Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 1 Trường Đại Học Bách Khoa Tp. HCM KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Đề tài: Cải tạo giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần. GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN SVTH: MSSV 1. NGUYỄN HOÀNG ANH 60800048 2. NGUYỄN THIÊN ANH DŨNG 60800353 Tp. HCM Ngày 8 Tháng 6 Năm 2011 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 2 Mục lục Trang 1. Mở đầu: 1.1. Đặt vấn đề: .................................................................................. 3 1.2. Mục đích nghiên cứu: .................................................................. 4 2. Tổng quan tài liệu: 2.1. Tế bào trân: ............................................................................... 4 2.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào trần: ................................................. 4 3. Kỹ thuật thu nhận tế bào trần: ............................................................. 7 4. Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót: .............................. 10 5. Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần: 5.1. Môi trường nuôi cấy: ................................................................ 11 5.2. Sự tái sinh cây:.......................................................................... 14 6. Dung hợp tế bào trần và sự lai soma: 6.1. Nguyên tắc: ............................................................................... 15 6.2. Các phương pháp dung hợp tế bào trần: .................................... 15 6.3. Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha:........................................ 16 6.4. Phương pháp nuôi cấy và mật độ tế bào lai: .............................. 17 6.5. Sự phát triển của tế bào lai: ....................................................... 17 6.6. Những thuận lợi và khó khăn của dung hợp tế bào trần:............ 18 7. Tài liệu tham khảo: ............................................................................. 19 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 3 1. Mở đầu: 1.1. Đặt vấn đề: Màng nguyên sinh chất cho phép các tế bào trần có thể hấp thu các tế bào đại phân tử (nucleic acid, protein), thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể, nhân bào…theo cơ chế của amip. Nếu để các tế bào trần cạnh nhau, chúng có thể dễ dàng hòa làm một. Đây là hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell somatic hybridization). Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ. Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân. Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid). Sự liên kết và dung hợp tế bào trần để tạo thành các tế bào lai heterocaryon giữa các mô cùng một loài hoặc thuộc các loài khác nhau tùy thuộc vào nồng độ các ion như natri, kali, canxi, cũng như độ pH của môi trương nuôi cấy. Đồng thời phụ thuộc vào một số chất có tác dụng tăng cường liên kết tế bào như lysozym, và đặc biệt là polyethylen glycol do cấu trúc phân tử của chúng có thể tạo nên các liên kết ion với các chất có mặt ở màng sinh chất của tế bào. Sử dụng polyethylen glycol (với nồng độ từ 0,2- 0,3M) có thể tạo ra các tế bào lai đạt từ 25- 50% và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều thế hệ. Sự tạo thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai. Kỹ thuật này cho phép mở rộng nguồn gene của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.[1] Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần, ta có thể chuyển những gene hữu ích như đề kháng sâu bệnh, cố định đảm, giúp tốc độ sinh trưởng nhanh hơn, tốc độ hình thành sản phầm cao hơn (chấ lượng Protein), chống chịu được sương giá, chịu hạn, kháng thuốc diệt cỏ, … Dung hợp tế bào trần là một công cụ quan trọng giúp cho sự cải tiến giống để đem đến thay đổi đặc tính di truyền và phát triển trong chủng nấm sợi lai. Dung hợp tế bào trần thường được dùng để kết hợp các gene của các loài sinh vật khác nhau để tạo ra các chủng với đặc tính mong muốn. đây chính là công nghệ mạnh mẽ cho việc nhân giống VSV mang tính chất công nghiệp. Công nghệ dung hợp tế bào trần sẽ tiếp tục được nghiên cứu và phát triển cho nền công nghệ sinh học hiện đại. Kĩ thuật này trong tương lai sẽ là công cụ được sử dụng thường xuyên nhất trong nuôi cấy mô, sinh học phân tử, cho các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học.[2] CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 4 1.2. Nội dung nghiên cứu:  Tìm hiểu kỹ thuật thu nhận và nuôi cấy tế bào trần.  Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót.  Tìm hiểu các phương pháp nuôi cấy và tái sinh tế bào trần.  Tìm hiểu các phương pháp dung hợp tế bào trần. 2. Tổng quan tài liệu: 2.1. Tế bào trần: Tế bào trần là những tế bào mà vách tế bào của nó được loại bỏ và được bao phủ bằng màng nguyên sinh chất. Tế bào trần được thu được bằng cách sử dụng các emzyme loại bỏ vách tế bào. Dung hợp tế bào trần là một quá trình vật lý, bằng cách hợp nhất hai hay nhiều tế bào tiếp xúc và hòa hợp với nhau, hay chúng tự phát trong các phản ứng sinh tồng hợp. [2] Đặc điểm của tế bào trần:  Có khả năng tiếp nhận một đoạn/toàn bộ DNA lạ hoặc cả một bào quan để cải tạo bộ máy di truyền.  Có thể dung hợp với tế bào cùng loài hay khác loài.  Có khả năng tái tạo vách cellulose và phục hổi toàn bộ chức năng của tế bào nguyên thuỷ (2-6 ngày);  Có thể tái sinh thành cây nguyên vẹn.  Dễ dàng nghiên cứu ở mức độ phân tử.[3] 2.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào trần: Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1960 và 1970 - Cooking 1960: Quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực vật. - Ruesink 1973: Nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất . - Willison et al. 1971: Nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975). - Howland et al. 1975: Phương pháp phá vỡ tế bào để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự biến dạng hư hỏng như các phương pháp ly trích thông thường. - Nickell và Torey 1969: Tạo ra tế bào lai sinh dưỡng liên quan đến sự cải thiện năng suất thu hoạch mùa vụ. - Takebe 1975: Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi sinh vật. Tính chất này được khai thác thành công trong thí nghiệm cho nhiễm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 5 đồng loạt bởi virus, nuôi cấy nhân giống vô tính tế bào và phân lập các tế bào đột biến. - Pojnar et al. 1967: Tế bào trần phân lập từ mô quả cà chua được khảo sát chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào - Nagata và Takebe 1970: Nghiên cứu sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần. - Grout and Coutts 1974 : Nghiên cứu bằng điện di có thể xác định bề mặt tế bào có tích điện và có thể trong một số điều kiện thông thường nào đó điện tích này là âm. - Power et al. 1970: Tìm ra hợp chất gây ra sự tan rã là nitrate sodium chúng làm giảm điện tích âm xuống làm cho màng tế bào sát lại gần nhau. - Kao và Michayluk 1974, Wallin et al. 1974: tìm ra chất Polyethylene glycol (PEG) được chấp nhận rộng rãi như một tác nhân gây ra sự tan rã - Power et al. 1976: Thực vật lai sinh dưỡng của Petunia hybrida và P. parodii đã được tạo ra thành công. - Cocking (1989): thành công khi sử dụng các đối tượng của họ cà Solanaceae để dung hợp tế bào trần. - Abdullah et al. 1986: tái tạo cây nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập không phải từ lá nhưng từ dịch treo nuôi cấy tế bào. Các nghiên cứu về tế bào trần trong thời kỳ 1980 và 1990 - Petunia parodii và Petunia parviflora (Powder et al. 1980) : nhìn thấy được phương pháp tinh vi mở rộng trong tái tạo lại cây nguyên vẹn từ gia tăng vững chắc số các loài cây và trong sản xuất tế bào lai sinh dưỡng và cybrids. - Bajaj 1989: Các quy trình được phát triển xa hơn cho các kỹ thuật vi tiêm, dung hợp bằng điện, flow cytometry, hấp thu và tích hợp DNA, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần. - Cocking and Pojnar 1969: khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá. - kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm là sự biểu hiện của plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, được đưa và tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò độc lập của plasmid Ti ở khía cạnh này (Davey et al. 1980). - Zang et al. 1988: thành công trong lúa chuyển gen có khả năng sinh sản theo phương cách chuyển nạp bằng điện xung vào tế bào trần lúa plasmids chimaeric. - Davey và Kumar 1983: xác nhận rằng PEG cũng gia tăng sự thu hút virus và acid nhân của virus vào trong tế bào trần. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 6 - Những năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 1980 đây là thời gian phối hợp giữa các kỹ thuật xác định plasmid Ti có thể chuyển nạp hay không vào tế bào trần thực vật. - Guerche et al. 1987: Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brassica napus được chuyển gen bởi pABD1 vào trong tế bào trần thịt lá bằng phương pháp xung điện . - Kưhler et al. 1987: Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt rau Vigna aconitifolia kháng kanamycin mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử lý bởi PEG và pLGV NEO 2103. - Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cũng cung cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen trong khoảng thời gian vài giờ xử lý chuyển nạp. Các nghiên cứu biểu hiện gen tạm thời (ngắn ngủi) như vậy có ích trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen reporter sẵn sàng có thể thử nghiệm ví dụ như CAT và b-glucurionidase. - Allshire et al. 1987: chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đưa vào và biểu hiện ở tế bào động vật. Viễn cảnh hiện nay - Davey et al. 1974: chứng minh rằng tế bào trần có thể cô lập bằng enzyme từ một số nhóm tế bào ví dụ như từ tế bào biểu bì lá của thuốc lá rồi có thể tái tạo lại thành cây nguyên vẹn. - Cooking 1985: chứng minh rằng lông hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của tế bào biểu bì rễ, và nó đã được chứng minh xử lý bằng enzyme có thể làm tiêu hủy đỉnh sinh trưởng của lông hút và phóng thích tế bào trần - Ahuja et al. 1983: Tế bào trần cô lập từ rễ cây con, thân lá mầm, và lá mầm của Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi trường nuôi cấy để tạo ra mô sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần - Abdullah et al. 1986: phát hiện sự phát sinh phôi dưỡng trong các tế bào trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo cây nguyên vẹn - Chand et al. (1988): quan sát thấy sự sự bóc trần tế bào cây dược liệu thân gỗ Solanum dulcamara ở điện áp 250 đến 1250 vol/cm2 trong ba xung điện kế tiếp nhau mỗi xung kéo dài 10 – 50 ms đã kích thích sự tăng trưởng của mô dẫn suất từ tế bào trần và cho thấy có gia tăng khả năng biệt hóa (Chand et al. 1988). - Sẽ rất quan trọng để mở rộng các nghiên cứu này trên hệ thống tế bào trần. Sẽ có ích khi tế bào trần Physcomitrella tái tạo chỉ sản sinh một khối u khi đáp ứng với ánh sáng đơn cực, và tế bào phân cực này phân chia sau 24 giờ từ tế bào trần cô lập, từ hai tế bào con có hai mặt phát triển khác nhau (Jenkin và Cove 1983). Biến đổi con đường phát triển có thể cung cấp đầu mối giải mã về sự phát triển tế bào thực vật, tế bào của nó và điều khiển phân tử. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 7 - Al-Mallah et al. 1989 và 1990: đã quan sát cấu trúc nốt sần tạo ra ở rễ lúa, rễ cây con của cây cải cho dầu khi xử lý rễ với hỗn hợp enzyme cellulase và pectinase và cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium - Cooking và Davey 1991: Các nghiên cứu này bao gồm sự phân hủy một phần vách tế bào làm lộ ra một phần màng sinh chất của tế bào biểu mô có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu sự cộng sinh của Rhizobium đối với các cây trồng không phải họ đậu.[4] 3. Kỹ thuật thu nhận tế bào trần: Nguyên tắc xử lý vách tế bào: Sử dụng enzyme để phân huỷ vách tế bào. Các phương pháp tách tế bào trần: Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất. Có ba phương pháp tách:  Phương pháp tách bằng cơ học: Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào. Ta thu được tế bào trần. - Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản - Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp.  Phương pháp tách bằng enzyme: Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoặc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào. Enzym sử dụng phải tinh khiết, nếu còn chứa ít nhiều protease hoặc peroxidase sẽ làm hỏng tế bào trần. Hiệu quả của việc tạo tế bào trần còn phụ thuộc vào loại mô và cây được sử dụng. - Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần - Các bước tiến hành như sau:  Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá.  Ngâm trong dung dịch có áp suất thẩm thấu cao -> hiện tượng co nguyên sinh chất, tế bào bị mất nước, nội dung tế bào nhỏ lại, màng nguyên sinh chất tách khỏi tế bào.  Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym.  Xử lý hỗn hợp enzym.  Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 8  Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp.  Phương pháp hỗn hợp: Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó dùng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau.[1]  Theo nghiên cứu mới của TS. Nguyễn Thị Phương Thảo đã xác định được quy trình tách tế bảo trần cho 8 dòng khoai tây nhị bội trong đó: Nồng độ dung dịch co nguyên sinh:  Manitol: 0.5M  CaCl2: 0.01%  ES: 0.06M Nồng độ enzyme:  Tỷ lệ: ௠௔௖௘௥௢௭௬௠௘ ௖௘௟௟௨௟௢௦௘ = ଴.ଵ ଴.଺݉݃/100݈݉ − ଴.ଶ଴.଼ − ଴.ଵ଴.଼ ; ଴.ଵଵ  Thời gian ủ enzyme (14-16h), tốc độ và thời gian ly tâm: từ 150-200 vòng/phút trong thời gian 20 phút ở ly tâm lần 1; và 250-300 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở ly tâm lần 2 và 3. [5] Thu nhận tế bào trần từ lá cây: Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất (relatively uniform cells). Phương pháp cơ bản để tách tế bào trần từ lá cây 1. Khử trùng mẫu lá 2. Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất 3. Tách lớp mặt dưới lá 4. Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym 5. Tinh sạch tế bào trần 6. Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 9 Hình 1. Các bước phân lập tế bào trần từ lá cây Thu nhận tế bào trần từ mô sẹo: Các mô sẹo non nuôi cấy in vitro cũng là nguyên liệu lý tưởng để thu được một lượng lớn tế bào trần. Nuôi cấy các mô sẹo già hơn thường cho các tế bào có kích thước lớn hơn và vách tế bào dày, điều này sẽ gây khó khăn cho sự thủy phân bằng enzyme. Vì thế, người ta thường sử dụng các mô sẹo non sau hai tuần cấy chuyển để phân lập tế bào trần. Nồng độ enzyme đặc biệt là cellulose có thể thấp hơn so với lá. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 10 Hình 2. Tạo mô sẹo, Tái sinh cây và sự phát triển của cây con từ tế bào trần Thu nhận tế bào trần từ huyền phù tế bào: Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào (cell suspension cultures) cũng cung cấp nguồn nguyên liệu rất tốt cho phân lập tế bào trần. Dịch huyền phù tế bào có mật độ cao được ly tâm, sau đó loại bỏ thể nổi (supernatants). Các tế bào được ủ trong hỗn hợp enzyme (cellulase + pectinase) và lắc từ 6 giờ tới qua đêm tùy thuộc vào nồng độ của các enzyme. Sử dụng nồng độ thấp của các enzyme mục đích ngăn cản sự kết dính trong dịch huyền phù tế bào để thu được hiệu suất phân lập tế bào trần cao hơn. Các protoplast có nguồn gốc từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có tiềm năng tái sinh cây hơn hẳn ở các loài mà trước đó đã không thành công khi thử tái sinh từ các protoplast có nguồn gốc tế bào thịt lá. Những thành công gần đây khi tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh từ protoplast của các loài ngũ cốc (kê, lúa miến, lúa mạch giống Golden Promise) đã chứng minh nuôi cấy dịch huyền phù tế bào là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các tế bào trần toàn vẹn.[6] 4. Xác định mật độ tế bào trần và khả năng sống sót: Các tế bào trần đều có dạng hình tròn khi quan sát dưới kính hiển vi. Để xác định chất lượng của tế bào trần cần trải qua ba bước: - Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không? Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 11 bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể. - Bước hai: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần. Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này. Có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x. Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống. Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ. - Bước ba: Xác định sức sống của tế bào trần. Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh evan. Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần. Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút, Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, còn những tế bào có màng nguyên sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được. Kiểm tra tỷ lệ sống của tế bào trần: Sử dụng fluorescein diacetat (FDA) ở thể tích 0,8ml dung dịch với 20ml môi trường chứa tế bào trần. Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần có màng sinh cất bị phá huỷ sẽ có màu sẫm hoặc màu tối.[1] 5. Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần: 5.1. Môi trường nuôi cấy: a. Thành phần môi trường: Nói chung, môi trường nuôi cấy tế bào trần tương tự với môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào và mô sẹo. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và amonium dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể là quá cao đối với nuôi cấy tế bào trần. Hầu hết muối của môi trường B5 và MS có cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca2+ trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình thường có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào. Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, nhưng ở một số loài (ví dụ: thuốc lá) sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn (1,5%). Môi trường nuôi cấy tế bào trần sử dụng nitơ hữu cơ dạng CH và nitơ vô cơ NH4NO3 (20 mmol/L). CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 12 Các vitamin dùng trong nuôi cấy tế bào trần cũng giống trong môi trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia trong các tế bào trần phân lập. Tế bào trần của ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như các auxin khác (NAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm năng phát sinh hình thái ở các mô sẹo có nguồn gốc tế bào trần. Các cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP, hoặc zeatin. Mặc dù, tổ hợp hai loại phytohormone nói trên thay đổi tùy loài, nhưng nói chung trong nuôi cấy tế bào trần tỷ lệ auxin/kinentin cao thích hợp cho phân chia tế bào, trong khi các tế bào trần có nguồn gốc từ những tế bào phân hóa cao lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây. b. Áp lực thẩm thấu của môi trường: Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các tế bào trần cần được duy trì cân bằng áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái sinh được vách tế bào vững chắc. Trong cả hai trường hợp chênh lệch áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng tế bào trần bị vỡ hoặc teo lại. Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu (thông thường là để tăng áp lực thẩm thấu) trong môi trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose. Các tế bào trần sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong trong dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu. Đối với các tế bào trần thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy tế bào trần của khoai tây, đậu hoa (sweet pea), tước mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu. Các chất phân ly ion (KCl 335 mmol/L và MgSO4.7H2O 40 mmol/L) cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast. Thông thường các dung dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định (CaCl2 5-100 mmol/L) song song với các nhân tố ổn định thẩm thấu không phân ly ion. Cocking và Peberdy (1974) đã phát triển dung dịch rửa tế bào trần (cell-protoplast washing, CPW) chứa muối và các nhân tố ổn định thẩm thấu thích hợp. Dung dịch CPW có thể được dùng trong suốt quá trình ủ enzyme và rửa protoplast. Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ của nó trong dung dịch và loại nguyên liệu được sử dụng. c. Mật độ dàn trải tế bào trần: Mật độ tế bào trần tối ưu là từ 1×104 đến 1×105/mL. Tuy nhiên, các thí nghiệm lai soma (somatic hybridization) và phát sinh đột biến (mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, do đó phải dàn trải protoplast ở mật độ thấp hơn (100-500 tế bào CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 13 trần /mL). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc. Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy tế bào trần (KM 8p) (Bảng 1) trong đó các tế bào trần được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ: Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành mô sẹo. Môi trường này còn kích thích phân chia nhanh hơn ở các tế bào trần thịt lá của cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây, và sản phẩm dung hợp potato + tomato được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp. Các protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường KM 8p sẽ trở nên độc đối với tế bào dưới điều kiện ánh sáng mạnh.[6] Bảng 1. Môi trường KM 8p dùng cho nuôi cấy tế bào trần ở mật độ thấp (khử trùng bằng phương pháp lọc) Thành phần Nồng độ mg/l Thành phần Nồng độ mg/l Muối khoáng Các acid hữu cơ NH4NO3 600 (chỉnh pH tới 5,5 bằng KNO3 1900 NH4OH) CaCl2.2H2O 600 Sodium pyruvate 5 MgSO4.7H2O 300 Citric acid 10 KH2PO4 170 Malic acid 10 KCl 300 Fumaric acid 10 Sequestrence 330 Fe 28 Các vitamin KI 0,75 Inositol 100 H3BO3 3 Nicotinamide 1 MnSO4.H2O 10 Pyridoxine-HCl 1 ZnSO4.7H2O 2 Thiamine-HCl 10 Na2MoO4.2H2O 0.25 D-Calcium 0,5 CuSO4.5H2O 0.025 pantothenate 0,2 CoCl2.6H2O 0.025 Folic acid 0,01 Đường p-Aminobenzoic acid Glucose 68400 Biotin 0.005 Sucrose 125 Choline chloride 0,5 Fructose 125 Riboflavin 0,1 Ribose 125 Ascorbic acid 1 Xylose 125 Vitamin A 0,005 Mannose 12 Vitamin D3 0,005 Rhamnose 125 Vitamin B12 0,01 Cellobiose 125 Các phytohormone Sorbitol 125 2,4-D Mannitol 125 Zeatin NAA Nước dừa (lấy từ quả già xử lý 60oC/30 phút rồi lọc) CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 14 Phương pháp nuôi cấy (8 cách): 1. Nuôi cấy trong môi trường lỏng + chế độ lắc nhẹ. 2. Nuôi cấy trên môi trường đặc. 3. Nuôi cấy trong môi trường bán rắn. 4. Cố định tế bào trần trong các giọt alginate 5. Cố định tế bào trần trong chất tạo gel. 6. Cố định tế bào trần + cố định tế bào thương -> đồng nuôi cấy. 7. Tế bào trần ở trên lớp nilon mỏng đặt trên môi trường nuôi cấy tế bào thường. 8. Tế bào thường đang sinh trưởng mạnh trong môi trường nuôi cấy -> loại bỏ tế bào, giữ môi trường -> cho tế bào trần vào nuôi.[3] 5.2. Sự tái sinh cây: 5.2.1. Tạo vách tế bào: Quá trình hình thành vách tế bào có thể hoàn chỉnh trong vòng hai đến một vài ngày mặc dù các tế bào trần trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ. Vách tế bào được tạo thành bao gồm các vi sợi (microfibrils) sắp xếp lỏng lẻo, quá trình này đòi hỏi cung cấp nguồn carbon (sucrose) trong môi trường dinh dưỡng. Các chất phân ly ion để ổn định thẩm thấu trong môi trường đã ngăn cản sự phát triển vách tế bào. Các tế bào trần phát triển vách kém thường phân chia tế bào cũng rất kém. 5.2.2. Phát triển callus và tạo cây hoàn chỉnh: Ngay sau khi tạo vách tế bào chung quanh tế bào trần, các tế bào được tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau một tuần xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên. Sau 2-3 tuần, các khuẩn lạc tế bào có kích thước lớn được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng lên môi trường không có sự điều chỉnh áp lực thẩm thấu để phát triển mô sẹo. Các mô sẹo này được cảm ứng để phân hóa cơ quan, hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh. 5.2.3. Tế bào trần và vấn đề chọn dòng tế bào Cơ thể thực vật bậc cao thường có kích thước khá lớn cho nên các kỹ thuật xử lý và chọn dòng khó thực hiện với số lượng cơ thể theo tính toán xác suất thống kê, chính vì vậy kỹ thuật chọn dòng thường chỉ được ứng dụng ở đối tượng vi sinh vật và đạt được nhiều kết quả rất khả quan. Bằng biện pháp bỏ thành cellulose và đưa cơ thể thực vật về trạng thái từng tế bào riêng rẽ với kích thước không lớn hơn nhiều so với cơ thể vi sinh vật đã cho phép tiến hành kỹ thuật chọn dòng vi sinh vật đối với thực vật bậc cao. Một đĩa petri đường kính 5-7 cm cho phép nuôi tới 5× 106 tế bào trần thuốc lá trong khi muốn trồng 5×106 cây thuốc lá cần có 106 m2 tức là 100 ha đất canh tác. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 15 Ngoài ra, cơ thể thực vật bậc cao là cơ thể đa bào được phân hóa thành các tổ chức khác nhau. Nếu tiến hành xử lý đột biến cả tổng thể đó rất khó đạt được tần số cần thiết. Sử dụng tế bào trần riêng rẽ cho phép loại bỏ mối tương tác với các tế bào bên cạnh và những thay đổi di truyền có điều kiện biểu hiện rõ ràng hơn.[6] 6. Dung hợp tế bào trần và sự lai soma: 6.1. Nguyên tắc: Màng nguyên sinh chất cho phép các tế bào trần có thể hấp thu các tế bào đại phân tử (nucleic acid, protein), thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể, nhân bào…theo cơ chế của amip. Nếu để các tế bào trần cạnh nhau, chúng có thể dễ dàng hòa làm một. Đây là hiện tượng dung hợp (protoplast fusion) hay còn gọi là lai vô tính tế bào (cell somatic hybridization). Khi 2 hoặc nhiều tế bào trần dung hợp ngẫu nhiên sẽ tạo một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ. Nếu hai nhân khác nhau sẽ tạo ra thể lai dị nhân ngược lại có thể lai đồng nhân. Sự kết hợp nhân trong thể dị nhân hình thành tế bào trần lai thực sự gọi là thể dị nhân. Nếu 1 trong 2 nhân bị đào thải, nguyên sinh chất của 2 tế bào trần sẽ dung hợp tạo ra thể lai tế bào chất cybrid (Cytoplasmid hybrid) Sự liên kết và dung hợp tế bào trần để tạo thành các tế bào lai heterocaryon giữa các mô cùng một loài hoặc thuộc các loài khác nhau tùy thuộc vào nồng độ các ion như natri, kali, canxi, cũng như độ pH của môi trương nuôi cấy. Đồng thời phụ thuộc vào một số chất có tác dụng tăng cường liên kết tế bào như lysozym, và đặc biệt là polyethylen glycol do cấu trúc phân tử của chúng có thể tạo nên các liên kết ion với các chất có mặt ở màng sinh chất của tế bào. Sử dụng polyethylen glycol (với nồng độ từ 0,2- 0,3M) có thể tạo ra các tế bào lai đạt từ 25- 50% và các tế bào lai có thể tồn tại qua nhiều thế hệ. Sự tạo thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai. Kỹ thuật này cho phép mở rộng nguồn gene của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ.[1] 6.2. Các phương pháp dung hợp tế bào trần: 6.2.1. Xử lý bằng NaNO3: Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai tế bào trần. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hoá mạnh như tế bào trần từ nhu mô lá. 6.2.2. Xử lý bằng PEG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 16 Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng: hoặc cung cấp cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải.[7] 6.2.3. Xử lý với nồng độ ion Ca+2 cao và pH cao: Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCL2, 0,4M 9% (W/v) manitol, pH cao (8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt độ 370C trong 45phút. Bằng phương pháp này Keller và Melcher (1973) đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá. Tuy nhiên pH cao có thể gây độc cho tế bào trần của một số loài thực vật.[1]. 6.2.4. Dung hợp bằng điện: Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các tế bào trần hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich (1981) cũng đã chứng minh rằng các tế bào trần có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp bao gồm hai bước: Đầu tiên các tế bào trần được đưa vào một ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích thích các tế bào trần sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý. Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các tế bào trần vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma.[7] 6.3. Dung hợp tế bào trần bao gồm 3 pha: * Pha 1: Pha kết dính CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 17 Màng sinh chất của 2 hay nhiều tế bào trần tiến sát nhau. * Pha 2: Pha Dung hợp màng tại những vùng nhỏ liên kết chặt dẫn đến hình thành tế bào chất liên tục hoặc cầu giữa các tế bào trần. * Pha 3: Giãn nở của các cầu nguyên sinh chất và hình thành thể đồng nhân hoặc dị nhân hình cầu. Sau khi dung hợp màng tế bào chất của 2 tế bào trần sẽ kết hợp với nhau khoảng vài giờ. Nếu ở thể dị nhân lai tế bào chất 2 nhân có thể phân bào đồng thời trên cùng 1 sợi thoi vô sắc chung nhưng các nhiễm sắc thể không đi cùng nhau. Kết quả tạo ra mô khảm sau đó có sự thoái hoá và phân ly 1 nhân tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả 2 tế bào trần nhưng chỉ có 1 nhân. Thể dị nhân chỉ duy trì ở 1 vài thế hệ tế bào, sau đó xảy ra dung hợp nhân ở gian kỳ hoặc ở lần nguyên phân đồng bộ đầu tiên. Chỉ có những tế bào lai được tạo ra qua dung hợp nhân mới có khả năng tiếp tục phát triển. - Trong các tế bào lai sự hợp nhất hoàn toàn genom từ 2 nguần thường không xảy ra. Sự đào thải dần dần nhiễm sắc thể của 1 trong các dạng cha mẹ. Kết quả của tế bào lai là 1 tế bào của 1 loài. Tế bào lai chỉ dùng trong thời gian ngắn, trong vòng 1 vài thế hệ. 6.4. Phương pháp nuôi cấy và mật độ nuôi cấy tế bào lai: Các tế bào trần sau khi được tách từ mẫu thực vật sẽ được làm loãng trong môi trường lỏng - Xác định mật độ tế bào trong buồng đếm hồng cầu. + Mật độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào trần là104 -106 tế bào/ml môi trường +Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp thành tế bào mới được tái tạo sau khoảng 48-96 giờ nuôi cấy.sau đó các tế bào sẽ bắt đầu phân chia và hình thành mô sẹo.khi được chuyển sang một môi trường mới các tế bào mô sẹo sẽ phát sinh phôi(sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy) rồi phát triển thành cây hoàn chỉnh. - Ưu điểm: Nuôi cấy trong môi trường lỏng được sử dụng nhiều do có thể điều chỉnh được mật độ tế bào và áp suất thẩm thấu.một số loài thực vật tế bào trần không thể phân chia trên môi trường đặc. 6.5. Sự phát triển của tế bào lai: Các tế bào trần nuôi cấy invitro có thể chết, có thể dung hợp thành tế bào lai chứa hai nhân khác loài- heterocaryon. Nếu tế bào lai này tái sinh lớp vỏ cellulose và phân bào thi xem như chúng đã sống và phát triển. Tế bào trần thực vật có khả năng biểu hiện hoạt động của gene, sinh trưởng và tái sinh thành cây hoàn chỉnh, được xem là cây lai soma. Khi heterocaryon phân chia thì nhân ở thế hệ tế bào con chưa dung hợp thành một nhân lai độc nhất, tuy chúng có xu thế đồng thời hóa mitos. Một số CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 18 heterocaryon qua vài thế hệ bị chết đi. Trong các heterocaryon có nhân ở cạnh nhau thì qua mitos, hai bộ nhiễm sắc thể sẽ hợp nhất để cho ra một nhân lai và ở thế hệ sau, các tế bào con đều chứa một nhân lai duy nhất. Các tế bào phát triển từ một loại nhân lai cho ra các dòng lai (clon line). Chúng cũng phát triển như các tế bào soma bình thường được nuôi cấy invitro. Phương pháp chọn lọc và xác định các dòng tế bào lai và mô sẹo: Để xác định các dòng lai tế bào soma thực vật, các nhà nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp đánh dấu như ở tế bào lai động vật. Các chỉ tiêu hình thái được sử dụng để đánh dấu cho các giai đoạn phát triển của tế bào lai, của mô sẹo cho tới khi tái sinh cây hoàn thiện (ví dụ như sự có mặt hay không của các loại lạp thể). Sự sinh trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào hormon auxin, mức độ phát triển của biểu mô, hình dạng lá khi tái sinh…Các đánh dấu: số lượng nhiễm sắc thể, bản chất các isoenzym, sự biểu hiện của gene…đều được sử dụng để theo dõi, xác định và chọn lọc tế bào lai. Sử dụng các đột biến và bổ trợ gene làm chỉ tiêu đánh dấu, người ta có thể phát hiện trạng thái hoạt động của gene khi so sánh tế bào lai và cây lai soma với tế bào bố mẹ và cây lai hữu tính. 6.6. Những thuận lợi và khó khăn của dung hợp tế bào trần: Thuận lợi: - Với phương pháp này, người ta có thể vượt qua hàng rào giới tính để tạo ra nhiều dạng lai giữa các loài khác xa nhau về nguồn gốc, quan hệ họ hàng - Ưu thế của lai tế bào thực vật so với lai tế bào động vật hơn hết là về mặt thực tiễn. Từ tế bào lai thực vật, người ta dễ dàng tái sinh cây hoàn chỉnh, có thể sử dụng trong việc tăng năng suất và tạo giống cây trồng mới. - Kỹ thuật lai tế bào trần không đòi hỏi phức tạp như lai tế bào động vật. Từ các mô của thực vật có thể thu nhận được nhiều loại tế bào trần đơn bội, từ đây có thể dễ dàng chọn lọc nguyên liệu đồng nhất để nghiên cứu mà không phải sử dụng đến kỹ thuật chọn dòng phức tạp như đối với tế bào động vật. - Các dòng tế bào trần sống lâu và dễ dàng tạo tế bào lai. - Có thể dễ dàng quan sát, theo dõi quá trình phát triển của tế bào lai. Đồng thời, tế bào lai thực vật có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh nên có thể nghiên cứu sự biểu hiện của gene. Tế bào lai ở dạng song nhị bội, do đó mà không cần đa bội hóa. Đây là một điểm ưu việt so với lai xa. Khó khăn: Dung hợp tế bào trần gặp khó khăn do bộ gene của hai loài đem lai không tương thích. Đôi khi chúng có thể dung hợp lại với nhau và tạo nên những tế bào lai và phát triển thành cây hoàn chỉnh mang bộ gene của cả hai loài khác xa nhau về quan hệ họ hàng. Tuy nhiên, đa phần là khó khăn.[1] CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GVHD: TS LÊ THỊ THUỶ TIÊN Trang 19 7. Tài liệu tham khảo: [1] Lê Thị Lý, Tạo cây lại bằng phương pháp dung hợp tế bào trần ( dung hợp Protoplast), 2010, bài thảo luận nhập môn công nghệ sinh học, số trang 10. [2] Nitin Verma*,M.C.Bansal,Vivek Kumar, Department of Paper Technology, Indian Institute of Technology,Roorkee,Saharanpur Campus, Saharanpur, 247001, India;2007; Protoplast Fusion Technology and Its Biotechnological Applications; 8. [3] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2002. [4] Edward C. Cocking; Plant Genetic Manipulation Group University of Nottingham, Nottingham, U.K. (người dịch: Nguyễn Anh Tuấn.) [5] TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, 2010, Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần. [6] PGS – TSKH Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Nhà xuất bản Đà Nẵng, 2008 [7] Hoàng Trọng Phán, Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật.