Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐẶNG TRẦN ANH THƢ BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SOUTHERN BLOT PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYÊN NẤM Magnaporthe grisea GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐẶNG TRẦN ANH THƢ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  POPULATION STRUCTURE OF Magnaporthe grisea EXAMINED INITIALLY BY SOUTHERN BLOT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student LE DINH DON DANG TRAN ANH THU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM TẠ  TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Thầy Nguyễn Đức Sáng đã giúp đỡ tôi về hóa chất và vật liệu nghiên cứu trong thời gian làm đề tài. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. CON THÀNH KÍNH BIẾT ƠN Cha Mẹ, các em và người thân trong gia đình đã ủng hộ và hỗ trợ con về mặt vật chất cũng như tinh thần để con có thể hoàn thành tốt khóa học này. TP Hồ Chí Minh tháng 8/2006 Đặng Trần Anh Thư ii TÓM TẮT KHÓA LUẬN  ĐẶNG TRẦN ANH THƯ, Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern Blot phân tích tính đa dạng di truyền của nấm Magnaporthegrissea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”. Giáo viên hướng dẫn: LÊ ĐÌNH ĐÔN  Cơ sở nghiên cứu: Sử dụng marker phân tử RFLP trên cở sở phương pháp Southern blot và phân tích sự khác biệt về sự thay đổi cấu trúc gen dẫn đến phân tích tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea.  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số dòng nấm Magnaporthe grisea, làm cơ sở để đánh giá và có phương pháp phòng trị cho phù hợp.  Phƣơng pháp nghiên cứu: - Thực hiện ly trích và phân cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn - Tiến hành phân tách các đoạn DNA cắt giới hạn trên gel agarose, chuyển và cố định DNA lên màng - Thực hiện phản ứng lai với phân tử probe là DNA plasmid được đánh dấu và phát hiện bằng huỳnh quang - Sử dụng phần mềm để phân tích tính đa dạng di truyền.  Kết quả: - DNA ly trích tốt và thực hiện thành công phản ứng cắt giới hạn - Biến nạp và ly trích thành công các loại plasmid được cung cấp để đánh dấu sư dụng cho phản ứng lai phát hiện MAGGY trong genome của M. grisea - Thực hiện phản ứng lai với probe pMGY-SB thành công đối mẫu đối chứng là plasmid pMGY-SB.  Kết luận : Do quy trình Southern blot chưa hoàn thiện trong điều kiện phòng thí nghiệm ở TT PTTNHS của trường Đại học Nông Lâm và hạn chế về mặt thời gian nên kết quả của phản ứng lai đã không đi đến thành công. Do đó, không có cơ sở để phân tích sự đa dạng di truyền trên nấm M. grisea. iii MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................. viii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về cây lúa ......................................................................................... 3 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) ................................................................. 3 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa ......................................... 3 2.2.2. Triệu chứng bệnh của cây lúa bị bệnh cháy lá lúa .............................. 4 2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh ..................................................................... 5 2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh ........................................................................ 5 2.3. Phương pháp Southern blot ............................................................................ 6 2.4. Enzyme cắt giới hạn ....................................................................................... 7 2.5. Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...................................................... 8 2.5.1. Phương pháp mao dẫn hướng lên ........................................................ 8 2.5.2. Phương pháp mao dẫn hướng xuống ................................................... 9 2.5.3. Phương pháp mao dẫn hai chiều ......................................................... 9 2.5.4. Phương pháp chuyển bằng điện .......................................................... 9 2.5.5. Phương pháp chuyển bằng chân không ............................................... 9 2.6. Probe đánh dấu sử dụng trong Southern Blot .............................................. 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea .................................... 10 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea ............................................ 12 iv 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 14 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 14 3.2. Đối Tượng khảo sát ...................................................................................... 15 3.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................... 15 3.4. Vật liệu và hóa chất ...................................................................................... 16 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................ 16 3.4.2. Hóa chất ............................................................................................. 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 17 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm M. grisea (isolate) ............ 17 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trường lỏng nhân sinh khối sợi nấm ................... 17 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phương pháp lysis ...................................... 18 3.5.1.3. Phương pháp tinh sạch DNA ...................................................... 18 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ............................... 18 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp.............................................................. 18 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) .......................................................... 19 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp ........................................................... 19 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit ......................... 21 3.5.3. Thực hiện đánh dấu plasmid ............................................................. 22 3.5.4. Tạo mẫu lai ........................................................................................ 22 3.5.4.1. Thực hiện phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme cắt giới hạn ..................................................................... 23 3.5.4.2. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose ........................................ 23 3.5.4.3. Chuyển DNA từ gel lên màng bằng phương pháp mao dẫn hướng lên................................................ 24 3.5.4.4. Làm khô màng ........................................................................... 25 3.5.4.5. Cố định DNA lên màng .............................................................. 25 3.5.5. Lai southern ...................................................................................... 26 3.5.5.1. Thực hiện phản ứng lai ............................................................... 26 3.5.5.2. Rửa màng sau khi lai .................................................................. 26 v 3.5.5.3. Phát hiện kết quả trên phim X-ray .............................................. 27 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 28 4.1. Ly trích DNA tổng số của nấm M. grisea. ................................................... 28 4.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pEBA18, pMGR-T1 vào vi khuẩn E.coli DH5α ............................................................................ 30 4.3. Thiết lập phản ứng cắt DNA genome của M. grisea bằng enzym cắt giới hạn ...................................................................... 31 4.4. Phản ứng lai DNA M. grisea sau khi được cắt bằng EcoRV và BamHI với probe SB ......................................................... 33 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 38 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 38 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 38 TÀI NIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 49 vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp: base pair B: Bam HI Ctv cộng tác viên DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse transcrip SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA TBE: Tris-base Boric EDTA UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b) ................... 4 Hình 2.2. Bào tử nấm M. grisea chụp dưới kính hiển vi ........................................ 5 Hình 2.3. Vòng đời của nấm M. grisea ................................................................... 6 Hình 2.4: Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY ................................................ 10 Hình 4.1. DNA tổng số của nấm M. grisea .......................................................... 28 Hình 4.2. DNA của các nguồn nấm M. grisea sau khi được xử lý với RNAse .... 30 Hình 4.3. Kết quả ly trích plasmid điện di trên gel agarose 0,8 ............................ 31 Hình 4.4. Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn ........................................................................... .32 Hình 4.5. Kết quả điện di tạo mẫu DNA cho phản ứng lai ................................... 34 Hình 4.6. Kết quả phát hiện trên X-ray film ......................................................... 35 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng……………………………………………. ... 7 Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai…………. .. ..16 Bảng 3.2. Thành phần phẩn ứng cắt với tổng thể tích là 25 µl…………………. . ..23 Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl……… …23 Bảng 4.1. Những khó khăn và những giải pháp khắc phục trong thực hiện phản ứng lai Southern ……………………………… …36 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 5.3. Đặt vấn đề Magnaporthe grisea (Hebert) Barr. (anamorph, Pyricularia. grisea (Cooke) Sacc.) là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật thuộc họ Gramineae, Cannaceae, Cyperaceae và Zingiberaceae [12]. Đặc biệt, loại nấm này là nguyên nhân gây bệnh cháy lá (đạo ôn) trên cây lúa (Oryza sativa), đây là một loại bệnh nghiêm trọng và gây tổn thất lớn đối với các nước trồng lúa trên thế giới. Hàng năm, năng suất lúa gạo do bệnh này gây ra giảm 30% trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, đạo ôn cổ gié đã gây hại 138.000 ha trong năm 1991 và 217.000 ha trong năm 1992 ở đồng bằng Sông Hồng. Bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng ở đồng bằng Sông Cửu Long từ 1978-1981 [11]. Theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tổng diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn trong vụ Đông Xuân 2003-2004 là 37.029 ha (tăng 3 lần so với Đông Xuân 2003), vụ Hè Thu 2006 là 38.346 ha lúa bị nhiễm đạo ôn lá và 4046 ha bị nhiễm đạo ôn cổ bông. Trong những năm gần đây, người trồng lúa đã áp dụng nhiều biện pháp phòng trừ như: phun thuốc diệt nấm và tăng cường trồng giống kháng trên diện rộng. Thuốc diệt nấm có thể giảm một phần thiệt hại của bệnh nhưng không tiêu diệt được bệnh. Những giống kháng có thể kháng được bệnh đạo ôn nhưng chỉ có thể duy trì được tính kháng trong một thời gian ngắn. Điều này có thể được giải thích rằng nấm Magnaporthe grisea có sự đa dạng di truyền trong quần thể [11]. Một số giả thuyết cho rằng những yếu tố chuyển vị (transposon) [12], thể dị hạch (heterokaryosis), và sự tái tổ hợp trong sinh sản hữu tính có thể là nguyên nhân tạo nên sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm M. grisea [14]. Ngày nay, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, nhiều kĩ thuật mới ra đời như kĩ thuật PCR, Southern blot, đọc trình tự v.v.. giúp cho quá trình nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể sinh vật thuận lợi hơn. Những kỹ thuật này đã được ứng dụng để nghiên cứu sự đa hình trong quần thể dựa trên những DNA marker như: RFLP, ALP, AFLP, RAPD, DAF, SSR, AP-PCR, SSCP, MRDHV-DNA, SNP [1]. Trên thế giới, các kĩ thuật này đã được áp dụng thành công trong việc nghiên cứu về 2 sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea. Ở nước ta, những nghiên cứu như vậy còn rất ít. Xuất phát từ tình hình trên, tôi đã thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng kỹ thuật Southern blot phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa”, nhằm phân tích được cấu trúc di truyền giữa các dòng nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn trên cây lúa ở các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long. 5.4. Mục đích – Yêu cầu 5.4.1. Mục đích Bước đầu phân tích đa dạng di truyền của nấm Magnaporthe grisea gây bệnh đạo ôn bằng phương pháp Southern blot. 5.4.2. Yêu cầu - Phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Magnaporthe grisea. - Ly trích DNA các dòng nấm Magnaporthe grisea. - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt DNA genome bằng các enzyme giới hạn. - Tạo được phân tử probe đánh dấu từ DNA plasmid. - Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây lúa Lúa thuộc họ Gramieae, loại Oryza, loài Oryza sativa. Lúa đang được trồng thuộc loài phụ Indica (lúa tiên) và Japonica (lúa cánh). Lúa là một loại cây lương thực quan trọng trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Nam Á. Lúa có giá trị dinh dưỡng cao và được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, cung cấp năng lượng cho con người sống và hoạt động. Cây lúa có nguồn gốc lâu đời và đã được thuần hóa từ cây lúa hoang dại, bán hoang dại, dị hợp tử và đầy những biến dị. Quá trình thuần hóa cũng là quá trình lai tạo tự nhiên, đột biến gen do môi trường và sự chọn lọc của con người qua hàng ngàn năm. Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm, thích hợp cho sự sinh trưởng và phát dục của cây lúa, vì vậy hầu hết các địa phương đều có trồng lúa. Nơi quá cao không có hệ thống thủy lợi, người ta cũng trồng lúa cạn. Do vị trí địa lý nước ta chạy dọc theo bờ biển, địa hình, địa thế cao thấp khác nhau, có điều kiện khí tượng thủy văn khác nhau, nên hình thành các vụ lúa và các vùng trồng lúa khác nhau. Nước ta có ba vùng trồng lúa lớn là: vùng lúa Bắc bộ và bắc Trung bộ, vùng lúa Trung và nam Trung bộ, vùng lúa ở Nam bộ [5]. Lúa thường gặp rất nhiều loại bệnh mà nguyên nhân chủ yếu là do nấm, vi khuẩn và số ít là do virus. Bệnh do nấm gây ra điển hình như: bệnh đạo ôn, đốm nâu, bệnh khô vằn và một số bệnh khác. Bệnh do vi khuẩn gây ra như: cháy bìa lá lúa, bệnh vàng lá lúa. Bệnh do virus gây ra như lùn soắn lá lúa. Trong đó, bệnh do nấm gây ra là thường gặp nhất và gây tổn thất nhiều nhất [6]. 2.2. Bệnh cháy lá trên cây lúa (đạo ôn) 2.2.1. Sự xuất hiện của bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh được ghi nhận và mô tả đầu tiên tại Trung Quốc vào năm 1637. Năm 1704, M. Tsuchiya (Nhật) bắt đầu nghiên cứu hiện tượng cháy lá trên cây lúa. Sau đó, bệnh được báo cáo có ở nhiều quốc gia khác như là Ý (1788), Mỹ (1876) và Ấn Độ (1913). Đây là bệnh phân bố rộng và có mặt trên 80 quốc gia trồng lúa trên thế giới [2]. Ở Nhật từ năm 1953-1960, thiệt hại về năng suất là 2,98%, tính riêng trong năm 4 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24% trong tổng thất thu do sâu, bệnh, bão lũ. Bệnh có thể làm mất trắng như ở Hà Đông (Việt Nam). Đối với bệnh thối cổ gié, ước tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỉ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5%. Ở Miền Bắc, các vùng Hải Phòng, Thái Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang, Hà Đông bị thiệt hại nặng. Ở đồng bằng sông Cửu Long, hàng năm thường có hai cao điểm của bệnh là tháng 11-12 dương lịch và tháng 5-6 dương lịch. Các huyện Châu Thành, Chợ Gạo, Cai Lậy, Chợ Mới (An Giang), Thạnh Trị (Cần Thơ) là những nơi thường có bệnh [6]. 2.2.2. Triệu chứng bệnh cháy lá trên cây lúa Bệnh cháy lá lúa là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh đạo ôn. Khi dịch cháy lá xảy ra trên diện rộng thì năng suất và sản lượng sẽ giảm rất rõ và thiệt hại nghiêm trọng về mặt kinh tế. Tác nhân gây bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn của cây lúa; bắt đầu từ giai đoạn mạ hoặc sau khi gieo xạ cho đến trước trổ thì gọi là bệnh cháy lá. Bệnh có thể gây hại trên cổ lá nên gọi là thối cổ lá, hoặc gây hại trên cổ bông nên được gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa. a) b) Hình 2.1. Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lá lúa (a) và trên cổ bông (b). Nguồn: http//:aesrg.tamu.edu/Ricerice.htm Trên mạ: vết bệnh có hình thoi nhỏ, màu hồng hoặc nâu vàng. Bệnh nặng, từng đám vết bệnh liên kết kế tiếp nhau tạo thành những mảng cháy khô trên lá và thân làm cho cây mạ khô héo dần rồi chết. 5 Trên lá: vết bệnh hình thoi màu nâu nhạt, rộng ở phần giữa và nhọn ở hai đầu, giữa vết bệnh có màu xám tro, xung quanh nâu đậm, vòng ngoài cũng có màu nâu nhạt. Kích thước vết bệnh biến thiên từ một chấm nhỏ như mũi kim đến chiều dài 1,5cm, khi bệnh nặng các vết bệnh nối với nhau tạo thành những vệt lớn làm cho lá bị cháy. Trên thân, cổ bông: ban đầu trên lá có một chấm nhỏ màu nâu xám, về sau lớn dần bao quanh đốt thân làm thân thắt lại, trên cổ bông làm bông bị bạc (xuất hiện sớm), bông bị gãy gục (xuất hiện chậm khi hạt đã chắc). Trên hạt: vết bệnh không định hình có màu đen hoặc nâu đen [6]. 2.2.3. Đặc điểm phát sinh bệnh Bệnh phát sinh thất thường, tùy thuộc vào yếu tố ngoại cảnh. Bệnh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ thấp (200C), ẩm độ không khí cao và có gió mạnh. Khi không có đủ ánh sáng do mây mù, lúa sẽ tập trung nhiều Glutamic và nhiều amino acid khác nên sẽ tăng tính nhiễm của cây.[6] 2.2.4. Nguyên nhân gây bệnh Bệnh do nấm Magnaporthe grisea (Herbert) Barr. (anamorph, Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.), thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes. Đặc điểm của nấm này là sinh bào tử có kích thước 20-22 x 10-12 µm. Cành bào tử phân sinh có hình trụ, đa bào màu nhạt có từ 3-6 đốt, trên mỗi cành có từ 3-10 bào tử. Bào tử phân sinh có hình quả lê, có từ 2-3 ngăn ngang, không màu, có vỏ mỏng. Nấm M. grisea sinh ra hai loại độc tố: acid alpha-picolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3). Các độc tố này ức chế sự phát triển của cây mạ và sự nảy mầm của bào tử nấm làm cây bệnh tạo và tập trung chất coumain khiến cây lúa bị lùn. Hình 2.2. Bào tử nấm Magnaporthe grisea chụp dƣới kính hiển vi. (Nguồn: 6 Hình 2.3. Vòng đời của nấm Magnaporthe grisea. (Nguồn: http//:www.knowledgebank.irri.orgricedoctor_mxFact_ Sheets/Diseases/Rice_Blast.htm) 2.3. Phƣơng pháp Southern blot Southern blot (Southern 1975) là phương pháp để kiểm tra sự hiện diện của một đoạn gen nào đó trong genome, với sự chính xác và độ đặc hiệu cao. Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước. DNA được biến tính trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nilon hoặc nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai. Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ. Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 650C trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế độ nhiệt 650C, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng. Rửa màng lai bằng dung dịch SSC (NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 650C hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc hoặc sấy khô ở 650C. Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 200C, xử lý dưới ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai [13]. 7 2.4. Enzyme cắt giới hạn Trong phân tích genome, restriction endonuclease là nhóm enzyme có nhiệm vụ cực kỳ quan trọng. Đó là nhóm DNAse nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau). Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44 = 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt. Người ta xem nó như là chìa khóa để nghiên cứu kỹ thuật DNA tái tổ hợp (recombinant). Các enzyme này được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Nó bao gồm một phần của tính chất giới hạn (restriction) viết tắt R, và một phần của tính chất cải tiến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể, và những nhân tố di truyền lạ. Hệ thống R- M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật tiền nhân (prokaryote) như là một hệ thống miễn dịch [7]. Bảng 2.1. Các enzym cắt thông dụng. Enzyme Chuỗi mã di truyền bị tác động BamHI BglII EcoRI HindIII HpaI KpnI PstI SmaI SacI SalI AluI Taq G/GATCC A/GATCT G/AATTC A/AGCTT GTT/AAC GGTAC/C CTGCA/G CCC/GGG GAGCT/C G/TCGAC AG/CT T/CGA 8 Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính: - Một là restriction endonuclease, viết tắt là R-Enase, rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ phân hủy DNA ngoại sinh (exogenus DNA). - Hai là modification methylase của DNA, còn được gọi là methyltranferase, viết tắt là M-MTase, có sự chuyên tính về chuỗi mã rất đồng nhất. M-MTase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh (endogenus DNA) không bị phân hủy bởi R-Enase [7]. 2.5. Các phƣơng pháp chuyển DNA lên màng 2.5.1. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel. Gel này được đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật thể rắn, phẳng (Southern, 1975). Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm [14]. Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ gel agarose được sử dụng. Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb thì hầu hết nó được vận chuyển nhanh, đối với những đoạn DNA có kích thước lớn thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có hiệu quả [6]. 2.5.2. Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng xuống Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng. Khi đó, dòng dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở dưới. Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi được chuyển bằng hệ thống hướng lên. Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel [14]. 2.5.3. Phƣơng pháp mao dẫn hai chiều Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon. Đệm chuyển là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém. Không dùng phương pháp 9 này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao. Tuy nhiên, phương pháp này có thể được sử dụng để phân tích plasmid, acteriophages, hoặc cosmid 235 [14]. 2.5.4. Phƣơng pháp chuyển bằng điện Theo phương pháp này, những phân đoạn DNA sẽ di chuyển từ gel đến màng lai thông qua dòng điện. Dung dịch đệm đóng vai trò lưu dẫn dòng điện. Do sự điện giải, tính dẫn điện của dung dịch giảm dần, vì thế cần sử dụng một lượng dung dịch đệm thích hợp để dòng điện luôn ổn định trong khi chuyển. Tốc độ chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn DNA, nồng độ gel và hiệu điện thế dòng điện [14]. 2.5.5. Phƣơng pháp chuyển bằng chân không Phương pháp này tương tự phương pháp mao dẫn. Buồng chân không sẽ kéo dung dịch chuyển xuyên qua gel và màng, DNA từ gel sẽ di chuyển theo sự di chuyển của dung dịch đệm đến màng. So với phương pháp mao dẫn, phương pháp này nhanh và hiệu quả hơn [14]. 2.6. Probe đánh dấu đƣợc sử dụng trong Southern blot Probe là những đoạn acid nucleic (DNA, RNA hoặc oligonucletide) đã biết rõ trình tự và kích thước, dùng để định vị các đoạn acid nucleic cần nghiên cứu có trình tự bổ sung với trình tự của probe, qua một phản ứng chuyên biệt gọi là lai phân tử. Probe có độ đặc hiệu cao, do đó nó có thể phát hiện ra đoạn gen cần tìm trong hàng ngàn đoạn DNA hoặc RNA khác nhau. Có hai hệ thống đánh dấu probe. Hệ thống đánh dấu (labeling) bằng chất đồng vị phóng xạ như 32P, 35S, 125I, 3H, được phát hiện bằng hiện tượng phóng xạ tự ghi hoặc sử dụng các loại máy đếm Geiger- Muller. Hệ thống đánh dấu không dùng chất đồng vị phóng xạ như Biotin, Enzyme, Chemiluminescence, Fluorescence, Kháng thể (Antibodies). Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin - antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin”. Cả ba hệ thống này, thể probe lai có thể sẽ được phát hiện với cơ chất chromogenic. Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống [2]. Đánh dấu probe được thực hiện bằng một số phương pháp sau: phương pháp nick – translation, phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên), phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi), phương pháp photobiotin. 10 2.7. Cơ sở của sự đa hình trong quần thể nấm M. grisea Transposon là yếu tố thường gặp trong cả prokaryote và eukaryote, đây là những vùng có khả năng chuyển vị trong genome. Trong những năm gần đây, những yếu tố này được phát hiện tăng số lượng trong các loài nấm sợi. Transposon của nấm cũng giống như transposon của của các loài eukaryote khác, chúng được phân thành 2 nhóm chính. Các yếu tố nhóm I chuyển vị qua trung gian RNA, các yếu tố nhóm II chuyển vị trực tiếp từ DNA sang DNA. Yếu tố nhóm I phân thành 3 loại: retrotransposon LTR mã hóa enzyme RT (reverse transcription) và có chứa LTR (long terminal repeat) ở cả hai đầu, retrotransposon LINE cũng mã hóa RT và có đuôi polyA nhưng không có LTR và yếu tố SINE thể hiện đặc tính cần phải phiên mã bằng polymerase RNA III và không có gen RT. Sự biểu hiện của các transposon trong vi sinh vật luôn được quy định hoàn toàn bởi genome kí chủ. Nhưng hoạt tính của chúng lại rất khác nhau tùy theo điều kiện xử lý: shock nhiệt, chiếu tia UV, nuôi cấy mô, lai và chủng với vi khuẩn hoặc xử lý với những yếu tố gây bệnh của vi khuẩn [17]. M. grisea là một loại nấm có phổ kí chủ rất rộng, chúng có thể kí sinh trên hơn 50 loại thực vật thân cỏ và một số loài cây 1 lá mầm khác [11]. Loại nấm này phân hóa và gồm một số loại tác nhân gây bệnh chuyên biệt cho kí chủ. Tác nhân Oryza gây bệnh cho cây lúa (Oriza sativa), Setaria gây bệnh trên loài kê đuôi cáo (Setaria italica), Panicum gây bệnh trên loài kê thường (Panicum miliaceum), Triticum là tác nhân gây bệnh trên lúa mì (Triticum aesticum), Eleusine là tác nhân gây bệnh trên kê hình ngón tay (Eleusine coracana) và digitaria tác nhân gây bệnh trên loài cỏ crabgrass (Digitaria sanguinalis) [17]. Hình 2.4. Những vị trí cắt giới hạn của MAGGY . Các phân đoạn của nó pMGY18, pMGY23 (dòng kẻ đậm) và probe SB (bằng dòng kẻ trắng) để đánh giá số lượng bản sao của MAGGY trong genome. Tên viết tắt của các enzym cắt: BamHI (B), EcoRV (E), HindIII (H), PstI (P), SalI (S).(Yukio Tosa và ctv, 1995). 11 Genome M. grisea có 6 nhiễm sắc thể, có trọng lượng phân tử là 38 megabase và kích thước mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. Có nhiều transposon được tìm thấy trong genome của M. grisea tạo nên những trình tự DNA lập lại được gọi là MGR (M. grisea repeat), các MGR này giúp phân biệt các cá thể trong một quần thể nấm M. grisea đa hình. Một số MGR được tìm thấy trong quần thể nấm M. grisea: MGR583, MGR586, MGSR1, Grasshopper, MAGGY, Fosburi và Pot2 [9, 16]. Nhóm I gồm các retrotransposon LTR Grasshopper, MAGGY và fosbury, retrotransposon MGR583- LINE, yếu tố MGSR1-SINE và Mg-SINE, nhóm II gồm MGR586 hoặc Pot3 và Pot2. MGR583 được cho là những yếu tố cũ, đã xuất hiện rất sớm trong quần thể M. grisea trong quá trình tiến hóa của nó, LTR-retrotransposon MAGGY và Grasshopper thì bị giới hạn, và được cho là những yếu tố mới cái mà gần đây mới xuất hiện trong quần thể nấm Pyricularia bằng sự di chuyển ngang. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng MAGGY là yếu tố hoạt động mạnh nhất trong các yếu tố được kiểm tra về sự chuyển vị trong quần thể M. grisea [17]. MAGGY là một retrotransposon kích thước 5,6 kb, được phân tách từ nấm Magnaporthe grisea và có 2 ORF và các LTR có kích thước 253-bp ( Farman và ctv 1996). ORF1 mã hóa chuỗi polypeptide gồm 457 amino acid, ORF2 có đặc tính của gen pol mã hóa một polypeptide có chức năng protease. Hầu hết các retrotransposon được tìm thấy trong các loại nấm sợi ngày nay được phân vào nhóm Ty3-gypsy với một vài ngoại lệ. MAGGY có nhiều coppy trong bộ gen M. grisea phân lập được từ cây lúa, cây kê đuôi cáo, và một số loại cỏ khác, nhưng chúng không tìm thấy trong nấm M. grisea phân lập từ lúa mì [8]. 2.8. Một số nghiên cứu ứng dụng Southern blot trong phân tích đa dạng di truyền của quần thể nấm Magnaporthe grisea Hamer và ctv (1989) là những người đầu tiên tìm ra một họ những trình tự DNA lập lại trong genome của M. grisea được gọi là MGR586. Ứng dụng phương pháp DNA-fingerprinting sử dụng probe MGR586 đã mở ra một hướng mới trong nghiên cứu cấu trúc của quần thể nấm M. grisea. Sau đó, những nghiên cứu này được phát triển xa hơn trong nghiên cứu cấu trúc di truyền của quần thể nấm gây bệnh cháy lá trong các vùng trồng lúa trên thế giới. Một vài trình tự DNA lập lại trong quần thể nấm này cũng được tìm thấy sau đó như: Pot2, Fosbury, MGSR1, MAGGY và được sử 12 dụng thay thế cho probe MGR586. Trong đó, MAGGY được xem là probe tốt nhất vì trong một số trường hợp nó có thể cho thấy sự khác biệt giữa các nòi nấm M. grisea trong cùng một kí chủ. Hamer và ctv (1992) đã sử dụng probe MGR586, lai chéo với các dòng là tác nhân gây bệnh cho lúa và những dòng không gây bệnh trong phòng thí nghiệm. Kết quả ông đã tìm được 57 đoạn DNA cắt giới hạn được lai với probe MGR586 của dòng gây bệnh trên lúa và phát hiện ra 8 nhóm liên kết. Những kết quả đó cho phép Hamer xây dựng bản đồ 3 gen sắc tố (Alb1, Rsy1 và Buf1), vị trí lai (Mat1), tổ chức tạo nhân con (Rdn1), gen Smo1 và hai đa hình RFLP liên kết với Smo1. Kết quả của Hamer đã chỉ ra rằng vị trí của các MGR586 được phân bố một cách ngẫu nhiên trong genome của nấm M. grisea. Yukio Tosa và ctv (1995) đã sử dụng hai probe pMGY23 và pMGY18 được tách dòng từ MAGGY, để phân tích sự phân bố của retrootransposon MAGGY trong các dòng Pyricularia được phân lập từ các loài thực vật một lá mầm ở nhiều nước khác nhau. Kết quả ông đã tìm thấy được nhiều bản sao của MAGGY trong các nòi phân lập từ lúa và kê đuôi cáo (Setaria italica). Điều này chứng tỏ các nòi là tác nhân gây bệnh trên lúa có quan hệ di truyền gần với nòi từ loài Setaria. Pradeep Kachroo và ctv (1995) sử dụng phương pháp Southern blot với probe Mg-SINE, phân tích genome của các nòi M. grisea. Qua nghiên cứu Kachroo đã phát hiện ra khoảng 100 bản sao của Mg-SINE trên một thể đơn bội trong cả các nòi gây bệnh cho lúa và các nòi không gây bệnh cho lúa. Verel Shull và John E. Hamer (1996) sử dụng probe pCB586 để phát hiện đoạn MGR586 trong quần thể nấm M. grisea. Phân tích sự giảm phân của MGR586 Shull và Hamer đã tìm ra được một đa hình mới là MGR586-P2. P2 được tạo ra do một đoạn chèn gần, đó là một retrotransposon chứa đoạn LTR. Kết quả các ông đưa ra rằng những vị trí DNA đánh dấu có thể siêu biến tái sắp xếp chính xác. Le Dinh Don và ctv (1998) phân tích cấu trúc quần thể nấm M. grisea ở Nhật Bản bằng phương pháp DNA fingerprinting. Don đã sử dụng Probe SB lai với MAGGY và MGR586. Kết quả đã cho thấy rằng có hai dòng liên kết trong quần thể nấm, hai dòng này chỉ ra khả năng gây độc tương tự nhau. MAGGY thể hiện trong các nhóm cũng tương tự như MGR586, mặc dù hai yếu tố nay khác nhau về tính chất và 13 cấu trúc. Điều này cho thấy rằng MAGGY có thể thay thế cho MGR586 trong những nghiên cứu khác trong quần thể các nòi M. grisea gây bệnh cho lúa. Le Dinh Don và ctv (1999) đã tiến hành phân tích cấu trúc di truyền của quần thể nấm M. grisea gây bệnh đạo ôn trên vùng Đồng bằng Sông Hồng (1998) và Đồng bằng Sông Cửu Long (1996). Ứng dụng phương pháp Southern blot sử dụng probe chứa một đoạn phân lập từ MAGGY và đã phát hiện được 5 dòng chứa đoạn gen MAGGY. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa các nòi ở hai vùng trồng lúa này. Đầu tiên, khả năng gây độc rất khác nhau đặc biệt là trên những dòng có gen kháng Pi-ks và Pi-ta. Thứ hai, các nòi ở khu vực phía Bắc thì đa dạng về cấu trúc dòng hơn các nòi ở khu vực phía Nam. Motoaki Kusaba và ctv (1999) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể nấm M. grisea được phân lập từ nhiều loại kí chủ khác nhau bằng sự đa hình các đoạn MAGGY trong DNA genome. Kusaba nhận ra sự hiện diện với số lượng bản sao nhiều của MAGGY trong genome, thực hiện đọc trình tự vùng ITS2 để xây dựng sơ đồ mối quan hệ giữa các dòng. Những kết quả cho thấy rằng MAGGY di chuyển ngang trong di truyền quần thể nấm M. grisea. Những kết quả nghiên cứu đó đã xây dựng một cơ sở dữ liệu về bản đồ di truyền của quần thể nấm M. grisea kí sinh trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên cây lúa. Cơ sở dữ liệu đó có thể được sử dụng cho những nghiên cứu sau này. 14 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ 06-02-2006 đến ngày 15-08-2006. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông Học, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Phòng công nghệ sinh học, trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Đối Tƣợng khảo sát Các dòng nấm Magnaporthe grisea được cung cấp từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. 3.3. Nội dung thực hiện - Ly trích DNA từ sinh khối sợi nấm Magnaporthe grisea. - Thiết lập phản ứng cắt DNA genome bằng enzyme cắt giới hạn. - Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 . - Ly trích DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn. - Thực hiện phản ứng đánh dấu plasmid. - Tạo mẫu lai trên DNA genome của nấm M. grisea. - Thực hiện lai Southern với probe palsmid pMGY-SB được đánh dấu bằng biotin 3.4. Vật liệu và hóa chất 3.4.1. Dụng cụ và thiết bị 3.4.1.1. Dụng cụ - Micropipette (0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl), đầu tip các loại - Eppendorf 1,5 ml, 200 µl, ống ly tâm 15 ml 15 - Màng Hybond-N - Bình đựng nitơ lỏng - Kính hiển vi quang học - Bình tam giác (250, 500, 1000ml), ống nghiệm, đĩa petri, becher - Phim Konica 30 x 40 cm (100 tấm / hộp) - Cassette 30 x 40 Konica 3.4.1.2. Máy móc và thiết bị - Buồng lai: HB – 1000 Hybridizer - Máy cross-linker: GS GENE LINKER TM UV CHAMBER (Bio-Rad) - Máy điện di (Bio - Rad) - Máy chụp gel (Bio - Rad) - Máy lắc định ôn - Máy vortex - Bồn nước ổn nhiệt - Tủ sấy dụng cụ - Nồi hấp (Autoclave - Tomy) - Máy đo pH - Cân kỹ thuật - Máy khuấy từ - Máy lọc nước khử ion - Tủ cấy vô trùng (micro flow) - Tủ lạnh -4oC, - 20oC, - 70oC 3.4.2. Hóa chất Các hoá chất được sử dụng trong đề tài này được sản xuất bởi Công ty Sigma, Meark, Amersham Biosence và Bio Rad. 3.4.2.1. Môi trƣờng - Môi trường lỏng CZA : yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, Glucose. - Môi trường lỏng LB chứa Ampiciline: yeast extract, bactose trypton, NaCl. 3.4.2.2. Hóa chất dùng trong ly trích DNA - Nitơ lỏng - Phenol /Chloroform/Isoamyl (25:24:1) - Isopropanol - Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM tris HCl, 1mM EDTA pH 8.0 - Ethanol 70%, 100% - RNAse 16 - Dung dịch ly trích (lyssis buffer): 50mM tris HCl, 50mM EDTA, 3% SDS, 1% - mercaptoethanol. 3.4.2.3. Hóa chất dùng trong Southern blot Hóa chất chuyển DNA lên màng - Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M - Đệm trung tính: Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển (transfer buffer): SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X. Hóa chất để tạo probe - Reaction buffer - Labelling reagent - Cross – linker working Hóa chất dùng trong phản ứng lai - Dung dịch đệm lai: Alkphos Direct hybridization buffer (Amersham) - Dung dịch rửa 1 (Primary wash buffer): Urea 2 M; SDS 0,1%; natri phosphate. - Dung dịch rửa 2 (Secondary wash buffer ): Tris-base 1M, NaCl 2M, pH 10.0. Hóa chất để phát hiện phản ứng lai - Chất phát hiện: detection reagent with CDP – star (Amersham) - Bộ thuốc rửa phim Konica (developer + fixer) Enzyme cắt giới hạn Bảng 3.1. Enzym giới hạn dùng phân cắt genomic DNA tạo mẫu lai Tên enzyme Trình tự nhận biết Mã hàng Nhà sản xuất BamHI EcoRV HindIII G /GATCC GAT/ATG A/AGCTT Cat. No. 220 612 Cat. No. 667 145 Cat. No. 656 313 Roche Roche Roche 17 3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1. Triết tách DNA tổng số từ các mẫu nấm (isolate) 3.5.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm Các mẫu phân lập được nuôi cấy trên môi trường lỏng CZA (Czapek- Dox) (Tuite, 1969): 20g Glucose, 3g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g K2HPO4, 0,5g MgSO4-7H2O (hoặc 0.005g/500 ml FeSO4-H2O), một ít NaCL trên tổng thể tích 1000ml, pH 6.0-6.5. Chuẩn bị một cốc dung tích 1000ml, cho vào cốc 800ml nước cất vô trùng, cân đủ lượng tất cả các loại hóa chất này và cho vào cốc khuấy tan bằng máy khuấy từ. Sau đó, môi trường được san đều vào 10 bình tam giác, mỗi bình 100ml, hấp khử trùng trong nồi hấp 20 phút ở 1210C. Sợi nấm được lấy ra trên một đĩa petri vô trùng, dùng dao vô trùng băm nhỏ ra và cho vào bình chứa môi trường lỏng. Sinh khối nấm được nhân trong điều kiện lắc với tốc độ 5000 vòng, trong khoảng 72 giờ. Sau đó, tôi thu được khối sợi nấm là những hạt tròn nhỏ li ti, lọc lấy khối sợi nấm này qua vải lọc (đã được khử trùng) và làm khô bằng giấy thấm, đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở -80oC. 3.5.1.2. Ly trích DNA theo phƣơng pháp lysis buffer - Đặt 10 g sợi nấm đã được làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch nitơ lòng. Sau đó, sinh khối nấm đã nghiền nát được chuyển vào ống ly tâm 15 ml. Chú ý, trong giai đoạn này tránh để bột nấm bị ướt. - Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ ở 65oC. - Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm. Thêm vào khoảng 300 l Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) lắc nhẹ, dung dịch lúc này có màu trắng đục như sữa (không nên lắc mạnh tránh DNA bị đứt gãy). - Ly tâm 20 phút 10000 vòng ở nhiệt độ phòng. - Dùng pipet hút dịch nổi và chuyển vào một ống nghiệm mới. - Thêm 0,5 vol Isopropanol, vào dịch nổi mới thu được, trộn nhẹ nhàng, ủ ở - 20 0C khoảng 1 giờ, để làm kết tủa DNA, lúc này DNA kết tủa tạo thành những sợi màu trắng đục. 18 - Dùng ống thủy tinh (hiệu Ikarea) được tạo thành một đầu cong dưới đèn cồn và móc lấy DNA chuyển qua eppendorf sạch, dùng ethanol 70% rửa DNA nhiều lần mỗi lầm khoảng 300 l. - Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở tủ mát 40C hoặc tủ -200C cho đến khi sử dụng. 3.5.1.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bước tinh sạch DNA bằng RNAse như sau: - Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nước cất vô trùng (hoặc TE 1X) vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm 2 l RNAse vào hỗn hợp trên và trộn đều - Ủ ở 370C trong khoảng 2 giờ - Thêm vào 20 l phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm 13500 vòng trong 10 phút, thu phần dịch nổi cho vào eppendorf mới - Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm 13500 vòng 1 phút bỏ phần dịch nổi bên trên - Làm khô DNA và hòa tan DNA với TE 1X - Điện di trên gel agarose 0,8%, với dung dịch đệm TAE 0,5X, vận hành máy điện di trong 30 phút ở 100V và 250mA. Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. - Kết quả được đọc bằng máy chụp gel hiệu Bio-Rad (phần mềm quantity one 2000). 3.5.2. Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 3.5.2.1. Chuẩn bị tế bào khả nạp - Cấy 30 l dịch vi khuẩn E.coli DH5 vào 3 ống nghiệm chứa 3 ml môi trường LB lỏng. - Nuôi cấy lắc ở 370C trong 4 giờ đến khi đạt được mật độ khoảng 108 tế bào/ml. - Chuyển ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy vào thùng nước đá giữ lạnh trong 10 phút. 19 - Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên thu phần sinh khối ở bên dưới, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được, votex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf để làm khô kết tủa. - Thêm 150 l CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf hòa tan phần kết tủa trên, thêm 20 l glycerol 98% trộn đều và trữ ở -700C. 3.5.2.2. Biến nạp plasmid pMGY-SB, pMGR-T1, pEBA18 vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) - Hút 30 l dịch tế bào vi khuẩn E.coli DH5 đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1,5 ml, thêm một thể tích phù hợp tương ứng với 100ng của DNA plasmid, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf vào nước đá, giữ lạnh trong 2 phút. - Thêm 800 l môi trường LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200 l huyền phù tế bào đã biến nạp ở trên cho vào 3 ml môi trường LB chứa kháng sinh Ampiciline với nồng độ 70 g/ml, nuôi cấy lắc ở 37 0C qua đêm. Tôi tiến hành cùng một quy trình trên với tế bào khả nạp nhưng không cho DNA plasmid vào để làm đối chứng. 3.5.2.3. Kiểm tra kết quả biến nạp Kết quả biến nạp có thể được kiểm tra trực tiếp bằng cách nuôi trong môi trường LB chứa kháng sinh với nồng độ 70 g/ml. Những tế bào vi khuẩn nào có chứa plasmid thì có thể sống và tăng sinh trong môi trường kháng sinh, cón những tế bào nào không chứa plasmid thì không kháng lại được kháng sinh và chết. Từ đó, tôi có thể chọn lọc được dòng vi khuẩn chứa plasmid, và ly trích được plasmid mà tôi cần sử dụng với số lượng lớn. 20 Phƣơng pháp chiết tách plasmid sử dụng SDS-kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989) Nguyên tắc của phương pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng, Sau khi màng tế bào bị phá vỡ, dưới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh được sự phân hủy của enzyme DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách triết, làm cho DNA genome và DNA plasmid bị biến tính. Sau đó, trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA plasmid sẽ được phục hồi nhanh chóng, DNA của bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA plasmid. Vì vậy, DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein và DNA genome của tế bào sẽ bị tủa suống. Như vậy, ta có thể tách DNA plasmid ra khỏi tế bào của bộ gen mà it bị lẫn DNA genome. Chọn những ống vi khuẩn tăng sinh được trong môi trường kháng sinh ở trên để ly trích DNA plasmid theo quy trình sau: - Hút địch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000vòng/phút trong 1 phút ở 200C để thu sinh khối. - Hút bỏ dịch bên, tiếp tục hút dịch vi khuẩn từ những ống nghiệm tương ứng cho vào, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. - Cho 150 l dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, votex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. - Thêm 200 l dung dịch II, đảo nhẹ khoảng 8 lần (dịch trong eppendorf trở nên nhớt), sau đó thêm tiếp 150 l dung dịch III, đảo nhẹ eppendorf (chú ý trong bước này không nên votex). - Ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút ở 200C, thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tương ứng. - Thêm 1 l RNAse vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi mới thu được, ủ 370C trong 1 giờ để khử hết RNA. 21 - Cho vào mỗi eppendorf 300 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Cho vào mỗi eppendorf 300 l chloroform/isoamylalcohol (24:1), trộn đều ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút ở 200C, thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tương ứng. - Thêm vào mỗi eppendorf trên 300 l isopropanol, ủ -200C 30 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. hút bỏ dịch nổi thu kết tủa. - Rửa tủa trên bằng ethanol 70% 3 lần, úp ngược eppendorf trên giấy thấm để làm khô DNA. - Thêm 20 l TE 1X vào eppendorf để hòa tan kết tủa. - Hút 4 l chạy điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra kết quả ly trích 3.5.2.4. Tăng sinh vi khuẩn và ly trích plasmid bằng kit DNA plasmid để sử dụng làm probe phải có độ tinh sạch cao nên tôi tiến hành ly trích DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid mini kit của Bio-Rad. Quy trình ly trích như sau: - Chuyển 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch nổi thu sinh khối, lập lại bước này 3 lần. - Thêm 250 l dung dịch đệm hòa tan (resuspension solution), votex hoặc dùng pipet làm tan kết tủa trong dung dịch. - Thêm 250 l dung dịch ly trích (lysis solution), đảo ngược eppendorf 6-8 lần. - Thêm 350 l dung dịch trung hòa (neutralization solution) trong vòng 5 phút sau khi cho dung dịch ly trích, đảo ngược từ 6-8 lần (không votex). - Ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút, thu dịch nổi. - Trong khi ly tâm, tiến hành chèn cột vào ống do bộ kit cung cấp (capless wash). - Hút dịch nổi cho vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để DNA plasmid gắn vào màng, bỏ phần dịch bên dưới ống, lập lại bước này một lần nữa. 22 - Thêm 750 l dung dịch rửa vào cột, ly tâm 1 phút, sau đó ly tâm tiếp một phút. - Loại bỏ dịch rửa chuyển cột chứa plasmid sang eppendorf 1,5 ml, thêm 50 l dung dịch elution vào màng, để 1 phút, ly tâm 1phút để tách plasmid ra khỏi màng, thu phần dung dịch chứa DNA