Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP DH06SH Bài Tiểu Luận: CHẨN ĐOÁN BỆNH NEWCASTLE BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO GVHD: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI SVTH: TRẦN THỊ THANH PHẤN MSSV: 06126110 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................................4 II. TỔNG QUAN......................................................................................................5 1 Bệnh Newcastle ......................................................................................................5 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle ....................................................................................5 1.2 Virus gây bệnh...........................................................................................................6 1.2.1 Hệ thống phân loại..................................................................................................6 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus ..................................................................7 1.2.3. Các đặc tính sinh học.............................................................................................8 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle ............................................................12 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh ............................................................................12 1.3.2 Vật chủ.................................................................................................................12 1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus............................................................12 1.4 Đặc điểm bệnh học .................................................................................................13 1.4.1 Quá trình sinh bệnh ..............................................................................................13 1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích ......................................................................................14 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. ................................................................................16 2.1 Khái niệm ................................................................................................................16 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, ...............16 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết ..........................................................................16 2.4 Thành phần môi trường. .........................................................................................16 2.5. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào...............................................................................17 2.6. Thu hoạch tế bào.....................................................................................................18 2.7. Bảo quản tế bào. .....................................................................................................18 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3 2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào.............................................18 2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào ..................................................................18 3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.........................19 1. Thu thập và gởi mẫu đi chuẩn đoán bệnh..................................................................19 1.1 Mẫu cơ .....................................................................................................................19 1.2. Mẫu huyết thanh .....................................................................................................19 2. Xử lý mẫu ..................................................................................................................21 3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp................................21 3.1 Nguyên liệu..............................................................................................................21 3.2 Trypsin có tế bào .....................................................................................................22 3.3 Cấy tế bào vào chai..................................................................................................23 4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm .......................................................................................23 IV. KẾT LUẬN ............................................................................................................25 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................26 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Newcastle hiện nay đang là mối quan tâm hàng đầu trong chăn nuôi gà bởi bệnh lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết cao làm ảnh hưởng trực tiếp đến kinh tế hộ gia đình. Hơn thế bệnh còn là mối nguy cơ bùng phát dịch trên diện rộng gây ô nhiễm môi trường và sức khoẻ cộng đồng. Ảnh hưởng của bệnh Newcastle đối với nền kinh tế gia cầm toàn cầu rất lớn, là một trong những bệnh gây tác hại lớn đến sự phát triển của ngành chăn nuôi gia cầm thế giới. Ngoài ra thiệt hại liên tục do bệnh Newcastle gây ra sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cũng như chất lượng thực phẩm cho người dân. Trong thực tế đã có nhiều người thường có tư tưởng chủ quan khi thấy trong thời gian dài trong gia đình nhà mình không bị bệnh Newcastle đã không thực hiện đúng quy trình nhỏ và tiêm phòng vaccine Newcastle từ đó đã dẫn đến nguy cơ mắc bệnh cao.Từ đó mỗi khi có dịch bệnh xảy ra công tác kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn hơn. Vì vậy việc chẩn đoán mẫu bệnh phẩm để xác định nguyên nhân gây chết của gia cầm có phải là do virus Newcastle gây ra hay không có ý nghĩa thực tế rất lớn nhằm góp phần làm giảm tối đa các rủi ro có thể xảy ra cũng như ngăn chặn không cho dịch bệnh lan tràn sang các khu vực khác và trên thế giới. Vì vậy công tác kiểm soát dịch bệnh sẽ dễ dàng hơn và hiệu quả hơn. Hiện nay có rất nhiều kỷ thuật phân tử để chẩn đoán bệnh Newcastle như dùng phôi gà, phương pháp huyết thanh học, phương pháp thử thách, phương háp kháng thẻ huỳnh quang và một trong những phương pháp chẩn đoán chính xác hiệu quả và đặc trưng nhất chính là phương pháp nuôi cấy tế bào. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 5 II. TỔNG QUAN 1 Bệnh Newcastle 1.1 Khái quát về bệnh Newcastle Bệnh Newcastle hay còn gọi là bệnh dịch tả hay bệnh gà rù. Bệnh do virus avian paramyxovirus type 1 (APMV-1) gây nên chủ yếu trên các loài gia cầm, trong đó gà là loài mẫn cảm nhất. Trong các tài liệu chuyên môn trước đây, bệnh Newcastle còn gọi là bệnh pseudo-poutry plague, avian pest, avian distemper… Virus newcastle rất đa dạng về độc lực và thường gây ra nhiều dạng bệnh với mức độ nghiêm trọng rất khác nhau. Sự đa dạng này thường gây ra một số khó khăn trong việc nhận dạng được bệnh ngay khi có virus Newcastle xâm nhập vào đàn gia cầm (Trần Đình Từ, 1995). Bệnh Newcastle phức tạp ở chỗ các chủng virus khác nhau có thể gây ra những biến động rất lớn về mức độ nghiêm trọng của bệnh, kể cả một vật chủ đã biết rất rõ như gà. Để phân chia các thể hay các týp bệnh lý của bệnh Newcastle dựa vào các triệu chứng lâm sàng của gà, Beard và Hanson (1984) [72] đã tóm tắt như sau: (1) Thể Doyle (1927) [99] là thể bệnh Newcastle cấp tính, gây tử vong cho gà ở mọi lứa tuổi. Thường xuất huyết ở đường tiêu hóa và thể bệnh này được gọi là thể bệnh Newcastle độc lực cao hướng nội tạng ( VVND: Viscerotropic velogenic Newcastle disease). (2) Thể Beach ( Beach, 1942) [69] cũng là thể bệnh Newcastle cấp tính thường gây tử vong ở gà mọi lứa tuổi. Các triệu chứng hô hấp và thần kinh thường xuất hiện nổi trội vì vậy được gọi là bệnh Newcastle độc lực cao hướng thần kinh (NVND: Neurotropic velogenic Newcastle disease). (3) Thể Beaudette ( Beaudette and Black, 1946) [74] là một thể Newcastle nhẹ hơn, thường chỉ gây tử vong ở gà con. Virus gây ra týp bệnh này thuộc nhóm virus có độc lực trung bình ( Mesogenic NDV) và một số chủng virus thuộc nhóm này đã được sử dụng làm vaccine virus sống dùng để tiêm chủng lặp lại. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 6 (4) Thể Hitchner ( Hitchner và Johnson,1948) [127] là một thể bệnh đường hô hấp nhẹ gây ra bởi nhóm virus có độc lực thấp ( Lentogenic NDV), thường sử dụng để sản xuất các loại vaccine virus sống. (5) Thể ruột, không triệu chứng ( asymptomatic-enteric form) ( Lancaster, 1981) [156] là thể gây nhiễm ở đường ruột bởi các virus gần như không có độc lực, không gây bệnh rõ ràng ( Apathogenic or avirulent NDV). 1.2 Virus gây bệnh 1.2.1 Hệ thống phân loại APMV-1 hay virus Newcastle được xếp vào chi Rubulavirus thuộc họ phụ Paramyxovirinae của họ Paramyxoviridae. Các họ virus Paramyxoviridae, Filoviridae, Rhabdoviridae và Bornaviridae tạo nên bộ Mononegavirales, có bộ gen là một RNA chuỗi đơn âm ( negative single strained RNA) không phân đoạn, với nucleocapside có cấu trúc đối xứng xoắn ( Murphy và ctv, 1999) [176]. Có chín nhóm huyết thanh Avian Paramyxovirus đã được công nhận và ký hiệu từ APMV-1 đến APMV-9 (Alexander, 1988) [48]. Trong số này virus Newcastle ( APMV-1) là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất đối với gia cầm, nhưng APMV-2, APMV-3, APMV-6 và APMV-7 cũng có vai trò gây bệnh nhất định Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 7 1.2.2 Đặc điểm hình thái và lý hóa của virus Soi kính hiển vi điện tử tương phản âm thấy các tiểu thể virus Newcastle có dạng đa hình thái, tiêu biểu cho các thành viên của chi Rubulavirus. Các hạt dạng tròn có kích thước khoảng 100-500 nm, còn các dạng sợi có bề ngang khoảng 100 nm với chiều dài thay đổi mỗi khi quan sát. Bề mặt hạt virus được bao bọc với các mấu lồi dài khoảng 8 nm. Trong hầu hết các vi ảnh điện tử, Nucleocapside thường có “dạng xương cá trích” điển hình cho Paramyxovirus với chiều dài khoảng 18 nm, cấu trúc đối xứng xoắn, có thể được quan sát dưới dạng sợi tự do hoặc nhô ra từ các tiểu thể virus bị đứt gãy ( Murphy và ctv, 1999; Alexander, 2003) [176, 53] . Bộ gen của Avian Paramyxovirus chứa một RNA đặc trưng duy nhất, chuỗi âm với trọng lượng phân tử khoảng 5.106 Da ( Kolakofsky và ctv, 1974) [151], chiếm khoảng 0,5 % trọng lượng hạt virus. Giải mã trình tự Nucleotide của bộ gen của virus Newcastle cho thấy có độ dài bao gồm 15.186 Nucleotide ( Philips và ctv, 1998) [188]. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 8 Hạt virus có khoảng 20-25% Lipid có nguồn gốc từ tế bào vật chủ và khoảng 6% carbonhydrade. Tổng trọng lượng phân tử của một hạt virus trung bình là khoảng 5.108 Da, tỉ trọng trong đường Sucrose là 1,18-1,2 g/l ( Alexander, 2003) [53]. Điện di các tiểu thể virus Newcastle tinh sạch đã bị phá vỡ trên gel Polyacryamid thường cho thấy ít nhất 7 chuỗi Polypeptide. Tuy nhiên một trong 7 chuỗi này là Protein actin của vật chủ tích hợp vào hạt virus. 1.2.3. Các đặc tính sinh học a. Hoạt tính gây ngưng kết hồng cầu Khả năng gây nhưng kết hồng cầu ( Haemagglutination: HA) của virus Newcastle và các APMV khác là do Protein HN bám dính vào các thụ thể nằm trên bề mặt hồng cầu. Đặc tính này và sự ức chế ngưng kết đặc hiệu bởi huyết thanh miễn dịch đã được chứng minh là công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh Newcastle. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 9 Hồng cầu gà thường được dùng trong phản ứng HA nhưng virus Newcastle có thể gây ngưng kết hồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và những loài chim khác ( Lancaster, 1966) [154]. Avian Paramyxovirus còn có thể làm ngưng kết các tế bào không phải là hồng cầu nếu chúng có thụ thể phù hợp. a. Hoạt tính Neuraminidase Enzyme neuraminidase cũng là một thành phần của phân tử HN. Enzyme này có khả năng lấy đi các thụ thể từ tế bào vật chủ nhằm ngăn cản sự bám trở lại vào bề mặt tế bào của các hạt virus đã được giải phóng và sự ngưng tụ virus. b. Sự dung hợp tế bào và sự tan huyết Virus Newcastle và các APMV khác có thể làm tan vỡ hồng cầu hay sự dung hợp với tế bào khác bởi cùng một cơ chế. Hiện tượng bám vào vị trí thụ thể khi tái sản được tiếp nối bởi sự dung hợp màng của virus với màng tế bào dẫn đến sự dung hợp của ít nhất hai hay nhiều tế bào, hình thành các tế bào khổng lồ khi các tiểu thể virus mọc chồi từ các màng tế bào. Màng rắn chắc của hồng cầu thường bị vỡ bởi sự dung hợp của virus (Alexander, 2003) [53]. c. Sự tạo mảng của virus Sự tạo mảng ở môi trường tế bào của các chủng virus Newcastle khác nhau cả về hình dạng lẫn kích thước có hai hình thái của mảng: sang hoặc đỏ và kích thước Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 10 của mảng tương quan với độc lực của chủng virus đối với gà ( Reeve và postr, 1971) [194]. d. Độc lực của virus Khả năng mẫn cảm với virus Newcastle thay đổi theo loài vật chủ. Gà rất nhạy cảm với virus Newcastle Ở gà khả năng mắc bệnh Newcastle chủ yếu được quyết định bởi chủng virus, mặc dù liều nhiễm, đường lây nhiễm, tuổi và các yếu tố môi trường cũng có tác động. Gà càng non thể bệnh càng cấp tính. Giống gà không có ảnh hưởng nhiều đến tính mẫn cảm của gà đối với bệnh. Con đường lây nhiễm tự nhiên ( mũi, mắt, miệng) thường dẫn đến các triệu chứng hô hấp, trong khi tiêm vào bắp thịt, tĩnh mạch, màng não thì tăng các triệu chứng thần kinh. Hanson và Bradly (1955) [121] đã xếp các chủng virus Newcastle vào ba nhóm có độc lực khác nhau: virus Newcastle độc lực cao, virus Newcastle độc lực trung bình và virus Newcastle độc lực thấp dựa vào ba mốc thời gian gây chết phôi gà sau khi virus được tiêm vào túi niệu là < 60 giờ, từ 60-90 giờ và trên 90 giờ. Những nghiên cứu tiếp theo bởi khả năng gây bệnh của virus Newcastle dựa vào giá trị MDT ( Mean Death Time), ICPI ( Intracerebra Pathogenicity Index), IVPI ( Intravenous Pathogenicity Index) đã củng cố và sáng tạo thêm sự phân nhóm này ( bảng 1.2). Bảng 1.2: Phân loại nhóm độc lực của virus Newcastle được đánh giá qua các chỉ số độc lực cơ bản Nhóm độc lực MDT (giờ) ICPI IVPI Viscerotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Neurotropic VNDV* <60 1.5-2.0 2.0-3.0 Mesogenic NDV 60-90 1.0-1.5 0.0-0.5 Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 11 Lentogenic NDV >90 0.2-0.5 0.0 Asymptomaic NDV >90 0.0-0.2 0.0 Nguồn: Alexander, 1989 [89] VNDV*: Velogenic NDV d. Đặc tính nuôi cấy Tất cả APMV đều có thể nhân lên trong phôi trứng gà. Các virus Newcastle có khả năng và thời gian gây chết phôi gà rất khác nhau. Khi có virus Newcastle vào xoang niệu mô của phôi gà ấp từ 9-11 ngày, tùy theo độc lực của từng chủng mà có thể làm chết phôi từ 48 -100h. Hiệu giá virus cũng thay đổi theo chủng virus và những chủng gây chết phôi chậm hoặc không gây chết phôi sẽ cho hiệu giá cao nhất ( Gough và ctv, 1974) [115]. Đường tiêm cũng rất quan trọng, khi tiêm vào túi lòng đỏ thường gây chết phôi nhanh hơn khi tiêm virus Newcastle vào túi niệu ( Estupinan và ctv, 1968; Beard và Hanson, 1984) [101, 72]. g. Sức đề kháng: Ở 600C virus Newcastle bị diệt trong 30 phút, ở 1000C thì bị diệt trong 1 phút. Nhiệt độ môi trường từ 4-200C, virus có thể tồn tại trong 1 tháng và ở nhiệt độ âm virus tồn tại nhiều năm. Khả năng chịu nhiệt của từng chủng virus Newcastle là một đặc tính di truyền, các chủng khác nhau có khả năng chịu nhiệt khác nhau ( Trần Đình Từ, 1995) [31]. Ở nhiệt độ 560C có một số chủng virus chịu nhiệt tới 6 giờ mà vẫn còn khả năng gây nhiễm. Trong thịt thối rữa, phân, xác chết, virus tồn tại không quá 24 giờ. Trong phôi gà bệnh ở trạng thái khô lạnh, virus vẫn có khả năng gây bệnh trong 2 năm. Do virus Newcastle có màng bọc ngoài là lipid nên dễ mẫn cảm với các hóa chất như ether, chloroform, cồn, formol, phenol, beta-propiolacton làm mất khả năng gây nhiễm nhưng không ảnh hưởng đến tính miễn dịch của virus. Chất sát trùng như crezyl 5%, sữa vôi 10% có khả năng diệt virus ( Nguyễn Vĩnh Phước, 1977 và 1978) [25, 26] Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 12 Dung dịch Glycerin 50% có thể giữ virus trong bệnh phẩm 7 ngày ở 370C nhưng không còn khả năng gây nhiễm. Ở pH 10, virus mất khả năng gây nhiễm, virus cũng dễ bị diệt bởi các tia tử ngoại ( Nguyễn Lương, 1994) [21] 1.3 Đặc điểm dịch tễ học của bệnh Newcastle 1.3.1 Phân bố và diễn biến của bệnh Việc sử dụng rộng rãi phòng bệnh Newcastle ở nhiều nước trên thế giới là một bằng chứng về sự phổ biến của bệnh này trên thế giới. Hiện tại, vẫn có thể nói rằng bệnh Newcastle hiện diện ở khắp thế giới nhưng xảy ra thường xuyên chủ yếu là ở châu Phi, châu Á, Trung Mỹ, và một số vùng của Nam Mỹ. Do vậy, bệnh này vẫn được quan tâm giám sát và việc nghiên cứu cải tiến các kỹ thuật chuẩn đoán và biện pháp phòng bệnh luôn luôn được khuyến khích ( Falcon, 2004) [104]. 1.3.2 Vật chủ Bên cạnh gà, có lẽ hầu hết chim nuôi và chim hoang dã đều có thể bị nhiễm với các dòng virus Newcastle. Gà là vật chủ quan trọng nhất đối với virus Newcastle đồng thời có thể có vai trò của các loài chim khác như vịt, ngỗng, gà lôi, chim cút, bồ câu, gà tây. Virus newcastle cũng có thể gây nhiễm các loài động vật hữu nhũ. Con người cũng nhiễm bệnh, kể cả với các loài virus có độc lực cao lẫn độc lực thấp và sự nhiễm bệnh cũng có thể gây nên chứng viêm kết mạc nặng ( Chang, 1981) [88] 1.3.3 Đường xâm nhập và truyền lây của virus Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể gà qua đường hô hấp, kết mạc mắt và đường tiêu hóa. Có giả định cho rằng gà mẫn cảm hơn đối với virus Newcastle khi Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 13 xâm nhập vào đường hô hấp ( Spradbrow, 2001) [221]. Virus bài xuất ra khỏi cơ thể qua đường hô hấp hoặc qua phân. Lancaster (1966) [154] và Alexander (1988) [48] đã liệt kê những phương thức lây lan chủ yếu của bệnh Newcastle như sau: (1) Sự vận chuyển chim sống như buôn bán gia cầm, chim cảnh, bồ câu, chim hoang dã, (2) Tiếp xúc giữa những động vật khác, (3) Di chuyển người và phương tiện, (4) Luân chuyển sản phẩm gia cầm, (5) Truyền lây qua đường không khí, (6) Thức ăn gia cầm bị vấy nhiễm, (7) Nước uống, (8) Vaccine 1.4 Đặc điểm bệnh học 1.4.1 Quá trình sinh bệnh Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp và tiêu hóa. Những hạt < 5 micron trong không khí có thể phân tán vào trong toàn bộ khí quan hô hấp của gia cầm, kể cả túi khí. Các hạt > 5 micron bị giữ lại ở kết mạc, niêm mạc mũi và khí quản ( Kouwenhoven, 1993) [152]. Trong khí quản, virus lan truyền bằng cách nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác do hoạt động của các lông tơ. Hiệu giá virus cao nhất được phát hiện 24 – 96h sau khi nhiễm, sau đó giảm dần có thể do kháng thể được tạo thành từ ngày thứ 5, nhưng virus vẫn còn hiện diện tới ngày thứ 12. Sự lan truyền tiếp theo phụ thuộc rất lớn vào độc lực của chủng virus. Trong khi các chủng virus độc lực thấp chỉ hiện diện trong hệ thống tuần hoàn với hiệu giá thấp, các chủng độc lực trung bình có thể xâm nhập vào thận, phổi, túi Fabricius và lách. Còn các chủng virus độc lực cao có thể phát hiện trong vòng 22 – 24h trong tất cả các mô bào với hiệu giá cao nhất ở trong tuyến ức ( Thymus) và thấp nhất ở trong mô cơ và não (Singh và El – Zein, 1978) [214]. Sau khi nhân lên ban đầu ở vị trí xâm nhập virus độc lực cao xâm nhập vào máu, tới lách, gan, thận và phổi. Từ giờ thứ 36 sau khi nhiễm, sự nhân lên virus bị cản trở trong khoảng 12 – 24h và hiệu giá virus tụt xuống. Virus xâm nhập vào não sau khi quá trình nhân lên ở các mô ngoài hệ thống thần kinh ngừng lại từ giờ thứ 60 sau khi nhiễm và gà bắt đầu chết ( Asdell và Hanson, 1960) [65]. Đa số virus xâm nhập vào hệ thống Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 14 thần kinh trung ương qua đường máu trước khi một lượng kháng thể có ý nghĩa xuất hiện ở trong hệ thống tuần hoàn. Tuy nhiên một số virus hướng thần kinh đã nằm trong hệ thống thần kinh cùng thời điểm ở đường tiêu hóa và hô hấp là do có thể xâm nhập vào trung ương thần kinh thông qua dây thần kinh khướu giác. 1.4.2 Triệu chứng và bệnh tích Thời gian nung bệnh rất khác nhau, trung bình là 5-6 ngày.Hiên nay có 4 dạng bệnh khác nhau: a. Dạng gây ra do chủng độc lực mạnh-nhóm velegenic. * Triệu chứng: bệnh xuất hiện đột ngột và lây lan nhanh, chết cấp tính trong 3-4 ngày và biểu hiện rõ triệu chứng,bệnh tích. Chỉ thấy một số triệu chứng. - Gà lờ đờ, hô hấp tăng, thở mạnh, ho. - Đi tiêu chảy đôi khi có máu. - Một số chảy dịch nhờ ở mũi, mặt. - Mào, mồng, tích tím, có thể phù quanh đầu. - Sau 4-5 ngày nếu không chết thì biểu hiện triệu chứng thần kinh ( Mổ lung tung , đi quay tròn ). - Gà đẻ giảm số lượng trứng, vỏ mềm. - Tỉ lệ chết 50%- 90% tùy từng đàn. * Bệnh tích: - Đường tiêu hóa xuất huyết và loét từng điểm. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 15 - Thực quản, dạ dày tuyến, dạ dày cơ ( mề ), ruột tịt, ruột già, lỗ huyệt đều thấy xuất huyết. - Mạch ruột viêm đỏ và xuất huyết. - Niêm mạc mũi, có dịch nhầy và đôi khi xuất huyết lấm tấm đỏ. - Buồng trứng sung huyết đỏ và một số trứng bị teo. - Mào, não bị xuất huyết điểm đỏ lấm tấm. b. Dạng gây ra do chủng độc lực vừa-Nhóm Mesogenic. * Triệu chứng: Bệnh xuất hiện đột ngột, lây lan nhanh. - Giảm ăn, ho, tiêu chảy phân xanh hoặc hơi vàng .- Trạng thái run rẩy, sau 2 tuần triệu chứng thần kinh sẽ nặng - Gà đẻ tỉ lệ trứng giảm, trứng non nhiều. - Tỉ lệ chết từ 5%-50%, có đàn trên 50% . * Bệnh tích: - Niêm mạc dạ dày tuyến xuất huyết. xuất huyết khí quản Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 16 - Niêm mạc đường hô hấp có dịch nhờn, đôi khi có xuất huyết. - Giai đoạn đầu lách sưng to. c. Dạng gây ra do chuẩn độc lực yếu- nhóm Lenetogenic. * Triệu chứng: Chủ yếu ở đường hô hấp ( ho, thở khò khò vào ban đêm ). - Trứng đẻ giảm nhưng sau một vài tuần lại đẻ lại trở lại bình thường. - Gà lớn không chết, chỉ có gà con chết nhưng tỉ lệ ít 1%-10%. * Bệnh tích: Chủ yếu ở đường hô hấp, khí quản viêm nhẹ. d. Dạng mang trùng ( không có triệu chứng ) - Không gây chết nhưng nguy hiểm là tồn trữ mầm bệnh làm lây lan cho đàn gà mới nhập. 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 2.1 Khái niệm Nuôi cấy tế bào là kỷ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức năng biến dưỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. 2.2 Các loại tế bào nuôi cấy: Tế bào biểu mô, Nguyên sợi bào, Tế bào cơ, Tế bào thần kinh, Lympho bào. 2.3 Một số máy móc thiết bị cần thiết Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào, tủ ấm thường và tủ ấm CO2 tủ lạnh thường và lạnh sâu, bình Nito lỏng, hệ thống nước cất hai lần, hệ thống lọc vô trùng và hệ thống trypsin hóa, dụng cụ thủy tinh và nhựa, kính hiển vi soi ngược và một số máy móc khác. 2.4 Thành phần môi trường. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 17 - Carbohydrate: Glucose cung cấp nguồn năng lượng. - Aminoacid nồng độ 0,1- 0,2 mol tiền chất tổng hợp protein. - Muối đẳng trương: Giữ cân bằng trong và ngoài tế bào. - Bicarbonate: Hệ thống đệm trong sẽ kết hợp 5-10% CO2 ( tủ ủ ) - Vitamin, hormon: Nồng độ sử dụng khác nhau tùy theo nhu cầu các loại tế bào. - Phenol red: Chất chỉ thị PH môi trường. * Điểu kiện nuôi cấy. - Nhiệt độ 37o C. - PH 7,4. * Chất bổ sung vào môi trường. - Huyết thanh phải lọc qua lưới lọc 0.1µm ( vô trùng ) vì huyết thanh rất dễ bị nhiễm các loại vi khuẩn, virus. Đặt biệt là Mycoplasma dễ nhiễm vào huyết thanh vì nó có thể lọt qua lưới lọc 0,2µm.Vì vậy để khắc phục cần tìm hiểu rõ nguồn gốc của huyết thanh. - Ngoài ra trong môi trường nuôi cấy còn bổ sung thêm kháng sinh nhằm ngăn cản hiện tượng tạp nhiễm của vi khuẩn ( Pennicyline+ Streptomycne+ Gentamycine ). 2.5. Kiểm soát việc nuôi cấp tế bào. - Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng. - Mật độ lúc cấp 104- 105 tế bào tb/ml. - Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng - Sự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc, thiếu bề mặt tăng trưởng. Lúc này ta cần thay thế môi trường hoàn toàn hay một phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 18 2.6. Thu hoạch tế bào 2.7. Bảo quản tế bào. - Nhiệt độ: -700C: hàng tuần, hàng tháng - Nhiệt độ: -1960C: lâu hơn 2.8. Nguyên nhân gây nhiễm trùng trong nuôi cấy tế bào - Là do vi sinh vật từ rất nhiều nguồn khác nhau: không khí, tủ cấy, vật dụng, người thao tác, và chất bổ sung vào môi trường. - Cách nhận biết: + Giảm đột ngột pH của môi trường + Tạo lớp mây của môi trường + Môi trường đục, tạo cặn - Giảm nguồn nhiễm: + Sát trùng nơi làm việc + Sử dụng vật dụng nuôi cấy vô trùng + Vệ sinh cá nhân + Chọn nguồn huyết thanh 2.9. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Trong chẩn đoán bệnh - Chẩn đoán và điều trị ung thư - Sản xuất kháng thể đơn dòng - Sản xuất vaccine Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 19 - Chẩn đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học ( hormon, enzyme trị liệu ) 3. Chẩn đoán bệnh Newcastle bằng phương pháp nuôi cấy tế bào - Việc chẩn đoán bệnh rất quan trọng vì những lý do sau đây: + Newcastle là bệnh có trong danh mục kiểm dịch biên giới và các nước có dịch xảy ra phải thông báo với tổ chức dịch tễ thế giới ( OIE) + Khi các ổ dịch đã được khẳng định cần phải giúp cho chính quyền địa phương hiểu biết về dịch tễ học của bệnh Newcastle tại nước họ và phát triển chiến lược khống chế bệnh một cách phù hợp + Cần tìm hiểu rõ nguyên nhân gây chết vì ta biết rằng khi tiêm chủng vaccine phòng bệnh Newcastle không thể bảo vệ 100% đàn gà. 1. Thu thập và gởi mẫu đi chuẩn đoán bệnh 1.1 Mẫu cơ: Dòng virus cường độc gây bệnh thường yếu chịu nhiệt nên khi gởi mẫu phải đóng gói một cách đặc biệt cùng với nước đá. Điều kiện: - Mẫu tươi: Mẫu tùy tạng, lá lách, phổi và đầu gà còn nguyên vẹn gói vào giấy plastic và đặc vào hộp xốp cùng vói đá hoặc nước đá. - Nếu không thể giữ lạnh được mẫu hoặc khi không chắc chắn mẫu sẽ đến phòng thí nghiệm trong vòng 24h. Các mẫu lá lách, phổi, đầu nguyên vẹn và các đoạn xương dài sẽ được bảo quản trong glycerine 50% trong muối và giữ nó ở mức lạnh nhất có thể được và bảo quản trong thời gian đưa mẫu đến phòng thí nghiệm. 1.2. Mẫu huyết thanh -Độ tin cậy của xét nghiệm huyết thanh phụ thuộc phần lớn chất lượng của mẫu. Các mẫu đã bị tan máu hoặc bị nhiễm bẩn thường có kết quả không đáng tin cậy. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 20 - Kỹ thuật lấy mẫu máu: máu của gia cầm thường được lấy từ tĩnh mạch cánh. Mỗi con vật sẽ dùng một kim tiêm riêng để tránh rủi ro về tác nhân gây nhiễm lan truyền cơ giới từ con này sang con khác. - Dán nhãn cho mẫu: Các mẫu phải được dán nhãn theo thứ tự bằng loại mực không thấm nước. - Tránh hiện tượng tan huyết của mẫu: tan huyết xảy ra do kỹ thuật lấy mẫu kém, các trang bị bẩn hoặc kỹ thuật gởi mẫu kém. Nguyên nhân của hiện tượng tan huyết bao gồm: + Máu chảy chậm do tắt nghẽn, không trúng mạch. + Mẫu bị nóng, thường do để trong xe hoặc bị ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp quá lâu. + Làm đông lạnh mẫu. + Sự nhiễm bẫn của mẫu do nước. + Sự nhiễm bẩn do phân và các vật liệu khác. + Dùng sức ép mạch máu chảy qua tim + Bị nhiễm khuẩn khi lấy mẫu + Dùng các thùng không khử trùng để lấy mẫu và lưu giữ mẫu. - Bảo quản mẫu huyết thanh trước khi đưa đến phòng thí nghiệm + Các mẫu máu và huyết thanh không được để trong bình, các thùng hoặc ống và kim tiêm kèm theo chưa được khử trùng. + Để đông mẫu trước khi vận chuyển. Mẫu cần được để nơi ấm cho đến khi đông lại ( máu có thể không đông trong thời tiết lạnh hoặc mẫu đã được làm lạnh ngay sau khi lấy). + Khi máu đã đông mẫu cần được bảo quản lạnh để giảm sự nhiễm bẫn, giảm hiện tượng tan huyết và vỡ hồng cầu. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 21 + Nếu mẫu không chuyển ngay đến phòng thì nghiệm được và để lâu mới xét nghiệm nên chắt riêng huyết thanh vào lọ nhựa 5ml và 1.8ml vô trùng có nút vặn và chỉ chuyển huyết thanh đi. + Các mẫu máu dùng để chắc huyết thanh không được làm đông lạnh trước khi chắc huyết thanh. Các mẫu huyết thanh có thể bảo quản đông lạnh với điều kiện là không có tế bào máu bên trong 2. Xử lý mẫu Huyễn dịch được chuẩn bị ngay trước khi tiến hành phân lập virus. Não gà được lấy ra rồi ngâm vào dung dịch sinh lý vô trùng có chứa 2000 UI penniciline/ ml và 2000 µg streptomycine/ ml trong đĩa petri khoảng 30 phút ở 4 – 80C Lấy khoảng 2g não gà nghiền nhuyễn với 0.5g nước cất vô trùng trong cối sứ, thêm 8ml dung dịch sinh lý vô trùng có chứa 1000 UI penniciline/ ml và 1000µg streptomycine/ ml, nghiền trộn đều một lần nữa. Để lắng và hút 5ml dịch nghiền, ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút, thúc dịch bệnh phẩm cho vào ống nhựa eppendorf (1.5ml) ghi ký hiệu và cho ngay vào tủ lạnh (4 – 80C) trong khi chờ tiêm vào môi trường tế bào. 3. Phương pháp chuẩn bị môi trường xơ phôi gà ( CEF) một lớp. 3.1 Nguyên liệu - Trứng gà có phôi 9 – 11 ngày tuổi. Soi và chọn những trứng có phôi phát triển tốt, khỏe mạnh để làm tế bào. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 22 - Hóa chất và môi trường: + Dung dịch PBS pH 7,2 có kháng sinh với nồng độ: penniciline 200 UI/ml, streptomycine 200µg/ml + NaHCO3 0.75% + trypsin 0.25%, MEM và NCS - Tất cả dụng cụ, trang bị và phòng làm tế bào phải vô trùng. 3.2 Trypsin có tế bào - Sát trùng toàn bộ quả trứng bằng cồn iode. Dùng kéo cắt vỏ trứng nơi buồng hơi. - Dùng kẹp lấy phôi gà ngâm vào dung dịch PBS có kháng sinh. Dùng kéo cắt bỏ đầu, cánh, chân và phủ tạng chỉ lấy phần thân ngâm vào dung dịch PBS. - Rửa thân phôi với dung dịch PBS 3 lần - Cắt nhỏ phần thân phôi bằng kéo. Cho thân phôi đã được cắt nhỏ vào bình có khía với thanh khuấy từ. - Cho dung dịch PBS vào bình khía: rửa sạch các mảnh phôi đã được cắc nhỏ và để yên cho lắng xuống, chắt bỏ phần nước ở trên. Lập lại 3 lần cho đến khi nước trong. - Cho trypsin 0.25% mới cũng đã làm ấm trước ở 370C. 20ml/phôi, đặt bình khía lên máy khuấy từ và khuấy trong 20 phút ở 370C để phân cách tế bào ra. - Thu hoạch huyễn dịch tế bào và thêm một lượng MEM lạnh và huyết thanh để ngưng hoạt động của trypsin. - Lọc qua 4 lớp vải màng và bình ly tâm và ly tâm lạnh với tốc độ 1500 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ phần nước bên trên, phần tế bào bên dưới đáy được pha với một thể tích môi trường MEM thích hợp, đếm tế bào với 0.1% Trypan blue và điều chỉnh lượng tế bào để được số lượng 106 tế bào/ ml hoặc 1 phôi gà pha với 100ml môi trường phát triển( MEM 5% NCS). Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 23 3.3 Cấy tế bào vào chai - Pha môi trường phát triển: + Trong một lít môi trường căn bản có: • 5% huyết thanh bê sơ sinh ( NCS) • 200000 UI penniciline • 200 mg streptomycine • 50 mg Mycostatin • 0.75% NaHCO3 - Pha tế bào vào môi trường và ra chai: Pha trực tiếp số lượng tế bào thích hợp đã được xác định vào môi trường phát triển. Lắc đều tế bào trong môi trường bằng cách lắc bình xoay vòng nhiều lần và ra chai: 0.2ml huyễn dịch tế bào/ cm3 bề mặt chai nuôi cấy Để tất cả các chai tế bào vào tủ ấm 370C để tế bào tăng trưởng cho đến khi mọc đầy một lớp có thể nhiễm virus. 4. Kiểm tra mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu bệnh phẩm cho vào môi trường xơ phôi gà. Nếu thấy những mảnh lớn trong hoặc đỏ kích thước từ 0.5-1.5-2.4 mm trong môi trường tế bào thì kết luận bệnh phẩm bị nhiễm bệnh. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 24 Chủng độc lực mạnh gây bệnh tích tế bào có kích thước 2-4 mm. Chủng độc lực vừa nhóm Mesogenic gây bệnh tích tế bào với kích thước mảng nhỏ 0.6-1.5 mm Đối với chủng độc lực yếu ta phải bổ sung vào môi trường tế bào chất Mg và DEAE mới thấy tế bào bị nhiễm. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 25 IV. KẾT LUẬN Bệnh Newcastle là bênh truyền nhiễm cấp tính và lây lan rất nhanh, bệnh gây xáo trộn và bệnh tích trên đường hô hấp, tiêu hóa và thần kinh. Hiện nay bệnh là mối nguy hiểm cho ngành chăn nuôi gia cầm, bệnh thường gây nhiễm ghép với các bệnh khác và tỉ lệ chết là 100%. Do đó bệnh Newcastle đã gây ra những tổn thất to lớn cho nền kinh tế của các nước xảy ra dịch bệnh cũng như của cả thế giới. Ngoài ra nó còn ảnh hưởng đến sức khỏe của con người, gây ô nhiễm môi trường và gây ra những vấn đề về dinh dưỡng. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh có ý nghĩa rất lớn cả về phương diện kinh tế lẫn xã hội. Phương pháp chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào có độ chính xác cao và đây là phương pháp duy nhất thu nhận virus cho các nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là rất chậm, đắt tiền, đòi hỏi tay nghề kỷ thuật cao. Hiện nay, không có thuốc điều trị đặc hiệu. Nên bổ sung thêm vitamin C và vitamin nhóm B, chế phẩm K.C- Electrolyte, cải thiện khẩu phần thức ăn có thể làm giảm bớt tỉ lệ tử vong trong giai đoạn cuối ổ dịch. Chẩn đoán bệnh Newcastle bắng kỹ thuật nuôi cấy tế bào 26 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Ngọc Hải. Công nghệ sinh học trong thú y 2.Trần Thị Bích Liên. Nuôi cấy mô tế bào động vật 3. Dương Quốc Nghĩa. Nghiên cuuws bệnh Newcastle trên gà thả vườn ở tỉnh Đồng Tháp và xây dựng quy trình tiêm chủng vaccine phòng bệnh phù hợp. 4. 5. 6. www.mcb.uct.ac.za/cann/335/Paramyxoviruses.html 7. www.stanford.edu/.../1999/leanna/para-EM.html 8. www.edu-graphics.com/.../TissueCulture.html 9. www.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id