Các phương pháp phát hiện E.Coli trong thực phẩm

[Type text] [Type text] [Type text] [Type text] Page  PAGE \* MERGEFORMAT 22 Trường Đại Học Kỹ Thuật – Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghê Thực Phẩm   Đề tài: -Tp.HCM tháng 11/2011- Mục lục Chương 1 : Tổng quan 4 I. Sơ lược về vi khuẩn E.coli 4 1. Đặc điểm sinh học 4 1.1 Hình thái 4 1.2 Tính chất nuôi cấy 4 1.3 Tính chất hóa sinh 5 1.4 Kháng nguyên 6 1.5 Phân loại 6 2. Khả năng gây bệnh 7 3. Chẩn đoán vi sinh vật 12 3.1 Chẩn đoán trực tiếp 12 3.2 Chẩn đoán gián tiếp 12 4. Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh 13 4.1 Điều trị 13 4.2 Phòng bệnh 13 Chương II : Các phương pháp phát hiện E.coli 14 I. Phương pháp truyền thống 14 1. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN 14 1.1 Nguyên tắc 14 1.2 Quy trình phân tích 14 1.3 Cách đọc kết quả 15 2. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 15 2.1 Nguyên tắc 15 2.2 Môi trường và hóa chất 15 2.3 Quy hoạch phân tích 16 2.4 Cách tính kết quả 16 3. Phương pháp làm giàu vi khuẩn 17 3.1 Nguyên lý 17 3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh 17 3.3 Môi trường và thuốc thử 17 3.4 Cách làm 17 II. Phương pháp hiện đại 22 1. Phương pháp PCR 22 1.1 Nguyên tắc 22 1.2 Môi trường tăng sinh 22 1.3 Môi trường phân lập 22 1.4 Trích ly DNA 22 1.5 Qui trình multiplex-PCR 24 1.6 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 24 2. Phương pháp ELISA 25 2.1 Nguyên tắc 25 2.2 Các phương pháp ELISA 26 2.3 Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa 29 2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7 30 2.5 Ưu điểm của phương pháp E.lisa 30 3. Phát hiện E.coli bằng HYPERLINK ""phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang 30 Kết Luận 34 Phụ Lục 35 Tài liệu tham khảo 47 Chương I: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.COLI) Escherichia coli do Theodore Escherich (1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Trong các loài thuộc chi này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học. Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với kích thước 2 µm E.coli là một trong những thành viên chính của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu. E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung. E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất. nhiều thành tựu về di truyền học, hóa sinh học đã được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này. Ngày nay E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học. Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype). Đặc điểm sinh học 1.1 Hình thái E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di động. 1.2. Tính chất nuôi cấy E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường. Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Hiếu kỵ khí tùy ý. Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C. Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C. Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có váng mỏng. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn. E.coli không mọc trên canh thang Selenit. Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M. Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey). Không mọc được trên môi trường SS. Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh, như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton. 1.3. Tính chất hóa sinh E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi. Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc lên men rất chậm. Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform. E.coli có khả năng sinh indole. Không sinh H2S. Không sử dụng được nguồn carbon của citrate trong môi trường Simmons. Có decarboxylase, vì vậy có khả năng khử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic. Betagalactosidase dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dương tính. Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia Thử nghiệmCác loàiE.coli (bình thường)E.coli (inactive)E.blattaeE.fergusoniiE.hermanniiE.vulnerisE.albertiiCNPG+T-T++-Indole+T-++--Đỏ methyl++++++?Voges-Proskauer-------Citrate (Simmons)--TT---Lysine decarboxylaseTT++-T+Arginine dihydrolaseT----T-Ornithine decarboxylaseTT+++-+Di động+--+++-D-Glucose acid+++++++D-Glucose sinh hơi+-+++++Lactose+T--TT-SucroseTT--T--D-Mannitol++-++++Adonitol---+---Cellobiose---+++-D-Sorbitol+T-----D-Arabitol-------L-RamnoseTT+++++Sinh sắc tố vàng----+T- ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside +: >90% dương tính -: 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần. 1.         2. Ảnh 1: TEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silicaẢnh 2: SEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica Hình ảnh SEM (kính hiển vi quét) và kính hiển vi đồng tiêu của tế bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích Ảnh huỳnh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) VK gắn với phức hợp kháng thể - QDs Ảnh huỳnh quang phức hợp Silica – E. coli O157:H7: chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu Nikon C1plus – Ti-E. Viền màu đỏ bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn là phức hợp hạt silica + kháng thể đặc hiệu  Phổ huỳnh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể gắn kết với vi khuẩn E. coli O157:H7. Đây là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7để phát hiện nhanh, nhậy số lượng vi khuẩn này ở mật độ thấp KẾT LUẬN Hiện nay, ngộ độc thực phẩm đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật. Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do nguyên liệu dùng chế biến hay thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn. Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli. Trong thực tế cuộc sống, theo dõi khảo sát đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm để hạn chế sự ô nhiễm và tác hại của vi khuẩn trong quá trình thu hoạch các sản phẩm nông nghiệp, chăn nuôi, đánh bắt hải sản đến quá trình ‘bảo quản chế biến và nấu nướng tới tay người tiêu dùng thường rất phức tạp và gặp nhiều khó khăn. Do đó các phương pháp phát hiện vi khuẩn E.coli có vai trò quan trọng trong nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhằm làm giảm tỷ lệ ngộ độc do vi khuẩn gây nên. PHỤ LỤC I. THỬ NGHIỆM SINH HÓA Thử nghiệm sinh indol Nguyên tắc Trytophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme trytopanse tạo nên các sản phẩm chúa gốc indol. Phản ứng trung gian chính của phản ứng oxi hóa tryptophan là indolpyruvic acid IPA. Phân tử này sau đó bị biến đổi theo hướng loại nhóm amin (deamination) thành indol hay theo hướng loại nhom1carboxyl (decarboxylation) thành skatol. Trytophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin để tạo thành indol. Viêc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quione màu đỏ. Thử nghiệm này được dùng để phân biệt E.coli (+) với Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-) với các loài Proteus khác (+), Bacillus alvei (+) với các Bacillus khác (thường là -). Heamophilus heamoglobinophilus (+) và H.influenzae (-) với các loài Haemophilus khác (thường là -), Pasteurella multocida (+) và P.pneumotropica (+) với P.haemolytica (-) và P.urea (-). Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Serratia marcescens. Phương pháp tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này có thể là nước tryptone, hoặc các môi trường kết hợp như MIU (Motility Indol Urea), SIM (Sulfide Indol Motility)… khi cần kiểm tra cùng lúc nhiều đặc tính sinh hóa cần thiết. hai loại thuốc thử có thể sử dụng cho thử nghiệm này là thuốc thử Kovacs và thuốc thử Erlich. Sinh khối chủng thuần được cấy vào ống môi trường lỏng thuộc một trong các loại nêu trên, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24-48 giờ. Trước khi bổ sung thuốc thử có thể bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung môi hữu cơ. Đọc kết quả Thử nghiệm là (+) khi có sự xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường; là (-) khi có lớp màu vàng của thuốc thử trên bề mặt môi trường. đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất methyl hóa của indol, tạo ra. Thử nghiệm KIA, TSI Nguyên tắc Môi trường KIA (Ligler Iron agar) và môi trường TSI (Triple Sugar iron Agar) được sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S của chủng vi sinh vật Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa hai loại đường là 1% lactose và 0,1% glucose. Tương tự, môi trường TSI có thành phần như môi trường KIA nhưng có them 1% sucrose (saccharose). Khả năng sử dụng cà hai nguồn đường là glucose và lactose hay chỉ sử dụng glucose để thu lấy năng lượng cần cho tăng trường là tùy thuộc vào di truyền của chủng vi sinh vật và có thể được theo dõi trên ống thạch chứa môi trường KIA. Khi chủng cấy lên môi trường này, có ba trường hợp có thể xảy ra đối với sự tăng trưởng của chủng vi sinh vật thử nghiệm: chỉ sử dụng glucose, sử dụng các glucose và lactose, không sử dụng cà hai loại đường này. Khả năng này của vi sinh vật có thể được xác định thong qua sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường ở trên bề mặt và bên trong môi trường trong ống thạch nghiêng. Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, sau 18-24 giờ nuôi cấy môi trường bề mặt của ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể được giải thích là lượng glucose trong phần bề mặt của môi trường được vi sinh vật oxi hóa hoàn toàn thành H2O và CO2 để thu năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng cho tăng trưởng, vi sinh vật tiến hành dị hóa pepton trong môi trường qua đó giải phóng NH3 làm phần bể mặt của môi trường mới có pH kiềm. Ngược lại, ở phần sâu trong môi trường mới có điều kiện oxi không đầy đủ, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH của môi trường. nếu trong môi trường có chất chỉ thị là đỏ phenol thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu có màu vàng. Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, sau 18-24 giờ nuôi toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cá glucose và lactose ở bề mặt môi trường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà không cần phải sử dụng đến pepton. Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cấn cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diển ra trên phần của bề mặt môi trường và chỉ phần này trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tược đổi màu. Trong các trường hợp nêu trên, nếu sự lên men được tạo ra các sản phẩm khí thì khí sẽ tích tụ bên trong thành bọt khí hay sẽ làm vỡ thạch. Trường hợp sử dụng môi trường TSI, các hiện tượng lien quan đến sử dụng nguồn carbon cũng xảy ra tương tự. Thử nghiệm khả năng sinh H2S có thể thực hiện đồng thời trên hai môi trường này do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate hiện diện trong môi trường. Phương pháp tiến hành Môi trường KIA hay TSI được pha chế, hấp khử trùng và chuyển vào các ống thạch nghiêng sao cho đỉnh thạch nghiêng cách nắp ống nghiệm khoảng 2,5cm và phần sâu có chiều cao khoảng 2,5cm. dung que cấy thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần vào phần sâu của ống thạch nghiêng nhưng tránh chạm đáy ống, sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng. Sau khi cấy giống, các ống thạch nghiêng được ủ ở 370C từ 18-24 giờ. Ghi nhận màu, sự sinh khí ở phần sâu, màu ở mặt thạch nghiêng, sự tạo thành màu nâu bởi FeS. Đọc kết quả Thử nghiệm khả năng sử dụng đường: xem mục nguyên tắc. Thử nghiệm sinh H2S: thử nghiệm là (+) nếu xuất hiện tủa màu nâu đen bên trong môi trường, là (-) nếu không xuất hiện tủa nâu đen. Thử nghiệm MR (Methyl Red) Nguyên tắc Thử nghiệm MR nhằm phân biện vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy thì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này có màu thay đổi khác nhau tùy dãy pH hay nồng đô ion H+: đỏ khi ph thấp hơn 4,4 màu cam trong vùng pH 5,0 – 5,8, màu vàng khi pH trên 6,0. Hàm lượng ion H+ này phụ thuộc vào tỷ lệ CO2 và H2và con đường chuyển hóa đường của từng loài vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường được xác định trpong khoảng 18-24 giờ. Tuy nhiên các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường ngay khi chúng bắt đầu tăng trưởng. khi héo dài thời gian nuôi cấy, các vi sinh vật có phản ứng MR (+) có đặc tính là tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều hơn và độ pH trong môi trường ngày càng giảm; ngược lại, trường hợp các vi sinh vật cho phản ứng MR(-) sẽ tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm có tính acid đã được tạo ra thành các sản phẩm trung tính làm cho pH trong môi trường chuyển dần về phía trung tính. Thử nghiệm MR phụ thuộc rất nhiều vào thời gian nuôi cấy và thường được tiến hành trong thời gian khoảng 3-5 ngày ở 370C. Thử nghiệm này giúp phân biệt E.coli (+) với Klepsiella (-); Enterbacter aerogenes (-) với Enterbacter cloacae (+); Yersinia spp. (+) với các loài Bacillus Gram âm khác không thuộc đường ruột (-); xác định Listeria monocytogenes (+). Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Serratia marcescens. Phương pháp tiến hành Thử nghiệm được tiến hành trong các ống môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP broth). Dung que cấy vòng cấy một lượng nhỏ sinh khối từ khuẩn lạc chủng thuần trên môi trường KIA, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Them vài giọt thuốc thử methyl red (0,02% trong hỗn hợp cần nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay. Đọc kết quả Thử nghiệm MR là (+) khi môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử; là (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thục hiện lại thử nghiệm. Thử nghiệm VP (Voges-Prokauer) Nguyên tắc Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân, ở các loài vi sinh vật, sau đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa theo các con đường sinh hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác nhau. Họ Enterbacteriaceae có đặc tính chung là lên men sinh hỗn hợp acid như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (ví dụ như E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ như Klebsiella, Enterobacter). Phân tử 2,3-butanediol có thể chuyển hóa qua lại thành aceton: trong điều kiện có oxi và môi trường có tính kiềm, 2,3-butanediol bị oxi hóa thành aceton nhờ xúc tác của enzyme 2,3-bute\anediol dehydrogenase; ngược lại, acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase. Ngoài ra, acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl. Như vậy, khi có oxi và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetion, đến lượt mình acetion bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm VP. Nhu vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterbacteriaceae dựa trên sự oxi hóa acetion (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi hóa acetion thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-napthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc thử Koblentz và O’Meara có chứa creatime có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine. Thử nghiệm VP được dung để phân biệt Klebsiella pneumonia (+) và Enterbacter (+) với E.coli (-), phân biệt một số loài của Klebsiella, để xác định Listeria monocytogenes (+). Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Serratia marcescens, (-) là Proteus rettgeri. Phương pháp tiến hành Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), có pH 6,(. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối ( trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz như dưới đây thì cấy nhiều sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 370C trong 20-48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. một số loài như Enterobacter hafniae có kết quả thử nghiệm VP không ổn định ở 370C nhưng cho (+) ở 25-300C. Do vậy, trường hợp nghi ngờ nên tiến hành ủ các ống môi trường song song ở hai điều kiện nhiệt độ. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. có 3 loại thuốc thử VP là: Thuốc thử Barrit: gồm dung dịch A là 5% α-napthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B là 40% KOH hoặc NaOH. Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-napthol trong cồ 95%, dung dịch B là 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH. Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0,3% creatine 40% KOH hoặc NaOH. Khi sử dụng các loại thuốc thử có 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. đối với thuốc thử 1 thanh2n phần, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. lắc nhẹ ống 1 phút để oxi hóa acetone. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đố chứng như E.coli (VP-) và Enterobacter cloacae (VP+). Đọc kết quả Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường, là (-) khi bề mặt môi trường không đổi màu. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Nguyên tắc Một số vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vật chất. sự biến dưỡng citrate thường thong qua sự kết hợp với acetylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình tricarboxylic acid (chu trình Krebs). Sản phẩm biến dưỡng citrate thay đổi tùy pH của môi tường. khi pH tăng, môi trường chuyển sang kiềm, lượng acetate cà formate tạo thành sẽ tăng trong khi lactate và CO2 giảm. Ở pH trung tính sản phẩm chủ yếu là COP2 và acetate. Ở pH acid, sản phẩm tạo ra chủ yếu là acetoin và lactate. Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Như vậy trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium, khả năng tăng trưởng của chủng sẽ thể hiện qua khả năng biến dưỡng nguồn carbon citrate và nguồn đạm ammonium làm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thỉ bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường. Thử nghiệm này được dùng để phân biết nhóm Klebsiella, Enterbacter (+) với E.coli (-) trong thử nghiệm IMViC, hoặc để phân biệt Edwardsiella (-) với Salmonella (+). Chủng dùng làm đối chứng (+) cho thử nghiệm này là Proteus rettgeri, (-) là Staphylococcus epidermidis. Phương pháp tiến hành Môi trường sử dụng cho thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate là môi trường rắn Simmons Citrate Agar (CSA) hay môi trường Christensens Citrate Sulfide Agar (CCSA). Môi trường CSA chứa sodium citrate hoặc potassium citrate làm nguồn carbon duy nhất, chỉ thị bromothymol blue, pH 6,9. Chỉ thị này có màu vàng ở pH dưới 6,0 màu xanh lục ở pH trung tính và màu xanh dương ở ph lớn hơn 7,6. Chủng thuần trên môi trường KIA hoặc môi trường thích hợp khác được cấy ria trên bề mặt môi trường CSA rắn trong ống thạch nghiêng. ống thạch được ủ ở 350C trong 24-48 giờ hoặc kéo dài đến 4 ngày khi cần thiết. Môi trường CCSA chứa nguồn đạm là cystein, chỉ thị màu là phenol red, pH 6,7. Môi trường chưa sử dụng có màu thay đổi từ màu kem đến nâu. Ở pH acid (dưới 6,8), màu chỉ thị trở thành vàng và ở pH kiềm (trên 8,4) trở thành màu đỏ. Chủng vi sinh vật được cấy và ủ trong điều kiện tương tự như trường hợp môi trường CSA. Đọc kết quả Trường hợp môi trường CSA, thử nghiệm la (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương; (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. Trường hợp môi trường CCSA, thử nghiệm là (+) khi môi trường chuyển sang màu đỏ; (-) khi môi trường không đổi màu. II. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ THÔNG DỤNG Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL) Peptone 10 g Lactose 10 g Mật bò 20 g Brilliant green 0,0133 g Nước cất 1 lít Hòa tan peptone và lactose vào trong 500ml nước cất, mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green trong khoảng 100ml nước cất. trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối là 1 lít; chinh pH môi trường khoảng 7,4. Rót vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham 10ml môi trường BGBL. Hấp ở 1100C trong 15 phút. pH 7,2 ± 0,2 ở 250C. EC Broth ( Canh EC) Trypticase or tryptose 20 g Muối mật No.3 1,5 g Lactose 5 g K2HPO4 4 g KH2PO4 1,5 g NaCl 5 g Nước cất 1 lít Rót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham. Hấp ở 1210C trong 15 phút. pH 6,9 ± 0,2. Canh thang EE Peptone 10,0 g Glucose 5,0 g Disodium hydrogen phosphate 8,0 g Potassium dihydrogen phosphate 2,0 g Ox bile 20,0 g Brilliant green 0,015 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,2; chia ra bình, cứ mỗi bình 30ml. Tiệt khuẩn 5 phút ở 1210C. Canh thang dinh dưỡng Beef extract 3,0 g Peptone 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C Canh thang KCN Proteose peptone 3,0 g Sodium chloride 5,0 g Potassium dihydrogen phosphate 0,225 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,6. Diệt khuẩn 15 phút ở 1210C, để nguội và cho vào tủ lạnh 5-80C. Bằng cách vô khuẩn và thận trọng, cho thêm 15 ml cyanid 0,5% lạnh (5-80C) lắc nhẹ nhàng và phân ra ống nghiệm , mỗi ống 1 ml, đóng nút bằng nút bần thấm perafin và bảo quản ở 5-60C. Canh thang L-ST Tryptose, tryptone hoặc trypticase 20,0 g Lactose 5,0 g Dipotassium monohydrogen phosphate 2,75 g Potasssium dihydrogen phosphate 2,75 g Sodium chloride 5,0 g Sodium lauryl sulphate 0,1 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,8. Phân ra ác ống nghiệm, mỗi ống 10 ml với ống Durham lộn ngược. Tiệt khuẩn 10 phút ở 1210C. Canh thang MacConkey Peptone 20,0 g Lactose 10,0 g Ox gall 5,0 g Bromocresol purple 0,01 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,3; phân vào bình tam giác, mỗi bình 225 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Canh thang Nitrate Meat extract 3,0 g Peptone 5,0 g Potassium nitrate 1,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,0; phân ra ống nghiệm. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) Trytose 20 g Lactose 5 g Sodium chloride 5 g K2HPO4 2,75 g KH2PO4 2,75 g Lauryl sulphate 0,1 g Nước cất 1 lít Hấp ở 1210C trong 15 phút, pH môi trường là 6,8 ± 0,2. Môi trường Indol Tryptone 10,0 g Sodium chloride 5,0 g DL-trytophan 1,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH 7,0 phân ra các ống nghiệm đường kính 16mm, mỗi ống 5 ml. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Môi trường lên men carbohydrate Meat extract 3,0 g Peptone 10,0 g Sodium chlotide 5,0 g Chỉ thị 10,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,1-7,2; phân ra các ống nghiệm có ống Durham . Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Glucose, lactose, sucrose … đậm độ dùng cuối cùng là 1%. Đường cho vào môi trường cơ bản phải diệt khuẩn trước , trừ disaccharide phải tiệt khuẩn bằng lọc hoặc ở 1210C trong 10 phút và cho vào môi trường cơ bản đã tiệt khuẩn trước. Môi trường VP Peptone 7,0 g Glucose 5,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 5,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 6,9 và lọc. Tiệt khuẩn 20 phút ở 1150C. Simmon Citrate Agar Sodium citrate 2 g NaCl 5 g K2HPO4 1 g NH4H2PO4 1 g MgSO4 0,2 g Bromothylmol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất 1 lít Đun nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1 – 2 phút cho đến khi hòa tan. Phân phối vào 1/3 ống nghiệm có nắp 1 x 100 hoặc 16 x 150mm. hấp ở 1210C trong 15 phút. Đặt nghiêng ống nghiệm. pH cuối 6,8 ± 0,2. Thạch L-EMB a.Peptone 10,0 g Lactose 10,0 g Dipotassium hydrogen phosphate 2,0 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml b.Eosin Y 0,4 g Methylen blue 0,0065 g Pha dung dịch a, điều chỉnh pH tới 7,1-7,2. Chia ra từng bình 100ml.Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Đun chảy trước khi dùng, và cứ 100ml cho thêm 2ml dung dịch eosin Y 2% và 4,3 ml dung dịch methylen blue 0,15% Thạch MacConkey Peptone 20,0 g Lactose 10,0 g Bile salts 1,5 g Sodium chloride 5,0 g Agar 15,0 g Neutral red 0,03 g Crystal violet 0,001 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,1. Tiệt khuẩn 15 phút ở 1210C. Rót ra đĩa petri. Thạch TCBS Peptone 10,0 g Yeast extract 5,0 g Sucrose 20,0 g Sodium thiosulphate, pentahydrate 10,0 g Trisodium citrate dihydrate 10,0 g Sodium cholate 3,0 g Ox-gall 5,0 g Sodium chloride (NaCl) 10,0 g Ferric citrate 1,0 g Bromothymol blue 0,04 g Thymol blue 0,04 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml pH 8,6 ± 0,2 Hòa tất cả các thành phần trên trong nước cất. Đun nhỏ lửa và khuấy liên tục để cho tan thạch. Nguội tới 500C và rót ra đĩa Petri. Không tiệt khuẩn bằng hấp ướt. Đĩa môi trường để ở 40C dùng trong 24h (ISO 1990). Thạch TSI Meat extract 3,0 g Yeast extract 3,0 g Peptone 20,0 g Sodium chloride 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ferri citrate 0,3 g Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red 0,024 g Agar 12,0 g Nước cất 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml. Tiệt khuẩn 10 phút ở 1210C, để nghiêng phần thạch ở đáy ống cao 2,5 cm. Thạch urê a. Peptone 1,0 g Glucose 1,0 g Soium chloride 5,0 g Potassium hydrogen phosphate 2,0 g Phenol red 0,012 g Agar 15,0 g Nước cất 1000,0 ml Tiệt khuẩn trong 2 phút ở 1210C b. Urea 400,0 g Nước cất vừa đủ 1000,0 ml Tiệt khuẩn bằng lọc. Cho 50 ml b) vào 950 ml a) ở điều kiện vô khuẩn, điều chỉnh pH tới 6,8, phân ra các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml và để nghiêng. Trypticase (Tryptic) Soy Agar (TSA) Trypticase peptone 15 g Phytone peptone 5 g NaCl 5 g Agar 15 g Nước cất 1 lít Đun nóng để hòa tan agar, phân phối vào các erlen. Hấp khử trừng 15 phút ở 1210C. pH cuối 7,3 ± 0,2. Để sử dụng cho các chủng Vibrio spp. Ưa muối, công them NaCl vào để nồng độ cuối đạt 2 – 3%. Violet Red Bile Agar (VRBA) Cao nấm men 3 g Peptone hoặc gelysate 7 g NaCl 5 g Muối mật 1,5 g Lactose 10 g Neutral red 0,03 g Crystal violet 0,002 g Agar 15 g Nước cất 1 lít Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh về pH 7,4 ± 0,2. Đun sôi trong 2 phút, không hấp khử trùng. Sử dụng làm trong môi trường đổ đĩa. Thuốc thử kovacs p- Dimethylaminobenzalhehyde (p-DMABA) 10 g Isoamyl alcohol 150 ml HCl đậm đặc 50 ml Hòa tan p-DMABA trong dung môi, bổ sung và khuấy từng phần nhỏ HCl cho đến khi đủ lượng. thuốc thử được chứa trong chai màu tối tránh ánh sang ở 40C. có thể thay thế isoamyl alcohol bằng amyl alcohol hoặc butanol. Thuốc thử methyl red Methyl red 0,10 g Ethanol 95% 300 ml Nước cất (đủ) 500 ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol. Them nước cất vào cho đủ thể tích 500ml TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Vi sinh vật thực phẩm, tập Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu dánh giá chất lượng an toàn thực phẩm, NXB Y học. 2. , Trần Linh Thước,Các phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. 3. Vi khuẩn y học, Bộ y tế, NXB Giáo dục Việt nam, chủ biên PGS. TS Lê Văn Phủng. 4. Khóa luận tốt nghiệp, đề tài: Sử dụng kỹ thuật multilplex PCR để phát hiện các gen độc lực của vk Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò. 5. Cebula T. A., Payne W. L., and Feng P., 1995. Simultaneous Identification of Strains of Escherichia coli Serotype O157:H7 and Their Shiga – Like toxin Type by Mismatch Amplification Mutation Assay – Multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33: 248 - 250. 6. Leo Heijnen and Gertjan Medema , Journal of water and health 04.04.2006, Quantitative detection of E. coli, E. coli O157 and other shiga toxin producing E.coli in water samples using a culture method combined with real-time PCR. 7. Youngsheng He, James, E.Keen, Ralph B.Westama, E.Travis Littledike, Jimmy Kwang (1996) “Monoclonal Antibodies for Dectiction of the H7 Antigen of Escherichia Coli”, Applied and enviromental microbiology, Vol-62 No. 9p 3325-3332.