Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện THS. HỒ THỊ NGA MAI MINH MẪN BSTY. NGUYỄN KIÊN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM TẠ Con xin gửi đến Ba Má lòng thành kính ghi ơn. Con kính chúc Ba Má sức khỏe, con sẽ luôn phấn đấu để trở thành ngƣời có ích cho xã hội để không phụ công dƣỡng dục của Ba Má. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: * Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. * ThS. Hồ Thị Nga, BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng, đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. * PGS.TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã giúp đỡ cũng nhƣ động viên lúc tôi gặp khó khăn. * TS. Dƣơng Nguyên Khang cùng các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt đề tài. * Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh đã dành thời gian quý báu để cung cấp cho tôi những tài liệu, kinh nghiệm quý báu. * Cùng toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Sinh viên thực hiện MAI MINH MẪN iv TÓM TẮT MAI MINH MẪN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ” Giáo viên hƣớng dẫn: ThS. Hồ Thị Nga BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trên đối tƣợng thỏ. Nhiễm sắc thể là yếu tố ảnh hƣởng đến sự di truyền của một giống loài. Xây dựng đƣợc kiểu nhân của một loài là bƣớc đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế di truyền của loài đó. Phƣơng pháp hiệu quả nhất trong nghiên cứu kiểu nhân là nuôi cấy tế bào bạch cầu của máu và nhuộm. Máu thỏ nuôi cấy với hai liều lƣợng là 0,4 ml và 1 ml trong môi trƣờng RPMI 1640 có bổ sung một số chất giúp cho sự sinh trƣởng và phát triển tế bào nhƣ huyết thanh phôi bò (FBS), Pokeweed (lectin), kháng sinh antimycotic – antibiotic. Mẫu máu đƣợc nuôi cấy chủ yếu bằng chai Rough trong 72 giờ ở 37 0C trong tủ ấm CO2. Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trƣờng và ủ theo ba mức thời gian 20 phút, 40 phút và 60 phút trƣớc khi xử lý để nhuộm. Bên cạnh đó ống nghiệm 15 ml cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy thử nghiệm. Kết quả cho thấy khi nuôi cấy 1ml máu thỏ với môi trƣờng RPMI 1640 trong 72 giờ ở 37 0C và ủ với colcemid trong thời gian 60 phút thì thu đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. Ngoài ra, khi nuôi cấy máu thỏ với ống nghiệm 15 ml vẫn thu đƣợc các tế bào ở giai đoạn trung kỳ. Mặc dù vậy, chúng tôi vẫn chƣa xây dựng đƣợc kiểu nhân (karyotype) của bộ nhiễm sắc thể thỏ do nhiễm sắc thể chƣa trãi đều khi nhuộm. v SUMMARY MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007. “THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS” Supervisors HO THI NGA, MSc NGUYEN KIEN CUONG, DMV A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Chromosome is an element which affects the species genetics. Setting up karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’ genetic mechanism. The most effective researching karyotype method is that culturing and staining lymphocyte. Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two dosages, 0,4 ml and 1 ml. It was cultured in RPMI 1640 medium which supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin), antimycotic – antibiotic. Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37 0 C. In addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture. After 72 hours, we added colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was fixed. The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and incubating with colcemid in 60 min. Besides, the cells also grew and divided when they were cultured in 15 ml falcon tubes. So that, we could replace Rough vase with 15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes. However, we haven’t established rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides. vi MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ ...................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................ iv Summary .......................................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................ vi Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................. ix Danh sách các bảng ......................................................................................... x Danh sách các hình ........................................................................................ xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu ................................................................................................. 2 1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................... 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 2.1 Tổng quan về thỏ .......................................................................................... 3 2.1.1 Phân loài ................................................................................................. 3 2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý ......................................................................... 3 2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ ............................................................................ 3 2.2 Nhiễm sắc thể ............................................................................................... 4 2.2.1 Khái niệm ............................................................................................... 4 2.2.2 Hình thái và kích thƣớc .......................................................................... 4 2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể .......................................................................... 5 2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6 2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể ......... ………………………….6 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể ................................................... 8 2.3 Chu Kỳ sống của tế bào ............................................................................... 9 2.3.1 Gian kỳ ................................................................................................... 9 vii 2.3.1.1 Pha G1 ............................................................................................ 10 2.3.1.2 Pha S ............................................................................................... 10 2.3.1.3 Pha G2 ............................................................................................ 10 2.3.1.4 Phân bào ......................................................................................... 10 2.3.2 Nguyên phân ........................................................................................ 11 2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân ............................................................ 11 2.3.2.2 Các kỳ của phân bào ...................................................................... 12 2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể ........................................ 14 2.4.1 Kỹ thuật splash ..................................................................................... 14 2.4.2 Kỹ thuật squash .................................................................................... 16 2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ .............................................. 16 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................... 20 3.1 Thời gian và địa điểm................................................................................. 20 3.2 Đối tƣợng ................................................................................................... 20 3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20 3.4 Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 20 3.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 20 3.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 21 3.4.3 Hóa chất ............................................................................................... 21 3.5 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 23 3.5.1 Thí nghiệm 1 ........................................................................................ 23 3.5.2 Thí nghiệm 2 ........................................................................................ 23 3.5.3 Thí nghiệm 3 ........................................................................................ 24 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát ................................................................................... 24 3.6 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ..................................................................... 24 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim .............................................................. 24 3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai ............................................. 24 3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu .......................................................... 25 viii 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể ................................................................ 26 3.6.3.1 Kỹ thuật trãi đều nhiễm sắc thể ...................................................... 26 3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa .................................................. 27 3.7 Xử lý số liệu ............................................................................................... 27 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid ........................................... 28 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy .................................................. 29 4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml ................................... 31 4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm ...................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 38 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 38 5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 38 CHƢƠNG 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 39 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleotide ARN Acid ribonucleotide Ctv Cộng tác viên IU International unit FBS Fetal bovine serum NST Nhiễm sắc thể PHA Phytohemaglutinin PBS Phosphate buffer saline x DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài ................................................ 5 Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thể........................................... 17 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu ................................................ 22 Bảng 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid..................................... 28 Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy ............................................ 30 Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml .................... 32 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Nhiễm sắc thể ......................................................................................... 4 Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6 Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể ................................................................... 7 Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể ........................................ 8 Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào .......................................................................... 9 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm ...................................................... 13 Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực ...................................................................... 19 Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai .................................................... 25 Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu ...................................................................... 26 Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa ......................................................... 33 Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ ................................................................. 33 Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu .................................................. 34 Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ ........................................................ 36 Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính ...................................... 37 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của cơ thể sống. Trong tế bào có chứa các bào quan và nhân. Nhân tế bào là cấu thành bắt buộc của tế bào eukaryote, vì trong nhân có chứa nhiễm sắc thể (NST), là cấu trúc mang vật chất di truyền ADN (acid deoxyribonucleotide) của tế bào và cơ thể. Nhiễm sắc thể đƣợc quan sát đầu tiên bởi Nageli năm 1842, nhƣng đến năm 1888, NST mới đƣợc Waldeyer đặt tên là “chromosome” (“chromo” có nghĩa bắt màu nhuộm và “some” nghĩa là một thể) (Eldridge, 1985). Nhiễm sắc thể đóng vai trò rất quan trọng trong di truyền của các loài, một yếu tố quyết định cho sự tiến hóa hay suy thoái của giống nòi. Có thể nói hơn 100 năm qua, chƣa có một cấu trúc sinh học nào nhƣ NST đã đƣợc nhiều phòng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu, nhiều phƣơng tiện kỹ thuật và kinh phí để nghiên cứu. Mục đích cuối cùng là làm sáng tỏ cấu trúc phân tử, siêu vi thể cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng trong tế bào. Một trong những kỹ thuật nghiên cứu NST rất cổ điển nhƣng rất hiệu quả đó là phƣơng pháp nhuộm. Với phƣơng pháp nhuộm, chúng ta có thể nghiên cứu đƣợc kiểu nhân (karyotype) của một loài nào đó. Mà việc sử dụng bảng đồ kiểu nhân có tầm quan trọng trong nghiên cứu di truyền tế bào, trong y học lâm sàng chẩn đoán bệnh di truyền, bệnh ung thƣ, trong phân loại học cũng nhƣ trong công tác chọn giống cây trồng và vật nuôi. Do đó tìm ra một quy trình nhuộm NST tối ƣu để nghiên cứu kiểu nhân trong tế bào là điều rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm cùng với sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y, chúng tôi thực hiện đề tài “Bƣớc đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ”, để tạo cơ sở cho việc xây dựng kiểu nhân hoàn chỉnh của thỏ, góp phần ứng dụng cho những nghiên cứu sau này. 2 1.2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu Xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu trong máu thỏ. 1.2.2 Yêu cầu - Thu nhận và nuôi cấy tế bào bạch cầu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ. - Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau. - Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau. - Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về thỏ Thỏ có nguồn gốc từ thỏ rừng, đã đƣợc con ngƣời thuần hoá hơn 1000 năm trƣớc công nguyên và trở thành thỏ nhà với tên khoa học là Oryctolagus Cesnoaclus Domesticies. 2.1.1 Phân loài ־ Bộ gặm nhấm: Rodentia ־ Lớp: Lagomorpha ־ Loài: Orgctolagus ־ Họ thỏ: Leporides 2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý ־ Thân nhiệt: 39,50C (biến động từ 30 – 410C) ־ Nhịp tim: 120 - 160 lần/phút ־ Tần số hô hấp: 60 - 90 lần/phút ־ Nhiệt độ môi trƣờng thích hợp khoảng: 20 – 250C 2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ Lƣợng máu của thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lƣợng cơ thể. Thành phần máu gồm huyết tƣơng và tế bào máu. Huyết tƣơng chiếm 60% thể tích, gồm huyết thanh và chất sinh sợi huyết. Huyết tƣơng có vai trò vận chuyển chất hữu cơ và vô cơ trong cơ thể (Dƣơng Nguyên Khang, 2006). Máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Số lƣợng hồng cầu khoảng từ 6 – 6,5 triệu trong 1 mm3 máu, chiếm hơn 90% tế bào máu. Hồng cầu có vai trò vận chuyển O2 và CO2, điều hòa pH. Số lƣợng tiểu cầu khoảng 300.000 trong 1 mm3 máu. Tiểu cầu khi vỡ sẽ sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu, ngƣời ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu. Heparin có trong đại thực bào của gan, phổi và bạch cầu ƣa base, chúng không gây độc đối với tế bào. 4 Bạch cầu giữ nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, số lƣợng bạch cầu ở thỏ khoảng 7.600 trong 1mm 3 máu (Trịnh Văn Thịnh, 1978). Bạch cầu gồm hai nhóm: bạch cầu có hạt và bạch cầu không hạt. Bạch cầu có hạt gồm: trung tính, acid và base. Bạch cầu không hạt gồm: đơn nhân lớn và lympho. Trong đó, bạch cầu lympho có khả năng phân chia nhanh và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro (Eldridge, 1985). 2.2 Nhiễm sắc thể 2.2.1 Khái niệm Nhiễm sắc thể (NST) là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, cấu tạo chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và biến đổi hình thái cấu trúc theo qui luật trong các quá trình phân bào. Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng, trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ. Trong các tế bào bình thƣờng mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử. Mỗi loài bình thƣờng có bộ NST lƣỡng bội (2n) đặc trƣng về số lƣợng, hình thái, cấu trúc và ổn định tƣơng đối qua các thế hệ. Kiểu nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lƣợng và hình dạng của các NST chuyên biệt cho mỗi loài. Hình 2.1 Nhiễm sắc thể (Nguồn 2.2.2 Hình thái và kích thƣớc Nhiễm sắc thể quan sát ở trung kỳ thƣờng có hình dạng chấm hoặc hình que, thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính khoảng 0,2 µm đến 3 µm và chiều dài chiều dài khoảng 0,2 µm đến 50 µm. Về kích thƣớc ở các tế bào khác nhau thì không giống nhau, nhƣng chúng đặc trƣng cho các tế bào và cá thể của cùng một loài. 5 Tuy nhiên, các mô khác nhau của cùng một cơ thể có sự biến đổi hình dạng và kích thƣớc NST để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005). 2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể Số lƣợng nhiễm sắc thể là một chỉ tiêu đặc trƣng cho loài. Theo quy luật chung, mỗi một cá thể cùng một loài có số lƣợng NST đặc trƣng cho loài đó. Không thể dựa vào số lƣợng NST để đánh giá mức độ tiến hóa của các loài. Cũng giống nhƣ hàm lƣợng DNA, tuy có tính ổn định loài nhƣng chƣa thể hiện tính logic của bậc thang tiến hóa. Vấn đề là cần phải xem xét mức độ tổ chức và hoạt động của hệ gen trong DNA và trong NST. Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài (Eldridge, 1985) Ngƣời (Homo sapiens) 2n = 46 Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44 Cừu (Ovis aries) 2n = 54 Chó (Canis familiaris) 2n = 78 Mèo (Felis catus) 2n = 38 Ngựa (Equus asinus) 2n = 62 Vịt (Anas platyrhyncha) 2n = 80 Heo (Sus scrola) 2n = 38 Số lƣợng nhiễm sắc thể còn đặc trƣng cho bộ NST. Gồm các bộ: Bộ nguyên bội (monoploid) đƣợc ký hiệu là x, từ đó khởi nguyên hình thành các bộ đơn bội, lƣỡng bội, đa bội. Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu là n, đặc trƣng cho các tế bào, cơ thể đơn bội và các tế bào sinh dục trƣởng thành ở loài sinh sản hữu tính. Bộ lƣỡng bội (diploid) ký hiệu 2n, đặc trƣng cho các tế bào và cơ thể lƣỡng bội. Bộ lƣỡng bội đƣợc hình thành do sự kết hợp hai bộ đơn bội. Bộ đa bội (polyploid) đặc trƣng cho tế bào và cơ thể đa bội. Số NST đƣợc tăng lên theo bội số của n khởi nguyên. 6 2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể 2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể a) Nhiễm sắc thể thƣờng và nhiễm sắc thể giới tính Trong bộ lƣỡng bội (2n) thƣờng tồn tại nhiều cặp tƣơng đồng giống nhau về hình dạng, kích thƣớc đƣợc gọi là NST thƣờng (autosome). Ngoài ra còn có 1 cặp NST trong đó 2 thành viên khác nhau về hình dạng, kích thƣớc hoặc trạng thái hoạt động đƣợc gọi là NST giới tính (sex chromosome). Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể (Nguồn b) Centromere Centromere là cấu trúc định khu trên chiều dọc NST ở vùng đƣợc gọi là eo thƣa cấp một. Centromere là vùng phân hóa của NST có vai trò đính kết hai nhiễm sắc tử với nhau, đồng thời giúp cho nhiễm sắc tử phân ly khỏi nhau và di chuyển về hai cực của tế bào nhờ các sợi của thoi vô sắc. Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí centromere. Ngƣời ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác định vị trí của centromere và các kiểu hình NST. P: chiều dài vế ngắn. Q: chiều dài vế dài. 7 Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau: ־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc. ־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể. ־ Submetacentric có centromere ở gần chính giữa (Q > P). ־ Metacentric có centromere ở chính giữa chia 2 vế bằng nhau (P = Q). Có một số tranh luận khoa học về kiểu hình nhiễm sắc thể. Ngƣời ta tự hỏi telocentric có thật hay không. Một số nghiên cứu chứng minh rằng telocentric thật sự tồn tại, centromere của telocentric có dính một lƣợng rất nhỏ chất nhiễm sắc mà chúng ta khó xác định đƣợc. Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể (Nguồn c) Telomere Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN liên kết với protein tạo thành các sợi NST xoắn, gấp khúc chạy suốt NST. Đầu tận cùng của phân tử ADN ở đầu tận cùng của NST gọi là telomere. Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh rằng telomere có ba chức năng quan trọng: ־ Ngăn cản không cho enzyme deoxiribonuclease phân giải đầu tận cùng của phân tử ADN ־ Ngăn cản không cho NST trong bộ kết dính nhau ־ Tạo thuận lợi cho tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử Telomere có cấu trúc và thành phần đặc thù gồm những đoạn lặp nucleotid, tuy khác nhau ở các loài nhƣng thƣờng thể hiện theo phƣơng thức 5’ – T1-4 A0-1 G1-8 – 3’. Ví dụ ở ngƣời cũng nhƣ động vật có xƣơng sống có đoạn lặp lại là TTAGGG, ở thực vật arabidopsis thaliana có đoạn lặp lại là TTTAGGG. 8 2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể a) Sợi nucleosome Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn nhiều cấp, đƣợc gọi là sợi nhiễm sắc. Sợi nhiễm sắc cơ bản có đƣờng kính 11 nm, là chuỗi hạt cƣờm, đƣợc gọi là sợi nucleosome. Mỗi hạt cƣờm là một nucleosome có kích thƣớc 11 nm dạng khúc giò gồm lõi đƣợc cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H2A, 2 H2B, 2 H3, và 2 H4), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng (chứa khoảng 146 cặp nucleotid). Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN dài khoảng 60 nucleotid. Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H1, mỗi cuộn gồm sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đƣờng kính 30nm, đƣợc gọi là sợi solenoid. b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thƣớc khoảng 300nm. Các sợi 300 nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm tức là các nhiễm sắc tử. Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit có vai trò điều hòa hoạt động của gen. Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể (Nguồn 9 2.3 Chu kỳ sống của tế bào Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào đƣợc hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thức sự phân bào hình thành tế bào mới. Ngƣời ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân bào (mitosis). Thời gian của một chu kỳ sống của tế bào động vật rất dài, từ 20 đến 40 giờ. Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào (Nguồn 2.3.1 Gian kỳ Trong gian kỳ tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động sống khác nhau nhƣ tổng hợp các ARN (acid ribonucleotide) và ADN, protein và các enzyme chuẩn bị cho sự phân bào. Tùy theo đặc điểm chức năng ngƣời ta chia tế bào gian kỳ ra làm ba giai đoạn hay pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (gap 1), giai đoạn S (synthesis) và giai đoạn G2 (gap 2). Thời gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào. Thời gian này tùy thuộc vào thời gian của 3 pha G1 + S + G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1. Vì ở các tế bào khác nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tƣơng đối ổn định (Eldridge, 1985). Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút. Vậy thời gian tế bào chuột ở giai đoạn gian kỳ chiếm hơn 95% thời gian của một chu kỳ sống ở tế bào chuột. 10 2.3.1.1 Pha G1 Pha G1 tiếp ngay sau phân bào, là pha đầu tiên của tế bào con. Thời gian của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào tạo thành do phân bào, cho đến khi bắt đầu pha S là pha tổng hợp ADN. Vào cuối pha G1 có một thời điểm đƣợc gọi là điểm hạn định (restriction point), điểm R. Nếu tế bào vƣợt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S. Trong nuôi cấy tế bào, tế bào có vƣợt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện một trƣờng. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp trong đó có các cyclin và kinase. Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vƣợt qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào. 2.3.1.2 Pha S Pha S là pha tiếp theo pha G1, đƣợc gọi là pha tổng hợp ADN vì chính trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lƣợng NST của tế bào. Vào cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trƣng là cylin A và nhanh chóng tích lũy trong nhân tế bào. Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự tái bản ADN. Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tƣơng đối ổn định từ 6 – 8 giờ. 2.3.1.2 Pha G2 Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ. Trong pha G2, các ARN và protein đƣợc tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào. Cuối pha G2 một protein đƣợc tổng hợp là cyclin b đƣợc tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân bào. Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các thoi phân bào. 2.3.1.2 Phân bào Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con. Sự phân bào là phƣơng thức sinh sản của tế bào, và là phƣơng thức tế bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con. Ngƣời ta phân biệt bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân. 11 2.3.2 Nguyên phân 2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân Nguyên phân hay còn đƣợc gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha M của chu trình tế bào, tiếp ngay sau pha G2. Qua M, tế bào mẹ sau khi đã đi qua pha S sẽ tạo hai tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ máy di truyền giống hệt tế bào mẹ. Hiện tƣợng này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Strasburger và Flemming từ những năm 1882, khi quan sát thấy các cấu trúc sợi nên đặt tên là phân bào có tơ (Nguyễn nhƣ hiền, 2005). 2.3.2.2 Các kỳ của phân bào a) Tiền kỳ (prophase) Tiền kỳ đƣợc tiếp theo sau pha G2 của gian kỳ. Rất khó phân biệt một cách chính xác điểm chuyển tiếp này, các hiện tƣợng đặc trƣng cho tiền kỳ là: Hình thành nhiễm sắc thể: chất nhiễm sắc ở gian kỳ bao gồm các sợi nhiễm sắc đã đƣợc nhân đôi qua pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành các NST thấy rõ dƣới kính hiển vi thƣờng, mà số lƣợng, hình thái đặc trƣng cho loài. Màng hạch nhân có nhiều thay đổi: hạch nhân giảm thể tích, phân rã và biến mất. Màng nhân đứt thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé phân tán trong tế bào chất. Hình thành bộ máy phân bào: qua pha S, trung tử nhân đôi tạo thành 2 đôi trung tử con, do sự hoạt hóa của các chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong tế bào hợp tạo thành các vi ống tubulin. Các vi ống phóng xạ quanh trung tử tạo thành sao phân bào, hai sao di chuyển về hai cực của tế bào. Giữa hai sao, các vi ống phát triển sắp xếp thành hệ thống ống có dạng hình thoi, đƣợc gọi là thoi phân bào hay thoi vô sắc. Cấu tạo nên thoi có hai dạng vi ống: vi ống cực và vi ống tâm động. Đến cuối tiền kỳ, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi với hai sao đƣợc hình thành. Tiền kỳ chiếm thời gian nhiều nhất trong kỳ nguyên phân. Ở tế bào động vật, tiền kỳ chiếm hơn 50 % thời gian trong giai đoạn tế bào phân chia (Eldridge, 1985). 12 b) Trung kỳ sớm (prometaphase) Bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bong bóng nhỏ phân tán trong tế bào chất quanh thoi phân bào. Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển chiếm ngay vị trí trung tâm. Lúc này centromere đƣợc phân hóa thành 2 cấu trúc đƣợc gọi là tâm động có kích thƣớc khoảng 1 µm. Thông qua tâm động, NST đƣợc đính với các sợi tâm động của thoi. c) Trung kỳ (metaphase) Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985). Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo nên tấm trung kỳ. Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi. Đây cũng là thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lƣợng NST rõ nhất. Vì thế ngƣời ta thƣờng tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi loài. d) Hậu kỳ (anaphase) Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập. Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi. e) Mạt kỳ (telophase) Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và biến dạng thành chất nhiễm sắc. Hạch nhân đƣợc tái tạo, hình thành 2 nhân con trong khối tế bào chất chung. Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ. Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo thắt, đƣợc cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con. Khi vòng vi sợi actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con. Mặt phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào. 13 Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm (Nguồn 14 2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể Cơ chế chung của việc nghiên cứu kiểu nhân là giải phóng NST ở các tế bào, mô ở giai đoạn trung kỳ. Sau đó tiến hành nhuộm để quan sát hình thái, cấu trúc, số lƣợng cũng nhƣ những băng vạch trên nhiễm sắc thể. Có hai kỹ thuật dựa trên cơ chế này để nghiên cứu NST là kỹ thuật splash và kỹ thuật squash. 2.4.1 Kỹ thuật splash Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể từ rất lâu. Cơ chế của kỹ thuật này theo đúng theo tên gọi của nó là “splash” có nghĩa là “bắn” hay “văng”. Với kỹ thuật này, màng tế bào sẽ bị phá hủy, những giọt dịch chứa nhân của tế bào sẽ đƣợc cho rơi từ một độ cao thích hợp lên một mặt phẳng, nhờ điều này mà nhiễm sắc thể bị bắn ra khỏi nhân và trải đều trên phiến kính. Ta có thể tiến hành nhuộm và quan sát nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này đơn giản, đáng tin cậy và đƣợc ứng dụng trên các nguồn tế bào nhƣ: a) Tế bào in vivo Kỹ thuật splash đƣợc ứng dụng kỹ thuật đƣợc thực hiện đầu tiên ở các mô, tế bào phân chia nhanh trong in vivo để nghiên cứu về NST. Những mô, tế bào có thể sử dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể ngay nhƣ: rễ ở thực vật, hay tủy xƣơng, tế bào lách, biểu mô ruột ở động vật hữu nhũ, lƣỡng cƣ và chim (Herbert, 1993). Những mẫu mô này đƣợc ngâm trong những hỗn hợp dung môi nhƣ metanol – acid acetic để cố định mẫu, sau đó mẫu đƣợc nhuộm và bảo quản bởi một lớp papain. Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ thực hiện đƣợc trên những loài có số lƣợng NST thấp, đối với những loài nhƣ gia cầm có số lƣợng nhiều thì không có kết quả chính xác. b) Tế bào nuôi cấy in vitro Khắc phục nhƣợc điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dùng nguồn tế bào đã đƣợc nuôi cấy in vitro để thay thế. Năm 1885, Roux là ngƣời báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế bào” vẫn đƣợc dùng, mặc dù lĩnh vực này đã đƣợc mở rộng từ thập niên 1950 khi các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985). 15 Những mẫu mô nhƣ tim, da, gan, thận, phổi thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy để nghiên cứu kiểu nhân, vì tế bào của những mẫu mô này có thể phát triển và phân chia mà không cần các tác nhân kích thích đặc biệt (Herbert, 1993). Bên cạnh đó, ngƣời ta còn nuôi cấy nang noãn hay phôi nang (blastocyst) để nghiên cứu kiểu nhân (Eldridge, 1985). Tuy nhiên phƣơng pháp này vẫn có một số nhƣợc điểm là: sự phân chia của tế bào rất chậm và thời gian nuôi cấy tế bào thƣờng theo quy trình dài ngày từ một đến ba tuần. Bên cạnh đó các mô trên cơ thể rất khó trong việc bảo quản cũng nhƣ nuôi cấy tế bào, do các tế bào của mô này đòi hỏi phải có môi trƣờng sinh khiết nhƣ trong cơ thể và tế bào phải bám dính trên một gián thể mới tồn tại và phát triển đƣợc. c) Tế bào bạch cầu Cho tới năm 1960, tế bào bạch cầu chƣa đƣợc dùng để nghiên cứu NST. Vì ngƣời ta cho rằng tế bào bạch cầu, đặc biệt là tế bào lympho không thể phân chia khi đã đi vào dòng máu trong cơ thể. Năm 1960, Novell vô tình phát hiện ra Phytohemagllutinin (PHA) là tác nhân kích thích tế bào bạch cầu phân bào. Nó đƣợc chiết xuất từ cây đậu đỏ phaseolus vulgaris. Ông đặt tên phytohemaglutinin là do “phyto” nghĩa là thực vật, “hem” thuộc về máu và “agllutinin” có nghĩa là kết dính (Eldridge, 1985). Đặc tính của nó là có khả năng làm lắng tụ hồng cầu, nhờ đó mà tế bào bạch cầu đƣợc tách ra. Chính vì điều này mà làm tế bào bạch cầu, và chủ yếu là tế bào lympho có khả năng phân chia (Herbert, 1993). Ngày nay, ngƣời ta có thể sử dụng Pokeweed có thể thay thế cho PHA trong nuôi cấy tế bào bạch cầu. Tuy nhiên khả năng tác dụng của nó yếu hơn PHA. Pokeweed chỉ áp dụng cho những loại máu đòi hỏi nồng độ PHA thấp. Việc phát hiện ra PHA là một bƣớc tiến lớn trong việc nghiên cứu NST, vì tế bào bạch cầu có những ƣu điểm vƣợt trội so những dòng tế bào trƣớc đây. Thời gian phát triển của tế bào rất ngắn từ 48 đến 72 giờ, bạch cầu dể tồn tại trong môi trƣờng nuôi cấy và có khả phát triển tốt trong môi trƣờng huyền phù. Do đó tế bào bạch cầu đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu NST của các loài vật nuôi nhƣ: heo, bò, dê, cừu, gà… 16 Khi nuôi cấy in vitro, tế bào bạch cầu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp có bổ sung chất kích thích phân bào là PHA hoặc Pokeweed. Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, tế bào đƣợc xử lý và cố định trên một mặt phẳng nhất định và đƣợc nhuộm màu. Bằng kỹ thuật nhuộm băng nhƣ: nhuộm giemsa, nhuộm huỳnh quang, nhuộm màu kết hợp với xử lý bằng enzyme, hoặc bằng nhiệt sẽ làm xuất hiện các băng vạch trên NST, kỹ thuật này đƣợc gọi là “banding”. Các kỹ thuật banding thƣờng dùng là G-banding, R-banding, C-banding, Q-banding, T-banding… Sự hiện diện và phân bố các băng trên NST ở trung kỳ có thể phản ánh kiểu tổ chức thành đơn vị nhóm của sự hoạt hóa gen. Ví dụ: băng C tƣơng ứng với vùng chứa chứa đoạn ADN lặp lại và liên kết rất chặt với các protein acid. 2.4.2 Kỹ thuật squash Một phƣơng pháp khác trong nghiên cứu NST mà nó thƣờng dùng trong nghiên cứu hệ gen là kỹ thuật squash. Cơ chế của kỹ thuật này rất đơn giản. Các tế bào hay các mẫu mô nhỏ trên một mặt phẳng cố định, đặt một miếng kính phủ lên và tác động một lực mạnh lên kính phủ làm màng tế bào và màng nhân vỡ ra, giải phóng NST. Ƣu điểm của kỹ thuật này là có thể khống chế đƣợc lực tác dụng theo từng loại các tế bào do đó có thể thu nhận đƣợc nhiều tế bào ở trung kỳ. Kỹ thuật này đƣợc báo cáo đầu những năm 1930, nó đƣợc nghiên cứu đầu tiên trên NST ngƣời năm 1944. 2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ Năm 1926, Painter là ngƣời đầu tiên báo cáo số lƣợng nhiễm sắc thể thỏ là 2n = 44, sau đó rất nhiều báo cáo về kiểu nhân của thỏ trên nhiều loại tế bào khác nhau (Kannan và ctv, 2006). Năm 1962, Sarkar và ctv đã nuôi cấy lớp tế bào giác mạc và mô của phổi, Nicolai và Shaver (1977) sử dụng phôi nang sáu ngày tuổi của thỏ để nghiên cứu NST. Năm 2002, Hayes đã nguyên cứu kiểu nhân thỏ trên nguyên sợi bào. Và trong thời gian gần đây đã có những báo cáo về kiểu nhân NST thỏ trên tế bào bạch cầu nhƣ Parkányi và ctv (2004), Kannan và ctv (2006). 17 Dựa theo vị trí của centromere chia NST thỏ thành bốn dạng metacentric, submetacentric, subtelocentric và telocentric. Mỗi nhóm đƣợc xếp theo kiểu hình và chiều dài giảm dần. Theo Ford và ctv (1980), nhiễm sắc thể của thỏ đƣợc nhuộm theo kỹ thuật G – bading và đã đƣợc Hội nghị Quốc tế giới giới thiệu jiểu nhân nhƣ sau: Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thỏ Nhiễm sắc thể thứ Đặc điểm 1 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. Băng trung tâm nổi bật q: băng tối hẹp kề sát centromere. Hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm rộng, sáng và hai băng tối xa tâm. 2 p: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. q: băng tối hẹp kề centromere. Hai băng tối gần tâm. Hai băng tối xa tâm. 3 p: băng tối gần tâm. Băng tối xa tâm q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau. 4 p: băng trung tâm tối q: hai băng trung tâm tối 5 p: băng tối kề sát centromere q: băng tối gần tâm. 6 p: băng tối gần centromere q: băng trung tâm tối 7 p: băng trung tâm tối. q: hai băng tối gần tâm. Băng trung tâm sáng và hai băng tối xa tâm. 8 p: băng tối xa tâm. Băng hẹp gần tâm thỉnh thoảng hiển nhiên q: ba băng tối có khoảng cách bằng nhau. Băng gần tâm phân hai. 9 p: băng gần tâm tối. q: băng gần tâm tối có thể phân thành hai. Băng tối xa tâm. 18 10 p: băng rộng, tối kề sát centromere. Băng trung tâm tối. q: băng tối hẹp gần tâm. Băng tối xa tâm có thể phân thành hai. 11 p: băng trung tâm tối. q: băng trung tâm tối. Băng xa tâm tối 12 p: băng gần tâm tối. q: băng sáng kề sát centromere. Hai băng gần tâm tối. Băng trung tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 13 p: băng trung tâm tối. q: băng tối kề sát centromere. Hai băng trung tâm tối. Xa tâm sáng. 14 p: băng trung tâm tối. q: hai băng gần tâm tối. Hai băng xa tâm tối. 15 p: băng trung tâm tối. q: bốn hoặc năm băng tối khoảng cách bằng nhau. 16 p: băng xa tâm tối, hẹp. q: băng gần tâm tối. Băng xa tâm tối. 17 p: băng trung tâm hẹp, tối. q: ba băng tối khoảng cách bằng nhau 18 q: băng tối hẹp nằm gần centromere. Băng tối trung tâm có thể tách làm hai. Băng tối hẹp xa tâm 19 q: băng tối nằm gần centromere. Băng trung tâm tối. Băng tối hẹp xa tâm 20 q: băng tối nằm gần centromere. Băng tối trung tâm 21 q: băng tối nằm gần centromere. Xa tâm sáng X p: băng nằm gần tâm sáng. Băng nằm xa tâm tối q: băng nằm gần tâm tối. Hai băng tối nằm xa tâm Y p: băng tối kéo dài từ gần tâm đến xa tâm q: có thể không bắt màu nhuộm 19 Parkányi và ctv (2004) sau khi nhuộm bằng kỹ thuật G – banding và xây dựng kiểu nhân trên NST thỏ cũng đã đƣa ra năm dạng NST thỏ là: metacentric, submetacentric, subtelocentric, telocentric và acrocentric. Kiểu nhân đƣợc trình bày bởi Parkányi không có sự khác biệt với kiểu nhân đƣợc Hội đồng Quốc tế đƣa ra. Vì từ năm 1975, John và Freeman sau rất nhiều nghiên cứu trên kiểu hình nhiễm sắc thể đã cho rằng kiểu hình acrocentric cũng có thể bao gồm telocentric (Eldridge, 1985). Vì kiểu hình của arcocentric và telocentric đều không nhìn thấy đƣợc nhiễm sắc chất ở vế ngắn trong giai đoạn trung kỳ của tế bào, còn kiểu hình subtelocentric có thể thấy đƣợc trong giai đoạn trung kỳ. (Ford và ctv, 1980) (Parkányi và ctv, 2004) Hình 2.7 Kiểu nhân của nhiễm sắc thể thỏ đực 20 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Thời gian và địa điểm ־ Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2007. ־ Thỏ đƣợc nuôi tại trại bò Sarec, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. ־ Máu thỏ đƣợc nuôi cấy Phòng Nuôi Cấy Tế Bào và phân tích tại Phòng Sinh Lý Động Vật, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Đối tƣợng Đề tài thực hiện chủ yếu trên máu của thỏ có trọng lƣợng từ 2 – 3 kg. 3.3 Nội dung nghiên cứu ־ Máu thỏ đƣợc lấy và nuôi cấy để thu nhận đƣợc các tế bào lympho ở trung kỳ, sau đó tiến hành nhuộm với giemsa. ־ Xem mẫu dƣới kính hiển vi để xác định hình dạng NST thỏ. 3.4 Vật liệu và hóa chất 3.4.1 Thiết bị ־ Tủ ấm ־ Tủ ấm CO2 ־ Tủ cấy vô trùng ־ Máy ly tâm ־ Kính hiển vi độ có máy chụp ảnh ־ Máy ảnh kỹ thuật số ־ Tủ lạnh -200C ־ Tủ lạnh 40C ־ Cân điện tử ־ Bồn ủ nhiệt ־ Máy vi tính 21 3.4.2 Dụng cụ ־ Micro pipette loại 100 - 1000 μl, 10 - 100 μl ־ Đầu típ tƣơng ứng với các loại micro pipette ־ Ống nghiệm 15ml, chai Rough, eppendorf ־ Ống kháng đông có tráng heparin ־ Chai nắp xanh 250ml và 1000ml ־ Kim tiêm, ống chích, găng tay, khẩu trang và phiến kính 3.4.3 Hóa chất a) Các chất trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào bạch cầu: 1) Môi trƣờng RPMI 1640 (1X) của hãng Gibco BRL - Thành phần: L glutamine và 25mM HEPES trong 500ml môi trƣờng. - Chức năng: Là môi trƣờng chính nuôi cấy tế bào bạch cầu, cung cấp dinh dƣỡng, ổn định nồng độ CO2 5% và pH cho sự phát triển tế bào. 2) Pokeweed - Thành phần: 10 mg lectin trong 10 ml PBS - Chức năng: là tác nhân chính kích thích bạch cầu phân bào. 3) Huyết thanh thai bò (FBS) đã đƣợc bất hoạt bằng nhiệt - Chức năng: cung cấp đạm, hấp thu các ion kim loại độc. Nếu thiếu, tế bào không phân bào mà chuyển sang giai đoạn G0. 4) Antibiotic – Antimycotic (100X) - Thành phần: 10000 IU/ml penicilin G sodium, 10000 µg/ml streptomicin sulfate, 25 µg/ml amphotericin trong dung dịch muối 0.85%. - Chức năng: ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại cho tế bào. 5) Colcemid (10 µg/ml) - Chức năng: phá hủy thoi vô sắc của tế bào ức chế sự nhân đôi của centromere của NST làm tế bào dừng lại ở giai đoạn trung kỳ. 22 Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu Tên hóa chất Dung tích RPMI 1640 (1X) 8 ml FBS 1 ml Pokeweed 80 µl Antibiotic – Antimycotic (100X) 100 µl Colcemid 40 µl b) Các dung dịch trong quá trình nhuộm nhiễm sắc thể 1) Dung dịch nhƣợc trƣơng KCl 0,075 M - Thành phần: 0,56 g KCl trong 100 ml nƣớc khử ion. - Tác dụng làm tăng thể tích tế bào lên. 2) Dung định cố định - Thành phần: 3 methanol : 1 acid axetic - Chức năng: giữ tế bào tình trạng trƣơng phòng, loại bỏ lipid, biến tính protein nên làm màng tế bào và màng nhân rất mỏng dể giải phóng NST. 3) Dung dịch nhuộm - Thành phần: 8 ml giemsa trong 100 ml dung dịch sorensen buffer. - Chức năng: nhuộm nhiễm sắc thể. c) Một số dung dịch khác 1) Nồng độ các chất trong giemsa Tên hóa chất Liều lƣợng Giemsa 1 g Methanol 50 ml Glycerin 50 ml 23 2) Nồng độ các chất trong dung dịch PBS (phosphate buffer saline) Tên mg/50 ml mg/100 ml NaCl 400 800 KCl 10 20 Na2HPO4.12H2O 145 290 H2PO4 10 20 3) Nồng độ các chất trong dung dịch đệm (Sorensen buffer) Tên hóa chất g/500 ml nƣớc cất g/1000 ml nƣớc cất KH2PO4 4,54 9,078 Na2HPO4 5,94 11,876 3.5 Bố trí thí nghiệm 3.5.1 Thí nghiệm 1: khảo sát thời gian ủ mẫu với colcemid - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát tác động của colcemid theo thời gian đối với tế bào nuôi cấy để thu nhận đƣợc tế bào trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 nghiệm thức theo thời gian ủ với colcemid là 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi nhuộm. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm có 10 mẫu, bố trí theo kiểu một hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.2 Thí nghiệm 2: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy - Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát lƣợng máu nuôi cấy thích hợp để thu nhận đƣợc tế bào ở giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm hai nghiệm thức là nuôi cấy máu với thể tích 0,4 ml và 1ml. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm gồm 15 mẫu, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. 24 3.5.3 Thí nghiệm 3: tiến hành nuôi cấy trên ống nghiệm 15 ml. - Mục đích thí nghiệm: khảo sát khả năng dùng ống nghiệm 15 ml nuôi cấy tế bào bạch cầu để thay thể cho chai Rough - Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm chia làm 2 nghiệm thức là nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml với lƣợng máu là 1 ml và theo thời gian ủ với colcemid là 60 phút. Tƣơng ứng với mỗi nghiệm thức là một lô thí nghiệm có 3 mẫu. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Mỗi mẫu chúng tôi tiến hành nhuộm trên sáu phiến kính. 3.5.4 Chỉ tiêu quan sát Số mẫu nhuộm thành công: là số mẫu có phiến kính nhuộm thành công. Số phiến kính nhuộm thành công: là những phiến kính có bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ. Số lƣợng tế bào bạch cầu ở trung kỳ thu đƣợc theo từng thí nghiệm. 3.6 Phƣơng pháp tiến hành 3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ: 3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim Đầu tiên thỏ đƣợc cố định và xác định vị trí tim. Tim nằm ở giữa sụn mấu kiếm và xƣơng sƣờn đầu tiên, hơi lệch về phía trái đƣờng trắng khoảng 1cm. Sau khi cạo sạch lông và sát trùng nơi cần lấy máu với cồn, dùng xylanh 5ml đâm thẳng một cách nhẹ nhàng và từ từ hút 4ml máu. Sau khi hút, máu đƣợc chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin, chú ý lắc nhẹ và đều ống. Trƣớc khi lấy máu, không đƣợc cho thỏ ăn no, vì khi no thỏ rất dễ bị sốc và gây tử vong. 3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai Đầu tiên thỏ đƣợc cố định, xác định động mạch ở giữa tai, cạo sạch lông và sát trùng với cồn nơi cần lấy. Đâm kinh nhẹ vào động mạch sau đó dùng ngón cái và ngón giữa để giữ kim cố định, đồng thời rút từ từ khoảng 4ml máu, rồi chuyển nhanh qua ống kháng đông chứa heparin. Chú ý lắc nhẹ và đều ống để máu trộn đều với heparin. 25 Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai 3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu Máu sau khi đƣợc lấy chuyển nhanh tới phòng thí nghiệm để nuôi cấy. Dùng micro pipette hút môi trƣờng nuôi cấy theo bảng 3.1 vào chai Rough hay ống nghiệm 15 ml tùy theo bố trí thí nghiệm. Sau đó dựng đứng bình, trộn thật nhẹ để môi trƣờng đều. Trƣớc khi hút máu vào môi trƣờng, phải dựng đứng ống kháng đông từ một đến hai giờ. Vì sau thời gian này, máu sẽ phân tách thành hai lớp. Lớp dƣới là hồng cầu và lớp trên rất nhiều bạch cầu. Sau đó hút lƣợng máu theo kiểu bố trí thí nghiệm vào môi trƣờng nuôi cấy. Chú ý phải lắc nhẹ và đều để máu hòa đều vào môi trƣờng. Thao tác này rất quan trọng vì nó quyết định đến sản phẩm nuôi cấy. Bình nuôi cấy đƣợc chuyển vào tủ ấm CO2 và nuôi cấy ở 37 0C trong 72 giờ. Đối với chai Rough thì đậy chặt nắp còn đối với ống nghiệm 15 ml thì không đƣợc đậy nắp chặt. Ống 15ml phải đƣợc đặt cố định, nghiêng 300 so với mặt phẳng. Trong thời gian nuôi cấy phải lắc nhẹ chai Rough và ống nghiệm 15 ml từ một đến hai trong một ngày. Điều này sẽ làm cho hồng cầu lắng xuống đáy và tế bào bạch cầu phân chia nhiều hơn (Kannan và ctv, 2006). 26 Chai Rough Ống nghiệm 15 ml Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu 3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể 3.6.3.1 Kỹ thuật trải đều nhiễm sắc thể Quy trình nhuộm đƣợc tham khảo theo quy trình của Seabright (1971) Bƣớc 1: Sau khi ủ 72 giờ, cho colcemid vào môi trƣờng nuôi cấy tế bào và đặt vào tủ ấm 20 phút, 40 phút, 60 phút trƣớc khi đem cố định để nhuộm. Bƣớc 2: Sau khi ủ, chuyển môi trƣờng nuôi cấy vào ống nghiệm 15 ml và ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó loại bỏ hầu hết phần nổi, chỉ lấy khoảng 0,5 ml dịch tế bào còn lại. Bƣớc 3: Trộn đều dịch tế bào trong phần môi trƣờng còn giữ lại và cẩn thận cho thêm 2 ml KCl 0,075 M đã làm ấm trƣớc ở 370C, cho từng giọt một, nếu cho quá nhanh tế bào rất dễ vỡ trƣớc khi đƣợc cố dịnh. Sau đó khi khuấy nhẹ và tiếp tục cho thêm dung dịch KCl cho đến khi thể tích đạt 12ml. Bƣớc 4: Ủ ống nghiệm 15 phút ở 370C trong water bath. Bƣớc 5: Cho 1ml dung dịch cố định vào (hỗn hợp 3 methanol : 1 acid axetic) vào và đậy ống ly tâm lại và trộn đều bằng cách đảo ống. Bƣớc 6: Ly