trƣờng thì có thể thay bằng albumine. Albumine huyết thanh bò (bovine serum albumine - BSA) là loại thƣờng đƣợc sử dụng nhất, nó nhƣ là một biện pháp ngăn cản sự xâm nhập đa tinh trùng trong thụ tinh in vitro. Bổ sung BSA hoặc FCS đều làm tăng khả năng tiếp diễn giảm phân, nhƣng so sánh giữa hai kết quả này thì không có sự khác biệt nhau. Noãn chó đƣợc nuôi trong môi trƣờng North Carolina State University 37 (NCSU 37) có bổ sung 0,4% BSA và 100 ng/ml yếu tố tăng trƣởng biểu mô (epidemal growth factor - EGF) sẽ cho tỷ lệ noãn tiến đến giai đoạn MII cao nhất so với đối chứng và các nồng độ khác (Kim et.al., 2006). - Muối Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trƣờng nuôi trứng và phôi nhằm đảm bảo áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiêm cho sự điều hòa này nhƣng chủ yếu là Na+ và K+. Hàm lƣợng các ion trong môi trƣờng dựa vào thành phần các chất khoáng trong huyết tƣơng máu. 12 - Hệ đệm Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dƣới 5 % CO2 .Cơ chế của hệ đêm này cũng giống nhƣ hệ đệm trong sinh lý máu. Hệ đệm có vai trò quan trọng là ổn định nồng độ CO2 và pH của môi trƣờng. - Kháng sinh Các loại kháng sinh thƣờng dùng là penicillin, streptomycin, gentamycin. Các loại kháng sinh đều có vai trò quan trọng nhất là giảm nguy cơ nhiễm khuẩn từ các tác nhân bên trong và bên ngoài trong quá trình nuôi cấy.  Thành phần bổ sung - Hormon Hầu hết các môi trƣờng IVM đều đƣợc bổ sung hormon, đặc biệt là FSH và LH. FSH giúp noãn giãn nở hạt tụ và vƣợt qua chƣớng ngại trong giảm phân nhƣng không giúp phát triển hơn nữa. Ngoài ra còn bổ sung estradiol, progesteron vào môi trƣờng. Tỷ lệ MII khi thêm estradiol (14,7%) cao hơn so với đối chứng(1,5-8,2%), khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) (Kim et.al., 2005). - Yếu tố tăng trƣởng Trên chó, EGF đƣợc thu từ ống dẫn trứng. EGF đƣợc thêm vào môi trƣờng nuôi cấy làm tăng tỷ lệ MII (16,7%) so với đối chứng (4%) (Bogliolo et.al., 2002). Khi bổ sung EGF với nồng độ 20 ng/ml thì tỷ lệ trứng chín tăng (13,3%) so với đối chứng (2,7%) (Kim et.al., 2004). - Chất chống oxy hóa Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy có thể bị oxy hóa và tao một số chất độc gây ảnh hƣởng xấu tới noãn. Do đó chất chống oxy hóa thƣờng đƣợc cho vào môi trƣờng là β- mercaptoethanol. Tỷ lệ trứng đạt đến MII tăng 20% so với đối chứng khi bổ sung 50µM vào môi trƣờng nuôi cấy (Kim et.al., 2004). 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM 2.3.3.1 Thời gian Cho đến nay cũng chƣa có một công bố chính thức về thời gian tối ƣu nhất cho nuôi chín trứng in vitro trên chó, có nhà khoa học cho rằng thời gian tốt nhẩt là 13 48h (Bogliolo et.al., 2002), nhƣng cũng có kết quả cho là không có sự khác biệt giữa 48 giờ và 72 giờ (Kim et.al., 2006). 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn Theo Sorrensen và Wassaman (1976), nang noãn nguyên thủy chứa noãn không có khả năng hỗ trợ quá trình giảm phân và phát triển của phôi. Tỷ lệ noãn có khả năng giảm phân và hỗ trợ quá trình phát triển của phôi tăng dần theo đƣờng kính của noãn. Để đạt hiệu quả IVM cao thì kích thƣớc noãn thƣờng đƣợc lấy là 100 µm (Kim et.al., 2006). 2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái Hewitt và England (1998) so sánh noãn chó từ 2 nhóm tuổi : từ 1 - 6 tuổi và trên 7 tuổi. Kết quả chứng minh rằng noãn từ các chó từ 1 - 6 tuổi đạt tỉ lệ trƣởng thành nhiều hơn nhóm thứ hai. Yamada et.al., (1992) đã báo cáo rằng có đến 32% trứng lấy từ chó siêu bài noãn đạt đến MII sau 72 giờ nuôi cấy; trong khi đó, trứng lấy từ chó ở giai đoạn không động dục thì không có dấu hiệu tiếp diễn giảm phân kể cả khi nuôi tới 144 giờ. 2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng Nhiệt độ tốt nhất bảo quản mẫu buồng trứng là 37oC trong môi trƣờng nƣớc muối sinh lý có đệm phosphate (phosphate buffered saline - PBS), thời gian tối đa cho phép trữ mẫu từ lúc lấy buồng trứng ra ngoài cơ thể là 2 giờ (Kim et.al., 2006). Ngoài ra còn có một số yếu tố khác nhƣ: điều kiện vô trùng, thao tác ngƣời thực hiện, tủ nuôi cấy… 2.4 Phó tinh hoàn  Vị trí: nằm ở một bên thân và đầu dƣới của tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005)  Cấu tạo Về giải phẫu học, phó tinh hoàn gồm 3 phần (Hoàng Văn Tiến và ctv, 1995). Đầu: có rất nhiều ống dẫn ra (13 đến 20) đính vào ống dẫn của phó tinh hoàn, tạo nên một cấu trúc dẹt, gắn vào một đầu của tinh hoàn. 14 Thân: phần này hẹp, nối tiếp sau đầu phó tinh hoàn và tận cùng ở đầu kia của tinh hoàn. Đuôi: phần này nối tiếp sau phần thân và rộng hơn thân phó tinh hoàn. Đƣờng viền quanh của đuôi phó tinh hoàn là đặc điểm có thể thấy đƣợc ở gia súc còn sống. Bên ngoài là lớp màng sợi, trong là các ống sinh tinh. Ở đầu trên khoảng 15- 20 ống từ tinh hoàn đi lên, chúng uốn lƣợn, gấp đi gấp lại tập trung thành 6-10 ống ở phần thân, đi xuống đuôi chỉ còn 2-3 ống, cuối cùng còn 1 ống dẫn ra khỏi đuôi phó tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Phó tinh hoàn có 2 loại tế bào (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) - Tế bào hình trụ có tiêm mao: có chức năng hấp thu - Tế bào đáy: có chức năng bài tiết  Chức năng Làm tinh trùng thành thục và dự trữ tinh trùng: Những giọt bào tƣơng còn sót lại trên cổ tinh trùng tụt dần xuống các phần tận cùng của đoạn giữa tinh trùng, hoạt lực tinh trùng tăng lên khi tinh trùng đi vào thân phó tinh hoàn. Tại đuôi phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc cung cấp những yếu tố làm tăng khả năng thụ tinh, tinh trùng ở đuôi phó tinh hoàn có khả năng thụ tinh cao hơn tinh trùng ở phần thân, ngoài ra cũng có khả năng thụ tinh mà không cần bổ sung chất bài tiết của các tuyến phụ. Những bất bình thƣờng về hình thái tinh trùng trong tinh dịch có thể làm tăng lên trong quá trình tinh trùng đi qua và thành thục trong phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Trong phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc bao bởi một màng glycoprotein giúp tinh trùng vận động tiến thẳng, thể đỉnh thành thục (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005). Tinh trùng nằm trong phó tinh hoàn có thể giữ đƣợc năng lực thụ tinh trong vài tuần lễ và ống phồng trong đuôi phó tinh hoàn là cơ quan bảo tồn chính. Khả năng đặc biệt của đuôi phó tinh hoàn để bảo tồn tinh trùng phụ thuộc vào nhiệt độ thấp của bao tinh hoàn và hoạt tính của hormon tính dục đực (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Phó tinh hoàn làm tăng nồng độ K+, mà K+ có tác dụng ức chế sự vân động của tinh trùng, làm tăng tuổi thọ tinh trùng. Tinh trùng đƣợc chuyển xuống và dự trữ ở 15 đuôi phó tinh hoàn, môi trƣờng ở đây rất phù hợp để tinh trùng kéo dài tuổi thọ: Na+ thấp, K+ cao, phân áp oxy thấp, CO2 cao, pH tƣơng đối thấp, tinh trùng bị ức chế hầu nhƣ không vận động (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) Tinh trùng di chuyển trong phó tinh hoàn sẽ biến đổi cấu trúc để có thể sống lâu: giảm lƣợng nƣớc, giảm thể tích, sinh ra protein mới bao quanh tinh trùng làm tinh trùng mang điện tích âm nên không bị ngƣng kết với nhau, hoàn chỉnh khả năng thụ tinh, tinh trùng sống trong phó tinh hoàn 7-10 ngày, tối đa 2 tháng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Bảng 2.1. Lƣợng tinh trùng dữ trữ trong các phần của phó tinh hoàn (Nguồn: Davol, 2000) Hấp thu và bài tiết dịch: Hầu hết lƣợng lớn chất dịch ra khỏi tinh hoàn hằng ngày bị hấp thu ở phần đầu của phó tinh hoàn, phần đuôi cũng có khả năng hấp phụ những phần tử nhỏ kể cả tinh trùng. Dòng chảy của chất dịch màng lƣới tinh hoàn đi ra những ống dẫn ra và ống của phó tinh hoàn là cần thiết cho việc duy trì hình thái bình thƣờng của những ống này. Sự vận chuyển tinh trùng thông qua phó tinh hoàn là do dòng chảy của chất dịch màng lƣới, hoạt động của biểu mô có nhung mao của các ống dẫn ra và sự co rút của thành cơ của ống phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005). Phó tinh hoàn hấp thu rất mạnh, làm giảm nồng độ Na+, Cl-, tăng nồng độ K+ trong dịch của phó tinh hoàn (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005). 2.5 Tinh trùng 2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng Tinh trùng đƣợc sinh ra từ biểu mô ống sinh tinh và thải vào lòng ống. Tinh trùng di ra khỏi tinh hoàn và đƣợc dữ trữ ở phó tinh hoàn. Trƣớc khi xuất tinh, tinh Trọng lƣợng (kg) 4,5 - 15,4 15,9 - 17,7 27,2 - 38,1 Đầu phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 0,07 ± 0,01 0,23 ± 0,04 0,23 ± 0,05 Thân phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 1,1 ± 0,18 1,85 ± 0,16 2,27 ± 0,24 Đuôi phó tinh hoàn (10 9 tế bào/ml) 2,06 ± 0,31 3,3 ± 0,36 4,68 ± 0,39 16 trùng đƣợc đẩy ra khỏi phần đuôi phó tinh hoàn và đƣợc kết hợp với tinh thanh từ tuyến tiền liệt tại niệu đạo (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Tinh trùng có hình dạng giống nòng nọc. Tinh trùng chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm (Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). 2.5.2 Quá trình sinh tinh Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Quá trình này đƣợc chia làm 4 giai đoạn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005): Giai đoạn sinh sản: tinh nguyên bào ở biểu mô ống sinh tinh (2n) liên tục phân chia, dẫn đến tinh nguyên bào tăng về số lƣợng. Giai đoạn sinh trưởng: tinh nguyên bào ngừng phân chia, lớn lên thành tinh bào bậc I nhƣng số NST giữ nguyên 2n. Giai đoạn thành thục: tinh bào bậc I phân chia giảm nhiễm thành hai tinh bào bậc II có số NST n và một NST giới tính X hoặc Y. Tinh bào bậc II lại phân chia thành hai tinh tử có NST n. Giai đoạn tạo hình: tinh tử hoàn chỉnh cấu trúc thành tinh trùng. Các tiền tinh trùng dài ra phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. 2.5.3 Cấu tạo Tinh trùng có cấu tạo gồm 3 phần: đầu, cổ và đuôi ( Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Phần đầu: chứa vật chất di truyền, dài khoảng 5,6 µm. Đầu tinh trùng gồm 2 phần: nhân và thể đỉnh (acrosome). Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc biệt là phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp 17 song song và gắn rất chặt chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Phần trƣớc đầu tinh trùng đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh: hyaluronidase có tác dụng phân hủy acid hyaluronic – là chất liên kết giữa các tế bào hạt bao quanh trứng. Phần cổ: chỉ dài khoảng 1µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy phía sau của nhân. Phần đuôi: dài khoảng 49,26 µm - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. 2.5.4 Thành phần Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng chứa 75% nƣớc, 25% vật chất khô trong đó 85% protein, 13,2% lipid, 1,8% khoáng. Đầu tinh trùng chứa 65% nhân, chủ yếu là DNA; đuôi chủ yếu là lipid. Tinh trùng thành thục và đƣợc dự trữ ở phó tinh hoàn. Tại đây màng tinh trùng đƣợc bão hòa thêm một lớp glycoprotein giúp tinh trùng có khả năng vận động. 2.5.5 Đặc tính sinh lý Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn. Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động độc lập về phía trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và tính tiếp xúc với điện. Sự rung động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu hƣớng lội ngƣợc dòng 18 nƣớc. Đối với một vật lạ, tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, mà đặc tính của dòng điện chạy từ cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định. Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tinh trùng sử dụng năng lƣợng theo 3 phƣơng thức: Oxy hóa yếm khí: Fructose → acid lactic + CO2 + Q (27,7 Kcal) Với enzyme xúc tác là hexokinase, photphatase. Oxy hóa hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 674 Kcal Hệ số hô hấp của tinh trùng là số µl O2 tiêu hao cho 10 5 tinh trùng trong 1 giờ ở 37oC. Đây là chỉ tiêu đánh giá sức sống của tinh trùng. Phân giải ATP: do enzyme ATPase ở cổ và đuôi tinh trùng ATP → ADP + P + Q (7-12 Kcal) 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng Theo Nguyễn Quang Mai và ctv (2005), tuổi thọ và năng lƣợng vận động của tinh trùng phụ thuộc vào: Nhiệt độ: khi ở nhiệt độ cao, tinh trùng vận động mạnh làm tiêu hao nhiều năng lƣơng nên tinh trùng nhanh chết. Nhiệt độ thấp sẽ ức chế hoạt động của tinh trùng, do đó sẽ kéo dài tuổi thọ tinh trùng. Cơ sở này đã đƣợc ứng dụng trong công nghệ làm tinh đông viên hoặc tinh cọng rạ -196oC. pH: pH trung tính hay kiềm làm tinh trùng vận động mạnh, tiêu tốn nhiều năng lƣợng, dẫn đến giảm tuổi thọ tinh trùng. pH acid yếu ức chế vận động của tinh trùng nên sẽ kéo dài tuổi thọ của tinh trùng. 19 Áp suất thẩm thấu: môi trƣờng nhƣợc trƣơng hay ƣu trƣơng đều giảm thời gian sống của tinh trùng. Ánh sáng: tia tử ngoại và hồng ngoại kích thích vận động cuả tinh trùng, làm tinh trùng tiêu năng lƣợng và giảm tuổi thọ. Chất hóa học: tinh trùng mẫn cảm với muối kim loại nặng. Màng tinh trùng mang điện tích âm đẩy rời ra nhau, khi gặp điện tích dƣơng thì điện tích âm bị trung hòa, do đó tinh trùng dính vào nhau và mất khả năng vận động tiến thẳng. 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 2.6.1 Lịch sử IVF Sau khi IVM thành công trên một số loài thì các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục nghiên cứu về kỹ thuật IVF. IVF đã thành công trên rất nhiều loài động vật nhƣ chó, heo, thỏ, bò…Kỹ thuật ra đời đã mang lại một ý nghĩa to lớn trong việc giải quyết vấn đề vô sinh ở ngƣời. Năm 1959, con thỏ đầu tiên ra đời từ phƣơng pháp thụ tinh trong ống nghiệm Năm 1972, con chuột đầu tiên ra đời từ phôi đông lạnh. Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh. Năm 1982, bé gái