Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sản phẩm Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus

Công nghệ enzyme. GV: ThS. Trịnh Đình Khá. PAGE  PAGE 2 SV: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung. Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi là thời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên “công nghệ sinh học” đã rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới. Đối với Việt Nam, theo xếp hạng của Biotechnologi Atlas, công nghệ sinh học (CNSH) Việt Nam đứng ở nhóm giữa trong khu vực ASEAN nhưng vẫn lạc hậu so với các nước Singapore, Thái Lan trong việc ứng dụng nghiên cứu vào sản xuất, tạo ra các sản phẩm chủ lực… Rõ ràng, Việt Nam còn rất nhiều việc phải làm để đưa các kết quả nghiên cứu “vượt” ra ngoài phòng thí nghiệm. Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của sinh vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn gen trong tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà. Công nghệ sinh học Việt Nam đang được coi là một hướng phát triển mũi nhọn của đất nước. Trong đó có sự chú trọng đầu tư cho lĩnh vực công nghệ enzyme. Trong đó công nghệ enzyme tái tổ hợp là một hướng đi mới. Có rất nhiều loại enzyme tái tổ hợp đã được nghiên cứu để đưa vào ứng trong thực tiễn. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Vì vậy nhu cầu cải tiến tạo ra enzyme Protease tái tổ hợp mang những đặc tính ưu việt hơn rất được quan tâm. Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu “ Các bước sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus. ”. Chương I. Tổng quan về enzyme Protease và vi khuẩn Bacillus. 1.1. Tổng quan về enzyme Protease [2] 1.1.1 Giới thiệu chung Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide - Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase. - Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit. - Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...) [12]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng...[8]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN...[2]. So với Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease  1.1.2 Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5] Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin (1 Protease xerin tiêu biểu) Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: Protease-acid; Protease trung tính; Protease kiềm. Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa. Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa. Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp, oryzae OUT 5038 (52.000). Trọng lượng phân tử của các Protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease tiol và nhiều Protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000 Dalton. Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật NhómNguồn EChất kìm hãmĐặc điểm TTHĐpH tối thíchP XerinBac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coliDFP+XerinKiềmP-tiolStreplococcus Clostridium histoly-ticumIndoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat-SH7,5 7,0P kim loại Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac. Subtilisamy Losaccarilicis Bac. Megaterium Psuedomonasaeruginoa Atreptomeces naraensis Asp. Oryzae Acremonium kiliense ClostridiumhisttolytiumEDTA++ 1,10octa-fenantrolinKim loại hóa trị haiTrung tính P AcidAsp.niger Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilicaDizoaxetil Dlnorlox-inmetil esteCOOHAcid 1.1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5] Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 1.2. Nguồn thu nhận Protease [8] - Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. - Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [8]. - Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau: + Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. + Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. + Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao. + Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. + Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. + Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác. + vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [5] 2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [8]. Và gần đây nhất là những sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như: + Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút. [14]. + Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [15]. + Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [16],[7]. + “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C. + Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [1] 2.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [10]. Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin… [10]. Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chees pha enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [10]. Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sửa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [13]. Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[7],[6]. 3. Tổng quan về nguồn thu nhận từ vi khuẩn bacillus. Hình 3.1 Baccillus subtilis Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [9]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [9]. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các Protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.[2] Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các Protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với Protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và thơm và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [2]. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000dalton. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12. [2] Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872.[4] Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước (3- 5) × 0.6μm, có khả năng sinh bào tử và là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.[9] Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,[17] amylase,[18] glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase [19]. Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase....[4] Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc...[11] Chương II. Quá trình sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam. Sau đây là các bước trong quá trình sản xuất enzyme Protease tái tổ hợp từ chủng Bacillus sp Việt Nam biết trên genbank có một số trình tự mã hóa cho protein của một số loài trong chi Bacillus. (Tham khảo và tổng hợp từ các nguồn tài liệu: [3][20]) Bước 1. Phân lập khảo sát & chọn lọc chủng Bacillus cho hoạt tính enzyme Protease tốt nhất. Công đoạn này mất tương đối nhiều thời gian. Từ một số loài trong chi Bacillus tiến hành các biện pháp chọn lọc thử hoạt tính, xác định các tham số đặc trưng để chọn ra loài cho hoạt tính enzyme Protease cao nhất. Bước 2: Xác định gen mã hóa cho protein enzyme Protease. - Dựa vào đặc điểm phân loại để xem xét loài Bacillus ta chọn được từ bước trên bằng cách so sánh trình tự gen của nó với với trình tự gen mã hóa protein enzyme của các loài trong chi Bacillus có trình tự gen đã công bố trên genbank. - Xác định các trình tự gen bảo thủ. - Từ trình tự này trên genebank thiết kế mồi để tổng hợp đoạn ADN mã hóa cho protease. Hai đầu 5' của mồi bổ sung vị trí của 2 enzyme cắt giới hạn để đưa vào vector lựa chọn. - Tách chiết nhận hệ gen của vi khuẩn Bacillus ta chọn. - Tiến hành nhân gen cần quan tâm bằng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi đã thiết kế ở trên. - Sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt thu đoạn gen mong muốn. - Tinh sạch ADN và tiến hành đọc trình tự gen. - So sánh trình tự gen với trình tự gen đã biết trên genbank. Khi trình đã thu dc gen mong muốn (trình tự gen tương đồng) tiến hành bước 3. Bước 3: Tạo vector tái tổ hợp. Để nhân dòng một gen quan tâm ta lắp ghép gen đã nhân được bằng PCR vào vector nhân dòng để tạo vector tái tổ hợp. Thiết kế vector nhân dòng phù hợp. Các đoạn gen protease, vector nhân dòng được cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Sản phẩm cắt được tinh sạch và nối với nhau bằng enzyme nối. Xác định trình tự của gen nhân dòng để khẳng định gen đích thu được có chứa đầy đủ và chính xác trình tự mã hóa cho enzyme quan tâm là Protease. Bước 4: Biến nạp vào tế bào chủ. - Biến nạp vector vào chủng vi khuẩn định biểu hiện. Hiện nay có thể biểu hiện bằng E.coli. (ngoài ra có thể là Bacillus. Vì protease có nguồn gốc từ bacillus nên biểu hiện trong bacillus sẽ giảm thiểu trường hợp cuộn gập sai.) - Đối với tế bào vi khuẩn thường sử dụng Cacl2 và sốc nhiệt 42o trong 2 phút.) - Chuẩn điều kiện biểu hiện: nồng độ chất cảm ứng, thời điểm cảm ứng, thời điểm thu mẫu, nhiệt độ nuôi cấy. Bước 5: Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp. Sử dụng phương pháp lai axit nu có hiệu quả trong việc tách dòng gen mong muốn bằng viecj sử dụng mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Người ta tiến hành làm tan tại chỗ các khuẩn lạc trên giấy lọc nitrocellulo để AND thoát ra và gắn trên giấy. Cho mẫu dò lai với AND trên màng lai. Đọc kết quả thông qua phóng xạ tự ghi. Bước 6: Nuôi cấy lên men tiến hành thu sản phẩm enzyme Protease tái tổ hợp. Sử dụng các phương pháp lên men: lên men bề mặt hay lên men chìm. Bước 7: Tách chiết tinh sạch thu chế phẩm enzyme Protease tái tổ hợp. - Tiến hành chiết dịch enzyme bằn dung môi thích hợp và tiến hành ở nhiệt độ thấp. - Có thể bổ sung thêm 1 số chất bổ trợ. - Để chiết được dịch enzyme thì cần phá vỡ tế bào có thể dùng phương pháp siêu âm. Enzyme, máy nén, sốc nhiệt.. - Có thể cô đặc dich triết để tăng nồng độ - Tiến hành tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel, sắc kí ái lực… Bước 8: Đánh giá. Xác định hoạt lực enzyme. Độ sạch của chế phẩm thông qua hoạt độ riêng. Sử dụng phương pháp phân tích phổ để xác định cấu trúc. Xác định các tham số đặc trưng như Km, V, Ki.. Bước 9: Nghiên cứu tiến hành cải biến enzyme thu chế phẩm số lượng lớn và hoạt tính mạnh. Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy, tách chiết; Thành phần môi trường nuôi cấy. pH tối ưu. Nhiệt độ tối ưu. Dung môi chiết tối ưu, … Kết luận Các kỹ thuật sinh học mới ngày càng được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme đã và đang mang lại những lợi ích thiết thực để phục vụ cho cuộc sống con người. Hiện nay, việc tìm ra các enzyme mới và nâng hoạt lực của các enzyme cũ đang mang lại nhiều lợi ích trong sản xuất và đời sống. Nhờ đó, chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được tăng cao. Công nghệ enzyme ở nước ta hiện còn rất mới mẽ, đang trong giai đoạn hưởng ứng và ngày hoàn thiện dần lĩnh vực này trong tương lai. Do vậy việc đi sâu và tìm hiểu enzyme Protease, nguồn thu nhận Protease từ vi sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một đề tài mang tính thời đại, cấp thiết trong tình hình Việt Nam đang hội nhập mạnh mẽ với nền kinh tế thế giới. Với thời gian có hạn và sự hiểu biết hạn hẹp của sinh viên năm thứ 4 ngành công nghệ sinh học, em chỉ trình bày được một phần khía cạnh của các kỹ thuật trong sản xuất Protease tái tổ hợp. Mong có sự góp ý của thầy cô và các bạn. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ths.Trịnh Đình Khá đã hướng dẫn em hoàn thành tiểu luận này. Tài liệu tham khảo [1]. Vũ Ngọc Bội (2004), luận án tiến sĩ sinh học: “Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme Protease từ B.subtilis S5”, Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. [2]. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), [3]. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa. Công nghệ sinh học tập 3. NXB Giáo Dục. [4]. Nguyễn Thị Xuân Hiền, Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của bào tử và enzym protease của Bacillus subtilis, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. [5]. Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZym, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. [6]. Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng. Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. [7]. Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), “Phân tách Protease của Bacillus Subtilis bằng hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp. [8]. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [9]. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, Hà Nội. [10]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu. Enzyme Vi Sinh Vật, tập 1, , NXB Jhoa học kỹ thuật Hà Nội 1982. [11]. Phạm Thi Hồng Thắm, Nghiên cứu phân lập và bước đầu khảo sát một số vi sinh vật phân huỷ cellulose từ vỏ lụa sắn, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. [12]. Tạp chí sinh học, tập2(2)-2006: “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp Protease của chủng Serratia sp. DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi viện CNSH. [13]. Tạp chí sinh học, tập4(2)-2006: “ Xác định một số tính chất hóa lý của Protease chủng Serratia sp. DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Hương viện CNSH, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội. [14]. Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11- 2006. [15]. Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số2- 2007. [16]. Tạp chí Công nghệ sinh học, tập5, số3- 2007. [17]. Harry P. Rappaport, “A Bacillus Subtilis Proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, (1965), Vol. 240, No. 1, [18]. Konsoula Z., Kyriakides M.L, “α-amylase production in aqueous two-phase systems by Bacillus subtilis”, FEBS Journal 272, (2005), tr. 2. [19]. D.R.Kashyap, S.Chandra, A.Kaul, R.Tewari, “Production, purification and characterization of pectinase from a Bacillus sp. DT7”, World Journal of Microbiology & Biotechnology Vol 16, (2000), tr. 277-282. [20].